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FACULTAD DE MEDICINA
Carrera de Enfermería
GUIA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PROFESORES: Maribel Arnes.
Alexis Muñoz
SANTIAGO-CHILE
2013
LABORATORIO N° 1
SOLUBILIDAD Y RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO
I.- INTRODUCCIÓN
A) SOLUBILIDAD Es indudable que las propiedades físicas (el estado físico, viscosidad, conductividad térmica y eléctrica, solubilidad, etc.) de los diversos tipos de sustancia es consecuencia de su estructura. La experiencia indica que son numerosos los procesos químicos que tienen lugar en solución. Incluso las reacciones bioquímicas de gran importancia tienen lugar en solución, siendo el agua el disolvente por excelencia. Una solución es un sistema homogéneo, constituido por dos o más componentes. Se entenderá por un sistema homogéneo, aquel en que las propiedades y la composición son idénticas en todo el sistema. Como esta definición no restringe en modo alguno la naturaleza de las sustancias requeridas, se pueden considerar seis tipos fundamentales de solución, dependiendo del estado (sólido, líquido, gaseoso) de los componentes de la disolución (tabla Nº1). Siendo, las soluciones más interesantes las sólido-líquido y líquido-líquido. Tabla Nº1: Tipos de soluciones
Componente 1 Componente 2 Ejemplo
Gas Gas Aire
Gas Líquido Agua mineral
Gas Sólido H2 en paladio
Líquido Líquido Etanol en agua
Sólido Líquido Suero fisiológico
Sólido Sólido Soldadura (Estaño-plomo)
Hay tres factores básicos que afectan la solubilidad, y estos son:
La presión
La temperatura
La naturaleza del soluto y del solvente. La Ley de Henry establece que la solubilidad de los gases en líquidos aumenta a medida que se incrementa la presión a temperatura constante. Del mismo modo, al aumentar la temperatura y mantener la presión constante la solubilidad de un gas disminuye. Las soluciones líquido-líquido y sólido-líquido no se ven afectadas por la presión, sin embargo, la temperatura es un factor relevante en estas soluciones, debido a que si la reacción es endotérmica la solubilidad aumenta al ascender la temperatura, en caso contrario, cuando el proceso es exotérmico la solubilidad disminuye al ascender la temperatura. Conocer la naturaleza química del soluto y del solvente es fundamental, pues le permite predecir la solubilidad de una sustancia. Cuando la naturaleza del soluto y del solvente es de polaridad similar (sus estructuras son semejantes), se dice que las sustancias son solubles, en caso contrario son insolubles. Por ejemplo, etanol y agua son completamente solubles en toda proporción (miscibles), ambos son polares; benceno y agua son insolubles en toda proporción (inmiscibles), el benceno es apolar y el agua es polar.
Para conocer la polaridad de un compuesto se prueba su solubilidad en diferentes solventes tales como agua (polar), acetona (polaridad intermedia) y éter de petróleo (apolar). Una vez establecido su grado de solubilidad, mediante la regla “lo semejante disuelve lo semejante” se puede a través de la siguiente tabla obtener la polaridad de una determinada sustancia.
Compuesto Solubilidad en agua (polar)
Solubilidad en acetona
(polaridad intermedia)
Solubilidad en éter de petróleo
(apolar)
Polaridad del compuesto
A Soluble Insoluble Insoluble Polar
B Insoluble Insoluble Soluble Apolar
C Soluble Soluble Insoluble Medianamente polar
D Insoluble Soluble Soluble Medianamente apolar
E Soluble Soluble Soluble Intermedia
F Insoluble Insoluble Insoluble Indeterminada
B) HIDRATOS DE CARBONO
Los hidratos de carbono se conocen comúnmente como azúcares o sacáridos por su sabor dulce. Químicamente, se trata de aldehídos o cetonas polihidroxilados, cuya fórmula empírica general puede expresarse como (CH2O)n. Por ejemplo, cuando n=6 la fórmula molecular es C6H12O6.
Los hidratos de carbono, constituyen uno de los grupos más importantes de sustancias orgánicas de origen natural. Figuran entre los compuestos más abundantes de plantas y animales, en los que desempeñan variadas funciones:
i) constituyen una fuente importante de energía. ii) forman parte de los tejidos de sostén de las plantas y de algunos animales, por ejemplo la madera, el almidón,
el algodón, el esqueleto estructural de los ácidos nucleicos ARN y ADN, el azúcar de mesa, etc. Existen varios conceptos que permiten clasificar a los hidratos de carbono. Una clasificación clásica se basa en el
número de unidades simples de azúcares que lleva una molécula, así tenemos:
Monosacáridos: son los hidratos de carbono que no pueden hidrolizarse para dar moléculas más pequeñas, es decir, no se encuentran enlazados a otros hidratos de carbono y por lo tanto, son los azúcares más simples.
CHO
CH2OH
H
H
H
H
OH
OH
OH
HO
CH2OH
H
H
H
OH
OH
HO
CH2OH
O
Glucosa Fructosa
Oligosacáridos:Uno de los oligosacáridos más importantes son los disacáridos, debido a su abundancia en la naturaleza. Los oligosacáridos son aquellos hidratos de carbono que por hidrólisis dan como resultado entre 2 a 10 unidades simples de azúcares o monosacáridos. Los monosacáridos se encuentran unidos por un enlace glicosídico.
Polisacáridos:Son hidratos de carbono que por hidrólisis se obtienen como producto más de 10 unidades de monosacáridos.
O
CH2OH
CH2OHOH
OH
HO
HO
O
O
n
Amilosa
Los monosacáridos pueden clasificarse según el número de átomos de carbono que contenga en:
* Triosas:son aquellos hidratos de carbono que poseen 3 átomos de carbono. * Tetrosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 4 átomos de carbono. * Pentosas:son aquellos hidratos de carbono que poseen 5 átomos de carbono. * Hexosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 6 átomos de carbono.
Además si los monosacáridos contienen un grupo funcional aldehído, se conocen como aldosas y si contienen un
grupo funcional cetónico se conocen como cetosas. Así un monosacárido puede, tomar cualquiera de los siguientes nombres: aldopentosa, aldohexosa, cetopentosas, cetohexosa, etc.
HOOH
OH
CH2OH
O
Sacarosa
O
HOCH2
OH
HOCH2OH
O
Maltosa
O
CH2OH
HOOH
OH
O
(H,OH)
CH2OH
OH
OH
O
CH2OH
H
H
H
OH
OH
HO
CH2OH
O
CHO
CH2OH
H
H
H
H
OH
OH
OH
HO
Aldohexosa Cetohexosa
La D-glucosa, es el monosacárido más importante, se llama en ocasiones azúcar sanguíneo, porque se encuentra en la sangre y en otros fluidos corporales, o azúcar de uva, porque se encuentra presente en esta fruta. Es el componente principal de muchos oligosacáridos y polisacáridos.
La D-fructosa entre todos los azucares es el compuesto de sabor más dulce, es un monosacárido que es fácilmente convertido a D-glucosa en el cuerpo. Se encuentra en las frutas y en la miel.
La química de estos compuestos esta relacionada directamente con los grupos carbonilos e hidroxilos presentes
en estas moléculas. En solución acuosa, el grupo carbonilo en el carbono uno, en una aldosa, o el carbono dos, en una cetosa, y los grupos hidroxilos en los carbonos cuatro y cinco de los monosacáridos reaccionan en forma intramolecular para dar formas cíclicas que justifican muchas propiedades interesantes de estos compuestos. El anillo de cinco miembros se llama furanosa, por analogía con el furano.De modo similar, el anillo de seis miembros se denomina piranosa, por analogía con el pirano.
Ejemplos:
La estereoquímica de la forma cíclica de los azúcares se representa por la estructura de Haworth.
O
Pirano
O
FuranosaFurano Piranosa
O O
Fructosa Glucosa
1
2
3
4
5
6HOH2C CH2OH
HO
OH
O
OH OHHO
CH2OH
OH
OH
O
1
2
3
4
5
6
OH
CH2OH
HOOH
OH
O O
OH
OHHO
CH2OH
OH
-D-Glucopiranosa -D-GlucopiranosaGlucosa
CHO
CH2OH
H
H
H
H
OH
OH
OH
HO
Estructura HaworthEstructura FischerEstructura Haworth
-D-Fructofuranosa-D-Fructofuranosa
O
CH2OH
OH
OHHOH2C
HO
O CH2OH
OH
OH
HOH2C
HO
Fructosa
CH2OH
H
H
H
OH
OH
HO
CH2OH
O
Estructura HaworthEstructura FischerEstructura Haworth
De la figura anterior se puede observar que hay dos formas posibles para cada uno de los azúcares (D-glucosa y D-
fructosa) que se denominan y . Esto se debe a que al pasar de la forma de cadena abierta a la cadena cerrada se introduce un nuevo carbono asimétrico (C1 de las aldosas y C2 de las cetosas), llamado carbono anomérico. Los anómeros son azúcares que sólo se diferencian en la estereoquímica del carbono hemiacetálico y carbono hemicetálico (carbono anomérico).
El grupo hidroxilo (OH) del carbono anomérico de un monosacárido puede reaccionar con compuestos que presenten grupos OH, NH2o SH produciéndose la pérdida de una molécula de agua, formando los compuestos llamados glicósidos.
Al formarse un enlace glicosídico el carbono anomérico pierde su carácter reductor, se estabiliza la forma
anomérica del monosacárido en la forma en que reaccionó (o ) y ya no se puede observar el fenómeno de
mutarrotación (equilibrio entre la cadena abierta y cadena ciclada). Se puede hablar por tanto de -glicósidos o -glicósidos.
Según la naturaleza del grupo reaccionante se distinguen O-glicósidos (a partir de un OH), N-glicósidos (a partir de un NH2) y S-glicósidos (a partir de un SH).
Los monosacáridos componentes de los disacáridos y polisacáridos están unidos mediante enlaces O-glicosídicos.
En este tipo de enlace, el grupo OH del carbono anomérico de un monosacárido reacciona con un grupo hidroxilo de otro monosacárido, desprendiéndose una molécula de agua.
Cuando los carbonos anoméricos forman un enlace O-glicosídico, es decir, no existe carbono hemiacetálico o hemicetálico, el oligosacárido es un azúcar no reductor; Por ejemplo, la sacarosa es un azúcar no reductor porque ambos carbonos anoméricos están unidos formando un enlace glicosídico. Pero cuando, a lo menos uno de los carbonos anoméricos queda libre, existe carbono hemiacetálico o hemicetálico, el ologosacárido es un azúcar reductor; Por ejemplo, la Lactosaes un azúcar reductor, porque solo un carbono anomerico participa en el enlace glicosídico y el otro
queda libre pudiendo existir en dos formas anoméricas: -Lactosa (OH del carbono anomerico libre hacia abajo) y -lactosa (OH del carbono anomerico libre hacia arriba)
H2O+
O OH
OH
OHHO
HOH2C
CH3OH+
O
OH
OHHO
HOH2C
OCH3
-D-glucopiranosa Metanol Metil--D-glucopiranósido
O
OH
OHHO
HOH2C OCH3.Carbono acetálico(carbono anomérico)
Enlace glicosídico
Sacarosa -Lactosa
La sacarosa, el azúcar de mesa, es un disacárido compuesto de D-glucosa y D-fructosa, se obtiene de la
remolacha y de la caña de azúcar, siendo uno de los principales productos orgánicos industriales. Es un azúcar no reductor, puesto que en enlace glicosídico participan ambos carbono anoméricos.
La lactosa, es el azúcar de la leche, es un disacárido compuesto de D-galactosa y D-glucosa, es utilizado en alimentos infantiles y en la leche malteada. Es un azúcar reductor, puesto que en enlace glicosídico solo participa un carbono anomérico.
Los polisacáridos son polímeros de monosacáridos que se encuentran formando largas cadenas. Los tres elementos estructurales que definen un polisacárido son: (1) la identidad de los monómeros constituyentes (2) la naturaleza de los enlaces glicosídicos entre ellos (3) cuando es apropiado, la secuencia de los residuos. Respecto del primer punto, los polisacáridos pueden clasificarse como homopolisacáridos (todos los residuos idénticos) oheteropolisacárido (residuos diferentes). Los polisacáridos de origen natural tienen un tamaño que varia ampliamente a una gama de hasta varios miles de residuos monoméricos. Además el número de residuos varía con frecuencia entre muestras de un mismo material. Por tanto, el peso molecular de los polisacáridos tiene un valor aproximado.
La celulosa es un polisacárido de hasta 14000 unidades de D-glucosa, que se agrupan en haces torcionados, a modo de lazos, sujetos por interacciones puentes de hidrógeno. La celulosa es el compuesto orgánico más abundante de la tierra. Las hojas secas contienen 10 a 20 % de celulosa, la madera un 50% y el algodón un 90%.
El almidón es el segundo polisacárido más abundante, está constituido por unidades de D-glucosa. Al ser triturado y tratado con agua caliente, se divide en dos fracciones principales según su solubilidad: amilosa (soluble), que constituye aproximadamente el 20% y la amilopectina (insoluble) que forma el 80% restante.
El glucógeno es un polisacárido utilizado como reserva de glucosa, sobre todo en el hígado y en los músculos de los mamíferos.
Los monosacáridos y disacáridos son sólidos o líquidos con aspecto de jarabe, de sabor dulce, son solubles en
agua e insolubles solventes no polares o apolares. Los polisacáridos poseen propiedades similares, pero generalmente son insolubles en agua debido a su alto peso molecular.
Muchos azúcares reaccionan frente a los reactivos de Tollens, Benedict o Fehling (agentes oxidantes en medio
básico) sufriendo la oxidación del carbono anomérico. Los azúcares susceptibles de ser oxidados por estos reactivos se denominan azúcares reductores. Ttodos los monosacáridos se oxidan con gran facilidad porque están en equilibrio con la forma de cadena abierta, y por lo tanto solo los disacáridos que presenta un carbono anomerico libre pueden oxidarse con estos reactivos. Sin embargo, los polisacáridos no se oxidan con estos agentes oxidante, todos son azucares no reductores.
Enlace glicosidico
Carbono
anomérico libre
El enlace glicosídico puede romperse por reacciones de hidrólisis (ruptura de una molécula por acción del agua). La hidrólisis química de los azúcares se puede realizar calentando la solución acuosa del azúcar usando como catalizador un ácido (hidrólisis ácida), obteniéndose los monosacáridos constituyentes. En los sistemas biológicos las enzimas actúan como catalizadores de esta reacción (hidrólisis enzimática).
Por esta razón, es que los disacáridos y polisacáridos no reductores después de realizar la hidrólisis darán respuesta positiva frente a los reactivos de Tollens, Benedict o Fehling. 1) Test de Molisch
Este test es de reconocimiento general, es decir, reconoce todos los hidratos de carbono o azúcares. Está basado
en la deshidratación de estos azúcares, por ácido sulfúrico a furfural y sus derivados, los cuales son condensados con -naftol y subsecuentemente son oxidados. Cuando la reacción es positiva se observa la presencia de un anillo violeta.
EL -NAFTOL ES TÓXICO Y CARCINÓGENO, TRABAJE CON CUIDADO!! 2) Reacción de Fehling
Consiste en una solución alcalina de sulfato de cobre. Es un agente oxidante suave y debido a esto necesita calor para actuar. Reacciona con azúcares reductores. Cuando la reacción es positiva se observa un precipitado rojo ladrillo.
3) Test de Barfoed
Consiste en una solución ácida de acetato de cobre (II). De acuerdo a la velocidad de reacción, permite diferenciar entre monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Cuando la reacción es positiva aparece un precipitado rojo al calentar en baño de agua.
Los monosacáridos dan reacción positiva entre los 30 segundos y los 5 minutos. Los disacáridos dan reacción positiva entre los 6 y los 15 minutos. Los polisacáridos no dan reacción positiva, es decir, N.H.R., al calentarlos por un tiempo máximo de 15 minutos.
4) Test de Seliwanoff
Es similar al reactivo de Molisch, con la diferencia que se utiliza un agente deshidratante más suave que el ácido
sulfúrico (HCl 6 M). Las cetosas dan reacción positiva al calentar por 2 minutos, la aparición de un color rojo corresponde a una
cetohexosa y el color verde a una cetopentosa. Las aldosas requieren de horas de calentamiento para reaccionar, observándose la aparición de un color
anaranjado cuando es una aldohexosa y un verde limón cuando es una aldopentosa. El primer paso en el estudio de los hidratos de carbono es su purificación. Para ello se puede utilizar la centrifugación diferencial, cromatografía de intercambio iónico o filtración en gel. II.- OBJETIVOS
Reconocer propiedades físicas y químicas de los hidratos de carbono.
Identificar a través de reacciones sencillas la presencia de:
Monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
Azúcares reductores.
Identificar una Muestra problema, señalando las características físicas y químicas que ésta presenta.
CH2OHHO
OH
OO HOH2C
OH
OH
CH2OH
Glucosa FructosaSacarosa
+HO
CH2OH
OH
OH
O
OH
HOH2C
CH2OHHO
OH
O
HO
H+
H2O+OHO
III.- PARTE EXPERIMENTAL A.- Propiedades Físicas de Hidratos de Carbono: Solubilidad a) Coloque en un tubo de ensayo limpio y seco, una punta de espátula de cada uno de los hidratos de carbono a ensayar. b) Agregue a cada tubo 3,0 mL de agua destilada, agite y observe. c) Repita el procedimiento con los siguientes solventes: acetona y éter de petróleo. d) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla.
Hidrato de carbono
(1 punta de espátula)
Agua dest. (3,0 mL)
Acetona (3,0 mL)
Éter de Petróleo (3,0 mL)
Polaridad
glucosa
fructosa
sacarosa
almidón
B.- Propiedades Químicas de Hidratos de Carbono: Reconocimiento a) Reacción de Molisch: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de
azúcares (ver tabla), agregue 0,5 mL de agua destilada y agite hasta disolver. Luego adicione 2 gotas de una solución
de -naftol al 10% p/v (Reactivo de Molisch), agite nuevamente, incline el tubo en 45º y agregue 20 gotas de ácido sulfúrico concentrado por la pared del tubo, de manera que el ácido forme una capa debajo de la solución acuosa (NO AGITE LA SOLUCIÓN). Observe inmediatamente lo que ocurre en cada caso.
b) Reacción de Barfoed: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de azúcares (ver tabla), agregue 0,5 mL de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue 1,0 mL del reactivo de Barfoed, agite, caliente en un baño de agua a ebullición y observe.
c) Reacción de Seliwanoff:En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de
azúcares, agregue 0,5 mL de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue 2,0 mL del reactivo de Seliwanoff, agite, caliente en un baño de agua a ebullición por dos minutos y observe.
d) Reacción de Fehling:En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de
azúcares (ver tabla), agregue 0,5 mL de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue a cada tubo de ensayo 2,0 mL de reactivo de Fehling, agite bien, coloque por 2 minutos en un baño de agua caliente (ebullición) y observe.
e) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla:
Hidrato de carbono
(1 punta de espátula en 0,5 mL de agua
dest.)
Molisch 1°: 2 gotas de Molisch 2°: Inclina el tubo de ensayo en 45° y agrega20 gotas de H2SO4. NO AGITE!!!
Barfoed (1,0 mL)
Seliwanoff (2,0 mL)
Calentar 2 min.
Fehling (2,0 mL)
Calentar 2 min.
glucosa
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
fructosa
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
sacarosa
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
almidón
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
MUESTRA PROBLEMA
Pida a su profesor una Muestra Problema y, a través de las reacciones que usted aprendió en este laboratorio, determine la naturaleza física y química de su muestra.
LABORATORIO N°2
PROTEÍNAS Y LÍPIDOS
I.- INTRODUCCIÓN A) PROTEÍNAS Las proteínas son moléculas de gran tamaño que se encuentran en todos los organismos vivos. Existen diferentes tipos de proteínas las cuales cumplen distintas funciones biológicas. Así, por ejemplo, la queratina de la piel y las uñas la fibroína de la seda y de las telarañas, el colágeno de los tendones y de los cartílagos, son todas proteínas estructurales; la insulina que regula el metabolismo de la glucosa en el cuerpo, es una proteína hormonal; y el ADN polimerasa y la inversotranscriptasa, actúan como catalizadores biológicos de las reacciones químicas en las células son proteínas llamadas enzimas. Sin importar su aspecto o su función, todas las proteínas son químicamente similares puesto que todas están constituidas por muchas unidades de aminoácidos.
Los aminoácidos son moléculas bifuncionales, contienen un grupo amino (básico) y un grupo carboxílico (ácido).
Los aminoácidos se unen a través de un enlace amida o enlace peptídico. Resulta un dipéptido cuando se forma
un enlace amida entre el grupo -amina de un aminoácido y el grupo -carboxílico de otro aminoácido; un tripéptido resulta de la unión de tres aminoácidos vía dos enlaces peptídicos, y así sucesivamente. Ejemplo: Pentapéptido
Se han identificado 20 -L-aminoácidos en las proteínas en donde la estructura de los aminoácidos sólo difiere en la naturaleza del grupo de la cadena lateral (R). Dependiendo de la naturaleza de la cadena lateral los aminoácidos se pueden clasificar en:
a) aminoácidos apolares b) aminoácidos polares neutros c) aminoácidos polares ácidos d) aminoácidos polares básicos
Los 20 aminoácidos estándares que se encuentran comúnmente en las proteínas se clasifican como esenciales
(indispensables) y no esenciales (dispensables). Sin embargo los términos esenciales y no esenciales pierden nitidez cuando el interés de clasificación se centra en el ámbito metabólico.
Por definición un organismo no puede sintetizar un aminoácido que sea esencial para su especie. En este sentido estricto la lisina y la treonina son los unicos aminoácidos esenciales para los humanos.
H2N
H
R
COOHC
Enlaces Peptídicos
H2N
H
R
C C
O
N
H
C
R
H
C
O
N C
H
R
H
C
O
N
H
C
R
H
C
O
N
H
C
H
R
COOH
Sin embargo, consideraremos esencial a aquellos aminoácidos que no pueden ser sintetizados por el organismo a la velocidad y en la cantidad requerida y deben ser suministrados en la dieta. En este contexto la lisina, treonina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalalina triptófano y valina. En el caso de los lactantes se debe agregar histidina, necesaria para el crecimiento, aunque algunos estudios señalan que la histidina tambien es esencial para el adulto.
Desde el punto de vista químico, las proteínas son polipéptidos de elevado peso molecular, cuya estructura
presenta varios niveles. La más básica o estructura primaria de una proteína se refiere al número e identidades de los aminoácidos que la componen y al ordenamiento o secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica. La estructura secundaria está referida a la forma regular en que están orientados los segmentos del esqueleto peptídico en el espacio formando espirales, hojas o esferoides compactos. La estructura terciaria es la forma en la cual la molécula entera de la proteína está enrollada para asumir su configuración tridimensional global y la estructura cuaternaria describe la forma en que se agrupan varias moléculas de proteínas (cadenas polipeptídicas) para formar grandes agregados estructurales.
Las proteínas se clasifican como fibrosas o globulares, dependiendo de sus estructuras secundarias y terciarias.
Las proteínas fibrosas son fuertes, rígidas e insolubles en agua, y en consecuencia, participan como los principales
componentes estructurales de tejidos animales, por ejemplo, la -queratina, el colágeno, la miocina, etc. Las proteínas globulares son solubles en agua, tienen forma casi esférica y son móviles dentro de las células, por lo tanto, presentan una variedad de funciones que tienen relación con la mantención y regulación del proceso de la vida, por ejemplo, la insulina, anticuerpos, albúmina, hemoglobina, etc.
En ciertas condiciones y frente a ciertos reactivos químicos se puede destruir la actividad biológica y la naturaleza
de una proteína,sin romper los enlaces peptídicos. Esto se conoce como desnaturalización. Estructuralmente, la desnaturalización es una desorganización de la proteína al destruirse las estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias.
Todas las proteínas desnaturalizadas tienen la misma conformación, muy abierta y con una interacción máxima
con el solvente, por lo que una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble y precipita. La desnaturalización se puede producir por agentes desnaturalizantes como: calor, radiación UV, radiación de microondas, solventes orgánicos, ácidos y bases fuertes, los detergentes o la agitación fuerte, sales de metales pesados (Hg
+2, Ag
+,
Pb+2
). La mayoría de las desnaturalizaciones son irreversibles, por ejemplo el huevo no recupera su forma original cuando disminuye la temperatura y la leche cuajada no vuelve a hacerse homogénea. Sin embargo, se han encontrado muchos casos en los cuales ocurre una renaturalización espontánea cuando se restablecen las condiciones naturales de la proteína, este es el caso de las enzimas. Reconocimiento de Proteínas a) Reacción de Biuret:Reconoce compuestos con dos o más uniones peptídicas y es una prueba general para identificar
la presencia de proteínas. Cuando la reacción es positiva se observa un cambio de color de celeste (color del reactivo de Biuret) a lila o morado claro.
b) Test del Azufre Reducido:Este test detecta proteínas con un alto contenido de azufre. Cuando la reacción es positiva
se observa que la solución de proteína se torna de color café.
c) Reacción del Ácido Xantoproteico:Esta reacción detecta proteínas con anillos bencénicos que a su vez estén asociados a grupos amino y/o hidroxilo, los cuales son fácilmente nitrados. Cuando la reacción es positiva se observa la aparición de un precipitado de color amarillo.
B) LÍPIDOS Los lípidos son moléculas orgánicas naturales, que se aíslan de células y tejidos por extracción con solventes orgánicos no polares. Los lípidos se definen por propiedades físicas (solubilidad) más que por su estructura molecular. Debido a que generalmente tienen grandes porciones de hidrocarburos en sus estructuras, los lípidos son insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos apolares.
Los lípidos más abundantes hallados en los organismos vivos son derivados del glicerol. Las grasas y aceites son triesteres del glicerol, es decir, triacilgliceroles (denominados a menudo triglicéridos). Las ceras son ésteres formados de ácidos carboxílicos (ácidos grasos) y alcoholes de cadena larga. Los terpenos son moléculas orgánicas relativamente pequeñas con una inmensa diversidad de estructuras; algunos son hidrocarburos, otros contienen oxígeno; algunos son de cadena abierta, otros contienen anillos. Los fosfolípidos son ésteres mixtos de glicerol en los que uno de los grupos hidroxilos del glicerol está esterificado con un resto de ácido fosfórico. Los esfingolípidos son derivados del amino glicerol, muy relacionados con los fosfolípidos. Debido a la diversidad de estructuras químicas que son incluidas en los lípidos, las funciones que ellas tienen son también múltiples. Así, por ejemplo, las ceras protegen la piel, el pelo y las plumas haciéndolas flexibles e impermeables. Un ejemplo, es la cera de abeja cuyo principal componente es el hexadecanoato de triacontilo. Los fosfolípidos se encuentran formando parte de la membrana celular de tejidos de plantas y animales. Los esteroides, constituyen otro grupo importante de lípidos, se encuentran ampliamente distribuidos en los tejidos corporales y tienen una gran variedad de actividades fisiológicas. En el cuerpo humano la mayoría de los esteroides actúan como hormonas. Los monoterpenos y sesquiterpenos se encuentran principalmente en las plantas, pero los terpenos mayores se encuentran tanto en plantas como en animales. Por ejemplo, el lanosterol es el precursor de todas las
hormonas esteroidales en la naturaleza, y el -caroteno es una importante fuente de vitamina A que abunda en algunos vegetales.
Las grasa animales y los aceites vegetales son los lípidos más abundantes. Aunque parecen diferentes, las grasas
animales son sólidas y los aceites vegetales son líquidos sus estructuras guardan íntima relación. Químicamente, las grasas y los aceites son triacilglicéridos, es decir, triesteres de glicerol. Los triacilgliceroles ricos en ácidos grasos insaturados como los ácidos oleicos y linoleicos, suelen ser aceites; mientras que los ricos en ácidos saturados, como los ácidos esteárico y palmítico, suelen ser grasas. La hidrogenación, adición de hidrógeno a algún doble enlace presente en la cadena carbonada del ácido graso no saturado, convierte los aceites vegetales en grasas.
La hidrólisis de una grasa o un aceite con hidróxido de sodio acuoso (saponificación) produce glicerol y tres sales
de ácidos grasos (jabón).
R
C
C
C
O
O
O
RCH2
CH2
O
O
O
CH R
(CH2)7CH CH(CH2)7CH3
H2, Presión
Calor
C
C
C
O
O
O
CH2
CH2
O
O
O
CH
(CH2)7CH2 CH2(CH2)7CH3
R'
R'
R'
Aceites Grasas
Triglicérido Glicerol Jabón
C
C
C
O
O
OR'
R
R''
CH2
CH2
O
O
O
CHNaOH
CH2
CH2
O
O
O
CH
H
H
H
C
O
C
O
R'
R''
+
C R
O
NaO
NaO
NaO
Los jabones son mezclas de sales de sodio y potasio de ácidos carboxílicos de cadenas largas (ácidos grasos). Estos compuestos ejercen su acción limpiadora debido a que los dos extremos de la molécula son muy diferentes. En el agua dura (agua rica en cationes de Mg
+2 y Ca
+2), los carboxilatos de sodio (solubles) se convierten en sales de estos cationes
(insolubles), lo cual ocasiona el percudido de la ropa blanca y el conocido depósito en forma de anillo en las bañeras. Los químicos han resuelto estos problemas sintetizando una clase de detergente basado en sales de ácidos alquilbencenosulfónicos de cadena larga. El principio por el cual operan estos detergentes es idéntico al principio de los jabones, sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en el caso de los jabones, los detergentes no forman sales insolubles de metales en el agua dura y no dejan el desagradable depósito.
II.- OBJETIVOS
Reconocer químicamente las proteínas.
Observar experimentalmente el fenómeno de desnaturalización de una proteína.
Observar experimentalmente algunas características de los lípidos.
Presencia de insaturación en grasas y aceites. III.- PARTE EXPERIMENTAL 1.- Reconocimientos de Proteínas
a) Reacción de Biuret: En cada tubo de ensayo limpio y seco, coloque 2,0 mL de solución de proteínas, adicione 2,0 mL de NaOH 3M, agite y agregue 2 gotas de reactivo de Biuret, agite nuevamente y observe.
b) Test del Azufre Reducido: A 2 mL de solución de proteína agregue 2,0 mL de NaOH6 M, caliente cuidadosamente
a la llama por 15 segundos, agregue 5 gotas de solución saturada de acetato de plomo. Si no observa cambios, caliente la mezcla suavemente por 15 segundos.
c) Reacción del Ácido Xantoproteico: A 2,0 mL de una solución de 30 gotas de HNO3 concentrado con mucho
cuidado, agite y observe.
d) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla.
Proteína (1 punta de espátula + 2,0 mL de agua destilada)
Biuret 1°: 2,0 mL de NaOH 3M 2°: 2 gotas de Biuret
Azufre reducido 1°: 2,0 mL de NaOH 6M y caliente 15 seg 2°: 5 gotas de acetato de plomo (II)
Xantoproteico (30 gotas de HNO3conc.)
Gelatina
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Caseína
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Jabón
C
O
O-Na+CH3(CH2)16
Detergente
O-Na+CH3
(CH2)16 O S
O
O
2.- Desnaturalización (denaturación) a) Acción del calor:En un tubo de ensayo adicione 2,0 mL de una solución de albúmina caliente en un mechero a fuego
suave hasta que hierva y observe.
b) Acción de Metales Pesados:En un tubo de ensayo adicione 2,0 mL de una solución de albúmina. Agregue 10 gotas de solución saturada de HgCl2 y observe.
c) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla.
Proteína (2,0 mL)
Acción del calor Adición de HgCl2
(10 gotas) Mejor desnaturalizante
albúmina
Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
3.- Insaturación de Lípidos a) En tubos de ensayo, secos y limpios, disuelva separadamente con 2 mL de diclorometano cantidades equivalentes de
ácido esteárico, ácido oleico y aceite de maravilla. BAJO CAMPANA agregue 5 gotas de solución de Reactivo de Bromo y observe.
b) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla:
Lípido (5 gotas o 1 puntita de
espátula)
Diclorometano (2,0 mL)
ANOTE COLOR INICIAL
Tubo anterior + Reactivo de Bromo
(5 gotas) ANOTE COLOR FINAL
Tipo de Lípido
ácido esteárico
ácido oleico
aceite de maravilla
4.- Jabones y Detergentes Sintéticos
a) En un tubo de ensayo disuelva una punta de espátula de jabón en 5,0 mL de agua destilada, agitando suavemente.
b) Separe esta solución (mezcla homogénea) en dos tubos de ensayo.
c) A uno de los tubos de ensayo adicione 5 gotas de HCl 3,0 M. Agite y observe.
d) Al otro tubo agregue 5 gotas de una solución saturada de CaCl2. Agite y observe.
e) Repita el procedimiento utilizando detergente en vez de jabón líquido. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla.
Muestra Una punta de espátula + 5 mL de agua destilada
HCl 3,0 M (5 gotas)
Solución saturada de CaCl2 (5 gotas)
Jabón Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
Detergente Observación: Conclusión:
Observación: Conclusión:
LABORATORIO Nº 3
ENZIMOLOGÍA
I. - INTRODUCCIÓN
A) ESPECTROFOTOMETRIA:
Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los 800 nm.
La energía de una onda electromagnética está dada por la ecuación: E = hν, donde h es la constante de Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ).
La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto número de enlaces conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz se denomina cromóforo.
Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como cromóforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solución se debe a la luz transmitida. La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación.
Leyes de la absorción de energía radiante
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución.
La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es:
A = ε l c
Donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada en moles por litro se denomina “coeficiente de extinción molar” y cuando es expresada en gramos por litro “coeficiente de extinción específico”. El término “l” representa el espesor de la capa absorbente y está en unidades de cm.
Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el término “l” de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que ε, es también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración:
A = k c (k = ε l).
La absorbancia es adimensional, presenta valores entre 0 y 2 unidades de absorbancia o densidad óptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer
Características de un espectrofotómetro La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro: Estos equipos contienen los siguientes componentes básicos:
Posee una fuente de luz capaz deemitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un diámetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida después de su paso por la celda es cuantificada por un detector.
Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relación entre ambos es:
A = 2 - log % T
La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.
100 80
% 60 Absorbancia Transmitancia 40
20
concentración (g/l) concentración (g/l) La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.
Curvas de calibración
Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica.
La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.
Ejemplo: curva de la Hemoglobina.
B) ENZIMAS:
La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos,
ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que
realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las
enzimas.
¿Qué es catálisis? ¿Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple:
A + B C + D
Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede
realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo a la misma velocidad.
Esto es lo que conocemos como equilibrioquímico y podemos expresar su constante de equilibrio:
Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se
acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los
catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar.
La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética
de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se
mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad
de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas
se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se
requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante:
A B* C
Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera:
B
D
A
CKeq
A
B*
C
Donde B* es el estado
de transición
En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la
energía de activación requerida sea menor:
Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato.
El cambio de Energía libre ó G, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y
el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado
energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los
mismos y el G es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado.
La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato
consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la
unidad de enzima como: “la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol (micro mol) de sustrato por
minuto bajo condiciones definidas”
Donde ESes la unión de
la enzima con el sustrato
A
C
ES
B*
E ACTIVACIÓN
En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas.
La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso.
Existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática, entre otros:
a) Concentración de enzima
b) Concentración sustrato
c) Temperatura
d) pH
e) Inhibidores
Efecto de la Concentración de enzima:
Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distinta concentraciones de
ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo los otros factores ambientales constantes
(temperatura y pH), se establece que la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la
enzima.
Efecto de la Concentración de Sustrato y velocidad de la reacción:
La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de Michaelis-Menten, la que
describe la relación entre la velocidad
de la reacción y la
concentración de sustrato:
Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k3 es insignificante y que lo importante son
los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la
reacción inversa, E + P ES, es también despreciable.
Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante:
Donde k1, k2 y k3 son constantes de velocidad.
1
32
k
kkKm
k1 k3
E + S ES E + P
k2
La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación:
Donde V = velocidad de la reacción; Vmax = velocidad máxima; [S] = concentración de sustrato; Km= constante
de Michaelis-Menten
Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una enzima, ya que
indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es inversamente proporcional a la fuerza de
unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo,
una alta afinidad.La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su sustrato.
Al graficar velocidad inicial versus concentración de sustrato se tendrá el siguiente gráfico:
Se pueden distinguir dos fases en la reacción.
• Una primera fase, en que la velocidad de la
reacción es directamente proporcional a la concentración de
sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas
concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no está
saturada de sustrato, de manera que si aumentamos la
concentración de sustrato, la velocidad aumenta.
• En la segunda fase, la velocidad de la reacción se
vuelve independiente de la concentración de sustrato, es decir,
es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por
el sustrato, de manera que aunque aumentemos la
concentración de sustrato, la velocidad se mantiene constante.
De este gráfico se desprende que la Km corresponde a
la concentración de sustrato a la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima.
Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una representación
lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos.
Lineaweaver-Burk, proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la
concentración de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico, también conocido como de grafico de los
Dobles Recíprocos.
Km
V
S
SV
max
Efecto de la temperatura en la Actividad Enzimática
En la mayoría de las reacciones químicas, un aumento de temperatura causa aumento en la velocidad de la
reacción, y por ende el número de colisiones efectivas entre las moléculas dado que aumenta la energía cinética de las
moléculas participantes de la reacción. Sin embargo, en el caso de las enzimas, hay que considerar su naturaleza
proteica, ya que se sabe que un aumento de temperatura produce desnaturalización de las proteínas, lo que se ve
traducido en un brusco descenso de la actividad enzimática.
Para cada enzima hay una temperatura óptima. Para la mayoría de las enzimas de los mamíferos, es de 37 ºC.
Para algunas enzimas microbianas, en particular para las bacterias termófilas, la temperatura óptima puede ser superior
a los 65ºC.
Efecto del pH en la Actividad Enzimática
Al igual que en el caso de la temperatura, las enzimas poseen un pH o un rango de pH óptimo, en el que su
actividad es máxima. Valores mayores o menores a este rango de pH provocan disminución de la actividad. Esto se
explica por el hecho de que algunos radicales de los aminoácidos cambian su polaridad a distinto pH, cambiando la
conformación de la proteína y de esta manera podemos afectar sitios que son críticos para la actividad enzimática.
El pH óptimo de la actividad de una enzima, refleja, generalmente, el ambiente celular en el cuál se encuentra la
enzima. Por ejemplo, la Pepsina que hidroliza algunos enlaces peptídicos de proteínas durante la digestión estomacal,
tiene un pH óptimo cercano a 1,6 (el rango de pH estomacal fluctúa entre 1 y 2). Por otra parte, la Glucosa- 6 - fosfatasa
del hepatocito, tiene un pH óptimo cercano a 7,8 (el pH intracelular del hepatocito es cercano a 7,2).
II.- OBJETIVOS
- Aprender a usar correctamente el espectrofotómetro - Conocer y aplicar los principios básicos de la espectrofotometría - Construir una curva de calibración - Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Invertasa.
III.- PARTE EXPERIMENTAL
A.- CURVA DE CALIBRACIÓN
1. Material de estudio
Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En
1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, la llamó Fermentinversif. Más
recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa.
El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos los monosacaridos glucosa y fructosa.
En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la
reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos.
2. Curva de Calibración (ó Curva Estándar)
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
Reactivos
TUBOS
1 2 3 4 5 6
Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5
Glucosa y Fructosa 0,05 M (producto)
- 0,2 mL 0,4 mL 0,8 mL 1,2 mL 1,5 mL
Sacarosa 0,6 M
1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Buffer Acetato 0,1 M 2,0 mL 1,8 mL 1,6 mL 1,2 mL 0,8 mL 0,5 ml
pH 4,7
3,5-DNS
2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
2) Agite los tubos para homogenizar las mezclas.
3) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en un baño a ebullición.
4) Enfríe los tubos.
5) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Para el uso del espectrofotómetro siga las siguientes instrucciones: 1. Encendido de lámparas: 1.1.- Lámpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo. 1.2.- Lámpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nmaprox), encienda el equipo 30 min antes de usarlo 2. Oprima la tecla MODE para accionar el modo absorbancia (A). 3. Ajuste la longitud de onda utilizando las flechas arriba o abajo. 4. Vierta una pequeña porción del blanco (Tubo de ensayo N°1) en una celda o cubeta. 5. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras. 6. Oprima la tecla 100 %T para llevar a cero absorbancia . 7. Saque el blanco y devuelva el líquido al tubo de ensayo. 8. Sacuda la cubeta sobre papel absorbente y vierta una pequeña porción del siguiente tubo de ensayo. 9. Inserte la muestra a medir en el portaceldas, cierre la puerta del compartimiento. 10. Lea la medición de absorbancia en la pantalla. 11. Repita el procedimiento desde el punto 7. Importante: las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas con papel corriente por el carácter abrasivo de éste, sino que con un papel suave. Anote las lecturas en la siguiente tabla:
CURVA DE CALIBRACIÓN Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5
Cantidad de Producto (mol) 0 10 20 40 60 75
Absorbancia
6) Grafique la Absorbancia versus cantidad de producto (curva de calibración), B.- EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
Reactivos TUBOS
1 1b 2 2b 3 3b
Buffer Acetato 0,1 M pH 4,7 1 mL 2 mL 1 mL 2 mL 1 mL 2 mL
Sacarosa 0,6 M 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Invertasa (agite los tubos) 1 mL - 1 mL - 1 mL -
Temperatura de Incubación (5 minutos) Hielo Ambiente Ebullición
2) Registre la temperatura de cada sistema de incubación (hielo, ambiente y de ebullición).
3) Transcurridos los 5 minutos de incubación, adicione 2 mL de 3,5-DNS a cada uno de los tubos y agitelos.
4) Coloque los tubos de ensayo en un baño a ebullición por 5 minutos para que se desarrolle el color y luego enfríe los tubos de ensayo.
5) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en el espectrofotómetro a 540 nm.
6) Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo “blanco” (tubo 1b)
7) Mida la absorbancia del tubo 1y anote la lectura en la tabla correspondiente.
8) Repita el procedimiento 6) y 7) para las otras temperaturas. Debe ir cambiando los blancos cada vez que mida una nueva temperatura.
9) Anote las lecturas en la siguiente tabla.
1 2 3
Absorbancia 00000
00000
10) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración (práctico N°3 primera parte) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla:
Temperatura Agua Hielo: Ambiente: Ebullición:
Cantidad Producto (µmol)
11) Grafique temperatura versus Producto.
12) Determine el efecto de la temperatura sobre la actividad de la Invertasa
LABORATORIO Nº 4
GLUCOGENÓLISIS I.- INTRODUCCIÓN
La molécula de Hidrato de Carbono más importante desde el punto de vista fisiológico es la Glucosa, la cual se clasifica como monosacárido del tipo polihidroxialdehido de baja masa molecular, químicamente corresponde a una aldohexosa, es decir, está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el carbono uno. En solución acuosa, el grupo carbonilo y los grupos hidroxilo de la glucosa reaccionan intramolecularmente para formar una estructura cíclica de 5 miembros denominada piranosa.
Los monosacáridos pueden unirse para formar estructuras mayores, ya sean disacáridos (2 unidades), oligosacáridos (cadenas cortas de unidades) o polisacáridos (cadenas de más de 10 unidades); en todos ellos estas uniones corresponden a enlaces glicosídicos (químicamente grupo funcional éter).
La glucosa forma varios tipos de polisacáridos que se diferencian estructuralmente, lo que deriva en que cumplen
diversas funciones:
Forman parte de los tejidos de sostén de plantas y animales.
Constituyen una fuente importante de energía.
OH
CH2OH
HOOH
OH
O O
OH
OHHO
CH2OH
OH
-D-Glucopiranosa -D-GlucopiranosaGlucosa
CHO
CH2OH
H
H
H
H
OH
OH
OH
HO
Estructura HaworthEstructura FischerEstructura Haworth
HOOH
OH
CH2OH
O
Sacarosa
O
HOCH2
OH
HOCH2OH
O
Maltosa
O
CH2OH
HOOH
OH
O
(H,OH)
CH2OH
OH
OH
O
EnlacesGlicosídicos
Con respecto a está última función encontramos el glucógeno; polisacárido formado por varias cadenas que
contienen de 12 a 18 unidades de D-glucosas unidas mediante enlaces glicosídicos (1,4); uno de los extremos de esta
cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace (1,6). Una sola molécula de glucógeno puede contener más de 120.000 unidades de glucosa.
Los principales lugares destinados para la reserva de glucógeno en animales son el Hígado que puede almacenar
aproximadamente 70 g (280 Kcal) de glucógeno y los Músculos Esqueléticos que pueden contener hasta 400 g (1600 Kcal). Sin embargo, este contenido fluctúa notablemente como consecuencia de la alimentación y de los estímulos hormonales, entre otras causas.En el hígado, el glucógeno tiene como función mantener el nivel de glucosa en la sangre (glicemia) constante.En los músculos, el glucógeno se utiliza para abastecer de energía (ATP) al proceso de contracción muscular. Debido a la estructura tan ramificada del glucógeno, permite la obtención de moléculas de glucosa libre en el momento que se necesiten; éste proceso se denomina Catabolismo del Glucógeno o Glucogenólisis. Para llevar a cabo este proceso se requiere la acción combinada y secuencial de 3 enzimas:
Glucógeno Fosforilasa
Enzima Desramificante del Glucógeno
Fosfoglucomutasa
Glucógeno Fosforilasa: Cataliza la denominada Escisión Fosforolítica de los enlaces glicosídicos (1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la reacción siguiente
n (Glucosa) +Pi n-1 (Glucosa) + Glucosa-1-P Enzima Desramificante del Glucógeno: La glucógeno fosforilasa, no puede degradar los enlaces glicosídicosα(1-6) por lo tanto es la enzima desramificante la encargada de realizar dicha función. Fosfoglucomutasa: Se encarga de transformar la Glucosa-1-P en Glucosa-6-P. Esta es una reacción reversible.
Glucosa-1-P Glucosa-6-P Para poder ser liberada al torrente sanguíneo y de este modo regular la glicemia, la Glucosa-6-P debe ser
desfosforilada, o sea, debe perder el grupo fosfato, para obtener una glucosa libre mediante la enzima Glucosa-6-fosfatasa, presente sólo en el hígado.
Glucosa-6-P + H2O Glucosa +Pi
En resumen, la regulación del metabolismo del glucógeno en el hígado, se lleva a cabo a través de la concentración de glucosa extracelular. Para mantener la glicemia, el hígado actúa como dador o captador de glucosa, dependiendo de los niveles extracelulares de ella.
Las enzimas claves para la regulación de la glicemia son la Glucógeno Fosforilasa y la Glucógeno Sintetasa, ambas enzimas se comportan de acuerdo a la acción de dos hormonas secretadas por el páncreas: el Glucagón y la Insulina que actúan dependiendo de si el organismo se encuentra en condición de hipoglicemia o hiperglicemia. Cuando el nivel de glucosa en la sangre es bajo (hipoglicemia), el glucagón producido por el páncreas activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado liberando glucosa al torrente sanguíneo con lo que su concentración aumenta. Por el contrario, cuando el nivel de glucosa sanguínea es alto (hiperglicemia), la insulina producida también en el páncreas activa la acción de la glucógeno sintetasa que estimula la síntesis de glucógeno por lo que la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye.
La disponibilidad de glucosa es esencial para que la célula pueda realizar correctamente su metabolismo energético. Así, el mantenimiento de una concentración adecuada de glucosa es crucial para el organismo.
Un individuo adulto requiere de unos 500 g de hidratos de carbono al día. El glucógeno ingerido en la dieta es degradado en el tubo digestivo por enzimas hidrolíticas, y contribuye de esta manera a los requerimientos energéticos celulares. Frente a una dieta rica en hidratos de carbono, se promueve la acumulación de glucógeno hepático y muscular.
II.- OBJETIVOS - Reconocer el efecto de una dieta rica en hidratos de carbono sobre la acumulación de glucógeno hepático en ratas. - Comparar los niveles de glucógeno hepático en ratas sometidas a una dieta rica en hidratos de carbono y en ayuna con respecto a ratas controles. - Determinación de Glucógeno por su reacción con Yodo. III.- PARTE EXPERIMENTAL A.- CURVA DE CALIBRACION (ó Curva Estándar) Procedimiento: a) Desarrolle el siguiente protocolo:
- A partir de una solución stock de glucógeno de concentración 0,4 mg/mL realice las diluciones indicadas en la siguiente tabla:
Reactivos
TUBOS
1 2 3 4 5 6
Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5
Glucógeno
(0,4 mg/mL) ----- 0,5 mL 1,0 mL 1,2 mL 1,5 mL 2,0 mL
H2O destilada
2,0 mL 1,5 mL 1,0 mL 0,8 mL 0,5 mL -----
Solución de Yodo
(Lugol) 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota
b) Homogenice las soluciones. c) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda, utilice el tubo Nº 1 (blanco) para calibrar el equipo a cero. d) Anote las lecturas en la siguiente tabla:
CURVA DE CALIBRACIÓN Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5
Glucógeno (mg/mL)
0,10 0,20 0,24 0,30 0,40
Absorbancia
f) Realice un gráfico (curva de calibración) de Absorbancia versus concentración de glucógeno.
B.- DETERMINACION DE GLUCOGENO HEPATICO EN RATAS 1. Animales de experimentación
Se utilizaron 3 ratas, las cuales se mantuvieron con pellet comercial y agua ad libitum (libre disposición), a 25º C. 2. Dietas
Una de las ratas fue mantenida con dieta glucídica. Para ello, fue alimentada durante los últimos 6 días anteriores a la toma de muestra, con pellet comercial y el agua fue reemplazada por una solución de azúcar al 59% (p/v). La otra fue mantenida en ayuna durante 3 días y agua ad libitum. La tercera rata fue mantenida con dieta normal, es decir, alimentada con pellet comercial y agua ad libitum por un período de 6 días. 3. Obtención de muestras
Cada uno de los animales fue anestesiado con éter; luego, se les extrajo el hígado. Estos tejidos fueron homogenizados independientemente en un mortero con arena y con aproximadamente 300 mL de Ácido tricloro-acético al 5% p/v.
Cada homogenizado fue centrifugado a 3.000 rpm por 10 min. Luego cada sobrenadante fue filtrado sobre papel filtro y rotulado como filtrado I, II y III.
4. Determinación de glucógeno por método de Yodo 1. Rotule cuatro tubos de ensayo con los números 0, 1, 2 y 3 2. Al tubo 0 adicione 2 mL de agua destilada (Blanco) 3. Al tubo 1 agregue 2,0 mL del filtrado I 4. Al tubo 2 agregue 2,0 mL del filtrado II 5. Al tubo 3 agregue 2,0 mL del filtrado III 6. Adicione a cada tubo de ensayo 1 gota del reactivo de yodo, agite suavemente. 7. Lea la Absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro a 540 nm y complete la siguiente tabla:
Tubo N° 1 2 3
Absorbancia
8. Con los datos anteriores, interpole los valores de Absorbancia en la curva de calibración confeccionada en la primera parte de este laboratorio, para obtener la concentración de glucógeno y complete la siguiente tabla:
1 2 3
Glucógeno(mg/mL)
9. Deduzca, según los resultados obtenidos, el tipo de dieta a la que fue sometida cada rata y cual le corresponde a cada
filtrado:
Filtrado I: ________________________________________ Filtrado II: _______________________________________
Filtrado III: _______________________________________
LABORATORIO Nº 5
COLESTEROL
I.- INTRODUCCIÓN Las grasas (o lípidos) son los compuestos con los que el cuerpo humano almacena energía para las épocas de carencia.Evolutivamente, el cuerpo humano es “almacenador de energía”, es decir, está diseñado para acumular parte de la energía que absorbe por los alimentos para épocas de ayuno. La forma más eficaz de almacenar esta energía es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo que en poco peso de grasa se puede acumular mucha energía. El colesterol es una grasa presente en todas las células del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la médula espinal, páncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en el hígado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50% de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hígado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal presentes en la dieta.
En la molécula de colesterolestructuralmente, se puede distinguir una cabeza polar constituida por el grupo hidroxilo y una cola o porción apolar formada por los distintos ciclos y los sustituyentes alifáticos. Así, el colesterol es una molécula hidrofóbica que al igual que otros lípidos es bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo, acetona y éter. Considerando lo anterior, cualquier método de extracción de lípidos requiere utilizar mezclas de solventes orgánicos que permitan solubilizar todos los lípidos y precipiten proteínas e hidratos de carbono para su mejor separación. Los organismos mamíferos obtienen colesterol a través de dos vías:
Vía exógena o absorción de colesterol contenido en los alimentos. El colesterol se encuentra exclusivamente en alimentos de origen animal, mayoritariamente en la yema de huevo, hígado, lácteos, cerebro (sesos) y músculo esquelético (carnes rojas).
Vía endógena o síntesis de colesterol en las células animales a partir de su precursor, el acetato, en su forma activada acetil-coenzima A.
La producción de colesterol es regulada directamente por la concentración del colesterol presente en las células,
habiendo una relación inversa con los niveles plasmáticos de colesterol. Una alta ingesta de colesterol en los alimentos conduce a una disminución neta de la producción endógena y viceversa.
El colesterol es necesario en el organismo porque es imprescindible para la vida por numerosas funciones: •Forma parte de la membrana de cada una de las células del organismo permitiendo o no el paso de sustancias y
participando en procesos fisiológicos relacionados con ella. •Es el componente básico de las sales biliares que tienen como función principal ayudar a la digestión de las
grasas, sin ellas se produce un síndrome de malabsorción. •Es precursor de hormonas importantes como las corticosteroideas: cortisol y aldosterona que entre otras cosas
regulan el contenido de agua y de sales en el organismo. •Es precursor de hormonas sexuales como progesterona, testosterona y estrógenos que permiten el desarrollo
de los caracteres sexuales y la fertilidad. •Es parte de la vitamina D que deriva del colesterol y participa fundamentalmente en el metabolismo del calcio.
El colesterol para poder cumplir con todas estas funciones debe ser transportado a todo el organismo, esto se realiza a través de sustancias llamadas “lipoproteínas”. Las lipoproteínasestán formadas por una parte proteica y una parte lipídica compuesta por distintos tipos de grasas.Existen varios tipos de lipoproteínas en función del contenido proteico y lipídico que presentan. Los dos tipos de lipoproteínas que contienen colesterol son:
Lipoproteínas de alta densidad (HDL) compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoA. También denominado colesterol bueno, porque transportan el exceso de colesterol desde los tejidos hasta el hígado.
Lipoproteínas de baja densidad (LDL)compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoB. También conocido como elcolesterol malo, responsable de la aterosclerosis, o acumulación del colesterol en la pared de las arterias. Es la forma en que el organismo recoge el colesterol del hígado (donde lo sintetiza) y lo distribuye a los tejidos. El 70% del colesterol que circula por la sangre lo hace en forma de LDL-colesterol.
De esta manera, la existencia sostenida de niveles elevados de colesterol LDL por encima de los valores
recomendados, incrementa el riesgo de sufrir eventos cardiovasculares (principalmente infarto de miocardio agudo). De manera interesante, el colesterol presente en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) ejercería un rol protector del sistema cardiovascular.
La aterosclerosis es un fenómeno muy complejo, que comienza en las primeras etapas del desarrollo y se prolonga durante años. Consiste en el depósito de células cargadas de partículas de LDL-colesterol en las paredes de las arterias. Esta pared responde a la agresión induciendo una respuesta protectora, que finalmente conduce a la formación de una placa. Con el paso del tiempo, la placa aumenta de tamaño, hasta que estrecha la arteria dificultando la circulación de la sangre. Por otra parte, la placa también se puede romper, originando un trombo que puede obstruir completamente la arteria. El final del proceso es que el corazón se ve privado de oxígeno y nutrientes por lo que se produce una angina o infarto al miocardio.
La aterosclerosis está directamente relacionada con la concentración de partículas de LDL-colesterol presentes en la sangre, por lo que la prevención pasa por disminuir al máximo el nivel de LDL y aumentar el HDL-colesterol, que es el que retira el colesterol circulante y lo devuelve al hígado.
La forma de conseguir estos objetivos es adoptar hábitos de alimentación adecuada, realizar ejercicio físico habitualmente y cuando esto no es suficiente, se debe recurrir a fármacos específicos.
La concentración actualmente aceptada como normal de colesterol en el plasma sanguíneo llamada
colesterolemia de individuos sanos es de 150 a 200 mg/dL. (1 dL = 100 mL). Se ha definido clínicamente que los niveles de colesterol plasmático total (suma de colesterol presente en todas
las clases de lipoproteínas) recomendados por la Sociedad Norteamericana de Cardiología (AHA) son:
Colesterolemia por debajo de 200 mg/dL: es la concentración deseable para la población general, pues por lo general correlaciona con un bajo riesgo de enfermedad cardiovascular.
Colesterolemia entre 200 y 239 mg/dL: existe un riesgo intermedio en la población general, pero es elevado en personas con otros factores de riesgo como diabetes.
Colesterolemia mayor de 240 mg/dL: puede determinar un alto riesgo cardiovascular y se recomienda iniciar un cambio en el estilo de vida, sobre todo en lo concerniente a la dieta y al ejercicio físico.
II.- OBJETIVOS - Determinación de colesterol presente en una muestra de plasma sanguíneo.
III.- PARTE EXPERIMENTAL A.- CURVA DE CALIBRACION 1. Preparación Patrones: Procedimiento:
a) A partir de una solución estándar de colesterol de concentración 300 mg/dL prepare los siguiente patrones, realizando las diluciones indicadas en la tabla:
Reactivos
TUBOS
Solución Patrón A
Solución Patrón B
Solución Patrón C
Solución Patrón D
Volumen de solución estándar (µL) 400 650 850 1000
Volumen de etanol(µL) 600 350 150 0
b) Tape los tubos con papel parafilm y homogenice suavemente los tubos por inversión.
2. Preparación curva de calibración:
Procedimiento:
a) A continuación prepare los siguientes tubos utilizando los patrones preparados en el paso anterior.
TUBOS
Blanco 1 2 3 4
Solución Patron ----- 20 µL Patron A 20 µL Patron B 20 µL Patron C 20 µL Patron D
Etanol 20 µL ----- ----- ----- -----
Reactivo CHOD-PAP 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
b) Tape los tubos con papel parafilm y homogenice las muestrasinvertiendo el tubo de ensayo. c) Espere 10 minutos para que se desarrolle el color. d) Ajuste a cero el espectofotómetro a 500 nm con el tubo blanco. e) Lea la Absorbancia del resto de los tubos en el espectrofotómetro a la misma longitud de onda y complete la
siguiente tabla:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Concentración colesterol (mg/dL) 120 195 255 300
Absorbancia (500 nm)
f) Dibuje una curva de calibración, graficando Absorbancia v/s Concentración de coleterol (mg/dL).
B.- ANALISIS DE UNA MUESTRA DE PLASMA SANGUINEO 1.- Análisis de una muestra mediante el método de CHOD-PAP:
a) Anote el número de su muestra de plasma.Muestra Nº _________ b) Rotule tres tubos de ensayo, blanco (B), muestra (M) y contramuestra (CM). c) A continuación adicione 20 µL de etanol al tubo B; 20 µL de muestra de plasma sanguíneo al tubo M y 20 µL de
muestra de plasma sanguíneo al tubo CM d) Agregue atodos los tubos de ensayo 2 mL del reactivo CHOD-PAP, tape con papel parafilm y homogenice por
inversión. e) Espere 10 minutos para que se desarrolle el color. f) Ajuste a cero el espectrofotómetro a 500nm con el tubo blanco y lea la Absorbancia de la muestra y
contramuestra completando la siguiente tabla:
Muestra (M) Contramuestra (CM)
Absorbancia (500 nm)
g) Con los datos anteriores, determine la concentración de colesterol que presenta su muestra y contramuestra
utilizando la curva de calibración h) Regístre los datos obtenidos en la siguiente tabla:
Muestra Contramuestra
Concentración colesterol(mg/dL)
i) Según sus conocimientos previos acerca de la colesterolemia, y los resultados obtenidos ¿Cuál es la condición
médica del paciente?
PRUEBA DE COMPETENCIA EXPERIMENTAL TEÓRICA
La prueba de competencia experimental teórica corresponde a una prueba escrita individual, que contempla la evaluación final de los contenidos teóricos y experimentales de los laboratorios 1, 2, 3, 4 y 5. La hora y sala serán informados y publicados por el profesor de laboratorio una semana antes. Deben presentarse sin delantal, calculadora y con lápiz pasta. La duración de la prueba es de 1 hora.
La inasistencia debe ser justificada en un plazo máximo de 24 horas directamente al profesor de laboratorio, a fin de programar una fecha recuperativa de ésta. La ausencia no justificada, en el plazo establecido, implica la nota mínima (1,0) para la prueba de competencia experimental teórica, sin tener derecho a reclamos posteriores.
PRUEBA DE COMPETENCIA EXPERIMENTAL PRÁCTICA
La prueba de competencia experimental práctica corresponde a un informe escrito del desarrollo de una actividad práctica grupal, que involucra los conocimientos teóricos y prácticos de los laboratorios 3, 4 y 5. Deben presentarse con delantal, calculadora y lápiz de pasta. La prueba de competencia experimental tiene una duración de 45 minutos.
La inasistencia debe ser justificada en un plazo máximo de 24 horas directamente al profesor de laboratorio, a fin de programar una fecha recuperativa de ésta. La ausencia no justificada, en el plazo establecido, implica la nota mínima (1,0) para la prueba de competencia experimental práctica, sin tener derecho a reclamos posteriores.