bioquÍmica i- guía de laboratorio

~ 1 ~

B i o q u í m i c a I

Autores: Elena Benavides Rivera Juan Salazar Sánchez

Lima – Perú 2015-II

~ 2 ~

GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA I

© Derechos Reservados 2012

© Área de Química

Segunda Edición

Primera reimpresión

Diseño, Diagramación e Impresión

Universidad Científica del Sur

Panamericana Sur Km. 19. Lima-Perú 610-6400

Tiraje 1500 ejemplares

IMPRESO EN PERÚ

~ 3 ~

MBA Rolando Vallejo Cortéz Vicepresidente Ejecutivo Dra. Josefina Takahashi Rectora Dr. Edmundo Gonzales Vicerrector Académico

Dra. María Pía Sirvent De Luca

Directora de Gestión Académica M Sc. Alejandro Fukusaki Coordinador de Cursos Básicos de Ciencias Q.F. Juan Salazar Sánchez Coordinador de Área Química Autores Dra. Elena Benavides Rivera Q.F. Juan Salazar Sánchez

Reservados todos los derechos: ningún material de este manual puede ser reproducido sin autorización expresa por escrita por los

autores. La autorización será en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito aparte, no se refiere a este

manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y

sin lucro

~ 4 ~

“Me lo contaron y lo olvidé, lo vi y lo entendí, lo hice y lo aprendí”

Confucio

INDICE

Página

Práctica 1. Espectrofotometría 1

Práctica 2 . Preparación de soluciones amortiguadoras 5

Práctica 3. Factores que afectan la Velocidad de Reacción Enzimática 9

Práctica 4. Digestión Enzimática del Almidón 13

Práctica 5. Determinación de Ácido Úrico en suero sanguíneo 15

Práctica 6. Evaluación de la Glicemia 17

Práctica 7. Balance Energético / Evaluación parcial de práctica. 19

Práctica 8. Efecto del ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático 27

Práctica 9. Hidrólisis enzimática de los lípidos 29

Práctica 1 0 . Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma 31

Práctica 1 1 . Determinación de Vitamina C en alimentos vegetales 35

Práctica 1 2 . Determinación de proteínas plasmáticas 39

Práctica 1 3 . Determinación de Hemoglobina, Determinación de Urea en orina 41

SISTEMA DE EVALUACION:

EL ESTABLECIDO EN EL SYLLABUS POR COMPETENCIA

~ 6 ~

Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la

determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra

la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la luz transmitida

y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos químicos en solución.

El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a través de una

solución es reflejada en parte, mientras que la mayor fracción de esta es absorbida por

la sustancia disuelta. La absorción es proporcional a la concentración del soluto.

La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada longitud

de onda es dependiente de su estructura química. La ley de Lambert y Beer expresa las

relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuación:

Io

Long --------- = ε.l.c.

It

Io = Luz incidente It = Luz transmitida ε = Coeficiente de extensión c= concentración de la solución

l = Distancia recorrida por la luz a través de la solución.

El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) ó absorbancia de la solución

y es directamente proporcional a la concentración del soluto.

Para determinar la concentración de una determinada sustancia puede hacerse uso del factor de calibración o de una curva de calibración.

La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones

conocidas de la sustancia cuya concentración deseamos conocer. Luego se determina

la absorbancia de cada una de dichas concentraciones y se procede a preparar un

gráfico, donde en el eje de abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia y

en el eje de ordenadas la absorbancia.

Factor de Calibración.-

Se define como la relación que existe entre la concentración del estándar y su

respectiva absorbancia. Este factor puede obtenerse de la manera siguiente:

Factor de calibración = Concentración de estándar

----------------------------------------

Absorbancia

La concentración del estándar pude expresarse como: mg/dL, ug/dL, mEq/L, U/L,

etc. Para encontrar la concentración de una sustancia problema se multiplica el factor

de calibración por la Absorbancia del problema, operación que se realiza de acuerdo al

siguiente procedimiento.

~ 7 ~

Experimento 1: Preparación de una curva de Absorción

Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente sistema:

Solución de azul de metileno (10 mg/dL) 1 mL.

Agua destilada 4 mL.

Luego se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes

longitudes de onda: 560, 580, 600, 620 640, 660, 680 y 700 nm.

Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las longitudes de

onda y determinar el pico de máxima absorción del azul de metileno, el cual

corresponde al mayor valor de la absorbancia.

Experimento 2: Preparación de una curva de calibración

Preparar un experimento de la siguiente manera:

Tubo Nº

Reactivos 1 2 3 4 5

mL Azul de metileno (10mg/dL)

0.5 1 2 3 4

mL Agua destilada

4.5 4 3 2 1

Con agua destilada llevar el espectrofotómetro a cero

Luego leer los tubos a una longitud de onda de 660 nm.

Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el

eje de abscisas y las absorbancias en el eje de las ordenadas, luego trazar una recta a

través de los putos obtenidos experimentalmente.

Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración determinara la

concentración de la sustancia problema que recibirán en la presente práctica.

~ 10 ~

1 1

El poder amortiguador de los cambios de pH en un determinado sistema; es una expresión

simple de reacciones fundamentales reversibles que se establecen en el equilibrio y que se

basan en la teoría ácido-base. Nuestro organismo cuenta con sistemas amortiguadores tanto

intracelular como extracelular:

1. Ecuación de Henderson-Hasselbach

La ecuación de Henderson-Hasselbach, ha sido derivada de la Ley de acción de masas de

Gulberg y Waage, del concepto de constante de equilibrio y de la ionización de ácidos y

bases débiles. Se utiliza para calcular el pH teórico de una mezcla de ácidos débiles y sus

sales.

Para el siguiente sistema en equilibrio:

HA(ac) <====> (H)1+

(ac) + A1−

(ac)

Calculando Ka para el ácido débil, HA:

Ka H A

HA

Despejando la concentración de iones hidrógeno se tiene:

H1 HA Ka

A1-

Aplicando logaritmo y multiplicando por (-1), se obtiene:

log H1

- log Ka - log

HA

A1-

Reemplazando:

A1

pH = pKa + log HA

Expresión conocida como ecuación de Henderson-Hasselbach, para un ácido débil.

~ 11 ~

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1.- DETERMINAR el pH TEÓRICO y PRÁCTICO en las

SIGUIENTES SOLUCIONES:

NaOH 0,01 M

HCl 0,01 M

CH3COOH 0,1 M

NH4OH 0,1 M

NH4Cl 0,1 M

Determinar el valor del pH teórico según la ecuación de Henderson-Hasselbach.

Tomar 10 mL de cada solución y determinar el valor del pH práctico utilizando el

pH-metro.

EXPERIMENTO 2.- INFLUENCIA DEL pH EN LA SOLUBILIDAD DE

SUSTANCIAS ORGÁNICAS – SOLUBILIDAD DEL

BENZOATO DE SODIO

En un vaso de precipitados de 100 mL de capacidad disolver 10 mg de benzoato de

sodio con 10 mL de agua destilada, inmediatamente medir su pH, luego adicionar 5

gotas de HCl concentrado agitar y observar. Medir nuevamente el pH de la

solución final.

EXPERIMENTO 3.- NATURALEZA AMORTIGUADORA de la ALBÚMINA Preparar 4 tubos de prueba con los siguientes reactivos:

Tubo 1.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H20

Tubo 2.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H20

Tubo 3.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftaleína + 2 mL de H20

Tubo 4.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftaleína + 2 mL de H20

A los tubos 1 y 3 agregar 3 mL de solución de albúmina, agitar y observar.

A los tubos 2 y 4 agregar 3 mL de H2O, agitar y observar.

Explicar sus resultados.

~ 12 ~

~ 13 ~

~ 14 ~

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de acelerar las

reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad es

afectada por diversos factores: concentración de sustrato, pH, concentración de enzima,

temperatura, inhibidores, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.

Efecto de la concentración del sustrato

La velocidad de una reacción catalizada por enzimas es dependiente de la concentración del

sustrato. Esta dependencia es lineal cuando la concentración de sustrato es menor que el valor

Km, perdiéndose esta relación cuando la concentración es muy cercana a Km, para finalmente

tornarse independiente de la concentración de sustrato.

El experimento se realizará utilizando la enzima Fosfatasa ácida de hígado de pollo, enzima que

tiene la propiedad de hidrolizar el p-nitrofenil fosfato en medio ácido formando como productos

de la reacción fosfato inorgánico y p-nitrofenol. Este último compuesto absorbe a 405 nm. Con

tal propósito se prepararán los siguientes medios de reacción:

B-1 1 B-2 2 B-3 3 B-4 4

mL. Tampón citrato

0.1M pH 5.0

mL. p-nitrofenil

fosfato 0.001 M

mL. p-nitrofenil

fosfato 0.01 M

mL. agua destilada

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.2 0.2 0.4 0.4 ---- ---- ---- ----

---- ---- ---- ---- 0.1 0.1 0.2 0.2

0.8 0.7 0.6 0.5 0.9 0.8 0.8 0.7

Colocar los tubos en baño maría a 37° C durante 2 minutos, luego adicionar la enzima conforme

se indica a continuación:

mL. de enzima ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1

Detener la reacción EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adición de 1 mL de NaOH 1

N. Leer en el espectrofotómetro a 405 nm

Determinar la velocidad de reacción de cada uno de los tubos y luego graficar:

a.- velocidad en función de la concentración de sustrato.

b.- 1/v versus 1/[S].

c.- Calcular los valores de Vmax y Km de la enzima.

Determinar la velocidad máxima y el Km de la enzima utilizando ambos gráficos.

~ 15 ~

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

La velocidad de una reacción enzimática depende directamente de la concentración de enzima.

Los experimentos deben realizarse en condiciones de velocidad inicial. Para este propósito se

preparan los siguientes medios de reacción:

B

1

2

3

mL. de tampón citrato 0.1 M pH 5.0

1.0

1.0

1.0

1.0 mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M 0.2 0.2 0.2 0.2 mL. agua destilada 0.8 0.75 0.7 0.65

Los tubos de ensayo se incubarán durante 2 minutos a 37 °C a cuyo término se adicionará la

enzima, que dará inicio a la reacción.

mL. de enzima ---- 0.05 0.1 0.15

Se colocarán nuevamente los tubos en el baño maría durante 2 minutos EXACTAMENTE y se

detendrá la reacción mediante la adición de 1 mL de NaOH 1 N. Se leerán las densidades

ópticas a 405 nm.

Graficar la actividad enzimática o la velocidad de la reacción en función de la concentración de

enzima expresada como mL de enzima.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.-

El pH del medio de reacción afecta la velocidad con que una enzima cataliza una reacción. La

variación en la velocidad de catálisis ocurre debido a que el pH puede afectar la estabilidad de la

enzima, los grupos ionizables en la enzima, los grupos ionizables del sustrato, etc. Con la

finalidad de observar este efecto se prepararán los siguientes medios de reacción:

pH

mL. tampón citrato 0.1M

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01M 0.2

mL. de agua destilada

3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.2 0.2 0.2 0.2

0.7 0.7 0.7 0.7 0.7

Colocar los tubos en el baño maría a 37º C durante 2 minutos e iniciar la reacción mediante la

adición de la enzima:

mL. de enzima

~ 16 ~

La reacción se detiene transcurrida EXACTAMENTE 2 minutos, mediante la adición de 1 mL

de NaOH 1 N, luego leer en el espectrofotómetro a 405 nm.

Graficar actividad enzimática en función del pH.

~ 17 ~

~ 18 ~

El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso

de digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que actúa la alfa-amilasa

salivar, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidón y formar

polisacáridos de menor peso molecular.

HIDROLISIS DEL ALMIDON POR LA AMILASA SALIVAR

Para realizar el experimento se prepararán los siguientes medios de reacción:

1

2

3

mL. tampón fosfato 0.1 M pH 6.5

1.0

1.0

1.0 mL. de almidón al 1% 2.0 2.0 2.0 mL. ácido clorhídrico 0.5 N

mL. de agua destilada ---

2.0 ---

1.5 1.5

---

Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37° C durante 2 min, luego adicionar:

mL. solución de saliva --- 0.5 0.5

Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de 0.5 mL. de cada uno de los

tubos a los 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a los tubos previamente preparados que

contienen 2.0 mL de ácido clorhídrico 0.05 N, de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo N° 1 2 3

mL de ácido clorhídrico 2.0 2.0 2.0

Luego adicionar a cada tubo:

Gotas de solución de Lugol I gota I gota 1 gota

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarán modificaciones del color inicial de los

tubos como consecuencia de la acción de la alfa-amilasa salivar.

El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.

~ 19 ~

~ 20 ~

El ácido úrico es un compuesto que se forma en el organismo como producto de excreción de

las purinas. Los niveles séricos se encuentran elevados en diversas enfermedades tales como:

insuficiencia cardiaca crónica, leucemia, gota, síndrome de Lesch-Nyhan, etc.

Determinación enzimática de ácido úrico en suero:

La determinación de ácido úrico en suero se realiza utilizando dos enzimas, la uricasa que

transforma el ácido úrico en alantoína y la enzima peroxidasa, que en presencia de 4-

aminofenazona forma quinonimina de color rojo.

Uricasa

Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + H2O2 + CO2

POD

2 H2O2 + 4-AF Quinonimina roja

Preparar lo siguientes medios de ensayo:

B X St Suero o plasma

Estándar

Reactivo de Trabajo (mL)

----- 20 u L -----

----- ----- 20 u L

1.0 1.0 1.0

Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37° C. Enfriar y leer la

densidad óptica en el espectrofotómetro a 505 nm.

Valores de referencia:

Hombres: 2 . 5 – 6.0 mg/dL

Mujeres: 2 . 0 – 5.0 mg/dL

~ 21 ~

~ 20 ~

~ 21 ~

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que podría

permitir diagnosticar diversas patologías: diabetes mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.

Determinación enzimática de glucosa en sangre (Método de Trinder).

La determinación enzimática de glucosa sanguínea se realiza utilizando 2 enzimas: glucosa

oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalíticas en presencia de apropiados reactivos químicos,

permitirán la formación de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la

glucosa existente en el medio de reacción.

Glucosa oxidasa

Glucosa + H2O + 02 Acido glucónico + H2O2

Peroxidasa

2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B X St

Suero o plasma

Standard

Reactivo de trabajo (mL)

---- 20 u L ----

---- ---- 20 u L

2.0 2.0 2.0

Incubar en baño maría a 37º C durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

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~ 23 ~

~ 24 ~

El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el Gasto Energético diario de un

individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad, sexo y actividad física, y la Ingesta

Energética diaria a través de los macronutrientes de los alimentos consumidos.

Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo prolongado, el

individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se adelgaza. Por otro lado, si

predomina la ingesta, el exceso de energía se acumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos,

en el tejido adiposo, observándose un aumento de peso.

Para realizar este balance, es necesario calcular, en forma independiente, el Gasto Energético

en las 24 horas de cualquier día rutinario, de acuerdo a la Tasa Metabólica Basal (TMB) y la

Actividad Física realizada, luego compararlo con la Ingesta Energética que proporcionaron los

alimentos consumidos el mismo día, utilizando la Tabla de Composición Química de los

Alimentos de Mayor Consumo en el Perú, Tabla de Medidas Caseras, y los Factores de

Conversión de Peso de Alimentos Cocidos a Crudos.

OBJETIVOS:

1. Calcular las propias Necesidades Energéticas (Gasto Energético) del alumno.

2. Calcular la Ingesta Energética del alumno.

3. Establecer el Balance Energético.

MATERIALES:

Calculadora electrónica de bolsillo.

Lista detallada de las actividades realizadas durante las 24 horas, de un día rutinario

(6:00 a m - 6:00 a m).

Lista detallada de alimentos consumidos durante las 24 horas del mismo día.

Peso real actual.

PROCEDIMIENTO:

1. Calcular la Ingesta Energética, utilizando:

1.1. La Tabla de Trabajo.

1.2. Listado de alimentos consumidos en 24 horas.

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1.3. Tabla de medidas caseras (ANEXO Nº1).

1.4. Tabla de Factores de Conversión de peso de alimentos cocidos a crudos (ANEXO Nº2).

1.5. Tabla de Composición Química de Alimentos de mayor consumo en el Perú (ANEXO

Nº3 y Nº4).

2. Calcular el Gasto Energético, utilizando:

2.1. Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) de la Tabla Nº1.

2.2. Tabla de Categorías y Factores de la Actividad Física (Tabla Nº2).

3. Calcular el Balance Energético:

Balance Energético = Ingesta Energética - Gasto Energético

4. Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) ó (-) (déficit)

4.1. EQUILIBRIO: Ingesta Energética = Gasto Energético.

4.2. BALANCE (+): Ingesta Energética Gasto Energético.

4.3. BALANCE (-): Ingesta Energética Gasto Energético.

5. Calcular el Porcentaje de Adecuación de la Dieta:

% de Adecuación = (Energía ingerida / Energía requerida (*)) x 100

(*) Gasto Energético = Necesidades energéticas ó Energía requerida.

6. Analizar el Porcentaje de la Adecuación de la Dieta obtenido, según los siguientes

parámetros:

6.1 Valores normales = 90 - 110%.

6.2 Déficit = 90%

6.3 Exceso = 110%

“CÁLCULO DE LA INGESTA ENERGÉTICA”

a) En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones de todo el día en cada uno

de sus constituyentes. En columnas ordenadas calcular mediante regla de tres el contenido de

proteínas, grasas y carbohidratos de cada alimento respectivamente, según la cantidad que se

haya consumido.

Ejemplo1: ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL.

Leche fluida de vaca: proteínas en 100 mL 3.1 g

Para calcular la cantidad de proteína que existe en 250 mL de leche fluida de vaca:

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100 mL. de leche --------- 3.1 g de proteína

250 mL. ---

------ X X = 250 x

3.1 / 100

X = 7,75 g de proteínas

Ejemplo2: Ingesta de pulpa de carne de vacuno = 90 g.

Pulpa de carne de vacuno: proteínas en 100 g de porción comestible. 21.3 g.

Para calcular la cantidad de proteína que existe en 90 g de pulpa de carne de vacuno:

100 g. de pulpa de carne de vacuno(*) --------- 21.3 g. de proteína

90 g. --------- X

X = 90 x 21.3 / 100

X = 19.17 g de proteínas

(*) La tabla de Composición química de los alimentos indica los valores en 100 g de

porción comestible cruda (a menos que indique los valores en cocido).

b) Totalizar luego cada una de las tres columnas, y el valor obtenido en gramos de cada

macronutriente se multiplica por el factor respectivo.

Proteína x 4,0 kcal.

Grasa x 9,0 kcal.

Carbohidrato x 4,0 kcal.

c) Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad de energía

(Kilo/calorías) que aportaron los alimentos consumidos ese día.

TABLA DE TRABAJO

Alimentos

Cantidad en

Cantidad

Proteínas (g)

Grasas

Carbohidratos (g)

Desayuno

Almuerzo

Comida

Entre

comidas

medida casera (g) (g)

Sub-total:

Factor: x 4 x 9 x 4

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TOTAL

: (kilo/calorías)

INGESTA ENERGÉTICA = (kcal)/d

“CÁLCULO DEL GASTO ENERGÉTICO”

G.E. = TMB Factor de Actividad

a) Se calcula la Tasa Metabólica Basal (TMB) o gasto en reposo, aplicando la

fórmula de la siguiente tabla.

TABLA Nº1

Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) a partir del peso corporal (P)

Rango de edad (años) kcal/día

Hombres:

0 -3

3 - 10

10 - 18

18 - 30

31 - 60

> 60

60,9 P - 54

22,7 P + 495

17,5 P + 651

15,3 P + 679

11,6 P + 879

13,5 P + 487

Mujeres:

0 - 3

3 - 10

10 – 18

18 - 30

30 - 60

> 60

61,0 P - 51

22,5 P + 499

12,2 P + 746

14,7 P + 496

8,7 P + 829

10,5 P + 596

OMS(1985)

Ejemplo: La TMB para una estudiante de 19 años de edad , con 55 kg. de peso, será:

TMB = 14.7 P + 496

~ 28 ~

TMB = 14.7 55 + 496

TMB = 1 305 kcal/d

b) Con la lista de actividades, se agrupan éstas por categorías, tomando en cuenta el tiempo

empleado (en minutos) y multiplicándolas por el múltiplo de la TMB o factor de actividad

(o gasto de energía promedio por actividad).

Las categorías de actividad física son las siguientes:

TABLA Nº2

Actividad Física Categoría Múltiplo de la TMB o

Factor por actividad

Dormir, descansar. Reposo 1,0

Manejando automóvil, escribiendo a máquina,

atendiendo clase, trabajando en laboratorio, viendo TV,

cocinando, planchando, jugando cartas, tocando un

instrumento musical .

Muy ligera 1,5

Caminando a 4 - 5 km/h, atendiendo al público,

limpieza de la casa, cuidando niños, trabajo de

carpintería y electricidad, jugar tenis de mesa.

Ligera 2,5

Caminando a 5.5 - 6.5 km/h ,Manejando bicicleta,

bailando, trabajando en jardinería, cargando bultos

pesados.

Moderada 5,0

Jugando fútbol, vóley, básquet, caminando con carga

pesada cuesta arriba, cortando árboles, trabajo de

excavación manual.

Pesada 7,0

* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y muscular.

Recomendación FAO/OMS 1985.

Ejemplo:

1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:

HORA ACTIVIDAD TIEMPO

06:00 a.m. a 06:15 a.m. Aseo personal 15 ‘

06:15 a.m. a 06:45 a.m. Tomar desayuno 30 ‘

06:45 a.m. a 07:00 a.m. Caminar para tomar el bus 15 ‘

~ 29 ~

07:00 a.m. a 08:00 a.m. Viajar en bus 60 ‘

08:00 a.m. a 10:00 a.m. Asistir a clase 120 ‘

etc. (Debe completar 1440 minutos).

2) Agrupar por categoría de actividad:

Categoría de actividad Tiempo

empleado

(Horas)

Múltiplo de la TMB

o factor por

actividad

Factor de TMB

ponderado

En reposo

Muy ligera

Ligera

8

14

2

1,0

1,5

2,5

8,0

21,0

5,0

TOTAL 34,0

Promedio / hora

(Factor de TMB/ 24 h)

1.417

Gasto Energético

(1.417 x TMB)*

1 850,0

GASTO ENERGÉTICO = 1.417 TMB

= 1.417 1 305

GASTO ENERGÉTICO = 1 850,0 kcal/d

~ 30 ~

~ 31 ~

~ 32 ~

El hígado es el órgano que almacena glucógeno como un elemento de particular importancia

energética, que le permite al organismo mantener la glicemia durante los periodos en que no

ingiere alimentos. A diferencia del tejido muscular, el hígado puede degradar el glucógeno y

liberar glucosa a la sangre.

Extracción de glucógeno de hígado de rata.-

Preparación de los animales de experimentación.- Se dispondrán de 2 ratas en jaulas

individuales, una de las cuales recibirá su dieta habitual, mientras que la otra será sometida a un

ayuno de 24 horas. A ambas se les proporcionará agua "ad libitum".

Extracción del glucógeno.- Se sacrificarán ambos animales previamente anestesiados

con cloroformo y se procederá a extraerles el hígado. Luego, se realizará una observación del

tamaño y color del mencionado órgano. Se pesará 0.5 g de hígado de cada animal se colocarán

en tubos de boca ancha. y se les adicionará 1 mL de KOH al 30%. Se colocará en la boca de

cada tubo un embudo pequeño y se les someterá al baño maría hirviente durante 30 minutos.

Después de enfriar, se les adicionará 3 mL de agua destilada y 5 mL de alcohol etílico. Se

formará precipitado en aquel hígado que contenga glucógeno. Se centrifugará durante 10

minutos a 3000 rpm a cuyo término se eliminará el sobrenadante. Disolver el precipitado en 200

mL de agua destilada. La determinación del glucógeno se realizará con la antrona.

Se prepararán los siguientes medios de reacción:

1 2 3 4

mL disolución rata en ayunas

1.0

---

---

--- mL disolución rata normal

mL estándar de glucosa (5mg/dL)

mL agua destilada

---

---

---

1.0

---

---

---

1.0

---

---

---

1.0

Colocar los tubos en agua helada y adicionar 5.0 mL del reactivo de antrona. Llevar los tubos al

baño maría durante 15 minutos, enfriar y leer a 660 nm.

~ 33 ~

~ 34 ~

~ 35 ~

--- 5.0 5.0 5.0

Hidrólisis de los lípidos por la lipasa pancreática.-

Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa pancreática.

En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la

propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente acción de la lipasa pancreática.

Con la finalidad de mostrar experimentalmente la acción hidrolítica de esta enzima se

prepararán los siguientes medios de reacción:

B

1

2

3 mL. de tampón fosfato 0.1 M pH 7.8 2.0 2.0 2.0 --- mL. de aceite 1.0 1.0 1.0 1.0 mL. de sales biliares al 1% 2.0 2.0 --- 2.0 mL de agua 5.0 --- 2.0 2.0

Añadir II gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una

solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloración débilmente grosella estable, luego

adicionar:

mL. de solución de pancreatina al 1%

Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitándolos cada 5 minutos.

Al finalizar el tiempo de incubación adicionar nuevamente a cada tubo II gotas de

fenolftaleína y proceder a titular, utilizando una bureta, con una solución de NaOH 0.05 N

hasta que aparezca nuevamente la coloración ligeramente grosella.

Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido esteárico liberado por acción de la

lipasa pancreática.

~ 36 ~

~ 37 ~

~ 38 ~

La determinación de triglicéridos en plasma constituye un dato muy importante en el manejo de

ciertas dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye un factor de riesgo positivo para

aterosclerosis.

Determinación de triglicéridos en plasma

Los triglicéridos del plasma son hidrolizados por una lipoproteína lipasa (LPL) que forma como

productos glicerol y ácidos grasos. El glicerol en presencia de ATP por acción de la glicerol

quinasa es convertido en glicerol-1-fosfato, compuesto que es convertido por la glicerol fosfato

oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrógeno, este compuesto en

presencia de 4-aminofenazona (4-AF), clorofenol y peroxidasa (POD) es transformado en una

quinonimina de color rojo.

LPL

Triglicéridos Ácidos grasos + Glicerol

Glicerol quinasa

Glicerol + ATP ADP + Glicerol-1-fosfato

GPO

Glicerol-1-fosfato + O2 Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

POD

2 H2O2 + 4-AF + clorofenol Quinonimina roja

B X St

Suero o plasma ---

Standard

Reactivo de Trabajo

- 20 u L ----

---- ---- 20 u L

2 mL 2 mL 2 mL

Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37º C, luego leer en el espectrofotómetro a

505 nm.

Determinación de colesterol total

El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una estrecha relación con

diversas patologías, por cuyo motivo su determinación puede contribuir al diagnóstico de:

aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.

Determinación de colesterol total en sangre

La técnica utilizada para la determinación se fundamenta en la hidrólisis previa de los ésteres

de colesterol por la colesterol esterasa, la posterior acción de la enzima colesterol oxidasa que

formará peróxido de hidrógeno en cantidades estequiométricas y finalmente la participación de

~ 39 ~

la peroxidasa que en presencia de reactivos químicos formará un compuesto coloreado

proporcional a la cantidad de colesterol existente en la muestra de sangre.

Colesterol esterasa

Esteres de colesterol + H2O Colesterol + AGNE

Colesterol oxidasa

Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2

Peroxidasa

2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O

Preparar el siguiente sistema:

B

X

St

Suero o plasma

Standard


----

----

2.0

20

----

2.0

uL

----

20 u L

2.0

Incubar durante 5 minutos en baño maría a 37º C y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

~ 40 ~

~ 41 ~

~ 42 ~

La vitamina C es un compuesto que el ser humano debe ingerir necesariamente en su dieta

habitual, debido a que no dispone de las enzimas necesarias para sintetizarlo, como ocurre en las

ratas.

Determinación de vitamina C en frutas cítricas

La vitamina C puede determinarse cuantitativamente utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu,

para cuyo propósito se procederá de la siguiente manera:

Preparación de la muestra.-

Se procederá a extraer el jugo de una fruta cítrica como el limón o la naranja y se procederá a

diluirlo al 1/2 con ácido tricloroacético al 10%, luego se filtrará y centrifugará a 2500 rpm

durante 10 minutos.

Para la determinación cuantitativa de vitamina C se procederá de la siguiente manera:

B P St

mL. del jugo de fruta diluido

mL. del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10%

mL. de estándar de ácido ascórbico (0.1 mg/mL)

mL. de agua destilada

--- 0.1 ---

0.2 0.2 0.2

--- --- 0.1

1.8 1.7 1.7

Dejar en reposo durante 10 minutos y proceder a leer en el espectrofotómetro a 750 nm.

Para realizar los cálculos es necesario considerar la dilución de la muestra problema.

Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la vitamina C en frutas.-

En un tubo de cultivo con tapa rosca medir 2 mL del jugo de fruta diluido y luego colocarlo en

un baño maría a 100º C. Determinar el contenido de vitamina C de acuerdo a la técnica antes

descrita a los 20 minutos y luego a los 40 minutos de incubación, para cuyo propósito se

tomarán alícuotas de 0.1 mL.

En un papel milimetrado graficar el % del contenido de vitamina C en función del tiempo ó el

logaritmo del porcentaje de vitamina C remanente en función del tiempo.

~ 43 ~

36

~ 44 ~

~ 45 ~

Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantes para un

apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden cumplir funciones de

transporte, catalíticas, coagulación, etc. Su determinación cuantitativa es muy útil para el

diagnóstico de algunas patologías como: desnutrición, deshidratación, cirrosis, etc.

Determinación de proteínas plasmáticas total (Método de Biuret):

La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando iones cúpricos que en medio

alcalino reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta,

cuyo pico de máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentración

de proteínas.

Preparar los siguientes medios de reacción:

B X St

Agua destilada

Suero

Standard de proteínas

Reactivo EDTA/Cu (mL)

50 u L ---- ----

---- 50 u L ----

---- ---- 50 u L

3.5 3.5 3.5

Incubar durante 15 minutos a 37º C y leer en el espectrofotómetro a 540 nm.

Determinación de albúmina:

La albúmina reacciona con el Bromo cresolsulfonftaleína a pH 3.8 formando un compuesto

coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:

B St X

Suero estándar

Suero

Reactivo BCF (mL)

---- 10 u L ----

---- ----- 10 u L

3.5 3.5 3.5

Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el

espectrofotómetro a 625 nm.

~ 46 ~

~ 47 ~

~ 48 ~

La hemoglobina es una proteína que tiene un papel muy importante en el transporte de gases en

todo el organismo. Sus niveles en sangre mantiene una estrecha relación con la anemia,

policitemia o deshidratación.

Determinación de hemoglobina (Método de Drabkin):

La determinación de hemoglobina se realiza utilizando el reactivo de Drabkin, en cuya

composición se encuentra el ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y bicarbonato de sodio.

El ferricianuro transforma las hemoglobinas en metahemoglobina, compuesto que luego

reacciona con el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina, que tiene la propiedad

de absorber a 540 nm.


X St Sangre

Standard de hemoglobina


20 u L ----

---- 20 u L

5.0 5.0

Mezclar y después de 3 minutos leer en el espectrofotómetro a 540 nm llevando el equipo a

cero con el Reactivo de trabajo.

UREA

La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hígado a partir del ion amonio,

bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reacción es la carbamoil fosfato

sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N-acetil glutamato. La excreción de urea por la

orina depende fundamentalmente de la ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede

ocurrir a causa de una probable disfunción renal.

Determinación de urea en orina.-

La determinación de urea en orina se fundamenta en la acción que ejerce la enzima ureasa sobre

la urea, descomponiéndola en anhídrido carbónico y amoniaco. Este amoniaco reacciona con

hipoclorito y fenol en medio alcalino, formando un compuesto azul denominado azul de

indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentración de urea.


Blanco Estándar Problema Estándar (0.60 g/L) --- 20 uL --- Orina diluida --- --- 20 uL Ureasa I gota I gota I gota Mezclar mediante agitación e

incubar a 37º C x 5 minutos Reactivo 1 1 mL 1 mL 1 mL Reactivo 2 1 mL 1 mL 1 mL Mezclar e incubar a 37º C por

5 minutos, luego agregar: Agua destilada 10 mL 10 mL 10 mL

~ 49 ~

Mezclar los tubos por inversión, retirar del baño maría, dejar en reposo durante 10 minutos y

leer en el espectrofotómetro a 540 nm.

Nota.- Debido a que la densidad de la orina está relacionada con la concentración de urea, es

necesario diluirla de acuerdo al esquema siguiente:

Densidad hasta 1.015 …………………. Diluir 1/10

Densidad de 1.016 a 1.025 …………... diluir 1/20

Densidad mayor a 1.025 ………………. diluir 1/40

Es necesario preparar un Blanco de orina. El procedimiento difiere ligeramente del

correspondiente al Blanco. La diferencia radica en que debe añadirse al tubo de ensayo 20 L

de orina después de haber añadido el Reactivo 1, es decir, antes de añadir el Reactivo 2. Con el

Blanco se lleva el espectrofotómetro a Cero.

~ 50 ~

~ 51 ~

PRÁCTICA 13

INFORME

DETERMINACIÓN DE UREA EN ORINA

Apellidos Nombre(s) Mesa Nº Fecha

1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 52 ~

PRÁCTICA 13

INFORME

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 53 ~

PRÁCTICA 12

INFORME

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS PLASMÁTICAS


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 54 ~

~ 55 ~

PRÁCTICA 11

INFORME

DETERMINACIÓN DE VITAMINA C EN ALIMENTOS


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 56 ~

~ 57 ~

PRÁCTICA 10

INFORME

DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN PLASMA


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 58 ~

~ 59 ~

PRÁCTICA 9

INFORME

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LIPIDOS


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 60 ~

~ 61 ~

PRÁCTICA 8

INFORME

EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCOGENO HEPÁTICO


1. Objetivos

2. Resultados

a.- Rata con dieta normal.-

b.- Rata en ayuno de 24 horas.-

3. Conclusiones

~ 62 ~

~ 63 ~

PRÁCTICA 6

INFORME

EVALUACIÓN DE LA GLICEMIA


1. bjetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 64 ~

~ 65 ~

PRÁCTICA 5

INFORME

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 66 ~

~ 67 ~

PRACTICA Nº 4

INFORME

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDON


1. Objetivos

2. Resultados

Tubo Nº

Tiempo (min.)

Color observado

1

5

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

...........................................

2

5

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

...........................................

3

5

............................................

10

...........................................

15

...........................................

20

..........................................

3. Conclusiones

~ 68 ~

~ 69 ~

PRACTICA 3

INFORME

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA


1. Objetivos

2.

Resultados

a.- Efecto de la concentración de sustrato.-

Densidad óptica

Concentración de sustrato

.............

...............

.............

...............

.............

...............

.............

...............

b.- Efecto de la concentración de enzimas.-

Densidad óptica Concentración de enzima

......................... .................................

......................... .................................

......................... .................................

c.- Efecto del pH.-

Densidad óptica pH

......................... ...............................

......................... ..............................

......................... ..............................

3. Conclusiones

~ 70 ~

~ 71 ~

PRACTICA 2

INFORME

PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERS


1. Objetivos

2. Resultados

DETERMINAR el pH TEÓRICO y PRÁCTICO en las SIGUIENTES

SOLUCIONES:

SOLUCIÓN pH - TEÒRICO pH - PRÁCTICO

NaOH 0,01 M HCl 0,01 M CH3COOH 0,1 M NH4OH 0,1 M NH4Cl 0,1 M

3. Conclusiones

~ 72 ~

~ 73 ~

PRACTICA 1

INFORME

DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS


1. Objetivos

2. Resultados

3. Conclusiones

~ 74 ~

bioquÍmica i- guía de laboratorio

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