Biología Celular MedicinaProf. Catherine Guzmán.

2011

¿COMO TRABAJAN

LAS PROTEINAS?

LA FUNCION DE UNA PROTEINA DEPEDE DE SU CAPACIDAD SELECTIVA DE UNION A DETERMINADAS

MOLECULAS (LIGANDOS)

-La región de la proteína que se asocia a su ligando recibe el nombre de sitio de unión.

- El sitio de unión está formado por aminoácidos específicos provenientes de regiones alejadas de la

cadena polipeptídica

- La unión de una proteína a su ligando es altamente específica

-La especificidad de unión depende de enlaces no covalentes: puentes hidrógeno, enlaces iónicos,

fuerzas de van der Waals e interacciones hidrofóbicas.

-Las proteínas tienen alta afinidad por su ligando.

AMP cíclico

EFECTO CATALIZADOR DE LAS ENZIMAS

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Catalizadores: las enzimas disminuyen las barreras energéticas que bloquean el desarrollo de una

reacción química.

Las enzimas estabilizan el estado de transición de la reacción al formar un complejo de unión

específico con el sustrato

Las enzimas son altamente específicas: catalizan solo una reacción

ENZIMAS

Catalasa: 2 H2O2 2H2O + O2

Condición Ea(kcal/mol) Velocidad (l/mol/seg)

No catalizado 18 1 x10 -7

Catalizado por Fe 10 56

Catalasa 2 4 x106

Energía de

activación

enzimática

Energíalibre, G

∆G

Progreso de la reacción →

PRINCIPALES CLASES DE ENZIMAS

1) Hidrolasas: catalizan rupturas hidrolíticas (adición de H20). (Proteasas,

nucleasas, fosfatasas, ATPasas).

Ej: Carboxipeptidasa A (aa-aa)n + H20 (aa-aa)n-1 + aa

3) Oxidorreductasa (deshidrogenasas): catalizan reacciones de oxido-

reduccción. Generalmente utilizan coenzimas como NAD+/FAD

Ej: Alcohol deshidrogenasa Etanol + NAD+ Acetaldehído + NADH

2) Tansferasas: catalizan la transferencia de un grupo funcional. Quinasas

Ej: Hexoquinasa D-Glucosa + ATP Glucosa-6P + ADP

4) Liasas: adicionan o remueven grupos a un C=C.

Ej: Piruvato descarboxilasa Piruvato Acetaldehído + CO2

6) Ligasas: catalizan la formación de enlaces (condensación) con aporte de

ATP. (Polimerasas, sintasas)

Ej: Piruvato carboxilasa Piruvato + CO2 + ATP OAA + ADP + P

5) Isomerasas: catalizan el reordenamiento de enlaces (isomerización) dentro

de una molécula

Ej: Glucosa isomerasa Glucosa Galactosa

PRINCIPALES CLASES DE ENZIMAS

Mecanismos de las enzimas para acelerar las reacciones

Sitio activo:Región donde se reconoce a el o los sustratos y región donde se cataliza la reacción.

Orientación de los sustratosLa enzima une dos moléculas de sustrato y los orienta precisamente para desencadenar una reacción que ocurre entre ellos

Alteración de la carga electrostática del sustratoLa enzima reordena los electrones en el sustrato creando cargas parciales negativas y positivas que favorecen la reacción

Tensión sobre el sustratoLa enzima ejerce tensión física sobre los enlaces del sustrato para favorecer la reacción

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA LISOZIMA

NOTA: Animación disponible en archivo lisozima.mov

PROTEINA KINASA A

GRUPOS PROSTETICOS

La actividad de algunas proteínas requiere de una pequeña molécula no peptídica o un metal que se une firmemente a la proteína, la mantiene en una conformación fija y participa en la unión con ligandos.

Grupo hemo Retinal

La actividad de algunas enzimas también dependen de grupos prostéticos llamados cofactores que generalmente forman un intermediario covalente con el sustrato contribuyendo a disminuir la energía libre de activación.Dentro de los cofactores se encuentran diferentes iones metálicos:Fe3+, Cu+ Zn+, Co2+, Ni+, Mg2+ Mn2+ Tambìén existen los cofactores orgánicos llamados coenzimas. Algunas se caracterizan por permitir la transferencia de grupos de una enzima a otra en reacciones acopladas Ej: NADH, FADH, Acetil-CoA

Cofactores y Coenzimas

VITAMINAS QUE PROPORCIONAN COENZIMAS EN CELULAS HUMANAS

Los complejos multienzimáticos ayudan a incrementar la velocidad del metabolismo celular

Para una célula es vital mantener la actividad meta bólica, por ejemplo, una célula típica de mamíferos recambia toda su dotación de ATP cada 1-2 minutos (=10 7 moléculas de ATP/seg)Las reacciones enzimáticas pueden estar limitadas por difusión , lo que implica la baja probabilidad de colisión entre la enzima y el sustrato.

Complejo multimérico: piruvato deshidrogenasa

E1: piruvato descarboxilasaE2: lipoamida transacetilasaE3: dihidrolipoil deshidrogenasa

REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS

REGULACION POR RETROALIMENTACION NEGATIVA

INHIBICIÓN POR RETROALIMENTACIÓN: REGULACIÓN DE VIAS METABÓLICAS CONECTADAS

• En el ejemplo: ruta de síntesis de aminoácidos (Lys, Met, Ile, -Thr) en bacterias.• Los aa. sintetizados, una vez producidos inhiben la cadena metabólica en diferentes puntos, permitiendo derivar los sustratos hacia otras vías metabólicas.

Las vías metabólicas son complejas y requieren sistemas de control elaborados que regulen cuando y cómo las reacciones enzimáticashan de ocurrir.

REGULACION ALOSTERICA

La interacción del efector (inhibidor o activador) con la proteína en el sitio alostérico, produce un cambio conformacional que altera la dispo sición espacial del sitio activo.

REGULACION ALOSTERICA NEGATIVA

REGULACION ALOSTERICA NEGATIVA

Aspartato transcarbamilasa primera enzima en la vía de síntesis de pirimidinas (C,U,T) en bacterias

REGULACION ALOSTERICA POSITIVA

REGULACION ALOSTERICA POSITIVA

Liberación alostérica de subunidades

El Ca2+ es muy utilizado para regular la actividad proteica

• La concentración de Ca2+ en el citosol es muy baja (aprox. 10-7 M).

• Cuando aumenta el Ca2+ citosólicoproteinas como calmodulina se unen a Ca2+ activándose.

• Calmodulina/Ca2+ activa a otras proteínas intracelulares actuando como un interruptor molecular.

LA UNION DE GTP GENERA CAMBIOS CONFORMACIONALES QUE ACTIVAN ALGUNAS PROTEINAS

- Las proteínas que unen GTP funcionan como interruptores moleculares.- Ejemplo: proteínas G que comunican una señal extracelular al interior de la célula

LA FOSFORILACION GENERA CAMBIOS CONFORMACIONALES QUE CONTROLAN LA ACTIVIDAD DE

LAS PROTEINAS

• Fosforilación: transferencia catalizada (por una quinasa) del grupo fosfato terminal del ATP al grupo hidroxilo de un residuo de serina, treonina o tirosina.

• La desfosforilación es catalizada por una enzima fosfatasa.

• La adición de un grupo fosfato involucra la adición de cargas que contribuyen a estimular un cambio conformacional en la proteína.

ACTIVACIÓN DE LA ENZIMA GLICÓGENO FOSFORILASA POR FOSFORILACION EN RESPUESTA A ADRENALINA

En muchos casos la conformación de las proteínas fosforiladas es reconocida por otras

proteínas activando su función.

Respuesta celular a insulina

ACTIVACION PROTEOLITICA

Las enzimas digestivas como tripsina y quimotripsina se producen como enzimas inactivas o zimógenos, que se activan por proteólisis en la luz del intestino delgado.

LA HIDRÓLISIS DE ATP PRODUCE CAMBIOS CONFORMACIONES EN LAS PROTEÍNAS MOTORAS QUE PERMITEN EL MOVIMIENTO AL

INTERIOR DE LAS CÉLULAS

NOTA: Animación disponible en archivo kinesina.mov

ANALISIS DE PROTEINAS

- Cromatografía

- Electroforesis

- Inmunopurificación

SEPARACION DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA

SEPARACION DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA

INMUNOPURIFICACION

ELECTROFORESIS EN GEL

Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene moléculas proteícas, éstas migran en una dirección y con una velocidad que refleja su tamaño y su carga neta.

Se utiliza como soporte para la migración de las proteínas una malla porosa formada por la polimerización de moléculas como la acrilamida o la agarosa.

SDS: detergente que permite solubilizar las proteínas, se asocia a las proteínas formado un complejo con ellas que posee cargas negativas en su superficie.

Mercaptoetanol: agente reductor que permite romper los enlaces S-S dentro de una cadena polipeptídica o entre cadenas diferentes.

Electroforesis: al aplicar un campo eléctrico las proteínas cargadas negativamente por el SDS migrarán hacia el polo positivo, la velocidad de migración será directamente proporcional al tamaño de la proteína (peso molecular).

Electroforesis en gelde poliacrilamida - SDS

EJEMPLO: PASOS EN LA PURIFICACION DE UNA PROTEINA

1: Extracto celular total2: Fracción obtenida de la columna de intercambio iónico3: Fracción obtenida de la cromatografía de filtración en gel4 y 5: Fracciones de la columna de afinidad donde el sustrato fue inmovilizado en la columna.En todos los carriles se ha sembrado la misma cantidad de proteína 10 ug

ISOELECTROENFOQUE

•Todas las proteínas presentan un pH característico llamado punto isoeléctrico en el cual su carga neta es cero.•En el enfoque isoeléctrico las proteínas son sometidas a una electroforesis en la cual se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de buffers.•Cada proteína se mueve hasta un punto en que su carga neta es cero, es decir, hasta alcanzar la zona de pH de su punto isoléctrico.