manual de guías de laboratorio de bioquímica 2013 b

1 MANUAL DE GUIacuteAS DE LABORATORIO DE Bioquiacutemica 2013-B Profesor LUIS JAVIER NARVAacuteEZ ZAMORA

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES

BIOQUIacuteMICA

Profesor LUIS JAVIER NARVAacuteEZ ZAMORA

Praacutectica de laboratorio No 1 Uso y Calibracioacuten de Micropipetas Objetivo Medir voluacutemenes precisos mediante el uso de micropipeta Calibrar una micropipeta Marco teoacuterico Una micropipeta es un dispositivo disentildeado para medir voluacutemenes muy pequentildeos de liacutequidos con un alto nivel de precisioacuten tales liacutequidos no deben atacar el polipropileno o el policarbonato materiales de los cuales estaacute construido el dispositivo de medida por igual no pueden usarse liacutequidos con elevadas presiones de vapor En cualquier caso el volumen de liacutequido a medir JAMAS debe tocar el cono de polipropileno de acoplamiento para puntas CUALQUIER CANTIDAD DE DISOLUCIOacuteN PRESENTE EN EL INTERIOR DE LA MICROPIPETA DATERIORA EL SISTEMA DE MEDIDA En ninguacuten caso se debe dejar la micropipeta en posicioacuten horizontal mientras tenga alguacuten liacutequido en la punta La micropipeta posee un sistema con cojiacuten de aire para el pipeteado de soluciones acuosas con densidad media y viscosidad baja a media siempre y cuando se lo utilice bajo las siguientes limitaciones ndash +15 degC a +40 degC (de aparato y reactivos pueden obtenerse otras temperaturas si asiacute se desea) presioacuten de vapor de hasta 500 mbar y viscosidad 260 mPas Brand 2012 p 66 Los liacutequidos viscosos y humectantes pueden afectar a la exactitud del volumen por igual los liacutequidos cuya temperatura difiera en maacutes de plusmn1 degC de la temperatura ambiente La micropipeta en referencia permite medir entre 100 y 1000 microlitros (aunque los topes

inferior y superior son de 28 y 1108 L respectivamente) Descripcioacuten de la micropipeta A continuacioacuten en la graacutefica No 11 se muestra una fotografiacutea Brand 2012 donde se

sentildealan las partes de una micropipeta para este caso de 100 ndash 1000 L


Graacutefica No 11 Descripcioacuten de la micropipeta de 0 a 1000 L

Eyector de puntas


Procedimiento

Una vez insertada la punta apropiada en el cono de acoplamiento esta se debe enjuagar con el liacutequido a transferir de acuerdo la Norma ISO 8655 El proceso de micropipeteado se describe en tres momentos aspirar la disolucioacuten transferirla y expulsar la punta a saber Aspirar el reactivo 1 Seleccionar el volumen a transferir utilizando el selector de volumen si al intentar girarlo este se resiste es necesario mover hacia arriba el seguro de proteccioacuten contra cambio de volumen tal como se muestra en la graacutefica No 12

Graacutefica No 12 Definicioacuten del volumen a transferir

Ahora girarlo por ejemplo hasta 48 L y baja el seguro de proteccioacuten contra cambio de volumen tal como lo muestra la graacutefica No 13

Graacutefica No 13 Activacioacuten del seguro contra cambio de volumen

Sumerge la punta 2 a 3 miliacutemetros en el liacutequido a transferir presiona el pulsador de pipeteado hasta el primer tope tal como se indica en la graacutefica No 14

Seguro de proteccioacuten contra cambio de volumen desactivado

Seguro de proteccioacuten contra cambio de volumen activado

Pulsador de pipeteado


Graacutefica No14 Aspirando la muestra Ahora sin sacar la punta del liacutequido a transferir suelta lentamente el pulsador de pipeteado para aspirar el liacutequido dejando la punta sumergida durante 1 o 2 segundos para permitirle al equipo la succioacuten precisa de liacutequido tal como se ilustra en la graacutefica No 15

Graacutefica No 15 Aspirando la muestra

Expulsar el reactivo Para expulsar el volumen medido saca la micropipeta de la disolucioacuten permitiendo un ligero toque de la punta con la pared del recipiente ahora apoya la punta en la pared del recipiente donde va a transferirse el volumen medido con un aacutengulo de 30o a 45o y presiona lentamente el pulsador de pipeteado con velocidad uniforme hasta el primer tope y mantenerlo asiacute tal como se muestra en la graacutefica No 16

Graacutefica No 16 Expulsioacuten del volumen medido

Luego presiona el pulsador de pipeteado hasta el segundo tope para vaciar completamente la punta y durante este tiempo escurre la punta de la pipeta contra la


pared del recipiente deslizaacutendola una distancia de aproximada de 10 mm tal como se indica en la graacutefica No 17

Graacutefica No 17 Expulsando el volumen medido Expulsar la punta Una vez efectuadas todas las mediciones pertinentes debes expulsar la punta para ello presiona hacia abajo el expulsor hasta el tope momento en el cual la punta plaacutestica sale eyectada al sitio de su almacenamiento y posterior desecho tal como se muestra en la graacutefica No 18 Graacutefica No 1 8 Expulsioacuten de la punta La norma ISO 8655 prescribe que la punta de la pipeta antes del proceso de pipeteado propiamente dicho debe enjuagarse con el liacutequido de la muestra iexclNo colocar nunca el aparato con la punta llena en posicioacuten horizontal Esta accioacuten introduciriacutea el liacutequido en el interior del mismo contaminaacutendolo e iniciando su deterioro Referencias Brand 2012 Transferpette S Documento consultado el 9 de agosto de 2012 3n httpwwwbranddefileadminuserpdfGAGA_Transferpette_S_DE-EN-FR-ES-ITpdf



QUIacuteMICA GENERAL


Praacutectica de Laboratorio No 2 Medicioacuten de Concentracioacuten de Disoluciones por Espectrofotometriacutea

Objetivos Calcular por espectrofotometriacutea Uv-Vis la concentracioacuten de algunas disoluciones problema a partir de disoluciones estaacutendar Materiales y Reactivos 2 Matraz aforado de 250 mL 3 matraces aforados de 10 mL 3 Mtraces aforados de 25 mL 1 pH-metro digital 1 gradilla para tubos de ensayo 5 tubos de ensayo de 15x150mmm 1 balanza analiacutetica 1 vidrio de reloj 1 espaacutetula metaacutelica 1 pipeta volumeacutetrica de 10 mL indicador de azul de bromotimol (solucioacuten alcohoacutelica al 04 pv) NaOH en perlas grado analiacutetico HCl concentrado grado analiacutetico Muestra problema aacutecida Muestra problema baacutesica Espectrofotoacutemetro Uv-Vis Procedimiento Soluciones Baacutesicas 1 Preparar 250 mL de NaOH 01M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro Espectrofotometrear en la zona visible del espectro electromagneacutetico para determinar la zona de absorbancia oacuteptima Configurar la medicioacuten para que el equipo muestre e imprima la curva de calibracioacuten 2 Repetir la lectura usando esta vez la longitud de onda apropiada 3 A partir de la disolucioacuten del punto anterior preparar 10 mL de NaOH 001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia 4 A partir de la disolucioacuten del punto 2 o del punto 1 preparar 10 mL de NaOH 0001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia 5 A partir de la disolucioacuten del punto 2 o del punto 1 preparar 10 mL de NaOH 00001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia


6 Con los datos obtenidos completar la siguiente tabla Longitud de onda oacuteptima______nm

Disolucioacuten NaOH pH praacutectico pH teoacuterico A

01 M

001 M

0001 M

00001 M

7 Con los datos obtenidos durante el desarrollo de la praacutectica elaborar una curva de calibracioacuten extrapolando absorbancia contra concentracioacuten 8 Medir la absorbancia de la muestra baacutesica entregada a cada grupo Utilizando los datos de la tabla anterior calcular la concentracioacuten de la disolucioacuten problema Disoluciones Aacutecidas Procedimiento 1 Preparar 250 mL de HCl 01M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro Espectrofotometrear en la zona visible del espectro electromagneacutetico para determinar la zona de absorbancia oacuteptima Configurar la medicioacuten para que el equipo muestre e imprima la curva de calibracioacuten 2 Repetir la lectura usando esta vez la longitud de onda apropiada 3 A partir de la disolucioacuten del punto anterior preparar 10 mL de HCl 001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia 4 A partir de la disolucioacuten del punto 2 o del punto 1 preparar 10 mL de HCl 0001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia 5 A partir de la disolucioacuten del punto 2 o del punto 1 preparar 10 mL de HCl 00001M Trasvasar 4 mL de esta disolucioacuten a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotoacutemetro y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima de absorbancia 6 Con los datos obtenidos completar la siguiente tabla

Disolucioacuten HCl pH praacutectico pH teoacuterico A

01 M

001 M

0001 M

00001 M

7 Con los datos obtenidos durante el desarrollo de la praacutectica elaborar una curva de calibracioacuten extrapolando absorbancia contra concentracioacuten 8 Medir la absorbancia de la muestra aacutecida entregada a cada grupo Utilizando los datos de la tabla anterior calcular la concentracioacuten de la disolucioacuten problema


Cuestiones 1 Elaborar una tabla con por lo menos 10 indicadores aacutecido base donde se involucre los cambios de color de acuerdo con el pH 2 Escribir las estructuras moleculares de por lo menos 5 indicadores colorimeacutetricos empleados con frecuencia en titulaciones por neutralizacioacuten Referencias Brown T L LeMay H E Bursten B E y Burdge J R 2004 Quiacutemica La Ciencia Central 9ordf edicioacuten Meacutexico Pearson Educacioacuten McMurray J E y Fay R C 2009 Quiacutemica General- 5a edicioacuten Meacutexico Pearson Prentice Hall Petrucci R H Harwood W S y Herring 2008 Quiacutemica General 8a edicioacuten ultima reimpresioacutenMadrid Pearson Prentice Hall Rubinson J F y Rubinson K A Quiacutemica Analiacutetica Contemporaacutenea 2007 Meacutexico Pearson Educacioacuten



BIOQUIacuteMICA


Praacutectica de laboratorio No 2 Titulacioacuten Aacutecido-Base con Bureta Digital

Objetivo Determinar la concentracioacuten de una disoluciacuteon problema mediante titulacioacuten con NaOH 05M Materiales Y Reactivos 1 bureta digital de 50 mL 1 pH-metro digital 2 erlenmeyer de 250 mL 2 matraces aforados de 250 mL 1 balanza analiacutetica 01 mg 1 agitador magnetico 1 espaacutetula metaacutelica fenolftaleina solucioacuten alcohoacutelica NaOH Disolucioacuten acida problema Marco Teoacuterico Para empezar se hace necesario describir los componentes y funciones de una bureta digital este utensilio de nueva generacion disentildeado para medir volumenes precisos de disoluciones en forma de goteo asistido por un sistema electroacutenico Con respecto a la bureta convencional de vidrio con llave del mismo material o de tefloacuten permite ademaacutes de medir voluacutemenes precisos efectuar recargas del titulante de manera faacutecil y raacutepida con el subsecuente ahorro de tiempo sin sacrificio de precisioacuten La precisioacuten del equipo se clasifica dentro los liacutemites de errror de clase A Esta condicioacuten se obtiene gracias a las funciones incorporadas las cuales se describern a continuacioacuten Al mantener presionada la tecla CLEAR ubicada en la parte superor de la bureta se accede a 4 funciones diferentes a saber

1 Ajustes con Easy Calibration Para acceder a esta teacutecnica denominada Easy Calibration basta con encender la bureta y oprimir durante 5 segundos la tecla CLEAR Estos ajustes se efectuacutean cuando el equipo se use durante periodos largos de tiempo o cuando se cambien piezas El usuario visualiza el ajuste en el visor de forma permanente tal como se muestra en la graacutefica No 21

Graacutefica No 21 Ajuste de la calibracioacuten


2 Preseleccioacuten de la fecha de calibracioacuten Para recordar la fecha de la proacutexima calibracioacuten de forma segura simplemente se almacena en la posicioacuten GLP Se puede acceder a la fecha de calibracioacuten cada vez que se conecta el aparato Para ello mantener presionada la tecla ConectarDesconectar (OnOff)durante un corto tiempo Se visualizaraacute uno tras otro la GLP el antildeo y el mes de la fecha indicada tal como se ilustra en la graacutefica No 22

Graacutefica No 22 Calibracioacuten de la fecha de calibracioacuten

2 Ahorro de energiacutea con Auto-Power-Off Durante interrupciones prolongadas de utilizacioacuten el aparato se desconecta automaacuteticamente El valor de la indicacioacuten actual se almacena y despueacutes de la reconexioacuten manual vuelve a visualizarse En la posicioacuten ldquoAPOrdquo (Auto-Power-Off) puede ajustar el tiempo hasta la desconexioacuten automaacutetica desde 1 hasta 30 minutos tal como se ilustra en la graacutefica No 23 Graacutefica No 23 Uso del sistema de ahorro de energiacutea Seleccioacuten de cifras decimales Para la utilizacioacuten como microbureta en la posicioacuten dP(decimal point) es posible conmutar la indicacioacuten del volumen valorado de 2 a 3 cifras decimales A partir de 2000 mL se visualizan 2 cifras decimales automaacuteticamente Con la bureta acoplable a frascos Titrettereg se pueden realizar valoraciones gota a gota con gran sensibilidad y maacutexima precisioacuten Esta funcioacuten es importante para todos los usuarios quienes requieren trabajar con buretas de vidrio dentro de los liacutemites de error de la clase A seguacuten DIN EN ISO 385 (pej en la industria farmaceacuteutica) Si fuera necesario con 3 cifras decimales hasta 20 mL A continuacioacuten en la tabla 11 se muestran los liacutemites de error de la bureta digital comparados con aquellos de la bureta de vidrio tipo A


Tabla No 11 Liacutemites de error de la bureta digital

Limitaciones de empleo Para obtener mediciones con gran precisioacuten se deben tener en cuenta los siguientes paraacutemetros Temperatura= +15 degC a +40 degC (59 degF a 104 degF) tanto del aparato como del reactivo Presioacuten de vapor hasta 500 mbar Viscosidad hasta 500 mm2s Altitud maacutexima de trabajo 3000 m sobre el nivel del mar Humedad relativa del aire entre el 20 y el 90 Limitaciones de uso No se pueden realizar valoraciones con Hidrocarburos fluorados y clorados o sustancias productoras de precipitados o sedimentos pueden dificultar o imposibilitar el desplazamiento del eacutembolo generando condiciones de deterioro del equipo De otra parte debe advertirse que el aparato no es autoclavable La bureta puede usarse con las siguientes sustancias en disolucioacuten con una concentracioacuten maacutexima 1 M Brand 2012 Sustancias quiacutemicas (10 M) de uso seguro con la bureta

Aacutecido Aceacutetico Arsenita Soacutedica Sulfato Ceacuterico

Aacutecido Clorhiacutedrico Cloruro De Bario Sulfato De Zinc

Aacutecido Clorhiacutedrico En Acetona

Dicromato De Potasio Sulfato Ferroso Amoniacuteaco

Aacutecido Niacutetrico Edta Sulfato Ferroso

Aacutecido Oxaacutelico Hidroacutexido De Amoacutenio Tetra-N-Butiacutelico

Tiocianato De Amonio

Aacutecido Percloacuterico Hidroacutexido De Potasio Tiocianato Potaacutesico


Aacutecido Percloacuterico En Aacutecido Aceacutetico

Hidroacutexido De Sodio Tiosulfato Soacutedico

Aacutecido Sulfuacuterico Nitrato De Plata Trietanolamina En Acetona

Bromato De Potaacutesico Nitrito De Soacutedio Yodato Potaacutesico

Bromato-Bromuro De Potaacutesico

Permanganato De Potasio Yodo

Bromuro-Bromato Potasio Hidroacutexido Alcohoacutelico Yoduro-Yodato

Carbonato De Soacutedio Sodio Cloruro

httpwwwbranddefileadminuserpdfLeafletsTitrette_ESpdf La manipulacioacuten correcta del equipo le permite al liacutequido dosificado entrar en contacto con los materiales quiacutemicamente resistentes de los cuales estaacute construido vidrio de borosilicato Al2O3 ETFE PFA FEP PTFE Platino-iridio PP (caperuza a rosca) La bureta digital presentada trabaja con liacutemites de error aproximados de 0002 en los primeros 20 mL de valoracioacuten a partir de este volumen el liacutemite de error se ubica aproximadamente en 001 mL valores ubicados dentro de los liacutemites permisibles de la norma DIN ISO 8655-3 Limitaciones de empleo

El aparato se emplea para valoraciones teniendo en cuenta los siguientes liacutemites fiacutesicos

+15 degC a +40 degC (59 degF a 104 degF) del aparato y del reactivo

Presioacuten de vapor hasta 500 mbar

Viscosidad hasta 500 mm2s n Altitud maacutex 3000 m sobre el nivel del mar

Humedad relativa del aire de 20 a 90 Bureta acoplable a frascos Titrettereg con certificado de conformidad certificado de calidad ademaacutes incluye tubo de aspiracioacuten telescopico (longitud 170 - 330 mm) tubo para dosificacioacuten inversa 2 microbateriacuteas de 15 V (AAAUM4LR03) 3 adaptadores de PP para frascos (GL 4532 GL 45S 40 GL 32NS 2932) 2 visores de inspeccioacuten topacios de proteccioacuten contra la luz instrucciones de manejo Condiciones de almacenamiento Almacene el aparato y los accesorios en lugar seco Temperatura de almacenamiento -20 degC a +50 degC Humedad relativa del aire 5 a 95 En la graacutefica No 2 4 se describe una bureta digital de 50 mL-


Graacutefica No 24 Descripcioacuten de una bureta digital de 50 mL

Tecla CLEAR Seleccioacuten

Tecla Pausa

Tornillo dosificador

Eacutembolo

Cilindro dosificador

Vaacutelvula de valoracioacuten y de purga

Caperuza o tapoacuten a rosca

EncenderApagar

Tubo telescoacutepico de aspiracioacuten

Rosca para frasco

Pantalla digital

Caacutenula de valoracioacuten ajustable en forma

horizontal o vertical con vaacutelvula de salida

integrada


Procedimiento 1 Utilizando los datos de pureza consignados en la etiqueta del frasco de embalaje prepara 100 mL de NaOH 05 M los cuales se utilizaraacuten como disolucioacuten titulante mide el pH para comprobar la concentracioacuten 2 Una vez insertada la caacutenula o tubo telescoacutepico de aspiracioacuten en la vaacutelvula de aspiracioacuten inferior de la bureta llena el frasco dispensador inferior con agua destilada hasta la mitad de su capacidad Gira a la izquierda la valvula de valoracioacuten de color rojo para impedir la salida del agua por la caacutenula de valoracioacuten tal como se muestra en la graacutefica No 25

Graacutefica No 25 Posicioacuten de la vaacutelvula de lavado 3 Gira el tornillo de dosificacioacuten derecho en el sentido de las manecillas del reloj para permitir el ascenso del agua al cilindro dosificador una vez lleno este cilindro gira el tornillo dosificador en el sentido contrario para obligar la salida del agua hacia el frasco dispensador Repite esta operacioacuten unas cinco veces aseguraacutendote en la ultima vez de evacuar toda el agua destilada del cilindro dosificador 4 Desacopla el frasco dosificador y en su lugar acopla otro con la disolucioacuten titulante la cual EN NINGUN CASO PUEDE EXCEDER la concentracioacuten 1M (Un mol de soluto litro de disolucioacuten) En lo posible usa concentraciones inferiores a 1M para evitar el deterioro prematuro de las partes de la bureta digital Una vez trasvasado el titulante debes purgar la bureta para ello abre la vaacutelvula de valoracioacuten giraacutendola hacia la derecha tal como se ilustra en la graacutefica No 26

Vaacutelvula de valoracioacuten hacia la izquierda para proceder al lavado


Graacutefica No 26 Posicioacuten de la valvula para purgar la bureta Ahora se coloca un beaker de 100 mL debajo de la caacutenula de valoracioacuten retira la caperuza o tapoacuten y procede a girar el tornillo dosificador para desalojar unos mililitros del titulante evacuando todas las burbujas de aire atrapadas en el ducto plaacutestico y en el cilindro de dosificacioacuten 5 Con una pipeta volumetrica trasvasa una aliacutecuota de solucioacuten aacutecida problema a un erlenmeyer de 100 mL lavado y seco antildeade 2 o 3 gotas del indicador respectivo e introduce un iman y el electrodo del pH-metro para medir el pH inicial tal como se muestra en la graacutefica No 27 Graacutefica No 27 Montaje para titulacioacuten con bureta digital



6 Pulsa la tecla CLEAR para dejar la pantalla en 000 inicia la titulacioacuten girando el tornillo dosificador en el sentido inverso de las manecillas del reloj ajusta la velocidad del goteo y permite la transferencia del 1 mL en este instante pulsar la tecla PAUSA y medir el pH resultante Repite esta operacioacuten mL a mL hasta alcanzar el punto de equilibrio donde la solucioacuten aacutecida vira a un color fucsia muy paacutelido luego agrega mL a mL unos 4 mL adicionales de titulante y por igual mide el pH Con los datos obtenidos completa la siguiente tabla

NaOH 05 M antildeadidos

pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Referencias Brand 2012 Catalogo documento consultado el 12 de agosto de 20212 en httpwwwbranddefileadminuserpdfGAGA_Titrette_DE-EN-FR-ES-ITpdf



BIOQUIacuteMICA

Profesor LUIS JAVIER NARVAEZ ZAMORA

Practica de Laboratorio No 3 Soluciones Buffers y Curvas de Titulacioacuten Objetivo Preparar un buffer de acetatos y demostrar su capacidad de amortiguamiento Marco Teoacuterico Una disolucioacuten buffer es la combinacioacuten de un par conjugado (un aacutecido deacutebil con una base fuerte o una de sus sales o tambieacuten una base deacutebil y su sal) capaz de resistir cambios de pH cuando se antildeaden iones H+ u OH- Al valorar un aacutecido deacutebil con una base fuerte se observa que el cambio de pH es miacutenimo generando una zona plana en la curva de titulacioacuten en cuyo centro se ubica el punto de equilibrio esta es la zona de tamponamiento fuera de ella los cambios de pH son significativos En el punto de equilibrio la capacidad de tamponamiento es maacutexima aquiacute la concentracioacuten del aceptor de protones se iguala a la concentracioacuten del dador de protones haciendo el pH = pKa La capacidad de tamponamiento disminuye a medida del aumento o disminucioacuten del pH porque cambia la proporcioacuten en la concentracioacuten del dador y el aceptor de protones entendidos estos como aacutetomos de hidroacutegeno desnudos o H+ Al mezclar una base fuerte con un aacutecido deacutebil midiendo el pH resultante se puede dibujar un graacutefico del pH en funcioacuten de la cantidad de base antildeadida y esto se conoce como curva de titulacioacuten En la siguiente grafica se muestran cuatro curvas tres de ellas con la misma forma y la del HCl un tanto diferente tal com se muestra en la graacutefica No 31 mL de NaOH 01M antildeadidos

Graacutefica No 31 Curvas de titulacioacuten soluciones de algunos aacutecidos 01M Todas las curvas de titulacioacuten de bases o aacutecidos deacutebiles son similares La razoacuten se comportan como soluciones amortiguadoras cuyo pH tiende a no cambiar en la zona de tamponamiento de acuerdo con la ecuacioacuten de Henderson-Hasselbalch Es importante recalcar que cada especie quiacutemica en disolucioacuten acuosa tiene un pKa

pH

Punto de equivalencia 12 8 4

HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91


Valor Amortiguador Las soluciones buffer difieren en su capacidad para resistir los cambios en el pH esto condujo a Van Slike a introducir el concepto de VALOR AMORTIGUADOR para comparar diferentes soluciones amortiguadoras Cuando se agrega un aacutelcali o un aacutecido a una solucioacuten amortiguadora se obtiene una curva de titulacioacuten cuya pendiente estaacute dada

por B(pH) donde B es el incremento de la concentracioacuten de aacutecido o base fuerte

agregados en moll y (pH) es el incremento del pH eacutesta pendiente es el VALOR

AMORTIGUADOR que siempre se positivo debido a que el B es negativo El hecho de agregar aacutecido produce un cambio negativo en el pH y el valor amortiguador maacuteximo se alcanza en el pka Materiales y Reactivos 1 Matraz aforado de 250 mL pH-metro 1 pipeta de 1 mL NaOH en perlas

1 micropipeta 100-1000L CH3COOH glacial 1 bureta digital de 50 mL HCl concentrado 1 Erlenmeyer de 100 mL Erlenmeyer de 50 mL 1 beaker de 100 mL Agitador magneacutetico 1 Beaker de 50 mL Fenolftaleina Procedimiento 1 Prepara 250 mL de KOH 01 M 2 Prepara 50 mL de CH3COOH 0002 M 3 Trasvasa una aliacutecuota de 20 o 25 mL de la disolucioacuten del punto 2 a un erlenmeyer de 100 mL adiciona 2 o 3 gotas de fenolftaleiacutena 4 Lava la bureta digital unas 5 veces y comprobar su funcionamiento oacuteptimo Desalojar toda el agua usada para el lavado Ahora transfiere toda a disolucioacuten del punto 1 al frasco de la bureta purga la bureta y enraacutesala a 000 mL 5 Titula mL a mL y completa la siguiente tabla

mL KOH antildeadidos

pH [H+] pOH [OH-] [HAc] Ka pKa

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


Cuestiones

1 Completar el siguiente tabla

Color del Indicador

INDICADOR ACIDO BASE Pka Liacutemite uacutetil de pH

Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo

Bromocresol puacuterpura

Rojo de fenol

Fenolftaleina

Describir adicionalmente el proceso para preparar estos indicadores en el laboratorio 2 Determinar el procedimiento para preparar una solucioacuten de los anteriores indicadores potencialmente uacutetiles en la identificacioacuten de buffers 3 Calcular el pH del buffer preparado en la praacutectica si a 100 mL de eacutel se le agregan por separado 2 mL de HNO3 001M y 3 mL de NH4OH 01 M

Referencias Bioquiacutemica y biologiacutea molecular 1999 Facultad de medicina UNAM departamento de

bioquiacutemica Bohinski Robert C 2004 Bioquiacutemica Quinta edicioacuten Editorial Addison Wesley

Longman Mexico Conn Eric Stupmpf P 1991 Bioquiacutemica Fundamental 3ordf ed Meacutexico Limusa Devlin Thomas 2004 Bioquiacutemica aplicada con implicaciones cliacutenicas 4a ed Barcelona

Reverteacute Horton RobertH Moran Laurence OCHS Raymond RAWN J DavidScrimgeour K

Gray 2007 Bioquiacutemica 4ordf ed Meacutexico Prentice Hall Hispanoamericana SA Kerridge David Tipton Keith 1980 Razonamiento Bioquiacutemico Zaragoza Acribia Lehninger Albert L 2002 Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten

celular Segunda edicioacuten Barcelona Omega SA Lozano JA Galindo JD y otros 2005 Bioquiacutemica y Biologiacutea Molecular Buenos Aires

McGraw Hill Miguez O Jose Bernardo 1992Practicas de Bioquiacutemica Universidad Pedagoacutegica y

Tecnoloacutegica de Tunja Boyacaacute Murray Robert K Granner Daryl K Mayes Peter A Rodwell Viacutector W 2010

Bioquiacutemica de Harper Vigeacutesimo octava edicioacuten Meacutexico El Manual Moderno


Plummer David 1981 Bioquiacutemica Praacutectica Chelsea College University of London Trad Barrera Luis Alejandro Revisioacuten Corredor Carlos Universidad del Valle Bogotaacute Mac- Graw Hill Latinoamericana SA

Rendina George 1974 Teacutecnicas de Bioquiacutemica Aplicada Trad Folch Fabre Roberto MeacutexicoInteramericana

Roskoski Robert Jr 1998 Bioquiacutemica Meacutexico McGraw Hill Interamericana Stryer Lubert Bioquiacutemica Tomos I y II Sexta edicioacuten Editorial Reverte Barcelona 2008 Sitios de intereacutes en Internet httpwwwbiochemicalabstracscom httpwwwchemicalabstracscom



BIOQUIacuteMICA Profesor LUIS JAVIER NARVAacuteEZ ZAMORA

Guiacutea de Laboratorio No 4 Propiedades Quiacutemicas de los Aminoacidos

Objetivo Demostrar algunas propiedades quiacutemicas de los aminoaacutecidos mediante reacciones cualitativas propias del grupo amino Marco Teoacuterico La presencia de los grupos amino y carboxilo le comunican a los aminoaacutecidos comportamiento aacutecido-baacutesico aunque existe una gran variedad de ellos solo 20 forman

-aminoaacutecidos es decir el grupo amino se encuentra enlazado al carbono alfa central de cada uno de ellos El carbono alfa es un aacutetomo asimeacutetrico o quiral (a excepcioacuten del caso de la glicina) por tanto general isoacutemeros dextroacutegiros y levoacutegiros estos uacuteltimos integran las proteiacutenas En disoluciones acuosas con pH neutro las dos formas isomeacutericas de los aminoaacutecidos existen como iones dipolares denominados zwitteriones (ioacutenes hiacutebridos) donde el grupo amino se encuentra protonado (-NH3)

+ y el grupo carboxilo estaacute desprotonado (-COO-)y su grado de disociacioacuten cambia de acuerdo al pH circundante Por lo general un aminoaacutecido a traveacutes de su grupo amino se enlaza al grupo carboxilo del segundo y asiacute sucesivamente hasta formar largas cadenas polipeptiacutedicas propias de cada proteiacutena este enlace es de tipo eacutester y se denomina enlace peptidico es decir los aminoaacutecidos quiacutemicamente se comportan como sales orgaacutenicas Todos los aminoaacutecidos se comportan como aminas primarias a excepcioacuten de la Pro uacutenico iminoaacutecido de la serie proteacuteica Por igual el radical R o cadena lateral de los aminoaacutecidos variacutean en tamantildeo forma carga capacidad de formar puentes de hidroacutegeno caraacutecter hidrofiacutelico-hidrofoacutebico y reactividad quiacutemica Berg Tymoczko y Stryer 2008 Asiacute los aminoaacutecidos tienen radicales Alifaacuteticos Gli Ala Val Leu e Ile Hidroxiacutelicos Ser y Thr Sulfurados Cys Cys-Cys y Met Aciacutedicos Asp y Glu Baacutesico Lis y Arg Aromaacuteticos Phe y Tyr Heterociacuteclicos Trp y His Iminoaacutecidos Pro e H-pro Propiedades Quiacutemicas de los Aminoaacutecidos El grupo carboxilato de los aminoaacutecidos los obliga a comportarse como aacutecidos carboxiacutelicos produciendo todos sus derivados caracteriacutesticos eacutesteres amidas anhiacutedridos y haluros de aacutecido reacciones no incorporadas en este apartado A continuacioacuten se presentan las reacciones maacutes significativas correspondientes al grupo amino entre ellas las siguientes


1 Reaccioacuten Xantoproteacuteica Los aminoaacutecidos con radicales aromaacuteticos reaccionan en caliente con el aacutecido niacutetrico concentrado para formar productos nitroderivados de color amarillo y sus sales se caracterizan por el color anaranjado Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo HNO3 concentrado NaOH 10M Fenol (1 gL) Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo y gradilla Procedimiento Trasvasa 05 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 05 mL de aacutecido niacutetrico concentrado a cada uno deja enfriar y observa el cambio de color Seguidamente agrega suficiente NaOH 10 M hasta alcanzar alcalinidad elevada para cambiar el color amarillo inicial hasta anaranjado brillante prueba de la formacioacuten de la sal correspondiente Repite la prueba con solucioacuten de fenol 2 Reaccioacuten de Milloacuten Los derivados fenoacutelicos reaccionan con el mercurio en medio aacutecido para formar compuestos de color rojo Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Reactivo de Milloacuten (solucioacuten de HgSO4 150 gL en H2SO4 15 vv tambieacuten se puede preparar disolviendo 50 g de Hg(NO3)2 en 100 mL de HNO3 concentrado En su defecto disolver 5 g de Hg en 10 mL de HNO3 concentrado y luego agregar 15 mL de agua agitar y dejar en reposo durante 12 horas ) Fenol (1 gL) NaNO2 (10 gL) Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo y gradilla beaker de 250 mL Procedimiento Trasvasa 05 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo usa tambieacuten 05 mL de fenol agregar5 gotas del reactivo de Milloacuten calienta en bantildeo de agua hirviendo durante 10 minutos deja enfriar y agrega 5 gotas de solucioacuten de NaNO2 la generacioacuten de un color rojo ladrillo es prueba de un resultado positivo 3 Reaccioacuten del aacutecido glioxilico El grupo indol reacciona con el aacutecido glioxiacutelico (aacutecido oxoaceacutetico u aacutecido formilfoacutermico) C2H2O3 en medio aacutecido para dar un derivado de color puacuterpura El aacutecido glioxiacutelico se obtiene exponiendo al aacutecido aceacutetico durante varias horas a la luz solar Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo H2SO4concentrado Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo y gradilla beaker de 250 mL malla de asbesto Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 2 mL de aacutecido glioxilico o en su defecto de CH3COOH ahora deja resbalar por las paredes del tubo 2 mL de H2SO4 concentrado la generacioacuten de un anillo de color violeta es prueba de un resultado positivo


4 Reaccioacuten de Pauly Las aminas fenoles e imidazoles reaccionan con el aacutecido sulfaniacutelico diazotizado para formar complejos coloreados Para esta reaccioacuten las soluciones deben enfriarse en bantildeo de hielo porque los compuestos diazonio solo se forman en friacuteo Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Aacutecido sulfaniacutelico (10 gL en HCl 1 M) NaNO2 50 gL Na2CO3 (10 gL Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo y gradilla beaker de 250 mL Beaker de 100 mL hielo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega1 mL de solucioacuten de aacutecido sulfaniacutelico y 1 mL de solucioacuten de NaNO2 enfria en bantildeo de hielo durante 4 minutos alcaliniza agregando 2 mL de Na2CO3 La generacioacuten de colores es considerada prueba positiva 5 Reaccioacuten de Ehrlich El p-dimetilaminobenzaldehiacutedo reacciona con aminas aromaacuteticas iacutendoles y compuestos ureacuteicos para formar complejos coloreados caracteriacutesticos Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehiacutedo 100 gL en HCl concentrado) HCl concentrado Solucioacuten de urea (1 gL) Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo gradilla Procedimiento Trasvasa 05 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo usar tambieacuten solucioacuten de urea Agregar 2 mL del reactivo de Ehrlich observa las coloraciones formadas 6 Reaccioacuten del nitroprusiato El Na2Fe(CN)5NO en exceso de amoniaco reacciona con los grupos ndashSH para formar derivados de color rojo Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Cys Met Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Nitroprusiato de Na 20 gL (uacutesese recieacuten preparado) Solucioacuten de NH4OH concentrado KCN o NaCN 1gL Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 05 mL de solucioacuten de nitroprusiato a cada uno y antildeade 05 mL de amoniacuteaco concentrado observa las coloraciones formadas 7 Reaccioacuten de Sakaguchi

Los grupos guanidiacutenicos reaccionan con naftol en presencia de un agente oxidante como el agua de bromo generando un derivado de color rojo


Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Arg Cys Met Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo usa por igual solucioacuten de urea

(1 gL) Solucioacuten denaftol (10 gL en etanol absoluto) Agua de bromo NaOH 10M Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 05 mL de solucioacuten de NaOH 10M a cada uno y antildeade 3 gotas de solucioacuten de

naftol observa las coloraciones formadas 8 Reaccioacuten con el HNO2 Todos los aminoaacutecidos a excepcioacuten de la Pro reaccionan con el HNO2 para formar el

correspondiente -hidroxiaacutecido y nitroacutegeno gaseoso medible por manometriacutea Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Pro Arg Cys Met Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten de HNO2 concentrado Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo gradilla Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solucioacuten de aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 05 mL de HNO2 concentrado a cada uno observa el desprendimiento de burbujas de nitroacutegeno gaseoso 9 Reaccioacuten de Soumlrensen El grupo amino reacciona con el formaldehido para formar NN-dihidrometilderivados Reactivos Coleccioacuten de aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Pro Arg Cys Met Gli Tir Phe y Trp(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten de formol 50 pv Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo gradilla beaker 250 mL Trasvasa 1 mL de cada aminoaacutecido disponible en sendos tubos de ensayo agrega 05 mL de formaldehiacutedo a cada uno calienta en bantildeo de agua a 80ordm C durante 3 minutos Observa los cambios ocurridos Reacciones generales de las proteiacutenas 1 Reaccioacuten de Biuret para enlaces peptiacutedicos Aunque la prueba del Biuret no es exclusiva para los enlaces peptiacutedicos tambieacuten funciona con compuestos con dos grupos carbonilo unidos a un aacutetomo de nitroacutegeno o de carbono La reaccioacuten del CuSO4 en medio alcalino con compuestos con 2 o maacutes enlaces peptiacutedico para dar un complejo de color violeta cuya intensidad depende de la cantidad de enlaces peptiacutedico presentes Reactivos Soluciones de algunas proteiacutenas como albuacutemina caseiacutena gelatina peptona(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten de CuSO45H2O (10 gL) Agua de bromo NaOH 10M glutatioacuten (5 gL) Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo


Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solucioacuten de solucioacuten de proteiacutenas disponibles en sendos tubos de ensayo antildeade 3 gotas de solucioacuten de CuSO4 y luego 1 mL de NaOH 10M observa las coloraciones formadas 2 Precipitacioacuten por metales pesados Las proteiacutenas se encuentran cargadas a pH neutro y ligeramente por encima de eacutel al agregar cationes de metales la carga se neutraliza y se produce una precipitacioacuten Si el pH es muy alcalino se precipitan los hidroacutexidos de os metales involucrados Reactivos Soluciones de algunas proteiacutenas como albuacutemina caseiacutena gelatina peptona(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten de metales pesados como CuSO45H2O Pb(NO3)2 y Hg(NO3)2 (01 M) Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solucioacuten de proteiacutenas disponibles en sendos tubos de ensayo antildeade 3 gotas de solucioacuten de CuSO4Pb(NO3)2 y Hg(NO3)2 y luego 1 mL de NaOH 10M observa las reacciones formadas 3 Precipitacioacuten de proteiacutenas por reactivos aciacutedicos A pH aacutecido algunos compuestos aciacutedicos poseen carga negativa enorme capaz de neutralizar a las proteiacutenas cargadas positivamente para formar una sal insoluble y faacutecilmente detectable Reactivos Soluciones de algunas proteiacutenas como albuacutemina caseiacutena gelatina peptona(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten de aacutecido sulfosaliciacuteco ( 20 pV) aacutecido piacutecrico saturado ( 10 pv) aacutecido taacutenico y aacutecido tricloroaceacutetico (20 pv) NaOH 1 M Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solucioacuten de proteiacutenas disponibles en sendos tubos de ensayo antildeade 5 gotas de solucioacuten los reactivos aciacutedicos disponibles agrega algunas gotas de NaOH 1 M observar las reaccciones formadas 4 Reaccioacuten de Folin-Lowry Al igual que en la reaccioacuten del Biuret donde las proteiacutenas reaccionan con el CuSO4 alcalino tambieacuten pueden reaccionar con fosfomolibdato de sodio para dar complejos coloreados cuya intensidad depende del nuacutemero de aminoaacutecidos aromaacuteticos Reactivos Soluciones de algunas proteiacutenas como albuacutemina caseiacutena gelatina peptona(1 gL) como miacutenimo Solucioacuten alcalina de Na2CO3 (20 gL en NaOH 01M solucioacuten de cobre-tartrato soacutedico potaacutesico (5 gL CuSO4 5H2O en tartrato sodio potaacutesico 10 gL usa las dos soluciones recieacuten preparadas) Solucioacuten alcalina preparada usando 50 mL de la solucioacuten alcalina de carbonato de sodio y 1 mL de la solucioacuten de cobre tartrato soacutedico potaacutesico reactivo de Folin Ciocalteau (Tungstato de sodio y molibdato de sodio en H3PO4 y HCl concentrados de aacutecido sulfosaliciacuteco ( 20 pV) aacutecido piacutecrico saturado ( 10 pv) aacutecido taacutenico y aacutecido tricloroaceacutetico (20 pv) NaOH 1 M


Materiales Pipetas de 10 mL pipetas de 5 mL tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solucioacuten de proteiacutenas disponibles en sendos tubos de ensayo antildeade 5 mL de la solucioacuten alcalina agitar vigorosamente y deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos agrega 05 mL de reactivo de Folin-Cicateau en forma raacutepida y observa las reacciones formadas Cuestiones 1 Plantea las ecuaciones de las reacciones ocurridas durante la realizacioacuten de la praacutectica de laboratorio 2 Plantea el fundamento teoacuterico los materiales y reactivos necesarios para realizar la prueba de Sanger 3 Determina el valor funcional de algunos peacuteptidos como hormonas antibioacuteticos y enzimas 4 Describe brevemente algunos mecanismos para determinar la estructura de los peacuteptidos Referencias Baynes J W Dominczak M H(2011) Bioquiacutemica meacutedica 2ordf edicioacuten Revisioacuten Sabriacutea

M J Elsevier Espantildea SA Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Concepts in Biochemistry 2ordf edicioacuten (2002) RF Boyer Ed Wiley-Liss Devlin T M (2000) Bioquiacutemica Libro de texto con aplicaciones cliacutenicas 3ordf edicioacuten

Reverteacute Feduchi Blasco Romero y Yaacutentildeez (2010) Bioquiacutemica Conceptos esenciales Editorial

Meacutedica Panamericana Flores L J (2008) Manual de praacutecticas de bioquiacutemica 2ordf edicioacuten Meacutexico McGraw-Hill Goacutemez C r y Sanz J (coordinadores) (2003) Estructura de proteiacutenas Ariel Ciencia Horton HR Moran L A Ochs R S Rawn D K Scrimgeour G (2002) Bioquiacutemica 3ordf

edicioacuten Prentice Hall Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten

celular Barcelona Omega Luque J y Herraacuteez A (2001)Texto ilustrado de Biologiacutea Molecular e Ingenieriacutea

Geneacutetica Harcourt Macarulla J M y Gontildei F M (2002) Biomoleacuteculas Lecciones de Bioquiacutemica Estructural

3ordf Ed Barcelona Reverteacute


Mathews CK van Holde KE AhernKG (2002) Bioquiacutemica 3ordf Edicioacuten Pearson Educacioacuten SA

Nelson D L y Cox M M (2000) Principios de Bioquiacutemica 3ordf edicioacuten Editorial Omega- Plummer D T (1981) Bioquiacutemica Praacutectica Chelsea College of London Trad Luis

Alejandro Barrera revision Carlos Corredor Bogotaacute Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina G (1974) Teacutecnicas de bioquiacutemica aplicada Meacutexico Interamericana 1974 Stryer L Berg J My Tymoczko JL (2003) Bioquiacutemica 5ordf EdicioacutenEd Reverteacute- T Mckee T y Mckee JR (2003) Bioquiacutemica La base molecular de la vida 3ordf

edicioacuten McGraw-Hill Voet D VoetJG (1995)Biochemistry 2ordf edition Wiley amp Sons Voet D Pratt C VoetJG (2002) Fundamentals Biochemistry Update Wiley amp Sons Voet J G y Voet D (2006) Bioquiacutemica 3ordf edicioacuten Editorial Meacutedica Panamericana SA


UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Profesor LUIS JAVIER NARVAacuteEacuteZ ZAMORA

BIOQUIacuteMICA

Praacutectica De Laboratorio No 5 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas y Aminoaacutecidos

Marco Teoacuterico Una de las tareas maacutes frecuentes en la investigacioacuten bioquiacutemica es ademaacutes de la

identificacioacuten la cuantificacioacuten de biomoleacuteculas para el caso especiacutefico de las proteiacutenas y los aminoaacutecidos la teacutecnica maacutes apropiada es la colorimetriacutea y en especial una variante de ella la espectrofotometriacutea

La teacutecnica se basa en la propiedad que tienen las moleacuteculas de absorber energiacutea cuando son sometidas al influjo de campos electromagneacuteticos todas las moleacuteculas incluidas las biomoleacuteculas al recibir una determinada cantidad de energiacutea absorben parte de ella (absorbancia o extincioacuten) y dejan pasar el resto de la misma (tramitancia)

Generalmente las disoluciones de las proteiacutenas y los aminoaacutecidos carecen de color razoacuten por la cual se requiere hacerlas reaccionar con sustancias capaces de generar alguacuten tipo de coloracioacuten a traveacutes de la cual se pueda identificarlas y cuantificarlas sin tener que extraerlas de mezclas complejas donde usualmente se encuentran como por ejemplo en los tejidos De todas formas para estas reacciones coloreadas la intensidad del color depende de la concentracioacuten de las biomoleacuteculas en estudio y esta concentracioacuten a su vez define tanto la absorbancia como la tramitancia ocurridas

El fenoacutemeno de la absorbancia y la tramitancia se fundamenta en la ley de Beer-Lambert al cual se puede resumir de la siguiente manera al hacer pasar un haz de luz monocromaacutetica con una determinada intensidad Io a traveacutes de una sustancia eacutesta absorbe parte de la energiacutea incidente y deja pasar el excedente

A = 2- log T

donde a= absorbancia y T = tramitancia La relacioacuten entre la absorbancia y la tramitancia depende de la longitud (l) del medio o celda donde se encuentre confinada la sustancia a medir y de su concentracioacuten

Materiales Y Reactivos Disoluciones patroacuten al 2 de proteiacutenas y aminoaacutecidos disponibles en el laboratorio (

caseiacutena albuacutemina peptona gelatina Ala Arg Cys Gli Tir Phe y Trp) Reactivo de Biuret espectrofotoacutemetro Uv-Vis muestra problema de aminoaacutecido y de proteiacutena

Procedimiento

1 Cada grupo recibe una muestra de disolucioacuten tanto de aminoaacutecido como de una proteiacutena posteriormente a cada una le aplicaraacute la prueba de Biuret u otra sentildealada por el profesor 2 Inicialmente deben establecer la longitud de onda de maacutexima absorbancia para cada patroacuten con esa longitud de onda se deben obtener sendos espectros para diluciones 11 15 110 y 115 estableciendo la curva de calibracioacuten respectiva Para evitar maacutergenes de error elevados la adicioacuten del reactivo seleccionado para esta praacutectica debe hacerse manejando el mismo tiempo para cada uno de los ensayos 3 Una vez establecida la curva de calibracioacuten correspondiente a las disoluciones preparadas a partir del patroacuten inicial mide la absorbancia o la tramitancia de las muestras


entregadas al grupo y a traveacutes de la pendiente de la curva establece la concentracioacuten de cada muestra

Cuestiones Aplicativas 1 Establecer una relacioacuten aritmeacutetica entre la absorbancia y la concentracioacuten de

cada dilucioacuten de muestra (aminoaacutecido y proteiacutena) Presentar la curva de calibracioacuten 2 Utilizando la curva de calibracioacuten calcular la concentracioacuten de las dos muestras

problema entregadas a cada grupo 3 Determinar posibles causas de errores ocurridos durante el desarrollo de la

praacutectica 4 Explicar las leyes de Beer de Lambert y unificar sus enunciados para explicar los

hechos ocurridos durante el desarrollo de la praacutectica Referencias

Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten

celular Macarulla J M y Gontildei F M (2002) Biomoleacuteculas Lecciones de Bioquiacutemica Estructural

3ordf Ed Barcelona Reverteacute Plummer D T (1981) Bioquiacutemica Praacutectica Chelsea College of London Trad Luis

Alejandro Barrera revision Carlos Corredor Bogotaacute Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina G (1974) Teacutecnicas de Bioquiacutemica Aplicada Meacutexico Interamericana



BIOQUIacuteMICA Praacutectica de Laboratorio No 6 Reconocimiento de Carbohidratos

Estas biomoleacuteculas provienen del proceso fotosinteacutetico vegetal y su importancia bioquiacutemica radica en su poder energeacutetico del cual se deriva en gran parte el mantenimiento de la vida de todos los organismos terrestres A nivel humano luego de ser ingeridos en la dieta alimentaria son transformados den glucosa la cual es inicialmente se almacena como glicoacutegeno y luego es oxidada hasta CO2 y H2O Los carbohidratos a nivel molecular son aldehiacutedos (aldosas) y cetonas (cetosas) de polihidroxialcohoacuteles las unidades baacutesicas son los monosacaacuteridos descritos a continuacioacuten

Estas estructuras moleculares existen en la naturaleza gracias a los carbonos quirales o


asimeacutetricos los cuales generan a su vez sus imaacutegenes especulares o esteroisoacutemeros Por ejemplo el gliceraldehiacutedo tiene un carbono asimeacutetrico y dos posibilidades de distribucioacuten de los cuatro grupos unidos a eacutel asiacute cada una de las estructuras moleculares de la graacutefica anterior tiene su propio esteroisoacutemero denominado derivado L Propiedades Quiacutemicas de los Carbohidratos La condicioacuten de aldosas y cetosas les permite exhibir algunas propiedades exclusivas para este tipo de sustancias entre ellas las siguientes Prueba de Molish La hidroacutelisis de los enlaces glicosiacutedicos se puede lograr en medio aacutecido para producir monosacaacuteridos susceptibles de deshidratacioacuten para producir furfural y sus derivados los cuales a su vez reaccionan con -naftol produciendo un complejo de color morado caracteriacutestico Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa -naftol (50 G L de etanol) H2SO4 concentrado Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada carbohidrato a cada uno se antildeaden 2 o 3 gotas de solucioacuten de a-naftol luego y de manera cuidadosa se deja resbalar por las paredes del tubo 1 mL de H2SO4 concentrado hasta conseguir la formacioacuten de dos capas La prueba es positiva con la generacioacuten de un anillo de color morado en la interfase Prueba de la Antrona Al igual de la prueba de Molish la prueba de antrona sirve para reconocer carbohidratos en general El fundamento teoacuterico de esta prueba es el mismo de la prueba anterior Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa antrona recientemente preparada (2gL en H2SO4 concentrado) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 1 mL de solucioacuten de antrona luego se agregan 5 gotas de solucioacuten de cada carbohidrato mezclar y observar cambios de coloracioacuten la prueba es positiva si se genera un color azul verdosa Reacciones de Carbohidratos Reductores

Los carbohidratos pueden reducir los reactivos de Fehling 0 Benedict (soluciones alcalinas de iones cuacutepricos en forma de complejos con iones tartratos 0 citratos respectivamente) 0 de Tollen (solucion amoniacal de una sal de plata) se conocen como azucares reductores Todos los monosacaridos (aldosas y cetosas) y la mayoriacutea de los disacaridos son reductores exceptuando la sacarosa Para explicar las dos primeras pruebas el Cu(OH)2 al ser calentado en solucioacuten alcalina forma el CuO de color negro en presencia de sustancias reductores el Cu(OH)2 produce Cu2O de color rojo ladrillo En las pruebas siguientes se usa CuSO4 en solucioacuten alcalina y


un compuesto orgaacutenico con un grupo OH- para reemplazar al hidroacutexido cuacuteprico Los carbohidratos con un grupo carbonilo libre o potencialmente libre o un grupo cetoacutenico son sustancias reductoras Prueba de Fehling El reactivo requiere dos soluciones (Fehling A y Fehling B) las cuales se preparan por separado Fehling A Disolver 30 g de CuSO45H2O en 1 Litro de agua Fehling B Disolver 150 g de tartrato de Na y K (Sal de Rochelle) en 100 mL de agua caliente adicionar 900 mL g de NaOH al 5 Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Fehling (mezclar voluacutemenes iguales de Soluciones de Fehling A y Fehling B) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 1 mL de Reactivo de Fehling luego se agregan 1 mL de solucioacuten de cada carbohidrato mezclar y observar cambios de coloracioacuten la prueba es positiva si se genera un color rofo ladrillo Prueba de Benedict Esta prueba es similar a la anterior con la diferencia del uso de una sola solucioacuten El reactivo de Benedict se prepara de la siguiente manera Disolver 170 g de citrato de sodio y 100 g de Na2CO3 en 800 mL de agua caliente filtrar y completar el filtrado hasta 850 mL Por aparte disolver 17 g de CuSO45H2O en 150 mL de agua antildeadir lentamente esta segunda solucioacuten a la inicialmente preparada Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Benedict Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada una de laa disoluciones de carbohidratos disponible durante la praacutectica luego se adiciona 1 mL del reactivo de Benedict a cada tubo y se hierve durante 3 minutos Observar los cambios ocurridos y los colores generados Prueba de Barfoed Este reactivo reduce solamente a los monosacaacuteridos sin embargo cuando una disolucioacuten de disacaacuteridos se deja hervir por tiempo considerable estos se hidrolizan dando reacciones positivas falsas esta prueba es similar a las de Benedict y Fehling la diferencia es la cantidad de oacutexido cuproso producido razoacuten por la cual es necesario dejar reposar por maacutes tiempo Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10


mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Barfoed (Disolver 14 g de acetato de cobre en 200 mL de agua y agregar 15 mL de aacutecido aceacutetico glacial) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la praacutectica luego se adiciona 1 mL del reactivo de Barfoed a cada tubo y se hierve durante 1 minuto Observar los cambios ocurridos y los colores generados Pruebas para carbohidratos especiacuteficos Prueba de Bial para Pentosas Las disoluciones de pentosas al ser calentadas en HCl concentrado forman furfurales los cuales se condensan con orcinol en presencia de iones feacuterricos generando coloraciones verde azulosas caracteriacutesticas sin embargo con las hexosas la reaccioacuten genera complejos coloreados Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Bial (Disolver 15 g de orcinol en 500 mL de HCl concentrado luego antildeadir 05 mL de FeCl3 100gL y agregar 15 mL de aacutecido aceacutetico glacial) Alcohol amiacutelico Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la praacutectica luego se adiciona 2 mL del reactivo de Bial a cada tubo calentar hasta que se inicie la ebullicioacuten Observar los cambios ocurridos y los colores generadosUna vez frios los tubos agregar 05 mL de alcohoacutel amiacutelico Prueba de Seliwanoff para Cetosas Las cetosas tambieacuten se deshidratan como las aldosas para formar derivados del furfural los cuales a su vez reaccionan con resorcinol para generar complejos coloreados rojos El tiempo de deshidratacioacuten de las cetosas es menor que el de las aldosas por tanto el calentamiento debe ser mucho maacutes corto al empleado en la prueba anterior Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Seliwanoff (05 g de resorcinol en HCl 3 M) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de reactivo de Seliwanoff y antildeada 5 gotas de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la praacutectica calentar en bantildeo de agua hirviendo hasta la generacioacuten del color rojo caracteriacutestico de la prueba Prueba de Lugol para Polisacaacuteridos Los polisacaacuteridos forman complejos coloreados de absorcioacuten con el yodo asiacute por ejemplo el almidoacuten genera un color azul muy oscuro mientras el glucoacutegeno o el almidoacuten


parcialmente hidrolizado generan coloraciones del tono pardo rojizo Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo 1 beaker de 500 mL 1 malla de asbesto 1 pipeta 10 mL Soluciones 5 gL de Maltosa Fructosa glucosa(dextrosa) celulosa arabinosa ribosa almidoacuten galactosa manosa gliceraldehido almidoacuten celulosa Reactivo de Lugol (5 mM en KI 30 gL) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la praacutectica adicionarles 1 mL de reactivo de Lugol calentar en bantildeo de agua hirviendo hasta la generacioacuten del color caracteriacutestico de la prueba Cuestiones 1 Plantear una ecuacioacuten para cada una de las pruebas realizadas durante la praacutectica Indicar en cada caso la utilidad praacutectica 2 Establecer la importancia de los carbohidratos en la bioacutesfera y a nivel humano en particular 3 Describir brevemente 3 enfermedades o desoacuterdenes metaboacutelicos derivados del metabolismo de carbohidratos 4Explicar la diferencia estructural de los carbohidratos D y L y los homopolisacaacuteridos y los heteropolisacaacuteridos Referencias







BIOQUIacuteMICA


Praacutectica de laboratorio No 7 Pruebas Polarimeacutetricas con Carbohidratos

Objetivo Determinar la rotacioacuten especiacutefica de algunos carbohidratos Marco Teoacuterico Los carbohidratos poseen en su estructura molecular uno o maacutes aacutetomos de carbono asimeacutetrico esta caracteriacutestica genera en ellos actividad oacuteptica es decir pueden hacer girar el plano de luz polarizada la cual se puede cuantificar en un polariacutemetro aparato lustrado en la graacutefica No 71 Graacutefica No71 Polariacutemetro Fuente httptriplenlacecom20121125polarimetria-iii-el-polarimetro

Este equipo funciona baacutesicamente de la siguiente manera la fuente de sodio emite radiacioacuten electromagneacutetica aproximada de 58944 nm en todas las direcciones y en todos los planos de vibracioacuten el primer prisma de Nicol usa un haz de luz con una sola direccioacuten pero con todos los planos (luz polarizada) Luego atraviesa la muestra en disolucioacuten contenida en una celda la cual hace girar el plano de luz polarizada bien sea en el sentido de las manecillas del reloj o en el sentido contrario En el primer caso la sustancia es dextroacutegira y en el segundo es levoacutegira Para medir el grado de desviacioacuten de la luz polarizada un segundo prisma girable permite determinar la rotacioacuten observada valor con el cual se determina la rotacioacuten especiacutefica utilizando el siguiente algoritmo

[ ]


Donde = rotacioacuten observada [ ] = rotacioacuten especiacutefica l= longitud del tubo en cm y c =

concentracioacuten en g L De manera esquemaacutetica en la graacutefica No 72 se muestra el funcionamiento del polariacutemetro Graacutefica No 72 Mecanismo de funcionamiento de un polariacutemetro Fuente httptriplenlacecom20121125polarimetria-iii-el-polarimetro Materiales y Reactivos Soluciones 10 mv de D-glucosa sacarosa D-fructosa D-ribosa D-manosa D-galactosa y otros carbohidratos disponibles en el laboratorio carbonato de sodio agua destilado polariacutemetro con sus tubos de 10 y 20 cm 1 baloacuten aforado de 25 mL 1 vidrio de reloj 2 espaacutetulas metaacutelicas Procedimiento 1 Encender el polariacutemetro 10 minutos antes de iniciar la cuantificacioacuten Liberar el tubo de sus dos tapas lavarlo Tapar como se ilustra en la graacutefica No74 y llenarlo con agua destilada de tal manera que no se observen burbujas en su interior cerrar el tubo con su tapa rosca como se muestra en la graacutefica No 73 Ajustar el equipo a cero para ello se debe girar el tornillo micromeacutetrico con el cual se hace girar el prisma de Nicol analizador bien sea a la derecha o a la izquierda seguacuten el caso Desocupar el tubo y secarlo Graacutefica No73 Tapa de polariacutemetro y sus componentes

Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana


Graacutefica No74 Tubos de polariacutemetro de 10 y 20 cm sellados La lectura correspondiente a la desviacioacuten del plano de luz polarizada se observa en el lente telescoacutepico del polariacutemetro antes de llegar al cero de calibracioacuten y despueacutes de haberlo obtenido se observan dos momentos bien definidos los cuales se ilustran en las graacuteficas No 75 Y No

Graacutefica No75 Antes y despueacutes de puesta a cero Una vez alcanzado el cero el lente telescoacutepico se muestra como en la graacutefica No76 De otra parte cuando se alcanza la medida de la desviacioacuten del plano de la luz polarizada por parte de la sustancia objeto de estudio el lente telescoacutepico se muestra como en la graacutefica No 77 Graacutefica No 76 Puesta a cero Graacutefica No77 Medicioacuten de rotacioacuten especiacutefica Para reportar la actividad o rotacioacuten especiacutefica de una sustancia basta con mirar a traveacutes de cualquiera de los dos lentes del visor momento en el cual se haraacute visible el giro del prisma de Nicol analizador de acuerdo con el giro del plano de luz polarizada por parte de la muestra La medicioacuten se precisa ubicando en primera instancia la cantidad de grados en nuacutemeros enteros la cual se encuentra determinada por la escala moacutevil Para el ejemplo presentado en la graacutefica No el giro corresponde a 60 grados Los decimales de grado se obtienen buscando en la escala fija la divisioacuten de esta escala que coincida formando una sola liacutenea con alguna de las divisiones de la escala moacutevil Para el caso ilustrado la huella intermedia entre el 6 y el 7 de la escala fija se alinea con la huella de 60deg por esta razoacuten la rotacioacuten observada se corresponde con 6065deg ver graacutefica No 78


Graacutefica No 78 Medicioacuten de la rotacioacuten observada 6065deg 2 Preparar 50 mL de solucioacuten de D-Glucosa al 10 mv recieacuten preparada transferir 16 mL de esta solucioacuten al tubo para polariacutemetro de 20 cm de tal manera que se forme un menisco por encima del borde superior del tubo deslizar la ventana de vidrio para evitar la presencia de burbujas y sellar con la tapa rosca Realizar una primera lectura de la rotacioacuten especiacutefica Realizar lecturas a intervalos de 2 minutos durante los primeros 10 minutos y despueacutes a intervalos maacutes largos hasta cuando ya no hayan maacutes cambios en la rotacioacuten y completar la tabla No 71 Realizar una curva de la rotacioacuten en funcioacuten del tiempo transcurrido durante la experiencia 3 Mutarrotacioacuten en aacutelcali Repetir el procedimiento anterior haciendo la siguiente variacioacuten mezclar 15 mL de solucioacuten de glucosa recieacuten preparada y agregar 15 mL de Na2CO3 01M y seguidamente leer la rotacioacuten observada de igual forma al punto anterior 4 Repetir el procedimiento del punto 2 esta vez con otro carbohidrato y asiacute sucesivamente hasta medir la rotacioacuten especiacutefica de los carbohidratos disponibles para la praacutectica y completar la tabla No Tabla No71 Rotacioacuten especiacutefica de algunos carbohidratos Carbohidrato 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 20 min 30 min

Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa

5 Con los datos correspondientes al minuto 30 de la tabla No 71 calcular la rotacioacuten

especiacutefica de cada una de las muestras usadas Cuestiones

1 Determinar las razones moleculares de la actividad oacuteptica 2 Definir el concepto de mutarrotacioacuten y explicar su ocurrencia 3 Enumerar y explicar brevemente algunas aplicaciones de la polarimetriacutea

Grados en nuacutemeros enteros

Grados en nuacutemeros decimales


Referencias Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten






BIOQUIacuteMICA Praacutectica de Laboratorio No 8 Cuantificacioacuten de Carbohidratos

Objetivo Determinar la concentracioacuten de algunos carbohidratos en disolucioacuten acuosa Marco Teoacuterico Una estrategia para cuantificar carbohidratos es la prueba con la antrona la cual genera una reaccioacuten coloreada faacutecilmente identificable por espectrofotometriacutea visible Los carbohidratos en contacto con el H2SO4 para producir furfural y sus derivados los cuales a su vez reaccionan con antrona para producir un complejo coloreado mostrado a continuacioacuten

O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH

hidroximetilfurfuralO

O

O

H2O

OH2

Este complejo tiene gamas de colores desde el azul hasta el verde los cuales se leen por lo general a una longitud de onda maacutexima de 620 nm sin embargo no se recomienda usar la prueba si en la muestra hay proteiacutenas con altos contenidos de triptoacutefano el cual genera una coloracioacuten roja con la antrona Materiales y Reactivos Reactivo de antrona (2 gL en H2SO4 concentrado) Diferentes soluciones patroacuten de carbohidratos (01 gL) 10 tubos de ensayo gradilla para tubos Bantildeo mariacutea espectrofotoacutemetro Uv-Vis Celdas de cuarzo para espectrofotoacutemetro 2 pipetas de 10 mL 5 matraces aforados de 25 mL 1 micropipeta Procedimiento 1 Cada grupo de trabajo recibe una solucioacuten patroacuten (01 gL) de carbohidrato en particular con ella preparan 4 diluciones en cascada diluyendo cada vez dos veces 2 Transfiera 2 mL de cada carbohidrato en dilucioacuten en sendos tubos de ensayo usar gradilla agregar a cada tubo 2 mL de reactivo de antrona lo maacutes raacutepido posible Introducir el conjunto de 6 tubos (el sexto tubo se corresponde con la muestra problema del carbohidrato asignada al grupo) en bantildeo mariacutea a 80 degC durante 10 minutos Enfriar y luego espectrofotometrear a 620 nm contra el reactivo de antrona como blanco Elaborar la curva de calibracioacuten y calcular la concentracioacuten de la muestra problema usando la pendiente de la curva Cuestiones 1 Escribir la ecuacioacuten correspondiente a la reaccioacuten efectuada por el grupo de trabajo


2 iquestCuaacutel es la razoacuten de utilizar la pendiente para efectuar el caacutelculo de la concentracioacuten correspondiente a la muestra problema 3 Solicitar los resultados de los demaacutes grupos de trabajo y presentar las curvas de calibracioacuten como las concentraciones de cada una de las muestras problema Referencias Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten






BIOQUIacuteMICA


Practica No9 Inversioacuten de sacarosa

Objetivo Hidrolizar la sacarosa e isomerizar la glucosa resultante hasta fructosa Marco teoacuterico La sacarosa es un disacaacuterido constituido por una moleacutecula de glucosa y otra de fructosa

unidas a traveacutes de un enlace 1-4-glicosiacutedico tal como se muestra en la siguiente figura

O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH

La inversioacuten de esta sustancia consiste en la separacioacuten hidroliacutetica de la glucosa y la fructosa generando cambios significativos en la mezcla resultante como por ejemplo la variacioacuten en su actividad oacuteptica es decir una cambio en la direccioacuten del plano de la luz polarizada como tambieacuten cambios en su comportamiento quiacutemico frente a reacciones claacutesicas como las de Fehling Benedict Barfoed Bial Selliwanoff Tollens etc La sacarosa es exhibe dextrorrotacioacuten de +66deg al hidrolizarse en glucosa (+52deg) y en fructosa (-92deg) la mezcla exhibe levorrotacioacuten de -20deg este modificacioacuten de +66deg a -20deg a 10 recibe el nombre de inversioacuten Por carecer de carbonos anomeacutericos libres la sacarosa no es reductora pero en medio aacutecido y caliente se hidroliza en la piranosa y la furanosa fuertemente reductoras Al invertirla se obtiene un liacutequido espeso dorado con mayor poder edulcorante debido a la fructosa en especial Materiales y reactivos 1 beaker o erlenmeyer de 1 litro 6 libras de sacarosa 1 triacutepode 1 mechero 1 g de aacutecido ciacutetrico (10 g de NaHCO3) 1 litro de agua tibia 1 beaker de 100 ml solucioacuten de a-D-glucosa al 10

solucioacuten de -D-fructosa al 10 1 polariacutemero 1 refractoacutemetro para sacarosa 1 espctrofotoacutemetro IR Reactivos de Fehling Benedict Barfoed Antrona Bial Selliwanoff y Tollens Procedimiento 1 Medir la actividad oacuteptica de las soluciones de glucosa y fructosa al 10 recientemente preparadas al hacerlo se debe tener especial cuidado con la solucioacuten de glucosa la cual exhibe el fenoacutemeno de la mutarrotacioacuten Asegurarse de llenar por completo los tubos portamuestras del polariacutemetro el cual debe precalentarse hasta lograr estabilidad en la laacutempara o fuente de luz de sodio


2 Por separado disolver 05 g de sacarosa glucosa y fructosa en agua hasta completar 100 ml de disolucioacuten medir la actividad oacuteptica Una vez terminada esta medicioacuten usar cada disolucioacuten para realizar las siguientes pruebas a) actividad oacuteptica b) determinacioacuten de espectros IR c) pruebas tiacutepicas para carbohidratos empleadas en praacutecticas pasadas (Usar en cada caso 5 ml de la disolucioacuten y 2 ml de cada reactivo especiacutefico) y d) contenido sacariacutenico 3 Inversioacuten de la sacarosa Disolver 6 libras de sacarosa en 1 litro de agua tibia agregar 1 g de aacutecido ciacutetrico (en su defecto se puede usar el jugo de unos 6 limones medianos)y 5 o 6 gotas de HCl 1M Calentar hasta ebullicioacuten vigorosa en este punto disminuir la intensidad de la llama y dejar hervir a fuego bajo durante 15 minutos Sacar una aliacutecuota de 50 ml y dejar enfriar Tambieacuten se puede emplear otra teacutecnica similar consistente en mezclar las 6 libras de sacarosa con agua tibia poner a hervir durante 10 minutos retirar del fuego y cuando la temperatura alcance los 50degC antildeadir 10 g de NaHCO3 mezclar bien para homogenizar el pH la solucioacuten adquiere un color blanco paacutelido el cual desaparece cuando se enfriacutee Si queda alguacuten residuo en la superficie este debe retirarse para luego almacenar convenientemente 4 Una vez finalizado el proceso transvasar unos 20 ml del producto obtenido y repetir con eacutel los pasos del punto 2 Disponer la sacarosa invertida en recipientes para su embalaje casero Cuestiones 1 Explicar el fenoacutemeno de la mutarrotacioacuten exhibida por la glucosa 2 Explicar brevemente el funcionamiento del polariacutemetro 3 Contrastar los espectros obtenidos antes y despueacutes de la inversioacuten 3 Escribir las ecuaciones de las reacciones sucedidas durante el desarrollo de la praacutectica 4 Determinar los principales usos del azuacutecar invertido obtenido Referencias







BIOQUIacuteMICA


Practica No10 Cuantificacioacuten sacariacutenica en frutas

Objetivo Determinar el contenido sacariacutenico de algunas frutas disponibles en la regioacuten Marco teoacuterico Gracias al proceso fotosinteacutetico los seres autoacutetrofos biosintetizan un amplio nuacutemero de especies de carbohidratos mono di y polisacaacuteridos de uso corriente por parte de los seres heteroacutetrofos de estas especies quiacutemicas la maacutes importante y abundante es la glucosa la cual junto a la fructosa y la sacarosa se acumulan especialmente en citoplasma mientras los almidones son los carbohidratos de reserva acumulados en plastidios la hemicelulosa y las pectinas integran el componente estructural celular Las frutas deben su sabor dulce principalmente al contenido de carbohidratos sin embargo el concepto de sabor tradicional lo deben al contenido de aacutecidos orgaacutenicos y sus derivados aunque en realidad y por cercaniacutea morfoloacutegica y fisioloacutegica de los oacuterganos del gusto y el olfato este ldquosaborrdquo tradicional en realidad es olor La maduracioacuten de los frutos genera cambios radicales en la estructura molecular de sus carbohidratos los cuales experimentan rutas metaboacutelicas tales como la glicoacutelisis el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y finalmente el sistema de transporte electroacutenico conducente a la formacioacuten de CO2 H2O y ATP la cual facilita la biosiacutentesis de otros componentes celulares Estos carbohidratos poseen en su estructura molecular grupos aldehiacutediacutedicos o cetoacutenico composicioacuten explicativa de su poder reductor oxidaacutendose en presencia de oxiacutegeno o reduciendo en solucioacuten alcalina a iones oxidantes como Ag+ Hg+ Cu2+ y Fe(CN)6

3- propios de una gran variedad de reactivos como los de Tollens Fehling Benedict Barfoed etc con los cuales reaccionan formando mezclas complejas de aacutecidos orgaacutenicos Para cuantificar el contenido sacariacutenico en frutas se puede usar la refractometriacutea o la espectrofotometriacutea ambas basadas en la ley de Beer-Lambert Materiales y reactivos 1 refractoacutemetro para sacarosa 0-80deg Brix 1 espectrofotoacutemetro Uv-Vis Frutas de diferentes especies Sacarosa 6 balones aforados de 50 ml 1 espaacutetula metaacutelica 1 balanza analiacutetica 1 micropipeta 26 tubos de ensayo 1 gradilla para tubos de ensayo 1 bantildeo mariacutea Reactivo de Benedict Procedimiento Contenido sacariacutenico por Refractometriacutea 1 Seleccione una primera fruta y extraiga de ella algunas gotas de su jugo las cuales deben colocarse directamente en el portamuestras de la compuerta del refractoacutemetro para medir el contenido sacariacutenico Lavar y secar el portamuestras y su tapa repetir este paso hasta completar la medicioacuten con todas las frutas disponibles Completar la tabla No 101


Tabla No101 Contenido sacariacutenico en frutas por tefractometriacutea

Fruta degBrix

Contenido sacariacutenico por espectrofotometriacutea Uv-Vis 1 Preparar 100 mL de disolucion de sacarosa 06 M incubar a 25 degC a partir de esta disolucioacuten y sin sacar del bantildeo mariacutea preparar 50 ml de cada una de las siguientes diluciones en serie e incubar inmediatamente 05M 04M 03M 02M y 01M De cada una de ellas transferir 5 ml a un tubo de ensayo y a cada uno agregar 2 mL de reactivo de Benedict incubar a 25 degC durante 5 minutos 2 Mientras se preparan las diluciones del punto anterior transferir 4 ml de la disolucioacuten de sacarosa 06M a un tubo de ensayo luego antildeadir 4 ml de Reactivo de Benedict incubar a 25 degC durante 5 minutos ahora dividir el contenido en dos partes iguales y transferirlas a dos celdas del espectrofotoacutemetro Determinar la longitud oacuteptima de absorbancia con la cual se debe construir la curva de calibracioacuten utilizando las diluciones del punto 1 3 Extraer 2 ml del jugo de cada fruta depositar este volumen en un tubo de ensayo agregar 2 ml de reactivo de Benedict incubar a 25degC y espectrofotometrear a la longitud de onda oacuteptima absorbancia definida en el punto anterior Completar la tabla 102 Tabla No 102 Contenido sacariacutenico en frutas por Uv-Vis

Fruta M degBrix


Continuacioacuten Tabla No 102

Fruta M degBrix

Cuestiones

1 Determinar las especies quiacutemicas responsables del sabor de cada fruta usada en la praacutectica 2 Explicar brevemente el funcionamiento del refractoacutemetro 3 Escribir las ecuaciones de las reacciones sucedidas durante el desarrollo de la praacutectica Referencias Alvear G S V (2011) Problemas tridimensionales de quiacutemica Neiva Editora

Surcolombiana




Alejandro Barrera revision Carlos Corredor Bogotaacute Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina G (1974) Teacutecnicas de Bioquiacutemica Aplicada Meacutexico Interamericana httpwwwhorticomcomrevistasonlineextrasextra0906_07pdf




Praacutectica de laboratorio No 11 Actividad cataliacutetica de la amilasa Objetivo Determinar la actividad cataliacutetica de la amilasa salival a traveacutes de pruebas cualitativas Materiales Y Reactivos 1 beaker de 50 ml solucioacuten de almidoacuten al 1 1 beaker de 500 ml solucioacuten alcohoacutelica de I 001 M 1 pipeta de 5 ml bantildeo Mariacutea Papel celofaacuten 2 placas de tincioacuten Reloj con segundero 1 probeta de 250 ml 5 tubos de ensayo gradilla para incubacioacuten Almidoacuten 1 I2 001 M NaCl 01 M H2O destilada Na2SO4 01 M Fehling A y Fehling B Papel filtro en tiras Horno desecador Marco Teoacuterico La amilasa (14 glucano-4-glucano hidrolasa) ha sido aislada de la saliva del paacutencreas humano como tambieacuten de Pseudomonas y Aspergillus De esta enzima existen dos

variedades las cuales se encuentran en la saliva -amilasa y amilasa la primera tiene un peso molecular de 45000 Da presente ademaacutes en el jugo pancreaacutetico hidroliza

indistintamente al azar los enlaces (1 4) glicosiacutedicos a lo largo de la cadena de la amilosa generando moleacuteculas libres de glucosa y maltosa tiene la capacidad de suprimir la capacidad de la amilosa de producir un color azul cuando esta reacciona con el yodo La

amilasa presente tambieacuten en la malta libera moleacuteculas de maltosa iniciando su hidroacutelisis por el extremo no reductor de la cadena de la amilosa La amilopectina tambieacuten

es atacada por las y amilasas liberando moleacuteculas de maltosa

Sin embargo estas dos enzimas no pueden hidrolizar los enlaces (1 6) glicosiacutedicos de los puntos de ramificacioacuten de la amilopectina por tanto su accioacuten libera tantas unidades

de maltosa hasta que la hidroacutelisis llegue a los enlaces (1-6) para producir un nuacutecleo muy

grande y ramificado denominado dextrina liacutemite la cual se hidroliza con una (1 6)-glucan-6-glucano hidrolasa Procedimiento 1 Enjuagarse la boca con agua y posteriormente recoger unos 20 ml de saliva en un beaker de 50 ml Algunas personas secretan saliva con una actividad deacutebil de sus amilasas Con una pipeta se trasvasan unos 5 ml de la saliva colectada a una bolsa de papel celofaacuten amarraacutendola en la parte superior para impedir el derrame de la saliva introducida esta pequentildea bolsa se introduce en unos beaker con 400 ml de agua destilada se espera una hora o maacutes hasta que ocurra la diaacutelisis Durante este proceso se cambia el agua unas tres veces cada 20 minutos y se agita tambieacuten la bolsa dializadora Diluir 20 veces la saliva restante para usarse en el punto 2 2 Pruebas Preliminares Mientras ocurre la diaacutelisis se debe determinar la actividad de la amilasa por tanto se requiere establecer la dilucioacuten oacuteptima para hidrolizar el almidoacuten


hasta el ldquopunto acromaacuteticordquo el cual se alcanza cuando una solucioacuten de yodo ya no produce color azul oscuro o negro en un lapso de 5 minutos a 37 degC Incubar en bantildeo de Mariacutea 10 ml de almidoacuten al 1 durante dos minutos a 37 oC ahora agregar 2 ml de saliva inicial diluida 20 veces obtenida en el punto 1 continuar la incubacioacuten a la misma temperatura cada 30 segundos y con la ayuda de una pipeta trasvasar 3 gotas de esta mezcla incubada a la depresioacuten de la placa de tincioacuten donde previamente se han agregado 2 gotas de solucioacuten de yodo 001 M Asiacute se identifica la muestra que ya no da positiva a la prueba del yodo sobre el almidoacuten (punto acromaacutetico) si el tiempo necesario para lograr este resultado es inferior a 3 minutos se debe diluir auacuten maacutes la saliva inicial del punto 1 Tal dilucioacuten debe permitir el resultado negativo a la prueba del yodo entre 3 a 8 minutos Las siguientes pruebas se realizaraacuten en la jornada de laboratorio siguiente 3 Activacioacuten De La Amilasa Salival Una vez efectuada la diaacutelisis se transfiere el contenido de la bolsa dializadora a una probeta de 250 ml y se diluye con agua destilada hasta una concentracioacuten igual a la del punto acromaacutetico del punto 2 Por igual se transfieren a otra probeta de 250 ml unos 5 ml de la saliva inicial del punto 1 y se diluye hasta la concentracioacuten del punto acromaacutetico estas dos soluciones se deben mezclar y transferir a 5 tubos de ensayo previamente rotulados en las cantidades definidas de la tabla siguiente

Tubos y ml antildeadidos

Sustancias 1 2 3 4 5

Almidoacuten 1 10 10 10 10 10

NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1

Saliva dializada diluida 2 2 2

Saliva inicial diluida 2 2

Incubar los 5 tubos a 37 degC durante 5 minutos este es el tiempo cero en el cual se puede agregar la saliva dializada diluida y la saliva inicial diluida a intervalos de 1 minuto se deben realizar sendas pruebas Determinar Grupos Reductores en la Mezcla de Digestioacuten Dividir una tira de unos 16x2 cm de papel filtro en 16 partes iguales ahora Incubar 10 ml de solucioacuten de almidoacuten al 1 durante 2 minutos a 37 oC 1 En el tiempo cero se antildeaden 02 ml de saliva sin diluir a la solucioacuten de almidoacuten y cada 30 segundos se hace la prueba del yodo hasta encontrar el punto acromaacutetico al mismo tiempo otro estudiante deposita una gota de la mezcla en digestioacuten en cada una de las divisiones del papel filtro hasta la uacuteltima de ellas esta tira de papel se seca al aire y finalmente se adicionan unas dos gotas de solucioacuten de Fehling Cuestiones 1 Determinar la composicioacuten de la saliva humana 2 iquestQueacute se trata de demostrar en el punto 3 3 iquestDe queacute manera afecta la diaacutelisis de la saliva a la capacidad de hidrolizar el almidoacuten Referencias Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten


celular Buenos Aires Omega Macarulla J M y Gontildei F M (2002) Biomoleacuteculas Lecciones de Bioquiacutemica Estructural





BIOQUIacuteMICA


Praacutectica de laboratorio No 12 Pruebas Cualitativas para Aacutecidos Grasos Una de las maneras maacutes sencillas para identificar aacutecidos grasos es la saponificacioacuten a traveacutes de la cual un liacutepidos libera por accioacuten de agentes fiacutesicos y quiacutemicos tanto glicerol como aacutecidos grasos Para lograrlo basta con calentarlos en presencia de un aacutelcali Este proceso es la base usada en la fabricacioacuten de jabones duros y blandos El exceso de Los aacutecidos grasos liberados reacciona con la base usada para formar la sal correspondiente Los jabones como tal son hidrosolubles pero generan precipitacioacuten en presencia de NaCl CaCl2 o MgCl2 Materiales y reactivos Fenolftaleina 10 g L de etanol Grasa animal (mantequilla) NaOH 01 M Aceite vegetal (aceite de oliva) NaCl 50 gL Aacutecido graso (aacutecido esteaacuterico) CaCl2 50 gL HCl concentrado MgCl2 50 gL Pb(CH3COO)2 50 gL KOH alcohoacutelico 100 gL Pipeta de 10 mL Papel tornasol azul 1 espaacutetula Gradilla con 10 tubos de ensayo Eacuteter etiacutelico KHSO4 Agua de bromo Yodo en cloroformo Procedimiento para saponificacioacuten 1 Colocar en un tubo de ensayo grasa hasta 05 de altura adicionar 1 mL de KOH alcohoacutelico hasta cubrir la grasa adicionada hervir durante 1 minuto aseguraacutendose de evitar salpicaduras las cuales son muy cauacutesticas Agregar 10 mL de agua hervir durante 10 minutos adicionales y dejar enfriar agregar cuidadosamente HCl hasta obtener una disolucioacuten de caraacutecter aacutecido(papel tornasol azul) Remover la capa superior de aacutecidos grasos ubicada en la parte superior Ahora adicionar 10 mL de agua al sobrenadante retirado y agregar NaOH 01 M hasta obtener una disolucioacuten clara Utilizar el producto en el siguiente punto 2 Obtencioacuten de jaboacuten Transferir 0 5 g de aacutecido esteaacuterico a un tubo de ensayo agregar NaOH 01M hasta formar una disolucioacuten jabonosa Dividir esta disolucioacuten en 4 tubos de ensayo HCl (revisar resultados) saturar con solucioacuten de NaCl CaCl2 MgCl2 y Pb(CH3COO)2 (observar resultados) Dividir la disolucioacuten del punto 1 en cuatro tubos de ensayo y repetir las pruebas del punto 2 Pruebas para aacutecidos grasos Disolver 02 g de aacutecido esteaacuterico en 5 mL de eacuteter etiacutelico por aparte medir 5 mL de fenolftaleiacutena en un tubo de ensayo antildeadir tantas gotas de NaOH 01 M hasta que


prevalezca un color ligeramente rosado La presencia de aacutecidos grasos libres produce la desaparicioacuten del color rosado Repetir la experiencia con mantequilla y aceite de oliva

Prueba para glicerol Al calentar glicerina con KHSO4 se genera una deshidratacioacuten con la subsecuente formacioacuten de un aldehiacutedo denominado acroleiacutena perceptible por su olor caracteriacutestico La reaccioacuten ocurre tanto para el glicerol como para sus sales Procedimiento En un tubo de ensayo colocar KHSO4 hasta una altura de 02 cm antildeadir una cantidad aproximada de 05 mL de glicerol antildeadir maacutes bisulfato Calentar por dos minutos hasta percibir el olor caracteriacutestico de la acroleiacutena Prueba de insaturacioacuten Por lo general los aacutecidos grasos constituyentes de las grasa animales son saturados en cambio aquellos derivados de los vegetales poseen una o maacutes doble ligaduras carbono carbono Al hidrogenar estos doble enlaces se obtienen grasas vegetales tal como ocurre con las margarinas Por igual los haloacutegenos reaccionan faacutecilmente con los doble enlaces para formar derivados halogenados (halogenuros de alquilo) Procedimiento Transvasar pequentildeas cantidades de mantequilla aceite de oliva y aacutecido esteaacuterico en sendos tubos de ensayo Con mucho cuidado y evitando el contacto con la piel agregar gota a gota agua de bromo agitar el tubo cada vez hasta lograr decoloracioacuten total del bromo Repetir el ensayo usando esta vez yodo en cloroformo

Cuestiones 1 Plantear en cada caso las ecuaciones correspondientes a cada reaccioacuten usar formato digital para este proceso No se reciben manuscritos escaneados 2 Establecer la importancia y los cuidados en la ingesta de aacutecidos grasos en la dieta alimentaria diaria 3 Plantear una discusioacuten sobre el impacto de la acroleiacutena en la salud humana Referencias Berg J M Tymoczko J L y Stryer L (2008) Bioquiacutemica 6ordf Ed Barcelona Reverteacute Lehninger A (1995) Bioquiacutemica Las bases moleculares de la estructura y funcioacuten





Graacutefica No 11 Descripcioacuten de la micropipeta de 0 a 1000 L

Eyector de puntas


Procedimiento



























01 M

001 M

0001 M

00001 M



01 M

001 M

0001 M

00001 M






BIOQUIacuteMICA







































Tecla Pausa


Eacutembolo




EncenderApagar


Rosca para frasco

Pantalla digital



integrada











pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA











Procedimiento



























01 M

001 M

0001 M

00001 M



01 M

001 M

0001 M

00001 M






BIOQUIacuteMICA







































Tecla Pausa


Eacutembolo




EncenderApagar


Rosca para frasco

Pantalla digital



integrada











pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA




























01 M

001 M

0001 M

00001 M



01 M

001 M

0001 M

00001 M






BIOQUIacuteMICA







































Tecla Pausa


Eacutembolo




EncenderApagar


Rosca para frasco

Pantalla digital



integrada











pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

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5

6

7

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9

10

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12

13

14

15


Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA














BIOQUIacuteMICA







































Tecla Pausa


Eacutembolo




EncenderApagar


Rosca para frasco

Pantalla digital



integrada











pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA











































Tecla Pausa


Eacutembolo




EncenderApagar


Rosca para frasco

Pantalla digital



integrada











pH [H+]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA




















pH [H+]

0

1

2

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4

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11

12

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14




BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

3

4

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6

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9

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Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

HH

H

OHOH

H OH

H

OH

O

O OH

H

OH

OH

H

HOH











BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA












BIOQUIacuteMICA




pH


HCl

CH3COOH CH3COO- + H

+ pka = 476

H2PO-4 HPO4

2- + H+ pka = 72

HCN CN- + H

+ pka = 91









1

2

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Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

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O

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BIOQUIacuteMICA





O

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OHOH

H OH

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OH

O

O OH

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OH

OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


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Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA


















1

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Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

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H OH

H

OH

H2SO4

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OOH


O

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H2O

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BIOQUIacuteMICA





O

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H

OHOH

H OH

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OH

O

O OH

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OH

OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA











Cuestiones


Color del Indicador


Azul de timol

Azul de bromofenol

Rojo de metilo


Rojo de fenol

Fenolftaleina


















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





[ ]




Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

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D-Glucosa

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BIOQUIacuteMICA





O

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA

















































BIOQUIacuteMICA







A = 2- log T




Procedimiento

































BIOQUIacuteMICA





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Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

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D-Glucosa

O

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H

OH

H2SO4

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BIOQUIacuteMICA





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O OH

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OH

OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA









































BIOQUIacuteMICA





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Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

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D-Glucosa

O

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H OH

H

OH

H2SO4

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OOH


O

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H2O

OH2









BIOQUIacuteMICA





O

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OHOH

H OH

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OH

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O OH

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OH

OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA













Tapa rosca

Empaque de caucho

Ventana de vidrio

Portaventana






Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

+

D-Glucosa

O

OHH

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OHOH

H OH

H

OH

H2SO4

O

OOH


O

O

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BIOQUIacuteMICA





O

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OHOH

H OH

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O OH

H

OH

OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA















Glucosa

Fructosa

Galactosa

Sacarosa















O

Antrona

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D-Glucosa

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H OH

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H2SO4

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BIOQUIacuteMICA





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O OH

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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA



















O

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H

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BIOQUIacuteMICA





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BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


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Cuestiones


Surcolombiana





















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BIOQUIacuteMICA

















BIOQUIacuteMICA





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H OH

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Fruta degBrix


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Cuestiones


Surcolombiana





















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Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA


















BIOQUIacuteMICA







Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















NaCl 01 M 1 1

H2O destilada 1 1

Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA












Fruta degBrix


Fruta M degBrix



Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















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Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA












Fruta M degBrix

Cuestiones


Surcolombiana





















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BIOQUIacuteMICA


























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Na2SO4 01 M 1










BIOQUIacuteMICA
















BIOQUIacuteMICA










manual de guías de laboratorio de bioquímica 2013 b

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