FUNDACIÓN PÉREZ-GUERRERO PARA LA COOPERACIÓN ECONÓMICA Y TÉCNICA ENTRE LOS

PAÍSES EN DESARROLLO, MIEMBROS DEL GRUPO DE 77

Informe técnico proyecto: “Aislamiento de Actinomicetos de Cuba, búsqueda de nuevos

agentes antibióticos y antiparasitarios”

Responsable: Dr. Eduardo Rodriguez

Institución responsable: Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET),

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina

Fecha: 10/10/2014

Introducción

Dentro de las estrategias actuales de búsqueda de nuevos productos naturales, por ejemplo

antibióticos, la adopción de metodologías mejoradas para el aislamiento de Actinomycetes

raros o menos conocidos es un requisito para evitar el re-aislamiento de cepas que producen

metabolitos bioactivos ya conocidos (Berdy, 2005). Esta hipótesis de trabajo fue dirigida a la

exploración de una gran variedad de lugares inhóspitos, incluyendo nichos específicos de Cuba

como ser medioambientes marinos y en asociación con plantas como huésped con

características únicas. Las nuevas cepas aisladas fueron usadas con el fin de identificar nuevos

estructuras químicas activas contra bacterias y parásitos de interés médico.

Resultados

En base a lo expuesto nosotros hemos aislado más de 200 Actinomicetes asociados a la

rizósfera, endófitos de plantas, líquenes y bacterias endolíticas así como sedimentos marinos e

invertebrados, algunas de las cuales mostraron al menos propiedades inhibidoras contra algún

agente etiológico. El proceso de caracterización incluyó el análisis fenotípico y genotípico de

las cepas aisladas como así también la producción y caracterización de metabolitos bioactivos

contra las distintas cepas Gram positivas, Gram negativas, hongos y parásitos.

Los distintos Actinomycetes fueron reconocidos mediante el crecimiento en forma de hifas

filamentosas (crecimiento típico de este grupo bacteriano) y la formación colonias adheridas a

la superficie del agar. Las colonias seleccionadas fueron mantenidas a 4°C sobre superficies de

medios solidos para una posterior caracterizacion e identificacion. A su véz, se prepararon

suspenciones de esporas (otra caracteristica típica de este grupo bacteriano) en 20 % glicerol

para su almacenamiento a -80°C (Kiesere et al., 2000).

Algunos ejemplos de las cepas aisladas de Cuba e identificadas como Actinomycetes se

muestran en la Figura 1. Se puede observar el aspecto de colonias secas y la producción de

pigmentos característicos de los metabolitos secundarios como así también la formación de

esporas típico de este grupo bacteriano. Estos ensayos se realizaron en distintos medios de

cultivos ya que tanto la formación de esporas como la posibilidad de producción de

metabolitos secundarios suele ser dependiente de las condiciones de crecimiento como el

medio de cultivo, la fuente de carbono, el pH, la temperatura, etc (Chater, 1984; Bibb, 1996).

Los medios de cultivos sólidos empleados fueron los siguientes: SFM (harina de soja-manitol),

ISP2 (peptona-extracto de levadura-glucosa) y SCA (almidón-caseína). Para el análisis de

producción de metabolitos también se empleó medios líquidos como R5 y F1 (Kieser et al.,

2000).

Fig. 1. Actinomycetes aislados de Cuba.

Tabla 1. Elección de diferentes medios para producir esporas y metabolitos secundarios.

Cepa Crecimiento y Esporulación (por refracción al microscopio)

A2 SCA>SFM

A3 SCA

B1 SFM>SCA

B12 SFM>SCA

B13 SFM>ISP2>SCA

J4 SFM>SCA

J11 SFM>SCA

SM1 SFM=SCA>ISP2

SM2 SFM>ISP2>SCA

SM3 SFM=SCA>ISP2

A partir de estas cepas aisladas se analizó el perfil de actividades antimicrobianas contra un

panel de cepas de referencia incluyendo Mycobacterium smegmatis, Staphylococcus aureus,

Micrococcus luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans mediante

ensayos de inhibición en medios sólido Mueller Hinton. Estos ensayos se realizaron mediante

distintas técnicas como ser por estría en cruza, por transferencia del agar o medio de cultivo

líquido donde creció el Actinomycete a una placa de Petri conteniendo la cepa testigo. La

Figura 2 muestra fotos de los ensayos de inhibición donde se puede apreciar claramente los

halos de inhibición por la presencia de metabolitos producidos por los Actinomycetes.

Fig. 2. Ensayos de inhibición contra M. smegmatis y M. luteus mediante el agregado de trozo

de agar o sobrenadante de cultivo conteniendo los metabolitos secundarios producidos por los

Actinomycetes.

Las actividades antibióticas encontradas a partir de las cepas aisladas se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Actividad antimicrobiana de las cepas de Actinomycetes de origen cubano.

Cepa

Microorganismo testigo

E. coli P. aeruginosa S. aureus C. albicans M. luteus M. smegmatis

A2 - - - + - -

A3 - - + - +

B1 + - + + + +

B12 + - + - + +

B13 + - + + + +

B42 - - - - - +

B47 + + + - + +

B63 - - + - + -

B64 - - - - - +

C19 - - + - + +

C21 - - + - + -

C22 - - - - - +

C27 + - - - - +

C28 - - + - + +

FB1 + + – – + +

FB2 + - + – + –

FB3 + - - – + –

FB4 + - - – - –

FB5 + - - – + –

FB6 + - - – - –

FB7 + - + – + +

FB8 + + - – + +

FB9 + - - - - -

FB10 + - - – + +

FB11 + - - - - -

FB12 + + - - - -

FB13 - - + - - +

FB14 + - + + + +

FB15 + - + + - +

FB16 - - - + - +

FB17 - + - – + –

FB18 + – - – - +

J4 - - + + + -

J11 + - + + + +

RL12 - - + - + +

SM1 + - + - - -

SM2 + - + - + -

SM3 + - + + + -

SD8 - - + - + -

V9 + - + - + +

Z15 - - - - + +

Nota: +, inhibición; -, no se detectó inhibición.

En base a los datos de la Tabla 2 se puede deducir que existen una diversidad de metabolitos

secundarios con actividad inhibitoria contra uno a más agente etiológico. En base a estos

resultados se seleccionaron algunas cepas de interés para un estudio más profundo como se

detalla a continuación. Una de las características que suelen presentar las cepas productoras

de antibiótico es la de autoresistencia frente al antibiótico o familia de antibiótico que ella

produce. En base a esto, se estudió la resistencia de estas cepas frente a antibióticos de

distinta clase para ver si las mismas presentaban algún mecanismo de resistencia que podría

indicar la familia de compuesto por ellas producen (Tabla 3).

Tabla 3. Resistencia frente a diferentes antibióticos (Medio Agar SFM).

Cepa Antibiótico (µg/ml)

Apr

50

Cn

50

Tet

50

Amp

50

Lin

50

Tio

10

Eri

50

Pur

50

Nal

50

Str

50

A2 - - - + - + - - + -

A3 - - - - - - - - - -

B42 - + - + + + + - + -

B63 - - - - - + - - + -

C19 - + - + - + - + + -

C21 - - - + - + + - + -

C22 - + - + + + - + + +

C28 - - + + - + - - + -

J4 - - + + - + - - + -

SD8 - - - + - + - - + -

Nota: Apr (apramicina); Cn (cloranfenicol); Tet (teraciclina); Amp (ampicilina); Lin

(lincosamina); Tio (tioestreptona); Eri (ereitromicina); Pur (puronmicina); Nal (ácido nalidíxico);

Str (streptomicina); +, crecimiento; -, no se detectó crecimiento.

Estos resultados indicarían que la mayoría de las cepas son resistentes a antibióticos conocidos

posiblemente por presentar auto-resistencia a los compuestos ya conocidos que ellas

producen como era de esperar.

Por otro lado, se realizaron caracterizaciones genéticas de las cepas de interés. A partir del

aislamiento del ADN genómico se realizaron amplificaciones mediante la técnica de PCR de

fragmentos correspondientes al rRNA ribosomal 16S usando primers descriptos en la literatura

(Stach et al., 2003):

SC-Act-235aS20 5’-CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG SC-Act-878aA19 5’-CCG TAC TCC CCA GGC GGG G

La Figura 3 muestra un gel de agarosa donde se separan los distintos amplicones amplificados

mediante la técnica de PCR a partir de los ADN genómicos de las cepas de interés.

Fig. 3. Amplicones del rRNA 16S.

La secuenciación y análisis bioinformáticos de dichos fragmentos mostró que la mayoría de

estas cepas pertenece al género Streptomyces y posiblemente produzcan compuestos ya

conocido como se detalla a continuación:

A2: 100 % idéntico con Actinomycetales y Streptomyces (S. caeruleus, S. mobaraensis, S.

lusitanus, S. hygroscopicus, S. verticillus)

A3: 99 % idéntico con Streptomyces (S. aureus, S. seoulensis, S. pulveraceus, S. kunmingensis,

S. drozdowiczii, S. phaeochromogenes)

B1: 99 % idéntico con Streptomyces (S. globisporus, S. griseus, S. cavourensis, S.

griseobrunneus, S. lohii, S. olivochromogenes, S. californicus)

B12: 100 % idéntico con Streptomyces (S. setonensis, S. lavendulocolor, S. roseolilacinus, S.

lilaceus, S. aurantiacogriseus)

Mar

cad

or

A2

A3

B1

B1

2

B1

3

J4

J11

SM1

SM2

SM3

640 pb

B13: 100 % idéntico con Streptomyces (S. roseocinereus, S. ramulosus, S. griseocarneus, S.

septatus, S. catenulae, S. fasiculatus, S. misakiensis)

CCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGAATGTCGCCCACAC

CTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCC

TCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACC

GCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTT

AAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACA

ACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCG

TCACTCTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCT

GCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCA

GTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACC

AACAAGCTGATAGGCCGCA (secuencia completa del fragmento correspondiente de la cepa B13

donde se subrayan los primer usados en la amplificación por PCR).

J4: 99 % idéntico con Streptomyces (S. cinnamocastaneus, S. ambofaciens, S. mutabilis, S.

fradiae, S. coeruleorubidus, S. coeruleorubidus, S. finlayi, S. eurocidicus)

J11: 99 % idéntico con Streptomyces (S. flaveus, S. griseus, S. erumpens, S. ornatus, S.

sporovirgulis, S. lavendulae, S. microflavus, S. flavolimosus, S. anulatus, S. flavofuscus)

SM1: 100 % idéntico con Streptomyces (S. rochei, S. avidinii, S. heteromorphus, S. flaveolus, S.

minutiscleroticus, S. olivoverticillatus, S. geysiriensis, S. enissocaesilis, S. glomeratus)

SM3: 100 % idéntico con Streptomyces (S. lusitanus, S. herbaricolor, S. aurantiacus, S.

galilaeus)

Este análisis permitió una posible identificación de los compuestos que las cepas aisladas

podrían estar produciendo. En base a los resultados genómicos y de la Tabla 2 se decidió en

primera instancia profundizar los estudios a partir de algunas de las cepas que eran capaz de

inhibir la mayoría de los microorganismos testigos utilizados: B12 y B13. A partir de estas cepas

se estudió de reversión de la inhibición con cepas testigo E. coli o S. aureus conteniendo

marcadores de resistencia de antibióticos conocidos. La Tabla 4 muestra los resultados

obtenidos con un par de las cepas estudiadas.

Tabla 4. Actividad del extracto crudo de la cepas B12 y B13 frente a S. aureus y E. coli.

Extracto Halo de Inhibición (mm)

Staphylococcus aureus Escherichia coli

ATCC 25923 ATCC 43300 X684* 424** DH5α Erir Str

r Tet

r

B12 20 21 13 25 29 28 27 22

B13 25 26 28 28

Nota: * Resistente a meticilina; ** Resistente a Oxacilina, Ciprofloxacino, Gentamicina, r (resistente).

Por otro lado se caracterizó la producción de metabolitos por parte de estas cepas en distintas

condiciones de crecimiento. Para esto se estudió la producción de metabolitos secundarios por

algunas de las cepas en diferentes medios sólidos (Tabla 5) y líquidos (Tabla 6) comúnmente

usado para cepas de Streptomyces.

Tabla 5. Actividad de las cepas de Actinomycetes crecidas en medio sólidos

Organismo Halo de Inhibición (mm)

B1 B12 B13 J11

SCA ISP2 SFM SCA ISP2 SCA ISP2 SFM SCA SFM

M. smegmatis 9 13 17 7 12 7 9 9 10 19

Tabla 6. Actividad de las cepas de Actinomycetes crecidas en medio líquido

Organismo

de

Ensayo

Halo de Inhibición (mm)

B1 B13 J11

R5 F1 R5 F1 R5 F1

M. smegmatis 0 0 12 9 0 0

Estos resultados evidencian la diferencia en producción de antibiótico bajo diferentes

condiciones de crecimiento y fuente de carbono (Bibb, 1996). A partir de estos estudios se

eligió una de las condiciones ensayadas para realizar un escalado del proceso con el fin de

purificar el compuesto de interés de una de las cepas seleccionadas. Por otro lado se realizaron

pruebas preliminares que permitieron identificar distintas condiciones de extracción con

solventes orgánicos de los compuestos producidos por las cepas seleccionadas (Tabla 7).

A partir de estos resultados se decidió seguir trabajando con la cepa B13 creciéndola en escala

de 1 litro en medio R5 por una semana a 30°C con agitación. Se descartó utilizar la cepa B12 ya

que el compuesto no podía ser extraído con solventes orgánico y esto dificulta en mayor

medida su purificación. Para la extracción del cultivo de la cepa B13 se decidió utilizar acetato

de etilo a pH neutro. Se mezcló la fase orgánica con el medio de cultivo por una hora con

agitación, se separaron las fases, se tomó la fase orgánica y se evaporó por vacío. El extracto se

analizó por cromatografía en capa delgada (TLC) utilizando distintas tinciones (Figura 4). Una

de las tiras de la TLC se colocó en el fondo de una placa de Petri y se llenó con medio Mueller

Hinton conteniendo la cepa testigo M. smegmatis. Esto permitió identificar el compuesto con

el principio activo por comparación con las TLC reveladas con los otros reactivos.

Tabla 7. Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de los extractos de las cepas B12 y

B13 frente a M. smegmatis.

Extracto

Halo de Inhibición (mm)

30 Min.

100 °C

pH=3

H2O

pH=3

AcEt

pH=9.5

H2O

pH=9.5

AcEt H2O AcEt

B12 11 13 0 0 0 13 0

B13 23 12 18 11 0 12 14

Nota: AcEt, acetato de etilo.

Fig. 4. Cromatografía en capa delgada del extracto concentrado de la cepa B13 revelado por

bioactividad (M. smegmatis), p-anisaldehido, rodamina B y sulfato de cobre fosfórico.

Luego se realizaron una serie de pasos en columnas de sílica lo que permitió purificar e

identificar mediante NMR el compuesto producido por la cepa B13 como albociclina (Figura 5).

La identificación de este compuesto fue realizada por comparación con los compuestos

producidos por las cepas identificadas mediante los estudios genéticos con ayuda de

búsqueda bibliográfica. De esta manera se encontró que la cepa S. roseocinereus, que

Compuesto bioactivo

mostraba 100% identidad con el fragmento amplificado de la cepa B13, es una productora

natural de albociclina (Furumai et al., 1968). Dicho sea de paso esta búsqueda nos permitió

discontinuar con esta línea de investigación ya que se trataba de un compuesto conocido y sin

mucho interés actual sobre el mismo.

O

O

HO

MeO

13

2

3

4

5

6

7

8

9

12

Fig. 5. Estructura química de la albociclina

Se realizaron varios intentos más para la purificación de otros productos producidos por otras

de las cepas sin éxito por distintos motivos técnicos. Alguno de estos análisis mediante

cromatografía líquida de alta presión acoplada un detector de masa (HPLC-MS) se ven en la

Figura 6.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min]0

1

2

3

4

6x10

Intens.

FB37_1-C,5_01_839.d: TIC +All MS FB37_1-C,5_01_839.d: Solvent B

0 2 4 6 8 10 Time [min]0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10

Intens.

16_1-A,1_01_2909.d: TIC +All MS 16_1-A,1_01_2913.d: TIC -All MS

Fig. 6. Análisis por HPLC-MS de extractos de las cepas productoras

Por otro lado el interés de otro grupo de nuestro laboratorio se centra principalmente en el

estudio de inhibidores de Mycobacterias. Es por esto que otra estrategia llevada adelante en

este proyecto fue la de buscar cepas que inhiban selectivamente a M. smegmatis y no al resto

de las bacterias. Como puede observarse en Tabla 2 existen varias cepas que presentaban esta

característica: B42, B64, C22.Cabe destacar que estos resultados se habían obtenido cuando

las cepas aisladas habían sido crecidas en medio sólido de harina de soja y manitol. El análsisi

de los extractos de estas cepas arrojó un resultado que mostraba perfiles similares entre las

distintas cepas. Ya que las mismas habians sido aisladas de regiones diferentes se llevó a cabo

un control realizando la extracción con solventes del medio de cultivo sin que haya crecido

ninguna de las cepas. Lo llamativo de este caso fue que se encontró que el principio activo

estaba presente en la harina de soja. EL análisis por HPLC-MS y la búsqueda bibliográfica sobre

el tema en estudio arrojó que los flavonoides presente en la harina de soja presentan actividad

inhibitoria contra Mycobacterium (Alistair et al., 2007). La figura 7 muestra los resultados

obtenidos a partir del medio SFM. En base a esto se descartó el uso de este medio para futuros

análisis de producción de antibióticos.

0 2 4 6 8 10 Time [min]0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10

Intens.

35_1-A,2_01_2910.d: TIC +All MS 35_1-A,2_01_2914.d: TIC -All MS

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Time [min]

0

50

100

Intens.

[mAU]

35_1-D,2_01_3025.d: UV Chromatogram, 360 nm

35_1-D,2_01_3025.d: Solvent B

Fig. 7. HPLC-MS de extyratos de medio harina de soja-manitol.

Finalmente se realizaron ensayos de inhibición de Trypanosoma cruzi a partir de los extractos

de cultivos de las cepas seleccionadas. Lamentablemente los mejores extractos que

presentaban actividad antibacteriana no fueron capaces de inhibir al parásito como se muestra

en la Figura 8.

3 4 5 6 7 8 9 10 Time [min]0

1

2

3

4

5

4x10

Intens.

35_1-A,2_01_2910.d: EIC 255.1 +All MS

35_1-A,2_01_2910.d: EIC 285.1 +All MS

35_1-A,2_01_2910.d: EIC 271.0 +All MS

255.1

277.0 285.1

+MS, 6.7-6.7min #(397-401)

0

1

2

3

4

4x10

Intens.

230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z

255.1

270.0

277.0

285.1

307.0313.1

+MS, 6.9-7.0min #(413-418)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

Intens.

230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z

255.1

271.1

293.0

+MS, 7.7-7.7min #(458-462)

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Intens.

230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z

Fig. 8. Ensayos de inhibición de T. cruzi.

Conclusiones

En este proyecto se realizaron experimentos de aislamiento de cepas y posterior

caracterización de producción de metabolitos de interés medicinal por las mismas. La mayor

problemática encontrada fue el re-aislamiento de cepas y compuestos ya conocidos. Este es un

inconveniente muy común en este campo de acción que se pensaba evitar mediante la

búsqueda en lugares inhóspitos de Cuba. Sin embargo este no el éxito de este planteo no fue

el esperado. Por otro lado, si sirvió para desarrollar las capacidades operativas y de nuevas

metodologías de la gente que participo del mismo siendo muy enriquecedor para la formación

académica de los involucrados. Además se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica intensa con

los datos genómico en mano que permitió diseñar nuevas estrategias para futuros proyectos.

Como ser, se encontró que la cepa de Streptomyces eurocidicus entre optras es productora de

2-nitroimidazole más conocido como azomicina. Interesantemente este producto es un

principio activo de la droga utilizada como antichagásica Benznidazol. El 2-nitroimidazole es

actualmente produicido por la industria química para asistir la síntesis del antichagásico.

Numerosos ejemplos de la industria farmacéutica indican una preferencia de los procesos

fermentativos por sobre la síntesis química debido a que en muchos casos permite reducir

costos de producción y establecer procesos menos agresivos para el medio ambiente. Es por

esto que como corolario del presente proyecto nos proponemos explorar la posibilidad de

0.00E+00

2.00E+07

4.00E+07

6.00E+07

8.00E+07

1.00E+08

1.20E+08

1.40E+08

1.60E+08

1.80E+08

2.00E+08

0 2 4 6 8

ControlB13B12J11C22FB15

Dias post-infección

N°

Par

ásit

os/

mL

mejorar el proceso de producción de 2-nitroimidazol mediante la implementación de un

proceso fermentativo a partir de su cepa productora o la cepa J4.

Referencias bibliográficas

- Alistair K. Brown, Athina Papaemmanouil, Veemal Bhowruth, Apoorva Bhatt, Lynn G. Dover

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- Stach JEM, Maldonado LA, Ward AC, Goodfellow M & Bull AT (2003) New primers for the

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