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FACULTAD DE FARMACIA

ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y EL PATRÓN DE

METILACIÓN DE GENES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO

EN MODELOS DIETÉTICOS DE OBESIDAD CON DIFERENTE

DISTRIBUCIÓN DE MACRONUTRIENTES

Almudena Lomba Piquer

Servicio de Publicaciones de la Universidad de Navarra

ISBN 84-8081-099-8

FACULTAD DE FARMACIA

Memoria presentada por Dª Almudena Lomba Piquer para aspirar al grado de Doctor

por la Universidad de Navarra

Almudena Lomba Piquer

El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de

Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología y autorizamos su presentación

ante el tribunal que lo ha de juzgar.

Pamplona, 8 de junio de 2010

Dr. Fermín I. Milagro Yoldi Dr. J. Alfredo Martínez Hernández

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero agradecer a la Universidad de Navarra, a la

Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra y a la Fundación IberCaja por su

financiación económica gracias a la cual he podido realizar durante estos años mi

proyecto de investigación.

Dedico un agradecimiento especial al Departamento que me acogió y en el

que me he formado: el Departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y

Toxicología. Cuando empecé esta aventura era el Departamento de Fisiología y

Nutrición, más pequeño que el Departamento actual, que además de haber

cambiado de nombre y haberse unificado con bromatología y toxicología, ha

crecido considerablemente en relación al número de personas que lo forman. A

todas ellas muchas gracias por el apoyo, interés, consejo y ayuda que me han

dedicado. Me gustaría dedicar un reconocimiento especial a mis directores de tesis

Fermín Milagro y J.Alfredo Martínez, por brindarme la oportunidad de conocer de

cerca el apasionante mundo de la investigación y de formar parte de él durante mi

aprendizaje en el Departamento. Particularmente querría destacar y agradecer la

dedicación de Fermín y su cercanía y accesibilidad, así como el continuo seguimiento

de mi trabajo.

Todavía me parece extraño que este momento haya llegado para mí. Parece

que fue ayer cuando llegué al Departamento que ha sido mi casa durante estos 4

años que han pasado mucho mas rápido de lo que nunca hubiera imaginado. Sin

embargo, antes de que esta etapa termine me gustaría dedicar unas palabras a las

personas que han compartido de cerca estos años conmigo: a mis compañeros y

amigos del “Depar”. En primer lugar quisiera recordar a las 2 últimas personas que

defendieron la tesis y con las que tuve la oportunidad de compartir muchas

experiencias: mis amigas Blanca y Cris. Muchas gracias a las 2 por todos los

momentos vividos y el apoyo que supone tener cerca a 2 personas más veteranas

que siempre me han ayudado y que, de no haber sido por nuestro paso por el

“Depar” no hubiera conocido. Cris, muchas gracias también en esta etapa final de

la tesis: qué hubiera hecho yo sin tus explicaciones sobre los estilos del Word! Has

sido en esto y en otras cosas como una “pequeña censora”.

También recuerdo con cariño a Ana “la de Bioquímica” porque en mis

primeros meses en el Departamento fue mi maestra, la persona con la que aprendí

las primeras técnicas de laboratorio y me acogió como si me conociera de siempre.

Gracias Anita y espero que tengas mucha suerte en el nuevo proyecto en el que

estás inmersa. Ánimo!

Ahora quiero recordar a mis 2 “compañeros de fatigas”, a Helen y Diego,

que se encuentran en las mismas circunstancias que yo, muy próximos a defender

sus tesis. Helen gracias por tu ayuda, por estar pendiente de mis avances y por tu

saber estar. Diego, gracias porque desde el principio de mis andanzas por el

Departamento siempre estuviste dispuesto a tenderme una mano y a ayudarme,

en los momentos buenos y en los menos buenos. Gracias por tu paciencia y

disponibilidad. Llegarás lejos.

También quiero tener ahora un recuerdo muy especial para Bea, Adri y

Laurilla que son mis 3 amigas que me precederán y para las que en poco tiempo

comenzará la cuenta atrás. Bea, vales mucho y pase lo que pase siempre tienes un

buen gesto y una sonrisa, lo cual es digno de valorar y agradecer. Adri, en la

mayoría de buenos recuerdos que me llevo del “Depar”, siempre estás tú, valoro

mucho tu optimismo, compañerismo, buen humor y amistad. Laurilla, no tengo

palabras para agradecerte todo lo que has cuidado a tu compañera de sitio, me has

prestado ayuda incondicional y había momentos en los que incluso has detenido tu

trabajo para agilizar el mío. No olvido tu ayuda con el EndNote y tu “no te

preocupes” cuando me agobiaba al darme cuenta que me estabas dedicando algo

más que un cuarto de hora. Gracias por tu disponibilidad, paciencia y generosidad.

A Itzi, por su ayuda y por estar ahí siempre que la he necesitado. A Pedro

González‐Muniesa, con quien solo he tenido la oportunidad de coincidir éste año.

Tu presencia ha sido muy favorable para la armonía del grupo y aunque he

coincidido poco contigo siempre tienes algo agradable que decir y estás muy

pendiente de todo el mundo. Gracias.

A Santi por su simpatía y su cercanía. No llevas mucho tiempo en el “Depar”

pero te hiciste un hueco entre nosotros con gran facilidad. Gracias por tu

amabilidad.

Agradezco también al resto de mis compañeros, Tara, Ceci, Rocío, Pablo,

Paúl, Pedro Prieto, María, Marta, Noe, Mentx, Jonay, Carlos, José Antonio, Ana,

Pilar, Lorena. Aprovechad mucho el tiempo y disfrutad de estos años porque pasan

volando. Ana Laura, gracias por tu apoyo, por aportarme una visión siempre

positiva de los acontecimientos y por tu eterna sonrisa. “Ido” gracias por animarme

desde la distancia.

Gracias también a las técnicos Ana, Vero y Asun y a las secretarias del

Departamento Paula y Bea por su ayuda y su disponibilidad. Asun, ha sido genial

coincidir contigo todos los martes y jueves antes de inglés.

Agradezco a todas aquellas personas con las que he coincidido y que, de un

modo u otro, han participado en esta fase de mi vida.

Quiero ahora recordar a mi amiga de la carrera Melania que siempre ha

seguido mis pasos muy de cerca y no ha dejado de estar pendiente de mí desde

hace 12 años. Gracias por tu lealtad y tu amistad. Mucho ánimo, dentro de poco

serás tu la que estés escribiendo los agradecimientos de tu tesis.

A mi incondicional amiga Ame que desde que empecé esta etapa siempre

ha estado apoyándome y sabe de mi evolución y mis publicaciones casi más que yo

misma. Gracias por tus continuos e‐mails de ánimo y apoyo y por estar siempre

dispuesta a escucharme. Gracias por tu amistad.

A mis compañeras de piso de mi etapa de doctorado Amparo, Maca y

Gracia. Me habéis ayudado mucho en bastantes aspectos pero sobretodo a crecer

como persona. Doy gracias a Dios de que hallamos podido compartir tantos

momentos juntas y sé que nunca dejaré de contar con vuestra amistad.

A mis padres que siempre me han apoyado en todo, en concreto a mi

madre que siempre está dispuesta a escuchar mis rollos aunque no sepa de qué le

hablo. Mamá y Papá, GRACIAS.

A mis hermanos Miguel y Mar (y Alfonso, que eres como mi hermano

también). Sois los mejores y cada uno a su manera me apoya. Muchas gracias.

A Miguelito, mi sobrino preferido, por alegrarme éste último año de tesis

aunque él no haya sido consciente de ello. Eres un cielo.

Por último quiero dar las gracias a Edu, mi marido, por su alegría, su

paciencia, su optimismo, su serenidad y su sentido común. Porque tú eres el que

ha vivido ésto más de cerca y has sabido comprenderme y apoyarme en cada

momento según correspondía. GRACIAS.

Me alegra darme cuenta que, además de una tesis, me llevo de estos cuatro

años un montón de amigos y de gente que me ha demostrado muchas cosas y han

sido mi gran apoyo. Sin vosotros no hubiera llegado al final.

Esta tesis está dedicada a todos vosotros.

“Lo extraordinario es imposible para los que miden sus dificultades, imaginando que lo que no ha sucedido no puede suceder”

(William Shakespeare)

A Dios

A mis padres

A Miguel, Mar y Alfonso

A Miguelito

A Edu

“La doctrina del hombre se prueba por su paciencia”

(Pr, 19, 11)

ÍNDICE

Índice

‐14‐

ÍNDICE ................................................................................................... 13

ABREVIATURAS ..................................................................................... 16

INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 19

1. OBESIDAD ........................................................................................................... 20

1.1. Definición, prevalencia e importancia en salud pública ............................. 20

1.2. Causas ......................................................................................................... 23

1.3. Complicaciones asociadas .......................................................................... 24

2. HÁBITOS DIETÉTICOS Y OBESIDAD ..................................................................... 29

2.1. Distribución de macronutrientes ............................................................... 29

2.2. Tipos de dietas ............................................................................................ 30

3. MODELOS DE ESTUDIO ....................................................................................... 35

4. EPIGENÉTICA ....................................................................................................... 39

4.1. Definición y clasificación de los procesos epigenéticos ............................. 39

4.2. Influencia de la dieta en los procesos de metilación del ADN ................... 44

4.3. La Epigenética como herramienta para el estudio de la susceptibilidad a

desarrollar trastornos metabólicos ........................................................................ 49

OBJETIVOS ............................................................................................ 53

DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA ............................................. 56

1. DISEÑO EXPERIMENTAL GENERAL ...................................................................... 57

2. REQUERIMIENTOS ÉTICOS .................................................................................. 57

3. ANIMALES Y DIETAS ............................................................................................ 59

4. DETERMINACIONES IN VIVO ............................................................................... 61

4.1. Calorimetría indirecta ................................................................................. 61

4.2. Test de sobrecarga intraperitoneal de glucosa .......................................... 62

5. DETERMINACIONES SEROLÓGICAS..................................................................... 63

6. DETERMINACIONES HEPÁTICAS ......................................................................... 64

7. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ................................................................... 64

8. ESTUDIOS DEL PATRÓN DE METILACIÓN DEL ADN: TECNOLOGÍA MASSARRAY‐

SEQUENOM ................................................................................................................ 69

9. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS ..................................................... 71

Índice

‐15‐

RESULTADOS ...................................................................................... .. 72

DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................. 97

1. CONSIDERACIONES GENERALES ......................................................................... 98

2. VALORACIÓN DE LOS EFECTOS DE LAS DIFERENTES DIETAS ISOCALÓRICAS

SOBRE EL PESO CORPORAL Y EL METABOLISMO ENERGÉTICO .................................. 99

3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y METILACIÓN DEL ADN EN GENES CLAVE

DEL METABOLISMO LIPÍDICO Y GLUCÍDICO ............................................................. 108

CONCLUSIONES ................................................................................... 116

BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 119

ANEXOS ............................................................................................... 153

ABREVIATURAS

Abreviaturas

‐17‐

ADN ó DNA: Ácido desoxirribonucléico

ARN ó RNA: Ácido ribonucléico

C: Dieta control

Ct: “Threshold cycle”

DM2: Diabetes mellitus tipo 2

ECV: Enfermedad cardiovascular

EE: Gasto energético

ELISA: Enzimainmunoensayo

FAS: Ácido graso sintasa

FFA: Ácidos grasos libres

GAPDH: Gliceraldehído ‐3‐ fosfato deshidrogenasa

GCK: Glucokinasa

HADHB: Hidroxiacil‐ CoA deshidrogenasa

HATs: Histonas acetiltransferasas

HDACs: Histonas desacetilasas

HDL: Lipoproteínas de alta densidad

HFD: Dieta “high fat diet”

HFS: Dieta “high fat sucrose”

HOMA‐IR: “Homeostatic model assessment index”

HS: Dieta “high sucrose”

IFN‐ gamma: Interferón gamma

IL‐4: Interleuquina 4

IL‐6: Interleuquina 6

IMC: Índice de masa corporal

Kcal: Kilocalorías

MDA: Malondialdehído

Abreviaturas

‐18‐

MnSOD: Manganeso superóxido dismutasa humana

NAFLD: Hígado graso no alcohólico

NDUFB6: NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1‐ beta subcomplejo 6

OXPHOS: Fosforilación oxidativa

RP: Tejido adiposo retroperitoneal

RQ: Cociente respiratorio

RT‐ PCR: Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real

SAH: S‐ adenosil‐L‐ homocisteína

SAM: S‐ adenosil‐L‐ metionina

SC: Tejido adiposo subcutáneo

TBARS: “Thiobarbituric acid‐reactive substance”

TG: Triglicéridos

TNF‐ alfa: Factor de necrosis tumoral alfa

WAT: Tejido adiposo blanco

INTRODUCCIÓN

Introducción

‐20‐

1. OBESIDAD

1.1. Definición, prevalencia e importancia en salud pública

La obesidad se define como una enfermedad crónica multifactorial

caracterizada por un aumento de la masa grasa, y por lo tanto del peso corporal,

como consecuencia de un balance energético positivo mantenido en el tiempo

(Salas‐Salvado y cols., 2007). Esta ganancia de peso supone normalmente un

aumento de las reservas del organismo en forma de grasa en relación con el

promedio normal para la edad, sexo, talla y complexión (Damcott y cols., 2003);

(Moreno‐Aliaga y cols., 2005). Actualmente se considera la obesidad como una de

las alteraciones metabólicas de mayor repercusión no sólo desde el punto de vista

sanitario, sino también desde ámbitos psicológicos, sociales y económicos

(Friedman y Fanning, 2004). Este fenómeno, de naturaleza epidémica, se debe en

gran medida a los cambios ambientales y sociales que han tenido lugar en las

últimas décadas (Martinez, 2000) y que han interaccionado con una determinada

predisposición génica (Marti y cols., 2008; Martinez y cols., 2007).

Actualmente, este trastorno se ha convertido en una pandemia, con

creciente prevalencia (Martinez y cols., 2004), que supone una grave amenaza para

la salud pública, debido al riesgo a desarrollar enfermedades asociadas como la

diabetes, hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento del riesgo de padecer

cáncer, insuficiencia respiratoria y osteoartritis, entre otras (Salas‐Salvado y cols.,

2007), y por el elevado coste sanitario que se deriva de las mismas (Ballesta y cols.,

2006).

La organización mundial de la salud (OMS) estima que más de mil millones

de adultos en todo el mundo tiene sobrepeso, de los cuales 300 millones son

clínicamente obesos, siendo particularmente alarmante el marcado incremento en

la edad infantil (WHO/OMS, 2003). Las tasas de obesidad, del orden del 15% en

Europa (Lobstein y Frelut, 2003) y superiores al 30% en Norteamérica (WHO/OMS,

2003), justifican los esfuerzos de la comunidad científica para investigar las causas

de esta enfermedad, entre las que se encuentran componentes genéticos y

Introducción

‐21‐

endocrinos junto con factores ambientales: inadecuados hábitos dietéticos y

modelos sedentarios de actividad física (Moreno‐Aliaga y cols., 2005).

El grado de obesidad en adultos se establece preferentemente con relación

al índice de masa corporal (IMC) resultado de la división del peso corporal (kg)

entre el cuadrado de la talla (m2). Aunque el IMC no es aplicable como indicador de

adiposidad en ciertos casos, como deportistas, mujeres gestantes y ancianos, es el

índice utilizado por la mayoría de los estudios epidemiológicos y organizaciones de

salud internacionales para el uso clínico dada su reproductividad, facilidad de

utilización y capacidad de reflejar la adiposidad en la mayoría de la población

(Salas‐Salvado y cols., 2007).

Tabla 1. Clasificación del índice de masa corporal (IMC) según los últimos criterios de la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (Salas‐Salvadó y cols., 2007).

Los datos actuales revelan que la tasa de obesidad en España se aproxima al

15,5%, siendo más elevada a partir de los 45 años, en el colectivo femenino y en las

personas con menor nivel de instrucción (Salas‐Salvado y cols., 2007). A su vez, la

prevalencia de sobrepeso se estima en un 39,2%, siendo más elevada en el

colectivo masculino. En conjunto, el exceso ponderal se estima que afecta al 54,7%

de la población española entre 25 y 64 años (Salas‐Salvado y cols., 2007). Estas

tasas son especialmente preocupantes en la población infantil y juvenil (entre 2 a

24 años) que se sitúa actualmente en un 26,3% de sobrepeso y obesidad (Aranceta‐

Valores límite

CATEGORÍA del IMC (kg/m2)

Peso insuficiente < 18,5

Normopeso 18,5‐24,9

Sobrepeso grado I 25‐26,9

Sobrepeso grado II (pre‐obesidad) 27‐29,9

Obesidad tipo I 30‐34,9

Obesidad tipo II 35‐39,9

Obesidad tipo III (mórbida) 40‐49,9

Obesidad tipo IV (extrema) > 50

Valores límite

CATEGORÍA del IMC (kg/m2)

Peso insuficiente < 18,5

Normopeso 18,5‐24,9

Sobrepeso grado I 25‐26,9

Sobrepeso grado II (pre‐obesidad) 27‐29,9

Obesidad tipo I 30‐34,9

Obesidad tipo II 35‐39,9

Obesidad tipo III (mórbida) 40‐49,9

Obesidad tipo IV (extrema) > 50

Introducción

‐22‐

Bartrina y cols., 2005). Datos preliminares del estudio DRECE (Dieta y Riesgo de

Enfermedades Cardiovasculares en España) muestran que en 14 años se ha

producido un incremento del 34,5% en la prevalencia de personas con exceso de

peso corporal (Gutierrez‐Fisac y cols., 2004).

Figura 1. Distribución de la prevalencia de obesidad en España (%) por áreas geográficas y sexo. Estudio DORICA “Dieta y Riesgo Cardiovasculares en España” (2005).

Los estudios que analizan el impacto económico de la obesidad sobre el

gasto sanitario, incluyendo el coste directo de su tratamiento, así como los gastos

indirectos que ocasiona, coinciden en atribuir porcentajes muy importantes (entre

el 2 y 7%) del presupuesto sanitario en diferentes países (Ballesta y cols., 2006). El

coste económico que implica la obesidad en España, según el estudio Delphi, se ha

estimado en unos 2.500 millones de euros anuales, lo que supone casi un 7% del

coste sanitario total (Gonzalez‐Zapata y cols., 2007).

Introducción

‐23‐

1.2. Causas

Las causas de la obesidad se basan en el desequilibrio producido en la

ecuación que comprende tanto a la ingesta de energía como a la energía que es

liberada por el organismo en favor de la primera variable. Este exceso de energía se

acumula en las células grasas del tejido adiposo que, debido a este fenómeno,

aumentan su volumen tanto de forma hipertrófica (aumento de tamaño) como

hiperplásicamente (aumento de número de células) (Bray, 2004a). El depósito

excesivo de lípidos conduce a diversos problemas clínicos relacionados con la

obesidad, ya sea directamente por la grasa extra acumulada o debido al aumento

de secreción de ácidos grasos libres y de diversos péptidos, que pueden

determinan el establecimiento de un estado pro‐inflamatorio que puede ser

dañino para las células de este tejido y que puede ser un factor determinante en el

establecimiento de obesidad y de sus patologías relacionadas (Bray 2004a).

Existen diversos factores que influyen en el exceso de peso y en el

subsiguiente establecimiento de la obesidad. Además, estos factores determinan

las diferencias que se presentan en la prevalencia de obesidad entre los distintos

países alrededor del mundo (Seidell, 1995). Estos factores son de tipo:

Demográfico: la edad y la etnia.

Sociocultural: el nivel de educación (la población con niveles de educación

más bajos presentan mayor prevalencia de obesidad), el nivel económico o la

profesión (la obesidad se relaciona con los estratos de ingresos más bajos) y el

estado civil (después del matrimonio suele aumentar el sobrepeso)

Biológico: el número de hijos se relaciona con mayor sobrepeso.

Conductual y ambiental: la nutrición (grasa de la dieta), el tabaco (al

abandonarlo se suele aumentar de peso), el alcohol (un elevado consumo de

bebidas alcohólicas se relaciona con un aumento del IMC) y por supuesto la

Introducción

‐24‐

actividad física (las personas físicamente más activas tienden a ser más delgadas

que aquellas que optan por el sedentarismo).

Otro de los factores que pueden determinar tanto la presencia de obesidad

como la distribución de los tejidos grasos entre las distintas partes del organismo

corresponde a la genética. Este hecho es más evidente a partir de estudios

familiares, de gemelos y de adopción (Calle y Thun, 2004). A partir de estas

investigaciones se ha estimado que entre el 40 y el 70% de los casos de sobrepeso

se encuentran relacionados con factores hereditarios (Comuzzie, 2002).

Sin embargo, los factores genéticos por sí solos no pueden determinar con

total seguridad la presencia de obesidad. Es necesario que estos factores se

asocien a factores sociales/ambientales, especialmente a aquellos relacionados con

una mayor disponibilidad de comidas densas calóricamente y a un estilo de vida

que cada vez facilite más la inactividad física. Es decir, los factores genéticos

predisponen a la enfermedad, pero son los factores ambientales los que potencian

y determinan su efecto final sobre el metabolismo (Marti y cols., 2008).

1.3. Complicaciones asociadas

El exceso de este tejido adiposo se acompaña de un aumento dramático en

el desarrollo de insulino‐resistencia y diabetes tipo 2, así como también de

dislipidemia, hipertensión, y de enfermedades cardiovasculares (Glass y Witztum,

2001). En términos generales, las patologías implicadas con la obesidad se pueden

clasificar a grandes rasgos dentro de dos categorías: las que son consecuencia

directa del aumento de la masa de tejido graso y aquellas enfermedades que están

relacionadas con los cambios metabólicos producidos debido al exceso de grasa

(Figura 2).

Introducción

‐25‐

Figura 2. Los problemas de salud asociados a la obesidad pueden ser atribuidos tanto al incremento de tamaño de las células de grasa o al incremento en la masa total del tejido adiposo. ECV, enfermedad cardiovascular; DM2, diabetes mellitus tipo 2; NAFLD, enfermedad del hígado graso no alcohólico (modificado de Bray, 2004a).

De esta forma, dentro de las que son consecuencia directa del aumento de

grasa se incluyen:

a) Estigma social: el sobrepeso se encuentra altamente estigmatizado en la

sociedad (Gortmaker y cols., 1993), lo que hace que los individuos que padecen

obesidad se encuentren expuestos a múltiples consecuencias psicológicas debido a

al rechazo social.

b) Apnea del sueño: en sujetos obesos se han observado alteraciones en

las funciones pulmonares debido a la disminución del volumen de los pulmones

provocada por la elevación de la presión producida en el diafragma debido al

aumento de la masa de tejido graso. En algunos casos, el sobrepeso asociado a la

apnea del sueño puede convertirse en un trauma bastante serio para la salud

(Poulain y cols., 2006)

Introducción

‐26‐

c) Osteoartritis: la obesidad aumenta considerablemente la presencia de

esta anomalía. El desarrollo de esta enfermedad se traduce en un aumento

considerable en el coste económico que conlleva la obesidad (Felson, 1992).

Dentro de los desordenes metabólicos derivados del exceso de grasa en el

organismo se destacan: la insulino‐resistencia, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y el

síndrome metabólico, la enfermedad del hígado graso no‐alcohólico (NAFLD) y la

esteatohepatitis no‐alcohólica, la colelitiasis, la hipertensión y enfermedad

cardiovascular (ECV), cáncer y cambios endocrinos:

a) DM2, insulino‐resistencia y síndrome metabólico: la DM2 se encuentra

altamente relacionada a la presencia de sobrepeso tanto en mujeres como en

hombres y además en todos los grupos étnicos. El riesgo de padecer diabetes

aumenta considerablemente con el grado y duración del sobrepeso, sobretodo si la

acumulación de grasa es de tipo visceral. La presencia de la insulino‐resistencia

esta relacionada con la presencia de obesidad, y se ha observado que valores altos

de IMC se correlacionan con una alta secreción de insulina. Además esta insulino‐

resistencia es uno de los indicadores por excelencia del síndrome metabólico (Chan

y cols., 1994; Colditz y cols., 1995). El síndrome metabólico es el resultado de una

combinación de factores genéticos y ambientales asociados al estilo de vida, en los

que la obesidad visceral y la resistencia a insulina se consideran los componentes

patogénicos fundamentales. Está relacionado con un incremento significativo del

riesgo de diabetes, enfermedad coronaria y enfermedad cerebrovascular , con

aumento del riesgo de mortalidad (DeFronzo y Ferrannini, 1991). Existen diversas

definiciones del síndrome metabólico establecidas por diversos organismos: World

Health Organization, Internacional Diabetes Federation, European Group for the

Study of Insulin Resistance, American College of Endocrinology (Day, 2007) entre

las que cabe destacar la plasmada en el tercer informe del National Cholesterol

Education Program Expert Panel of Detection, Evaluation and Treatment of High

Blood Cholesterol in Adults (ATP III) (Grundy y cols., 2004). Según el criterio del ATP

III, el síndrome metabólico para ser considerado como tal debe cumplir 3 o más de

los siguientes factores:

Introducción

‐27‐

Obesidad central, definida por una medición del perímetro de la cintura: ≥ 102 cm

en varones y ≥ 88 cm en mujeres.

Aumento de los triglicéridos: ≥ 150 mg/dL (1,7 mmol/L).

cHDL (colesterol unido a proteínas de alta densidad) reducido: < 40mg/dL

(1,03mmol/L) en varones, <50 mg/dL (1,3 mmol/L) en mujeres.

Aumento de la presión arterial: sistólica ≥ 130 y/o diastólica ≥ 85 mmHg, o toma de

tratamiento antihipertensivo.

Aumento de la glucosa plasmática en ayuno: glucemia ≥100 mg/L (5,6 mmol/L).

b) Hígado graso no‐alcohólico (NAFLD) y esteatohepatitis no‐alcohólica: el

hígado graso se define como un conjunto de anomalías desarrolladas en este

órgano y que están altamente asociadas a la obesidad. El sobrepeso se ha

relacionado con una prevalencia de 75% de esteatosis, 20% de esteatohepatitis y

un 2% de cirrosis en un estudio llevado a cabo en pacientes del norte de Italia

(Bellentani y cols., 2000).

c) Colelitiasis: tanto la hiperinsulinemia, la dislipidemia como la obesidad

son factores de riesgo conocidos para el desarrollo de esta patología hepatobiliar

(Boland y cols., 2002). Este aumento en el riesgo se puede explicar por el aumento

del colesterol, cuya producción es directamente proporcional a la cantidad de

grasa extra del cuerpo, y además por el aumento de grasa en el hígado, ligado a la

obesidad (Bray, 2004a).

d) Hipertensión: la obesidad, y en particular la obesidad de tipo central o

visceral, ha sido consistentemente asociada a hipertensión y a riesgo

cardiovascular. Según estudios poblacionales, al menos dos tercios de la

prevalencia de hipertensión está ligada directamente a la obesidad (Krauss y cols.,

1998).

e) ECV: el aumento en el peso corporal se ha asociado con numerosas

anormalidades cardíacas. Por ejemplo, el riesgo en mujeres de Estados Unidos a

desarrollar una enfermedad coronaria se encuentra aumentado 3,3 veces en

aquellas que presentan un IMC mayor a 29 Kg/m2 al compararlas con mujeres con

un IMC menor a 21 Kg/m2 (Manson y cols., 1995).

Introducción

‐28‐

f) Cáncer: se ha observado que personas que presentan sobrepeso son

más susceptibles a desarrollar ciertos tipos de cáncer, como los de tipo colorrectal,

de mama, endometrio, hígado, esófago, próstata, entre otros (Calle y Thun, 2004).

g) Cambios endocrinos: los cambios en el sistema reproductor son los más

importantes que se encuentran relacionados con el sobrepeso (Metwally y cols.,

2008).

A nivel hematológico, en pacientes obesos se ha observado un aumento de

los niveles circulantes del factor activador del plasminógeno (PAI‐1), así como en

pacientes con diabetes tipo II. Cuanto más graves son las manifestaciones del

síndrome metabólico, más alto es el nivel plasmático de PAI‐1 (Juhan‐Vague y cols.,

2003). El síndrome metabólico explica una parte importante del nivel de variación

plasmática de PAI‐1, siendo esta relación más fuerte en hombres que en mujeres

(45% vs. 26%) (Henry y cols., 1998). Estudios de intervención sugieren que si se

mejora la resistencia a la insulina, el disminuyen los niveles plasmáticos de PAI‐1.

Se ha propuesto tomar en consideración el aumento de los niveles de PAI‐1 como

un componente real del síndrome metabólico (Juhan‐Vague y cols., 1991).

Además, la obesidad se ha asociado con un estado pro‐inflamatorio y de

estrés oxidativo, debido a la liberación de citoquinas características de inflamación

(como IL‐6 y TNF‐alfa secretadas por los macrófagos que migran al tejido adiposo

en la adipogénesis) y la formación de especies reactivas de oxígeno como

consecuencia de la disfunción mitocondrial presentada en personas obesas. En los

seres humanos, se han detectado citoquinas proinflamatorias circulantes en

individuos obesos, lo que sugiere un estado de desregulación de la respuesta

inflamatoria. En modelos animales, tanto en estudios genéticos como en obesidad

inducida por la dieta, este trastorno aparece asociado con la disfunción inmune

(Lamas y cols., 2004; Mancuso y cols., 2006). In vitro, la secreción de citoquinas

inflamatorias como la IL‐4 e IFN‐gamma se encontró deteriorada (Mito y cols.,

2000). Estos hechos a su vez dan pie para el desarrollo de muchas de las secuelas

metabólicas negativas de la enfermedad, como la resistencia a la insulina o la

arteriosclerosis (Greenberg y Obin, 2006). Estos fenómenos también completan el

Introducción

‐29‐

círculo vicioso en el cual este estado pro‐inflamatorio actúa sobre los mismo

adipocitos, modificando su señalización e induciendo nuevos procesos

proadipogénicos con características patogénicas (Galinier y cols., 2006).

2. HÁBITOS DIETÉTICOS Y OBESIDAD

2.1. Distribución de macronutrientes

La alta disponibilidad de alimentos, el aumento de la densidad energética

de los mismos y la disminución de la actividad física, son factores que están

contribuyendo en gran medida al aumento del peso corporal (Goris y Westerterp,

2008). Así, la alimentación desempeña un papel clave en la génesis de la obesidad y,

por tanto, su modificación va a ser fundamental en la prevención y tratamiento del

sobrepeso, obesidad (Bray y cols., 2004b), y síndrome metabólico (Muzio y cols.,

2007).

En relación a los estudios de la distribución de macronutrientes en las dietas,

inicialmente se hipotetizó que la alta ingesta de grasa era la causante exclusiva del

aumento en la prevalencia de la obesidad, lo que llevó al establecimiento de dietas

hipocalóricas mediante la disminución de la ingesta lipídica. Sin embargo, diversos

estudios demostraron que a pesar de haber disminuido la grasa de la dieta y por

tanto la ingesta calórica total, los índices de obesidad continuaban aumentando

(Best y Grainger, 2007). Así se demostró que aquellas dietas con menor contenido

en grasa producían modestas pérdidas de peso a corto plazo pero difícilmente

sostenibles a lo largo del tiempo (Abete y cols., 2006). Posteriormente, las

investigaciones se centraron en el contenido en hidratos de carbono de las dietas.

Al reducir el contenido lipídico aumentaba la ingesta de hidratos de carbono, los

cuales parecían ser los responsables de los desequilibrios hormonales (elevados

niveles de insulina) que conducían a una ingesta continuada, dificultando la

adherencia a la dieta. Así, la restricción de la ingesta de los hidratos de carbono se

estableció como una nueva estrategia nutricional para el control de la obesidad

Introducción

‐30‐

(Malik y Hu, 2007). Este tipo de dietas parecían mejorar la pérdida de peso y ciertas

variables metabólicas comparadas con las de alto contenido en carbohidratos, sin

embargo tampoco aseguraban el mantenimiento del peso perdido a largo plazo.

Por otro lado, se demostró que ciertos alimentos o sustancias presentes en

los mismos, podrían influir específicamente en el tratamiento y prevención de la

obesidad (Abete y cols., 2008). Por este motivo, numerosas investigaciones tratan

de determinar la influencia específica de los diferentes macro y micronutrientes

presentes en los alimentos sobre la regulación del peso corporal. Así, no sólo se

tiene en cuenta la distribución de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas, sino

el tipo de restricción energética (Abete y cols., 2010).

2.2. Tipos de dietas

2.2.1 Dietas con alto contenido en grasa

Estas dietas suelen ser denominadas “dietas con bajo contenido en hidratos

de carbono (low‐carbohydrate)” y/o con alto contenido en grasas o “dietas

cetogénicas”, ya que tienden a provocar cetosis (Bellido, 2004). La distribución de

macronutrientes suele ser de entre 45‐65% de lípidos, mientras que el contenido

en hidratos de carbono puede ser inferior al 30% del total de energía (McAuley y

cols., 2006).

Las dietas con muy baja proporción en carbohidratos, pero con un alto

contenido en grasa, son anunciadas a través de los medios de comunicación como

apropiadas para perder peso corporal y mejorar el estado de salud (Abete y cols.,

2006). Aunque se considera que este tipo de dietas no parece incrementar el riesgo

de enfermedad cardiovascular y diabetes tipo 2 (Freedman y cols., 2001), la

Asociación Americana de Diabetes recomienda actualmente una reducción en el

contenido de grasa y un incremento en el aporte de carbohidratos complejos

(American Diabetes Asotiation, 2002). Por otra parte, la reducción del número de

calorías a partir de una dieta con elevado aporte de grasas, atenúan pero no

impiden el desarrollo de resistencia a la insulina y obesidad en ratones (Petro y

Introducción

‐31‐

cols., 2004), lo que deja en evidencia el importante papel que juega la distribución

de macronutrientes y su contenido en estos fenómenos. Además, las dietas con

alto contenido lipídico suelen aportar una alta proporción de grasas saturadas y

una pequeña cantidad de grasas poliinsaturadas, siendo a menudo éste tipo de

dietas las consumidas por pacientes obesos y con enfermedad de hígado graso no

alcohólico (NAFLD) (Musso y cols., 2003).

Una ingesta elevada de ácidos grasos saturados se halla estrechamente

relacionada con la incidencia de enfermedades cardiovasculares, mientras que los

ácidos grasos insaturados tendrían un papel protector frente a este tipo de

trastornos (Slavin, 2005).

Por otro lado, la restricción de los hidratos de carbono implica la

movilización de grasa como fuente de energía, dando lugar a la formación de

cuerpos cetónicos y disminución del apetito como consecuencia del descenso de

los niveles plasmáticos de glucosa e insulina (Freedman y cols., 2001).

2.2.2 Dietas con alto contenido en azúcares simples

La base de este tipo de dietas es, por un lado, disminuir la densidad

energética de la dieta dado el elevado aporte de energía por gramo de grasa (9

kcal/g) respecto a los hidratos de carbono (4 kcal/g) o las proteínas (4 kcal/g), por

lo que una reducción en la ingesta de grasa daría lugar a un descenso de la ingesta

calórica (McMillan‐Price y Brand‐Miller, 2004). Por otro lado, el efecto termogénico

inducido por la grasa es menor que el de las proteínas e hidratos de carbono, lo

que supone un gasto energético menor en su utilización (McMillan‐Price y Brand‐

Miller, 2004). Finalmente, los alimentos de igual contenido calórico, con mayor

proporción de grasa, son menos saciantes que los que presentan mayor contenido

en carbohidratos y proteínas. Por todo esto, los hidratos de carbono han sido

tradicionalmente recomendados en lugar de las grasas. Sin embargo, estudios

nutricionales recientes han demostrado que dependiendo del tipo de hidrato de

carbono consumido, una elevada ingesta de los mismos puede provocar un

aumento en los niveles de triglicéridos y favorecer su almacenamiento en forma de

grasa corporal (Noakes y Clifton, 2004); (Strychar, 2006). De hecho, programas de

Introducción

‐32‐

intervención han confirmado que el tipo de glúcido (simple o complejo) influye en

la evolución de parámetros metabólicos (Gaesser, 2007; Raben, 2002). Así, los

azúcares simples (y de alto índice glucémico) son digeridos y absorbidos

rápidamente, incrementando las demandas de insulina y aumentando el riesgo de

desarrollar diabetes mellitus tipo 2 (Schulze y cols., 2004). Los hidratos de carbono

complejos (y de bajo índice glucémico) han sido propuestos para el tratamiento y

prevención de la obesidad, ya que son absorbidos lentamente, disminuyen la

glucemia e hiperinsulinemia postprandial y producen una mayor sensación de

saciedad, que a su vez provoca la disminución de la ingesta energética (Riccardi y

cols., 2008), favoreciendo así el control del peso corporal (McMillan‐Price y Brand‐

Miller, 2004).

El consumo excesivo de azúcares se ha relacionado con varias anomalías

metabólicas y estados de salud adversos en seres humanos. Aunque los ensayos

experimentales son limitados, la evidencia de estudios observacionales y de meta‐

análisis en el ser humano han relacionado un mayor consumo de refrescos con una

ingesta energética mayor, incremento en el peso corporal y un menor consumo de

nutrientes esenciales (Johnson y cols., 2009; Vartanian LR y cols., 2007).

Se ha demostrado que las dietas ricas en sacarosa presentan efectos

perjudiciales en lo referente a la acción de la insulina en ratas, tanto a nivel

hepático como periférico (Pagliassotti y Prach, 1995; Podolin y cols., 1998; Storlien

y cols., 1988). Durante su absorción, la sacarosa se hidroliza en cantidades iguales

de fructosa y glucosa. En consecuencia, las dietas ricas en fructosa se han

comparado directamente con aquellas que presentan un alto nivel de glucosa o

elevado porcentaje de almidón en su composición, en un intento de distinguir qué

fracción del disacárido de sacarosa induce de forma mayoritaria el estado de

resistencia insulínica en ratas (Thorburn y cols., 1989; Tobey y cols., 1982). El

estudio llevado a cabo por Thorburn y cols., (1989) demostró que una dieta que

contenía 35% de fructosa produjo resistencia a la insulina, mientras que una dieta

que contenía 35% de glucosa, no lo hizo. Otro estudio experimental llevado a cabo

en ratas comparó los efectos de dietas ad libitum ricas en sacarosa, fructosa y

glucosa, y fructosa y almidón, estudiando la insulino‐resistencia y la tolerancia a la

Introducción

‐33‐

glucosa desarrollada por los 3 grupos dietéticos, sugiriendo sus resultados que la

fructosa es el principal mediador de nutrientes que produce la intolerancia a la

glucosa y la insulino‐resistencia inducida por dietas ricas en sacarosa (Thresher y

cols., 2000).

Sin embargo, el tema está en discusión debido al hallazgo de datos

controvertidos en relación al sobrepeso. Así, aunque muchos estudios

epidemiológicos han mostrado una relación positiva entre un mayor consumo de

bebidas azucaradas y el riesgo de la obesidad (Bachman y cols., 2006; Malik y cols.,

2006; Palmer y cols., 2008), otros estudios han mostrado evidencias en contra de

esta hipótesis (Forshee y cols., 2008; Johnson y cols., 2009). En roedores, el

consumo de dietas ricas en azúcares refinados parece incrementar el desarrollo de

obesidad y resistencia insulínica (Chicco y cols., 2003; Lomba y cols., 2009; Toida y

cols., 1996). Sin embargo, existen controversias acerca de los efectos las dietas con

alto contenido en azúcares simples. En este contexto, algunos autores han

observado efectos paradójicos de un exceso de ingesta energética de sacarosa

asociada con una disminución de la ganancia de peso (Goodson y cols., 2001;

Kanazawa y cols., 2003).

Asimismo el alto contenido en fibra de las dietas se establece como un

factor determinante en la regulación del peso corporal (Slavin, 2003). La ingesta de

alimentos con alto contenido en fibra favorece el mantenimiento del peso, así

como la mejora de los niveles de colesterol, gracias a una mayor sensación de

saciedad tras las comidas (Rodríguez y cols., 2005).

En este sentido, estudios previos han demostrado que las dietas ricas en

fibra insoluble son capaces de disminuir la ingesta de alimentos, el vaciado gástrico,

la tasa y la cantidad de absorción de grasas, e influye en la oxidación de grasas y el

almacenamiento de grasa, provoca una disminución de la glucosa postprandial y

los niveles de lípidos (Linko y cols., 2005), sensibilidad a la insulina y menor

aumento de peso (Isken y cols., 2009). Otra investigación llevada a cabo por Zhang

y cols. (2009) en ratas alimentadas con arroz salvaje, rico en almidón, concluyó que

Introducción

‐34‐

esta dieta fue capaz de inhibir el aumento del estrés oxidativo y demostró una

mejora en el perfil lipídico y el estado antioxidante.

Un mecanismo de acción similar al de la fibra dietética es el que lleva a cabo

el almidón resistente, que corresponde a la fracción del almidón ingerido que pasa

sin digerir al intestino grueso (Englyst y Cummings, 1985). Es aquí donde el almidón

se somete a una fermentación más o menos completa, lo que lleva a la producción

y absorción de ácidos grasos de cadena corta (Cummings y Englyst, 1987;

Cummings y cols., 1987). Esta fracción del almidón ha sido denominado almidón

resistente y definido por el European FLAIR Concerted Action on Resistant Starch

(EURESTA) como “la suma del almidón y sus productos de hidrólisis que no se

absorbe en el intestino delgado de individuos sanos” (1992). La importancia del

almidón resistente para la salud humana, en relación a la diabetes, el sobrepeso,

enfermedades cardiovasculares o cáncer, aún no se conoce bien. Sin embargo al no

digerirse, no se absorbe la glucosa en el intestino delgado

de los seres humanos sanos (Englyst y Cummings, 1986; Englyst y Cummings,

1987), y por tanto se puede esperar la reducción tanto de glucemia postprandial

como de la insulinemia después de su ingesta en comparación con el almidón

digestible. Tal efecto del almidón resistente puede ser beneficioso en el control de

la diabetes. Por otra parte, éste puede modificar, al igual que la fibra dietética, la

cantidad y velocidad de absorción de otros macronutrientes de la dieta como

azúcares y grasas, pudiendo ser beneficioso en el control de la glucemia y lipidemia

(Raben y cols., 1994).

Los principales carbohidratos alimentarios, el almidón o la sacarosa, pueden

afectar de manera diferente el metabolismo lipídico y el estado antioxidante en

ratas, con un aumento del aclaramiento de triglicéridos y de la ingesta de

micronutrientes antioxidantes proporcionados por los azúcares complejos en

relación con los refinados (Robert y cols., 2008).

Introducción

‐35‐

3. MODELOS DE ESTUDIO

Para el estudio de la obesidad en animales se emplean mayoritariamente

dos modelos de suministro de alimentos:

a) Modelos Ad libitum: Es el modelo de suministro de alimentos mas

ampliamente utilizado en estudios de experimentación animal. En éste tipo de

diseño el animal tiene libre acceso a la comida y bebida sin ningún tipo de

restricción en su ingesta. Diversos autores señalan el desarrollo de sobrepeso

(Boque y cols., 2009), aumento de la ingesta (Bourgoin y cols., 2008) y la adiposidad

(Garcia‐Diaz y cols., 2007; Milagro y cols., 2009), resistencia insulínica (Boque y cols.,

2009; Bourgoin y cols., 2008; Elmarakby e Imig, 2010; Milagro y cols., 2009),

hipertensión (Elmarakby e Imig, 2010), hiperleptinemia (Milagro y cols., 2009) e

hipertrigliceridemia (Bourgoin y cols., 2008), entre otros, como resultado de la

administración de dietas con distinta densidad calórica a la recomendada y sin

limitar su acceso a los animales. La principal ventaja del modelo Ad libitum es que

ante una dieta palatable, el aumento de peso y el desarrollo de obesidad son

rápidos.

b) Modelo Pair‐fed: Consiste en alimentar a todos los animales que

intervienen en este tipo de estudios con la misma cantidad de Kcal / g de peso

corporal del grupo cuya ingesta de alimento es menor. El grupo que recibe la dieta

en estudio limita su cantidad de kilocalorías a las consumidas por el grupo control,

el día anterior, como han descrito numerosos autores (de Meijer y cols., 2010;

Lomba y cols., 2009). La restricción de la ingesta calórica en ratones hace disminuir

su peso corporal (Goodrick, 1978) y mejora la respuesta inmune (Weindruch y cols.,

1979). En ratas este tipo de dietas mantiene el peso corporal (Hulman y Falkner,

1994), aumenta su tiempo de supervivencia (Davis y cols., 1983) y retrasa el

desarrollo de la diabetes (Gerritsen, 1976). La ventaja más notable del modelo

Pair‐fed es que a igualdad de ingesta calórica se observan mejor las diferencias que

son debidas al consumo de macro (o micro) nutrientes.

Introducción

‐36‐

Los diferentes estudios realizados en los últimos años por otros autores en

ambos modelos de estudio y diferentes tratamientos dietéticos, muestran

resultados diversos (Tablas 2 y 3).

Tabla 2. Algunos ejemplos de autores que han utilizado modelos Ad libitum o Pair‐fed en el estudio de la obesidad y el metabolismo.

Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia

Ratas Ad libitum High sucrose Medición inicial: 3 semanas A las 3 semanas:

Wistar (63% de sacarosa) Medición intermedia: 15 semanas 1.) Alteración temprana del metabolismo lipídico (aumento de

Medición final: 30 semanas LCA‐CoA en músculo)

2.) No se obsevaron daños en los depósitos de glucógeno ni

en la oxidación de glucosa en este momento

A las 15 y 30 semanas:

1.) Aumento de los niveles de triglicéridos y LCA‐CoA muscular

2.) Mayor oxidación de glucosa

3.) Reducción de los depósitos de glucógeno

4.) Insulino‐resistencia periférica

5.) Hiperglucemia moderada


Wistar Medición final: 12 semanas 1.) No se registraron diferencias en la ingesta

calórica, tejido adiposo subcutáneo y peso

2.) Mayor proporción de tejido adiposo mesentérico

A las 12 semanas:

1.) Mayor cantidad de grasa subcutánea y

mesentérica

2.) Hiperinsulinemia

3.) Hiperlipidemia

Ratas Ad libitum High fat 6 semanas 1.) Aumento de ganancia de peso corporal

Sprague‐Dawley (36% de grasa) 2.) Resistencia insulínica

3.) Aumento de niveles plasmáticos de leptina

4.) Aumento de niveles plasmáticos de TBARS

Ratas Ad libitum High fat 11 semanas 1.) Sobrepeso

Wistar (59% de grasa) 2.) Aumento significativo de adiposidad

retroperitoneal

3.) Insulino‐resistencia

4.) Hiperleptinemia

5.) Ligera hipermetilación del promotor de la leptina

Ratas Pair‐fed High sucrose 16 semanas 1.) Aumento en la producción de triglicéridos hepáticos

Sprague‐Dawley (60% de sacarosa) (Medición de algunos parámetros 2.) Ligero aumento en los niveles de ácido úrico a las 8 semanas,

a la mitad y final del tratamiento) constantes desde ese momento hasta el final del tratamiento

3.) Aumento de los niveles séricos de triglicéridos y colesterol

4.) Aumento ligero de adiposidad

5.) Aumento ligero de peso corporal

6.) Ligero aumento de triglicéridos séricos a las 8 y 16 semanas

7.) Aumento significativo de los niveles de colesterol séricos a las

8 y 16 semanas

8.) Aumento significativo de los niveles de insulina al final del

tratamiento

9.) Aumento hepático de MCP‐1 y TNF‐α

Ratas Pair‐fed High sucrose 13 semanas 1.) No se registraron diferencias significativas

Sprague‐Dawley (66% de sacarosa) en cuanto a ganancia de peso entre ambos grupos

2.) Hipertensión




Wistar (63% de sacarosa) Medición intermedia: 15 semanas 1.) Alteración temprana del metabolismo lipídico (aumento de

Medición final: 30 semanas LCA‐CoA en músculo)

2.) No se obsevaron daños en los depósitos de glucógeno ni

en la oxidación de glucosa en este momento

A las 15 y 30 semanas:

1.) Aumento de los niveles de triglicéridos y LCA‐CoA muscular

2.) Mayor oxidación de glucosa

3.) Reducción de los depósitos de glucógeno

4.) Insulino‐resistencia periférica

5.) Hiperglucemia moderada


Wistar Medición final: 12 semanas 1.) No se registraron diferencias en la ingesta

calórica, tejido adiposo subcutáneo y peso

2.) Mayor proporción de tejido adiposo mesentérico

A las 12 semanas:

1.) Mayor cantidad de grasa subcutánea y

mesentérica


3.) Hiperlipidemia

Ratas Ad libitum High fat 6 semanas 1.) Aumento de ganancia de peso corporal

Sprague‐Dawley (36% de grasa) 2.) Resistencia insulínica

3.) Aumento de niveles plasmáticos de leptina

4.) Aumento de niveles plasmáticos de TBARS

Ratas Ad libitum High fat 11 semanas 1.) Sobrepeso

Wistar (59% de grasa) 2.) Aumento significativo de adiposidad

retroperitoneal


4.) Hiperleptinemia

5.) Ligera hipermetilación del promotor de la leptina

Ratas Pair‐fed High sucrose 16 semanas 1.) Aumento en la producción de triglicéridos hepáticos

Sprague‐Dawley (60% de sacarosa) (Medición de algunos parámetros 2.) Ligero aumento en los niveles de ácido úrico a las 8 semanas,

a la mitad y final del tratamiento) constantes desde ese momento hasta el final del tratamiento

3.) Aumento de los niveles séricos de triglicéridos y colesterol

4.) Aumento ligero de adiposidad

5.) Aumento ligero de peso corporal

6.) Ligero aumento de triglicéridos séricos a las 8 y 16 semanas

7.) Aumento significativo de los niveles de colesterol séricos a las

8 y 16 semanas

8.) Aumento significativo de los niveles de insulina al final del

tratamiento

9.) Aumento hepático de MCP‐1 y TNF‐α

Ratas Pair‐fed High sucrose 13 semanas 1.) No se registraron diferencias significativas

Sprague‐Dawley (66% de sacarosa) en cuanto a ganancia de peso entre ambos grupos

2.) Hipertensión


(Chicco y cols., 2003)

(Toida y cols., 1996)

(Elmarakby e Imig, 2010)

(Milagro y cols., 2009)

(Sanchez‐Lozada y cols., 2010)

(Hulman y Falkner , 1994)

Introducción

‐37‐

Tabla 3. Ejemplos de experimentos en los que se emplean para la administración de la dieta ambos modelos, Ad libitum y Pair‐fed.


Rata Pair‐fed High fat‐sucrose 12 días Pair‐fed:

Sprague‐Dawley Para confirmar el estudio: (41% de sacarosa, 1.) No se registró aumento significativo de peso

Ad libitum 39% de grasa) 2.) No hubo diferencias en el peso del tejido adiposo

3.) Ligera reducción de los niveles de triglicéridos plasmáticos

4.) Ligera reducción de los ácidos grasos no esterificados

5.) Aumento ligero en la producción de triglicéridos hepáticos

6.) Ligero aumento de los niveles de glucosa e insulina plasmática

7.) Aumento ligero de la actividad total y específica de

lipoproteinlipasa


lipoproteinlipasa en músculo

Ad libitum:

1.) Aumento significativo de peso corporal

2.) Mayor adiposidad

Ratón Pair‐fed High fat 11 semanas Pair‐fed :

C57BL/6J (B6) Ad libitum (58% de grasa) 1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso

respecto al grupo control

2.) Mayores niveles de glucosa plasmática en relación con el

grupo control

Ad‐libitum:

1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso

respecto al grupo control y al Pair‐fed

2.) Mayor % de eficiencia respecto al grupo control y Pair‐fed

3.) Mayor ingesta que el grupo control y Pair‐fed


grupo Pair‐fed y control

5.) Hiperinsulinemia respecto al grupo Pair‐fed y control

Rata Ad libitum High fat Ad libitum:

Long‐Evans Para confirmar el estudio: (45% de grasa) Ad libitum : 7 semanas 1.) Mayor ganancia de peso

Pair‐fed Pair‐fed : 4 semanas 2.) Hiperleptinemia



5.) Intolerancia a la glucosa

6.) Niveles elevados de FFA plasmáticos

Pair‐fed :

1.) Ganancia significativa de adiposidad en

comparación con los animales control (Ad libitum )

2.) Similar nivel de glucosa sanguínea e intolerancia

a la glucosa que el modelo Ad libitum

3.) Niveles de insulina plasmática ligeramente menor

(probablemente debido al largo perído de ayunas

marcado por el protocolo Pair‐fed )


Rata Pair‐fed High fat‐sucrose 12 días Pair‐fed:

Sprague‐Dawley Para confirmar el estudio: (41% de sacarosa, 1.) No se registró aumento significativo de peso

Ad libitum 39% de grasa) 2.) No hubo diferencias en el peso del tejido adiposo

3.) Ligera reducción de los niveles de triglicéridos plasmáticos

4.) Ligera reducción de los ácidos grasos no esterificados

5.) Aumento ligero en la producción de triglicéridos hepáticos

6.) Ligero aumento de los niveles de glucosa e insulina plasmática


lipoproteinlipasa


lipoproteinlipasa en músculo

Ad libitum:

1.) Aumento significativo de peso corporal


Ratón Pair‐fed High fat 11 semanas Pair‐fed :

C57BL/6J (B6) Ad libitum (58% de grasa) 1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso

respecto al grupo control


grupo control

Ad‐libitum:

1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso

respecto al grupo control y al Pair‐fed

2.) Mayor % de eficiencia respecto al grupo control y Pair‐fed

3.) Mayor ingesta que el grupo control y Pair‐fed


grupo Pair‐fed y control

5.) Hiperinsulinemia respecto al grupo Pair‐fed y control

Rata Ad libitum High fat Ad libitum:

Long‐Evans Para confirmar el estudio: (45% de grasa) Ad libitum : 7 semanas 1.) Mayor ganancia de peso

Pair‐fed Pair‐fed : 4 semanas 2.) Hiperleptinemia



5.) Intolerancia a la glucosa

6.) Niveles elevados de FFA plasmáticos

Pair‐fed :

1.) Ganancia significativa de adiposidad en

comparación con los animales control (Ad libitum )

2.) Similar nivel de glucosa sanguínea e intolerancia

a la glucosa que el modelo Ad libitum

3.) Niveles de insulina plasmática ligeramente menor

(probablemente debido al largo perído de ayunas

marcado por el protocolo Pair‐fed )

(Mantha y Deshaies, 2000)

(Petro y cols., 2004)

(Posey y cols., 2009)

Introducción

‐38‐

(Continuación de la Tabla 3)

(de Meijer y cols., 2010)


Ratón Pair‐fed High fat 1º experimento: 9 semanas 1º experimento

C57BL/6J (B6) Ad libitum (59,9% de grasa) 2º experimento:19 semanas Pair‐fed:

Ad libitum (10 semanas) + 1.) Ligero aumento del peso corporal en comparación con el grupo control

Dieta control (9 semanas) o 2.) Ligero aumento del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal

Pair‐fed (9 semanas) o e inguinal en comparación con el grupo control

Ad libitum (9 semanas) 3.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control

4.) Aumento significativo de los niveles de triglicéridos respecto al grupo Ad‐libitum

Ad‐libitum:

1.) Mayor peso corporal que el grupo Pair‐fed y control

2.) Esteatosis Hepática y aumento significativo del peso del hígado


4.) Aumento significativo del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal

e inguinal en comparación con el grupo control y Pair‐fed

5.) Niveles elevados de glucosa en ayunas

6.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control

7.) Reducción significativa de los niveles de triglicéridos respecto al grupo control

8.) Reducción significativa de la expresión de FAS respecto al grupo control y Pair‐fed

9.) Aumento significativo de la expresión de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed

2º experimento

Ad‐libitum + posterior dieta control (10% de grasa):

1.) Reducción del significativa peso corporal, respecto a la etapa Ad‐libitum

2.) Reducción significativa de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa

3.) Reducción significativa del colesterol respecto a la etapa previa

4.) Incremento significativo de los triglicéridos respecto a la etapa previa

5.) Reducción significativa del peso del hígado

6.) Reducción signiificativa de todos los depósitos grasos respecto a la etapa previa

7.) Reducción significativa de los niveles de insulina en ayunas y del índice HOMA respecto

a la etapa previa

8.) Reversión de la esteatosis hepática

Ad‐libitum + posterior high fat Pair‐fed :

1.) Importante reducción de la ganancia de peso corporal respecto a la etapa previa

Ad‐libitum

2.) Aumento signiificativo de los niveles de colesterol respecto a la etapa

previa Ad‐libitum y grupo control

3.) Aumento significatico de los niveles de triglicéridos pero solo respecto a la

etapa previa Ad‐libitum

4.) Aumento significativo de la expresión hepática de FAS respecto al grupo control y

Ad‐Libitum ,a las 19 semanas

5.) Mantenimiento de la esteatosis hepática

Ad‐libitum + posterior high fat Ad‐libitum :

1.) Ligero aumento de la ganancia de peso corporal de forma consecutiva

2.) Aumento significativo de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa

Ad‐Libitum y control y Pair‐fed



4.) Aumento significativo de los depositos grasos respecto al grupo control, a las

19 semanas

5.) Aumento significativo del peso corporal respecto al grupo control, al as 19 semanas

6.) Reducción significativa de la expresión hepática de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed

7.) Exacerbación del estado de esteatosis hepática


Ratón Pair‐fed High fat 1º experimento: 9 semanas 1º experimento

C57BL/6J (B6) Ad libitum (59,9% de grasa) 2º experimento:19 semanas Pair‐fed:

Ad libitum (10 semanas) + 1.) Ligero aumento del peso corporal en comparación con el grupo control

Dieta control (9 semanas) o 2.) Ligero aumento del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal

Pair‐fed (9 semanas) o e inguinal en comparación con el grupo control

Ad libitum (9 semanas) 3.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control

4.) Aumento significativo de los niveles de triglicéridos respecto al grupo Ad‐libitum

Ad‐libitum:

1.) Mayor peso corporal que el grupo Pair‐fed y control

2.) Esteatosis Hepática y aumento significativo del peso del hígado


4.) Aumento significativo del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal

e inguinal en comparación con el grupo control y Pair‐fed

5.) Niveles elevados de glucosa en ayunas

6.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control

7.) Reducción significativa de los niveles de triglicéridos respecto al grupo control

8.) Reducción significativa de la expresión de FAS respecto al grupo control y Pair‐fed

9.) Aumento significativo de la expresión de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed

2º experimento

Ad‐libitum + posterior dieta control (10% de grasa):

1.) Reducción del significativa peso corporal, respecto a la etapa Ad‐libitum

2.) Reducción significativa de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa

3.) Reducción significativa del colesterol respecto a la etapa previa

4.) Incremento significativo de los triglicéridos respecto a la etapa previa

5.) Reducción significativa del peso del hígado

6.) Reducción signiificativa de todos los depósitos grasos respecto a la etapa previa

7.) Reducción significativa de los niveles de insulina en ayunas y del índice HOMA respecto

a la etapa previa

8.) Reversión de la esteatosis hepática

Ad‐libitum + posterior high fat Pair‐fed :

1.) Importante reducción de la ganancia de peso corporal respecto a la etapa previa

Ad‐libitum

2.) Aumento signiificativo de los niveles de colesterol respecto a la etapa

previa Ad‐libitum y grupo control



4.) Aumento significativo de la expresión hepática de FAS respecto al grupo control y

Ad‐Libitum ,a las 19 semanas

5.) Mantenimiento de la esteatosis hepática

Ad‐libitum + posterior high fat Ad‐libitum :

1.) Ligero aumento de la ganancia de peso corporal de forma consecutiva

2.) Aumento significativo de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa

Ad‐Libitum y control y Pair‐fed



4.) Aumento significativo de los depositos grasos respecto al grupo control, a las

19 semanas

5.) Aumento significativo del peso corporal respecto al grupo control, al as 19 semanas

6.) Reducción significativa de la expresión hepática de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed

7.) Exacerbación del estado de esteatosis hepática

Introducción

‐39‐

4. EPIGENÉTICA

4.1. Definición y clasificación de los procesos epigenéticos

Entre los diferentes mecanismos que pueden estar involucrados en las

diferencias interindividuales presentes en la obesidad, la regulación epigenética de

la expresión génica ha emergido en los últimos años como un factor que podría

contribuir de manera importante. En éste sentido, la epigenética ha sido definida

como el estudio de los cambios heredables en la expresión del un gen que se

producen en ausencia de un cambio en su secuencia de ADN (Junien y Nathanielsz,

2007). El prefijo epi en epigenética implica características que están "encima de" o

"además de" la genética, la superación del paradigma convencional asignado a la

herencia del ADN.

Los cambios epigenéticos incluyen la metilación del ADN, las modificaciones

covalentes de las histonas, el empaquetamiento del ADN alrededor de los

nucleosomas, el plegamiento de la cromatina y la unión de la cromatina a la matriz

nuclear (Dolinoy y Jirtle, 2008). De todos éstos procesos, probablemente los mas

estudiados sean las modificaciones de histonas y la metilación del ADN (Wild y

Flanagan, 2010).

4.1.1. Modificación de histonas

Las histonas, especialmente los residuos amino terminales de acceso a las

histonas H3 y H4 y las colas amino y carboxilo terminales de H2A, H2B y H1, son

susceptibles a una variedad de modificaciones post‐traduccionales, incluyendo la

fosforilación de la serina y treonina, acetilación de lisina , la metilación de lisina y

arginina, ubiquitinación de lisina, biotinilación lisina, ribosilación de ADP (adenosín

bifosfato), glicosilación y carbonilación (Margueron y cols., 2005). Dichas

modificaciones en las histonas puede crear o estabilizar los sitios de unión para las

proteínas reguladoras, como factores de transcripción, proteínas implicadas en la

condensación de la cromatina o la reparación del ADN, pero también puede tener

el efecto contrario, lo que altera u ocluye los sitios de unión de la cromatina

Introducción

‐40‐

(Goldberg y cols., 2007). Algunas de estas modificaciones son compatibles con

otras reacciones, facilitando así otras modificaciones que se produzcan y/o

coexistan, mientras que otras modificaciones son incompatibles, afectando

negativamente a otros cambios en las histonas.

Figura 3. (A) Estructura del nucleosoma. (B) Representación esquemática de la organización de las histonas en el núcleo formando un octámero que es rodeado por el ADN (línea negra). Primero se deposita un tetrámero H3/H4 en el ADN, seguido por dos dímeros H2A/H2B dando lugar al dominio globular constituido por las 8 proteínas histónicas (Modificado de Allis y cols., 2007).

a) Acetilación de histonas

Las histonas sufren acetilación y desacetilación, especialmente de los

residuos de lisina en la cola N‐terminal. Este mecanismo de regulación está

catalizado por dos tipos de enzimas, Histonas acetiltransferasas (HATs) e Histonas

desacetilasas (HDACs), que no sólo actúan sobre sustratos de histonas, sino

también en las proteínas no histónicas. En el proceso de acetilación, el acetil‐

coenzima A es el donante del grupo acetilo (Sadoul y cols., 2008). De hecho, la

síntesis nuclear del acetil‐CoA es un paso limitante para la acetilación de las

histonas. Así, el metabolismo del acetil‐CoA está directamente relacionado con la

regulación de la cromatina y puede afectar a diversos procesos celulares en las que

se entrecruzan la acetilación y el metabolismo, tales como estados de la

enfermedad y el envejecimiento (Takahashi y cols., 2006). La acetilación y

desacetilación de las histonas H3 y H4 influyen en la estructura de la cromatina y

en la accesibilidad a los factores de transcripción, ya que se supone que la

acetilación abre la estructura de la cromatina condensada y permite a la

maquinaria transcripcional un acceso más fácil a las regiones promotoras. Se

A BA B

Introducción

‐41‐

mantiene la hipótesis de que algunos inhibidores de HDACs podrían ser posibles

fármacos en el tratamiento de la obesidad (Milagro y cols., 2010).

b) Metilación de histonas

La metilación de histonas representa una buena combinación potencial con

respecto a otras modificaciones, debido a que los residuos de lisina pueden

albergar fracciones mono, di o tri‐metil en su grupo amino, mientras que los

residuos de arginina puede llevar residuos mono o dimetil en su grupo guanidinio

(Allis y cols., 2007 ). Ambas metilaciones, en la lisina y en la arginina, pueden actuar

como activadores o represores de la transcripción de genes (Bannister y cols.,

2002).

Existen una serie de nutrientes y compuestos de la dieta que se han

relacionado con cambios en la metilación de las histonas. Así, dosis altas de

diferentes minerales, como el cromo, el níquel y el arsénico, inducen cambios en la

metilación de las histonas en diferentes residuos (H3K4, H3K9 y H3K27 (Chen y

cols., 2006; Zhou y cols., 2009). Por otro lado las lisina metiltransferasas

transportan un grupo metilo de la S‐adenosil‐L‐metionina (SAM) al grupo amino de

un residuo de lisina, dando lugar al producto S‐adenosil‐L‐homocisteína (SAH)

(Dillon y cols., 2005). SAM está formado por grupos metílicos derivados de

nutrientes como la colina, metionina, o metil‐tetrahidrofolato, mientras que la

betaína, colina, metionina, zinc y ácido fólico son necesarios para la conversión de

la homocisteína en metionina. Así, los efectos de estos nutrientes en las marcas

epigenéticas están relacionadas entre sí, interactuando entre ellos para alterar el

ADN y los procesos epigenéticos de metilación de histonas (Campion y cols., 2009b).

c) Otras modificaciones de histonas

La fosforilación de histonas, aunque menos estudiada que la metilación y

acetilación, se cree que juega un papel directo en la mitosis, la muerte celular,

Introducción

‐42‐

reparación, replicación y recombinación, y por lo general relacionada con la

activación de la transcripción génica (Oki y cols., 2007). Se conocen diferentes

factores dietéticos que facilitan esta modificación, incluyendo la genisteína, que se

ha asociado a la fosforilación de H1 y H3 en las células cancerosas (Cappelletti y

cols., 2000), el sulforafano (Davie y Chadee, 1998), el alcaloide de la vinca

vinblastina (Juan y cols., 1998), o la micotoxina zearalenona (Ahamed y cols., 2001).

En cuanto a los factores metabólicos y ambientales, la histona H2AX, que media la

reparación del ADN, es rápidamente fosforilada cuando el ADN es dañado por la

hipoxia (Celeste y cols., 2003). Otras modificaciones de las histonas con efectos

sobre la expresión génica son la biotinilación de histonas, que depende de la

disponibilidad de biotina (la deficiencia de biotina produce efectos importantes

sobre la estructura de la cromatina (Hassan y Zempleni, 2006). Y por último la

ubiquitinación de las histonas H2A y H2B, que es inhibida por altas concentraciones

de níquel (Ke y cols., 2006).

Figura 4. Tipos de modificaciones en la cola amino‐terminal de las histonas y sitios susceptibles de cambios (Modificado de Allis y cols., 2007).

4.1.2. Metilación del ADN

La metilación del ADN es un proceso epigenético que participa en la

regulación de la expresión génica de dos maneras: directamente al impedir la

Histona H3

Histona H4

Histona H2A

Histona H2B

Fosforilación

Acetilación

Metilación(arginina)

Metilación(lisina activa)

Metilación(lisina reprimida)

Ubiquitinación

Histona H3

Histona H4

Histona H2A

Histona H2B

Fosforilación

Acetilación

Metilación(arginina)

Metilación(lisina activa)

Metilación(lisina reprimida)

Ubiquitinación

Introducción

‐43‐

unión de factores de transcripción, e indirectamente propiciando la estructura

"cerrada" de la cromatina (Mesa‐Cornejo y cols., 2006). La metilación de islas CpG,

definidas como regiones genómicas que contienen una alta frecuencia de

dinucleótidos Citosina‐Guanina (CG), tiene como resultado la conversión de la

citosina en 5‐metilcitosina. Cuando éste hecho ocurre en las regiones promotoras,

se asocia a menudo con el silenciamiento de genes (Chuang y Jones, 2007). Hay

tres enzimas que intervienen en el establecimiento y mantenimiento de los

patrones de metilación del ADN: las metiltransferasas de ADN DMNT3A y DMNT3B

son metiltransferasas de novo; mientras que DNMT1 asegura que los patrones de

metilación se copian fielmente a través de cada división celular (Klose y Bird, 2006).

Estas enzimas cooperar entre sí para establecer y mantener los patrones de

metilación celular del ADN y también interactúan con las desacetilasas y

metiltransferasas de histonas y proteínas de unión a metilcitosina en un complejo

sistema de regulación. La metilación de las islas CpG reprime la transcripción de

genes y es un elemento de control de la expresión génica (Figura 5).

Figura 5. Procesos de metilación del ADN. (A) El gen está abierto y este hecho favorece su expresión. (B) Cuando los genes se metilan, la cromatina se compacta y la expresión del gen se reduce.

En las células humanas, la mayoría de las islas CpG en regiones no

promotoras de los genes se encuentran hipermetiladas, hecho que está

Introducción

‐44‐

relacionado con la represión de la transcripción, mientras que las islas CpG

localizadas en las regiones promotoras de los genes activos están desmetiladas

(Urnov, 2002). Se ha propuesto que la metilación del ADN es un proceso reversible

y que los patrones de metilación dependen de un equilibrio dinámico entre los

procesos de metilación y desmetilación (Delcuve y cols., 2009; Niehrs, 2009).

En los últimos años, el análisis del ADN metilado representa una interesante

herramienta para el diagnóstico, terapia y pronóstico de enfermedad, así como en

el campo de la farmacogenética y estudios epidemiológicos (Mesa‐Cornejo y cols.,

2006).

4.2. Influencia de la dieta en los procesos de metilación del ADN

El impacto de la nutrición en los mecanismos epigenéticos (Ahmed, 2007;

Liddle y Jirtle, 2006), esta siendo estudiado cada vez con más interés. Parece que

cada vez hay más evidencia del papel determinante del medio ambiente,

incluyendo la nutrición, sobre la expresión de muchos genes relacionados con el

estado de salud (Dolinoy y cols., 2006; Tang y Ho, 2007).

El proceso de la metilación del ADN depende de la ingesta de grupos

donantes de metilo y cofactores ingeridos con los alimentos, que están

involucrados en el metabolismo de la metionina y el folato (Chmurzynska, 2010).

En éste sentido, las metiltransferasas emplean SAM como donante de grupos

metilo (Hitchler y Domann, 2009) que puede inducir directamente marcas

epigenéticas, siendo la biodisponibilidad de éste metabolito influenciado

directamente por la dieta. Así, el SAM está formado por grupos metil derivados de

la colina, metionina, o metil‐tetrahidrofolato. La betaína, colina, metionina, zinc y

ácido fólico son necesarios para la conversión de la homocisteína en metionina

(Zeisel, 2009). Varios compuestos dietéticos están implicados en la regulación de la

metilación del ADN. La vitamina B12 es un cofactor en la remetilación, mediada por

el folato, de la homocisteína a metionina, la cual es posteriormente activada a SAM,

el donante de metilo para la metilación del ADN. SAM se convierte en SAH después

Introducción

‐45‐

de la metilación del ADN. La hidrólisis reversible de la SAH a homocisteína

completa el ciclo. En condiciones de una elevada concentración de homocisteína,

esta reacción se invierte resultando un aumento de la concentración de la SAH

potente inhibidor de la SAM. La deficiencia en vitamina B12 lleva a una

acumulación de homocisteína en suero (Geisel y cols., 2005).

Figura 6. Versión simplificada del metabolismo monocarbonado. Esta vía es dependiente de la disponibilidad dietética de metionina, colina, betaína y vitamina B12. (Modificado de Chmurzynska, 2010)

Los efectos de estos nutrientes en las marcas epigenéticas están

relacionados entre sí, interactuando entre ellos para alterar los procesos

epigenéticos de metilación del ADN. De hecho, la perturbación del metabolismo de

uno de los donantes de metilo es consecuencia de cambios compensatorios en

otros debido a la interrelación de estas vías metabólicas (Hitchler y Domann, 2009).

Los estudios experimentales que modifican la composición de los nutrientes

de la dieta, muestran que la restricción de donantes de metilo provoca, en general,

la hipometilación del ADN (Locker y cols., 1986; Zapisek y cols., 1992) y la

suplementación produce hipermetilación del mismo (Choi SW y cols., 2005;

Steegers‐Theunissen y cols., 2009). Algunos países de todo el mundo recomiendan

a las mujeres que planean un embarazo la ingesta diaria de 400 microgramos de

ácido fólico sintético en el período periconcepcional para prevenir defectos de

nacimiento en los niños. El uso periconcepcional de ácido fólico se asocia con

Metilén‐tetrahidrofolato

MetioninaSAM

SAH

Reacciones deReacciones demetilacimetilacióónn

Betaína

Dimetil ‐glicina

Metil‐tetrahidrofolatoHomocisteína

Tetrahidrofolato

Cisteína

B6

Glicina

Colina

B12CH3

Metilén‐tetrahidrofolato

MetioninaSAM

SAH

Reacciones deReacciones demetilacimetilacióónn

Betaína

Dimetil ‐glicina

Metil‐tetrahidrofolatoHomocisteína

Tetrahidrofolato

Cisteína

B6

Glicina

Colina

B12CH3

Introducción

‐46‐

cambios epigenéticos en IGF2 en el niño que puede afectar a la programación

intrauterina del crecimiento y desarrollo, con consecuencias para la salud y la

enfermedad durante toda la vida (Steegers‐Theunissen y cols., 2009). Por otra

parte, la reducción importante de determinados suplementos alimenticios que

participan en los ciclos de la metionina y el folato durante el período

periconcepcional, puede conducir a la alteración epigenética de la metilación del

ADN en la descendencia, y modificar fenotipos relacionados con la salud en adultos

(Sinclair y cols., 2007).

Tabla 4. Ejemplos de cambios dinámicos en la metilación del ADN cuando es afectado por el aporte dietético de grupos donantes de metilo. Algunos de ellos presentan relación con la obesidad. (Modificado de Campión y cols., 2010)

El período vital en el que las modificaciones epigenéticas parecen ser más

determinantes son el embarazo y la lactancia. Así, investigaciones recientes han

puesto de relieve la importancia de ambientes adversos perinatales, durante el

embarazo o la lactancia, en el futuro desarrollo de la obesidad, lo que sugiere que las

opciones de la influencia de la nutrición de la madre o el estilo de vida pueden alterar

la programación durante el desarrollo del feto y sus crías (Vickers, 2007). De hecho, el

papel de la nutrición en la edad adulta es un tema de debate en relación a la

(Lv y cols., 2009)

Especie Tejido Estado nutricional Efecto Gen Relación con la obesidad Referencia

Humano Eritrocitos Folato sérico elevado El estado de metilación no SOD∙3

registró cambios (Superóxido dismutasa‐3)

Ratón Hígado, riñón Exceso de ácido fólico, Vitamina B12, Hipermetilación del ADN Alelo A (vy ) La obesidad materna induce la amplificación

y cerebro colina y betaína durante el desarrollo transgeneracional de la obesidad

Ratón deficiente Aorta Suplementación con betaína No hubo efectos TNF‐alpha La betaína puede ejercer un efecto antiaterogénico

en ApoE (Factor de necrosis tumoral alfa) al favorecer la inhibición de la inflamación

Rata Hígado Dieta deficiente en folato, tras el Incremento de la metilación ADN genómico

destete de los animales

Rata Hígado Deficiencia de Vitamina B12 Hipometilación Promotor de la Cistationina‐β

sintasa

Oveja Hígado fetal Restricción en el suministro de Múltiples cambios Nivel de metilación alterado en Los descendientes en edad adulta presentaron

vitaminas específicas y metionina un 4% de un total de 1400 islas CpG aumento de adiposidad y exceso de peso

Especie Tejido Estado nutricional Efecto Gen Relación con la obesidad Referencia

Humano Eritrocitos Folato sérico elevado El estado de metilación no SOD∙3

registró cambios (Superóxido dismutasa‐3)

Ratón Hígado, riñón Exceso de ácido fólico, Vitamina B12, Hipermetilación del ADN Alelo A (vy ) La obesidad materna induce la amplificación

y cerebro colina y betaína durante el desarrollo transgeneracional de la obesidad

Ratón deficiente Aorta Suplementación con betaína No hubo efectos TNF‐alpha La betaína puede ejercer un efecto antiaterogénico

en ApoE (Factor de necrosis tumoral alfa) al favorecer la inhibición de la inflamación

Rata Hígado Dieta deficiente en folato, tras el Incremento de la metilación ADN genómico

destete de los animales

Rata Hígado Deficiencia de Vitamina B12 Hipometilación Promotor de la Cistationina‐β

sintasa

Oveja Hígado fetal Restricción en el suministro de Múltiples cambios Nivel de metilación alterado en Los descendientes en edad adulta presentaron

vitaminas específicas y metionina un 4% de un total de 1400 islas CpG aumento de adiposidad y exceso de peso

(Uekawa y cols., 2009)

(Sinclair y cols., 2007)

(Hirsch y cols., 2008)

(Waterland y cols., 2008a)

(Kotsopoulos y cols., 2008)

Introducción

‐47‐

modificación de los patrones epigenéticos del ADN y la posible transmisión a través de

los gametos (Cobiac, 2007). Así, los cambios en los patrones de metilación del ADN

podrían ser un resultado de la interacción de diversos factores dietéticos, tales como

los desequilibrios en la oferta de donantes de metilo, sobre todo ácido fólico, o la

exposición a inhibidores de la metiltransferasa del ADN, como los polifenoles y,

posiblemente, isotiocianatos de las plantas (Johnson y Belshaw, 2008).

En éste sentido, los intercambios endocrinos entre feto y la madre, las

posturas intrauterinas, nutrición peri o prenatal, y la atención materna puede

contribuir al desarrollo de marcas epigenéticas específicas (Lathe, 2004). De hecho,

la desnutrición materna o el estrés, a veces asociada con bajo peso al nacer,

aumenta el riesgo de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en los hijos,

que ha sido parcialmente explicada por alteraciones en el metabolismo de los

glucocorticoides (Lesage y cols., 2001; Mairesse y cols., 2007). Algunos de estos

eventos se deben a desequilibrios fisiológicos, endocrinos o nutricionales, pero

también puede referirse a los mecanismos epigenéticos.

Tabla 5. Algunos ejemplos de los cambios dinámicos en el patrón de metilación del ADN y modificación de histonas debidos a diferentes condiciones nutricionales (Modificado de Campión y cols., 2009b)

Estado nutricional Modelo Condición dietética/nutricional Dosis/manipulación Duración del tratamiento Efectos epigenéticos y/o metabólicos Referencia

Alteraciones maternas Rata Reducción del flujo sanguíneo en el útero Ligadura de las arterias 3 días 43% menos de metilación en p53

durante el embarazo uterinas

Microminerales Humano Ingesta de micronutrientes (folato, Menor consumo de donantes Larga duración Aumento de la metilación de

vitaminas A y B1) de grupos metilo p16 (INK4a) y p14 (ARF)

Rata Deficiencia de selenio 0,2 mg selenio kg‐1

Ratas de reciente destete 20% menos de metilación en el ADN

Células Caco‐2 Deficiencia de arsenito 0,1 o 2 µmoles de arsenito L‐1

7 días 20% menos de metilación en el ADN

Dieta vegetariana Humano Dieta vegetariana vs. omnívora No se muestra o determina Años 30‐40% menos de metilación en el gen

de la Superoxido dismutasa

Ácidos grasos Células HCT116/HT‐29 Suplementación con butirato 4 mmoles L‐1

24 horas 70% menos de metilación en RAR‐β2

(receptor del ácido retinóico β2 )

Otros compuestos Células KYSE 510/150 Suplementación con genisteína de soja 5, 10 o 20 µmoles L‐1

6 días Reversión de la hipermetilación del gen

Células OSCC Suplementación con polifenoles de té 20 o 50 µmoles L‐1

6 días Inhibición de la ADN metiltransferasa

(epigalocatequina‐3‐galato)

Colonocitos de rata Suplementación con grupos dialilo disulfuro 200 µmoles L‐1

3‐6 horas Incremento de la acetilación de histonas

Ratón Administración oral de sulforafano 10 µmoles L‐1

6 horas Reducción del 50‐65% en la actividad

histona deacetilasa

Abeja Ingesta de jalea real Alimento con jalea real No se muestra o determina 10‐15% menos de metilación en la

dinactina p62

Toxinas o drogas Rata Bisfenol A durante el embarazo y lactancia 50 mg kg‐1de dieta Perinatal 15% menos de metilación en el activador

de la proteína de unión a CDK5 (CabpIAP)

y ganancia de peso corporal

Estado nutricional Modelo Condición dietética/nutricional Dosis/manipulación Duración del tratamiento Efectos epigenéticos y/o metabólicos Referencia

Alteraciones maternas Rata Reducción del flujo sanguíneo en el útero Ligadura de las arterias 3 días 43% menos de metilación en p53

durante el embarazo uterinas

Microminerales Humano Ingesta de micronutrientes (folato, Menor consumo de donantes Larga duración Aumento de la metilación de

vitaminas A y B1) de grupos metilo p16 (INK4a) y p14 (ARF)

Rata Deficiencia de selenio 0,2 mg selenio kg‐1

Ratas de reciente destete 20% menos de metilación en el ADN

Células Caco‐2 Deficiencia de arsenito 0,1 o 2 µmoles de arsenito L‐1

7 días 20% menos de metilación en el ADN

Dieta vegetariana Humano Dieta vegetariana vs. omnívora No se muestra o determina Años 30‐40% menos de metilación en el gen

de la Superoxido dismutasa

Ácidos grasos Células HCT116/HT‐29 Suplementación con butirato 4 mmoles L‐1

24 horas 70% menos de metilación en RAR‐β2

(receptor del ácido retinóico β2 )

Otros compuestos Células KYSE 510/150 Suplementación con genisteína de soja 5, 10 o 20 µmoles L‐1

6 días Reversión de la hipermetilación del gen

Células OSCC Suplementación con polifenoles de té 20 o 50 µmoles L‐1

6 días Inhibición de la ADN metiltransferasa

(epigalocatequina‐3‐galato)

Colonocitos de rata Suplementación con grupos dialilo disulfuro 200 µmoles L‐1

3‐6 horas Incremento de la acetilación de histonas

Ratón Administración oral de sulforafano 10 µmoles L‐1

6 horas Reducción del 50‐65% en la actividad

histona deacetilasa

Abeja Ingesta de jalea real Alimento con jalea real No se muestra o determina 10‐15% menos de metilación en la

dinactina p62

Toxinas o drogas Rata Bisfenol A durante el embarazo y lactancia 50 mg kg‐1de dieta Perinatal 15% menos de metilación en el activador

de la proteína de unión a CDK5 (CabpIAP)

y ganancia de peso corporal

(Thaler y cols., 2009)

(Pham y cols., 2003)

(Mas y cols., 2007)

(Davis y cols., 2000)

(Uthus y cols., 2006)

(Spurling y cols., 2008)

(Druesne‐Pecollo y cols., 2006)

(Myzak y cols., 2006)

(Kucharski y cols., 2008)

(Dolinoy y cols., 2007)

(Fang y cols., 2005)

(Kato y cols., 2008)

Introducción

‐48‐

Hay varios ejemplos sobre el papel de las intervenciones nutricionales en el

embarazo, tales como la restricción de proteínas, la deprivación calórica, la

deficiencia o suplementación de micronutrientes y la alimentación excesiva a base

de grasa, que determinan un conjunto de trastornos en los hijos. Dos de los

informes más interesantes provienen de Ravelli y cols. (1999), que mostraron que

la mayoría de los niños nacidos después de la hambruna holandesa de 1944‐45

desarrollaron obesidad en la vida adulta, y de Eriksson y cols. (Eriksson y cols.,

2003), que concluyeron que el retraso del crecimiento fetal es un factor de riesgo

para la obesidad.

No sólo los micronutrientes pueden inducir cambios epigenéticos. Un

aumento en la expresión del gen de la Manganeso superóxido dismutasa humana

(MnSOD) se ha asociado con una disminución de la metilación de islas CpG de de

un grupo vegetariano con un grupo omnívoro (Johnson y cols., 2007). Otros

factores dietéticos como los ácidos grasos son susceptibles a participar en la

regulación epigenética de la metilación del ADN (Hitchler y Domann, 2009). Por

ejemplo, los tocoferoles se han relacionado con modificaciones epigenéticas de las

histonas (Nottke y cols., 2009). Otros compuestos presentes en diferentes

alimentos vegetales, tales como la isoflavona genisteína (Manzo y cols., 2009),

polifenoles del té (Lin y cols., 2007) y el disulfuro‐dialilo del ajo (Halees y cols.,

2003) también son capaces de regular metiltransferasas de ADN o acetilación de

las histonas en cultivos de células cancerosas. Un hallazgo reciente de Kucharski y

cols. (Kucharski y cols., 2008) puso de manifiesto que la información epigenética

puede ser alterada por la diferente ingesta en las abejas y que la flexibilidad de

modificaciones epigenéticas pueden provocar cambios profundos en el desarrollo,

incluyendo la reproducción y el comportamiento. En el tejido adiposo humano,

Bouchard y cols. (2010) han demostrado recientemente los efectos de la restricción

calórica sobre la metilación del ADN y la expresión génica. Los avances en estas

áreas abrirán las puertas a estudiar el efecto de diferentes nutrientes y las

condiciones que facilitan la metilación del ADN, modificaciones de las histonas y

otros mecanismos implicados en la regulación epigenética de genes específicos

Introducción

‐49‐

relacionados con el aumento de peso y la aparición de diferentes enfermedades

metabólicas.

4.3. La Epigenética como herramienta para el estudio de la

susceptibilidad a desarrollar trastornos metabólicos

El número de publicaciones sobre los genes regulados por mecanismos

epigenéticos está aumentando continuamente, algunos de ellos relacionados con

el cáncer (Nosho y cols., 2009 ; Worthley y cols.,2010), y otros con enfermedades

metabólicas como la hipertensión (Friso y cols., 2008), aterosclerosis, diabetes

(Ling y cols., 2008) y obesidad (Milagro y cols., 2009). En este contexto, la búsqueda

de promotores de genes susceptibles a la regulación epigenética y con un papel en

el desarrollo de la obesidad es de gran interés. Así, de los aproximadamente 800

genes humanos con posible regulación epigenética

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), un 13% de ellos, definidos como

Epiobesogenes, podrían estar asociados a la obesidad. Los Epiobesogenes son un

conjunto de genes implicados en la obesidad y susceptibles de ser regulados por

mecanismos epigenéticos (Campion y cols., 2009b). El conocimiento de la

modificación de sus patrones de metilación, debido a diferentes factores dietéticos,

la edad, la inflamación o algunos de los aspectos fisiológicos que rodean al

sobrepeso, puede ser crucial para investigar el papel de estos mecanismos en la

prevención, el desarrollo y tratamiento de la obesidad (Martinez y cols., 2008).

Una de las adipoquinas clave involucradas en el peso corporal y regulación

de la ingesta de alimentos cuya región promotora presenta islas CpG que podrían

verse afectadas por la metilación dinámica, es la leptina. En ratas obesas, una isla

CpG en el promotor de la leptina resultó hipermetilado por la dieta alta en grasa

(Milagro y cols., 2009) y fue asociado a bajos niveles circulantes de leptina, lo que

sugiere que esta posición podría ser importante en la regulación de la expresión

del gen de leptina. Este hallazgo indica que la leptina es una secuencia diana de

diferentes factores de transcripción, cuyo promotor puede ser influenciado por la

obesidad inducida por la dieta y sugiere que los mecanismos epigenéticos podrían

Introducción

‐50‐

estar involucrados en la pandemia reciente de obesidad mediante el control de la

expresión de genes epiobesogénicos importantes (Campion y cols., 2009b).

Además de la adipogénesis, la inflamación es un proceso importante que participa

en la obesidad y sus comorbilidades asociadas (Moreno‐Aliaga y cols., 2005; Zulet y

cols., 2007). La inflamación podría inducir hipermetilación y dañar el ADN en los

promotores de varios genes (Stenvinkel y cols., 2007; Valinluck y Sowers, 2007),

cerrando el círculo entre sobrepeso y epigenética. Así, el estudio de los patrones de

metilación de los promotores de varios genes inflamatorios en diferentes

poblaciones celulares, como células de la sangre, hepatocitos o adipocitos, podría

ser un buen marcador del desarrollo de la obesidad o, por el contrario, de la

respuesta inducida por dietas de adelgazamiento (Martinez y cols., 2008). Así, el

TNF‐alfa es una citocina proinflamatoria, que está comúnmente elevada en los

sujetos obesos y cuyo promotor es susceptible de ser regulado por metilación de la

citosina. La regulación epigenética del promotor de TNF‐alfa humano por la

metilación de la citosina puede estar implicado en la susceptibilidad a perder peso

después de seguir una dieta hipocalórica equilibrada (Campion y cols., 2009a).

Introducción

‐51‐

Tabla 6. Ejemplos de varios genes humanos implicados en la obesidad cuya regulación por mecanismos epigenéticos ha sido descrita recientemente (epiobesogenes). (Modificado de Campión y cols., 2009b)

Un estudio en profundidad del porcentaje de metilación de las diferentes islas

CpG en los Epiobesogenes y su relación con el riesgo de sufrir obesidad o

enfermedades metabólicas, podría permitir crear una puntuación o score epigenético

que ayudaría a controlar mejor el peso corporal y conocer el riesgo de enfermedad

(Dandona y Roberts, 2009). Esta puntuación epigenotípica podría servir como una

herramienta de diagnóstico / pronóstico para prever la respuesta a una dieta

Papel en la obesidad Símbolo del gen Nombre Referencia

Adipogénesis PPARGC1A Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma‐coactivador 1‐alfa

Adipogénesis NR0B2 Receptor nuclear asociado a heterodímeros pequeños

Adipogénesis FGF2 Factor de crecimiento fibroblástico‐2

Adipogénesis PPARG Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma

Adipogénesis PTEN Homólogo de fosfatasa y tensina

Adipogénesis RARA Receptor alpha del ácido retinoico

Adipogénesis CDKN1A Ciclina dependiente del inhibidor de la quinasa 1A (p21, Cip1)

y ciclo celular

Adipogénesis e LEP Leptina

inflamación

Adipogénesis ESR1 Receptor de estrógenos alfa

Adipogénesis NR3C1 Receptor de glucocorticoides

Inflamación e TNF Factor de necrosis tumoral (Superfamilia TNF, miembro 2)

insulino‐resistencia

Inflamación y CASP8 Caspasa 8

apoptosis

Metabolismo lipídico LPL Lipoprotein lipasa

Metabolismo lipídico FABP4 Proteína de unión a ácidos grasos 4

Señalización insulínica CAV1 Caveolina 1

Señalización insulínica PIK3CG Fosfoinositol‐3‐quinasa, catalítico, gamma pp

Resistencia insulínica SSTR2 Receptor de somatostatina 2

Resistencia insulínica HSD11B2 11 beta‐hidroxiesteroide deshidrogenasa 2

y adiposidad

Resistencia insulínica IGFBP3 Proteína trasportadora del factor de crecimiento insulínico

Papel en la obesidad Símbolo del gen Nombre Referencia

Adipogénesis PPARGC1A Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma‐coactivador 1‐alfa

Adipogénesis NR0B2 Receptor nuclear asociado a heterodímeros pequeños

Adipogénesis FGF2 Factor de crecimiento fibroblástico‐2

Adipogénesis PPARG Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma

Adipogénesis PTEN Homólogo de fosfatasa y tensina

Adipogénesis RARA Receptor alpha del ácido retinoico

Adipogénesis CDKN1A Ciclina dependiente del inhibidor de la quinasa 1A (p21, Cip1)

y ciclo celular

Adipogénesis e LEP Leptina

inflamación

Adipogénesis ESR1 Receptor de estrógenos alfa

Adipogénesis NR3C1 Receptor de glucocorticoides

Inflamación e TNF Factor de necrosis tumoral (Superfamilia TNF, miembro 2)

insulino‐resistencia

Inflamación y CASP8 Caspasa 8

apoptosis

Metabolismo lipídico LPL Lipoprotein lipasa

Metabolismo lipídico FABP4 Proteína de unión a ácidos grasos 4

Señalización insulínica CAV1 Caveolina 1

Señalización insulínica PIK3CG Fosfoinositol‐3‐quinasa, catalítico, gamma pp

Resistencia insulínica SSTR2 Receptor de somatostatina 2

Resistencia insulínica HSD11B2 11 beta‐hidroxiesteroide deshidrogenasa 2

y adiposidad

Resistencia insulínica IGFBP3 Proteína trasportadora del factor de crecimiento insulínico

(Ling y cols., 2008)

(He y cols., 2008)

(Chang y cols., 2008)}

(Noer y cols., 2007)

(Goel y cols., 2004)

(Roupret y cols., 2008)

(Majid y cols., 2008)



{Milagro y cols., 2009; Noer y cols., 2007 ;

Stoger, 2006}

(Lai y cols., 2005)

(Oberlander y cols., 2008)

(Sullivan y cols., 2007)

(Lazcoz y cols., 2006)

(Hirasawa y cols., 2006)

(Semba y cols., 2002)

(Torrisani y cols., 2008)

(Alikhani‐Koopaei y cols., 2004)

(Chang y cols., 2002)

Introducción

‐52‐

hipocalórica así como para identificar individuos con mayores factores de riesgo para

desarrollar obesidad y otras enfermedades relacionadas, como por ejemplo el

síndrome metabólico(He y cols., 2010).

Principalmente son dos los objetivos perseguidos actualmente en el ámbito de

los factores dietéticos que influyen en la epigenética: en primer lugar, la identificación

(a una edad temprana) de las personas que podrían presentar perfiles específicos de

metilación en genes concretos que sugieran una mayor susceptibilidad a diferentes

enfermedades metabólicas, incluyendo el exceso de peso corporal y la diabetes tipo 2

y que permita la prevención y el control de su evolución. Y en segundo lugar, el uso de

la suplementación de la dieta como medio de contrarrestar perfiles epigenómicos

adversos de manera individualizada, similar a la administración de inhibidores de las

histonas deacetilasas e inhibidores de DNMTs s en la terapia del cáncer. Por lo tanto,

los desafíos en cuanto al papel de la epigenética en la obesidad incluirán la descripción

de los factores nutricionales que influyen en las marcas epigenómicas (Campion J y

cols., 2009b), la caracterización de los períodos vulnerables de la epigenética a lo largo

de la vida, la identificación de los puntos CpG supuestamente implicados en las

regiones promotoras de cada gen y la aplicación de la Epigenómica en el diseño de

biomarcadores fiables de obesidad y enfermedad metabólica, como se ha comprobado

para el cáncer y otras enfermedades crónicas (Schuffler y cols., 2009, Thorne y cols.,

2009).

OBJETIVOS

Objetivos

‐54‐

Una alimentación desequilibrada es un factor que puede inducir diversas

alteraciones metabólicas. En este contexto, un importante número de estudios

experimentales han demostrado que no sólo la ingesta calórica, sino también el

contenido de macronutrientes en la dieta puede desempeñar un papel importante

en la homeostasis de la insulina, y que la distribución inadecuada de

macronutrientes puede constituir un factor de riesgo para el desarrollo de

obesidad, diabetes, hipertensión y otros trastornos metabólicos. Así, el consumo

excesivo de hidratos de carbono, grasas, o de ambos, puede jugar un papel en el

desarrollo de resistencia a la insulina, esteatosis hepática y alteraciones lipídicas

asociadas a la obesidad y el síndrome metabólico. Por otra parte, la exposición a

diferentes factores nutricionales, químicos y físicos puede influir en los procesos

epigenéticos que contribuyen a modificar el perfil de expresión génica, lo que

podría alterar el riesgo de enfermedad. Los cambios epigenéticos relacionados con

los patrones de metilación del ADN podrían ser no sólo el resultado de la

interacción de diversos factores dietéticos y ambientales, sino también la causa de

algunas diferencias interindividuales relativas a la propensión a desarrollar

obesidad y otras enfermedades metabólicas.

El objetivo general del presente proyecto, según estas premisas, fue evaluar

la influencia de la distinta proporción en macronutrientes de diferentes dietas

isocalóricas sobre la obesidad, así como su efecto sobre la expresión génica y la

regulación epigenética de genes clave en las vías de la glucólisis, β‐oxidación,

lipogénesis y oxidación mitocondrial en hígado y tejido adiposo.

Los objetivos específicos fueron los siguientes:

1. Comparar dos regímenes dietéticos distintos, sin diferencias en el

contenido de energía (pair‐fed) pero con distinto contenido en hidratos de

carbono complejos y simples (almidón vs. sacarosa) sobre el peso corporal,

la adiposidad y diferentes marcadores de la homeostasis energética, así

como sobre la expresión de genes del metabolismo energético en hígado y

tejido adiposo blanco.

Objetivos

‐55‐

2. Estudiar la influencia del consumo de una dieta rica en sacarosa y grasas

saturadas (HFS) según un modelo de alimentación pair‐fed sobre cambios

bioquímicos, de peso y adiposidad, así como sobre los patrones de

metilación y la expresión de algunos genes clave del metabolismo hepático.

3. Evaluar el efecto de la ingesta de una dieta con elevada proporción de

grasas (HFD), según un modelo de alimentación pair‐fed, sobre el peso, la

adiposidad y diferentes marcadores del metabolismo lipídico, así como

sobre la expresión de genes clave del metabolismo en el tejido adiposo y el

patrón de metilación del ADN de esos mismos genes.

DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA

Diseño experimental y metodología

‐57‐

1. DISEÑO EXPERIMENTAL GENERAL

Los objetivos previstos fueron abordados con el diseño en paralelo de 3

estudios experimentales realizados en ratas Wistar (Figura 7). La administración de

la alimentación se realizó según un modelo pair‐fed y las 4 dietas con diferente

distribución de macronutrientes que se suministraron fueron las siguientes:

Dieta con elevada proporción de azúcares refinados (sacarosa) → HS

(“high sucrose”)

Dieta rica en grasas y azúcares refinados → HFS (“high fat‐sucrose”)

Dieta con alta proporción en grasas saturadas → HFD (“high fat diet”)

Dieta rica en almidón y baja en grasa → C (control)

La duración del tratamiento dietético fue de 69 días. La finalidad fue evaluar

tanto el efecto sobre el peso producido por cada una de las dietas (a pesar de que

el aporte calórico era el mismo en todos los grupos de intervención) como la

influencia de las diferencias en el aporte de macronutrientes sobre diversas

determinaciones de bioquímica sérica y hepática, expresión génica y regulación

epigenética del ADN (esta última se estudió en los animales tratados con dietas

HFS y HFD).

2. REQUERIMIENTOS ÉTICOS

Todos los procedimientos llevados a cabo durante el período experimental

fueron realizados según las normas nacionales e institucionales de la Protección de

los Animales y el Comité de Uso de la Universidad de Navarra.


‐58‐

Figura 7. Desarrollo general del diseño experimental.

Wistar

48

4 grupos

1212

1212

1111

1313

Control

HFS

HS

HFD10 semanas de

tratamiento dietético(pair‐fed)

Semana 5

SACRIFICIO

Estudios de expresión génica

Ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la medición

de insulina y adiponectina

Estudio del patrón de metilación de diferentes genes con implicación metabólica

Determinación de MDA yTG hepáticos

Determinaciones bioquímicas

Dietas

Disección de tejidos

Obtención de suerosPrueba de toleranciaa la glucosa

Calorimetría indirecta

Wistar

48

4 grupos

1212

1212

1111

1313

Control

HFS

HS

HFD

1212

1212

1111

1313

12121212

1212

1111

1313

Control

HFS

HS

HFD

Control

HFS

HS

HFD10 semanas de

tratamiento dietético(pair‐fed)

Semana 5

SACRIFICIO

Estudios de expresión génica

Ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la medición

de insulina y adiponectina

Estudio del patrón de metilación de diferentes genes con implicación metabólica

Determinación de MDA yTG hepáticos

Determinaciones bioquímicas

Dietas

Disección de tejidos

Obtención de suerosPrueba de toleranciaa la glucosa

Calorimetría indirecta

HFS

HFD

HS

Experimento 1

Experimento 3

Experimento 2

Control Lipids Health Dis. 2010; 9:60.

Mol Genet Metab.2010; en prensa.

J Nutrigenet Nutrigenomics. 2009; 2:267‐272.

HFS

HFD

HS

Experimento 1

Experimento 3

Experimento 2

Control Lipids Health Dis. 2010; 9:60.

Mol Genet Metab.2010; en prensa.

J Nutrigenet Nutrigenomics. 2009; 2:267‐272.


‐59‐

3. ANIMALES Y DIETAS

Un total de 48 ratas Wistar, de 8 semanas de vida, suministradas por el

Centro de Farmacobiología Aplicada (CIFA, Pamplona, España) fueron alojadas

individualmente en jaulas mantenidas en una habitación aislada a una temperatura

constante entre 21 y 23°C, con humedad controlada y con un ciclo de 12 horas de

luz (desde las 8 a las 20 horas). Los animales fueron asignados aleatoriamente

dentro de 4 grupos distintos: un grupo Control (n = 12) alimentado a base de pellet

estándar, un grupo de dieta alta en grasa: “high fat diet” (HFD; n = 11), un grupo de

dieta alta en grasas saturadas y azúcares simples: “high fat‐sucrose diet” (HFS, n =

12) y un último grupo alimentado con una dieta de elevado contenido en azúcares

simples: “high sucrose diet” (HS; n = 13). La administración de la alimentación se

realizó según un modelo pair‐fed. Las mediciones de la ingesta y el peso corporal

fueron realizadas diariamente.

En la mitad del período experimental se realizaron además 2

determinaciones in vivo: La sobrecarga intraperitoneal de glucosa (Iffiu‐Soltesz y

cols., 2010) y estudios de calorimetría indirecta (Garcia‐Diaz y cols., 2007). La

finalidad de ambos estudios fue comprobar la presencia o no de posibles

alteraciones metabólicas incipientes producidas por cada una de las dietas

ensayadas en la mitad del tratamiento dietético (semana 5).

Al final del período experimental, se procedió al sacrificio de los animales

por decapitación: inmediatamente se recolectó la sangre y se pesaron y recogieron

los diferentes depósitos grasos, hígado y músculos. El suero y los distintos órganos

y tejidos fueron almacenados a ‐80°C para posteriores determinaciones

bioquímicas, y de expresión génica y estudios epigenéticos, respectivamente.

3.1. Composición de las dietas empleadas

Para cada uno de los 3 experimentos se utilizó una dieta en la que el aporte

de un determinado macronutriente (o dos, en el caso del grupo HFS) era mayor

que el recomendado en condiciones normales. Sin embargo, en todos los grupos, la


‐60‐

ingesta calórica fue ajustada al consumo diario de Kcal registrado en el grupo

control (modelo pair‐fed), con objeto de fijar en cada grupo el mismo consumo

calórico de la dieta administrada en cada caso y evaluar posteriormente si se

producían diferencias de peso entre grupos, conociendo que el aporte energético

en cada uno de ellos era el mismo. La dieta suministrada en el Experimento 1 fue

elaborada manualmente, a base de pienso (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent

Maintenance Diet, Harlan Iberica, Barcelona, España) y leche condensada “La

lechera” en proporción 1:1,5. Se emplearon dietas comerciales para la realización

del Experimento 2 (D12451, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA ) y

Experimento 3 (D12330, Research Diets, New Brunswick, NJ,USA), y en la dieta

control (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan Iberica,

Barcelona, España) usada como referencia en los 3 experimentos. La composición

de la dieta estándar suministrada al grupo de referencia aportó 18% de la energía

en forma de proteínas, 71% de la energía como carbohidratos y el 11% en forma de

grasa.

Todas las dietas contenían en su composición suplementos minerales y

vitamínicos acordes con los requerimientos nutricionales de los animales.

La distribución de macronutrientes por dieta de estudio y experimento se

detalla en la Tabla 7.

Tabla 7. Composición energética de las dietas experimentales

HS HFS HFD

Ingesta energética (Kcal/g) 3,39 4,73 5,56

Proteínas (%) 12,5 20,0 16,4

Grasas (%) 18,5 45,0 58,0

Carbohidratos (%) 69,0 35,0 25,5

Sacarosa 41,6 17,5 0,0

Maltodextrina 10 0,0 10,1 12,6

Almidón 27,4 7,4 12,9

Experimento 1 Experimento 3Experimento 2

HS HFS HFD

Ingesta energética (Kcal/g) 3,39 4,73 5,56

Proteínas (%) 12,5 20,0 16,4

Grasas (%) 18,5 45,0 58,0

Carbohidratos (%) 69,0 35,0 25,5

Sacarosa 41,6 17,5 0,0

Maltodextrina 10 0,0 10,1 12,6

Almidón 27,4 7,4 12,9

Experimento 1 Experimento 3Experimento 2


‐61‐

4. DETERMINACIONES IN VIVO

4.1. Calorimetría indirecta

El consumo de oxígeno (O2) y la producción de dióxido de carbono (CO2)

fueron medidos usando el calorímetro indirecto Oxylet 00 O2/CO2 (Panlab SL,

Barcelona, España) como se ha descrito previamente (Garcia‐Diaz y cols., 2007).

Cada animal fue colocado en una de las cuatro cámaras acrílicas (350 mm x

200 mm x 180 mm). El flujo de aire de la habitación fue regulado a cada una de las

cámaras a razón de 700 mL / min, y posteriormente los niveles de O2 y CO2 de

cada cámara así como el aire de la sala se midieron cada 3 minutos. El período de

muestreo por cámara fue de 2 horas de recogida de datos.

El cociente respiratorio (RQ) se calculó como la relación entre el volumen de

CO2 producido y el volumen de O2 consumido, según las fórmulas propuestas por

el fabricante (Panlab SL, Barcelona, España), al igual que el gasto energético (EE).

Las fórmulas aplicadas para la obtención de los resultados fueron las siguientes:

VO2 = F x ‐100

[O2]s

[O2]e

100

x F x

[O2]e

100

1‐

[O2]s

1001‐ ‐

100

[CO2]s

VO2 = F x ‐100

[O2]s

[O2]e

100

x F x

[O2]e

100

1‐

[O2]s

1001‐ ‐

100

[CO2]s

VO2 = F x ‐100

[O2]s

[O2]e

100

x F x

[O2]e

100

1‐

[O2]s

1001‐ ‐

100

[CO2]s

‐100

[O2]s

100

[O2]s

[O2]e

100

x F x

[O2]e

100

1‐[O2]e

100

[O2]e

100

1‐

[O2]s

1001‐ ‐

100

[CO2]s

100

[CO2]s

[O2]e

100

1‐F x

[O2]s

100

1‐ ‐100

[CO2]s

x100

[CO2]s

100

[CO2]e‐VCO2 =

[O2]e

100

1‐F x

[O2]s

100

1‐ ‐100

[CO2]s

x100

[CO2]s

100

[CO2]e‐

[O2]e

100

1‐F x

[O2]s

100

1‐ ‐100

[CO2]s

x100

[CO2]s

100

[CO2]e‐

[O2]e

100

1‐F x[O2]e

100

1‐[O2]e

100

[O2]e

100

1‐F x

[O2]s

100

1‐ ‐100

[CO2]s[O2]s

100

1‐ ‐100

[CO2]s

100

[CO2]s

x100

[CO2]s

100

[CO2]s

100

[CO2]e

100

[CO2]e‐VCO2 =


‐62‐

Donde:

[O2]e = Concentración de oxígeno que fluye al interior de la jaula

[O2]s = Concentración de oxígeno dentro de la jaula

[CO2]e = Concentración de dióxido de carbono que fluye al interior de la jaula

[CO2]s = Concentración de dióxido de carbono dentro de la jaula

F = Flujo de aire que entra a la jaula

VO2 = Consumo de oxígeno

VCO2 = Producción de dióxido de carbono

Dentro de la fórmula del gasto energético se encuentra incluido el peso del

animal estudiado.

4.2. Test de sobrecarga intraperitoneal de glucosa

Después de un ayuno de 12 h, las ratas alimentadas con las 3 dietas en

estudio y la dieta control fueron sometidas a un test de sobrecarga intraperitoneal

de glucosa para lo cual se inyectó por vía intraperitoneal una solución de glucosa al

30% a dosis 1g / Kg de peso corporal, como describen otros autores (Iffiu‐Soltesz y

cols., 2010). Para cuantificar los niveles de glucosa se tomaron muestras de sangre

de la vena de la cola a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración

de glucosa. Los niveles de glucosa en sangre se determinaron utilizando un

glucómetro Glucotrend 2 (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania).

RQ =VCO2

VO2

RQ =VCO2

VO2

RQ =VCO2

VO2

EE (Kcal / día / peso corporal 3 / 4) = [ 3,815 + (1,232 x RQ) x VO2 x 1,44]EE (Kcal / día / peso corporal 3 / 4) = [ 3,815 + (1,232 x RQ) x VO2 x 1,44]


‐63‐

5. DETERMINACIONES SEROLÓGICAS

Los niveles circulantes de colesterol total y HDL‐colesterol fueron medidos

con los kits CP y HDL CP directo (ABX diagnóstico, Montpellier, Francia),

respectivamente; los triglicéridos y el lactato se midieron con un kit Randox y un

kit L‐lactato, respectivamente (Laboratorios Randox LTD, Ardmore Road, Reino

Unido). Los ácidos grasos libres (FFA) se cuantificaron con el kit NEFA C (Wako

Chemicals, Neuss, Alemania). Todos ellos se analizaron mediante métodos

cinéticos a tiempo final específicos y automatizados (COBAS MIRA, Roche, Basilea,

Suiza) según protocolos convencionales (Monreal y cols., 2005). La adiponectina

sérica (Linco Research, St. Charles, Missouri, EE.UU.) y los niveles de insulina

(Mercodia AB, Uppsala, Suecia) se midieron por técnicas de enzimainmunoensayo

(ELISA) en un equipo automatizado Triturus (Grifols International SA, Barcelona,

España).

Finalmente, el riesgo de presentar insulino‐resistencia se evaluó

considerando el índice HOMA‐IR de acuerdo con estudios publicados en roedores

anteriormente (Boque y cols., 2009) según la fórmula:

HOMA‐IR = (insulina plasmática en ayunas x glucosa plasmática) /22,5

Este índice estima el estado basal de la función beta celular del páncreas y

la sensibilidad a la insulina (Vogeser y cols., 2007).


‐64‐

6. DETERMINACIONES HEPÁTICAS

A partir de muestras de hígado de realizaron 2 determinaciones en los 3

grupos alimentados con las dietas experimentales y en el grupo de referencia:

Para la determinación de malondialdehído hepático (MDA) se utilizó un

ensayo colorimétrico de peroxidación de lípidos (kit de ensayo TBARS, Cayman

Chemical Company, EE.UU.), después de sonicar las muestras de hígado durante 15

segundos a 40 V en tampón RIPA con inhibidores de proteasas y centrifugar a 1600

g durante 10 minutos a 4°C. El MDA es considerado el principal producto de

autooxidación y degradación de ácidos grasos poliinsaturados o sus ésteres y sus

concentraciones plasmáticas son utilizadas frecuentemente como biomarcador

para estudiar el estrés oxidativo en humanos (Grotto y cols., 2007) y roedores

(Ahmed y cols., 2009).

Los niveles de triglicéridos hepáticos se determinaron mediante un ensayo

colorimétrico (triglicéridos MR, Cromatest; Linear Chemicals, España) tras 15

segundos de sonicación a 40 V en tampón Tris‐Cl. Un aumento de los niveles

hepáticos de triglicéridos puede ser indicio de un deterioro del metabolismo de los

lípidos y de esteatosis hepática leve (Lomba y cols., 2010).

7. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

7.1. Extracción y cuantificación de ARN

El ARN total fue extraído para la realización de RT‐PCR a partir de hígados y

tejido adiposo epididimal previamente almacenados y congelados a ‐80°C,

utilizando Tri® (Sigma‐Aldrich, Missouri, USA). Por cada 50 mg de hígado y 50 – 100

mg de tejido adiposo recolectado en un tubo de 15 mL, se agregó 1,7 mL de Tri® y

se llevó a un homogenizador. La homogenización se realizó primero lavando en

agua con etanol 75%, agua y Tri® antes de homogenizar la muestra. Luego las


‐65‐

muestras se traspasaron a tubos convenientemente etiquetados y se centrifugó a

12000 g durante 10 minutos. Posteriormente se descartó la fase superior, se

incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se añadió cloroformo. Se

agitaron los tubos y se volvieron a centrifugar a 12000 g durante 15 minutos. Luego,

se recuperó la fase superior (que contiene el ARN) en tubos nuevos y se les añadió

2‐propanol. A continuación se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos

y se deshechó el sobrenadante. Seguidamente se lavó el ARN con etanol al 75% y

se centrifugó por última vez durante 5 minutos. Finalmente, el pellet de ARN se

resuspendió en agua molecular libre de ARNasas, ADNasas y proteasas (5Prime Inc.,

Garthersburg, MD, US). Una pequeña fracción se empleó para evaluar la cantidad

de ARN y su grado de pureza respecto a proteínas y sales minerales. Esta se pudo

conocer midiendo su absorbancia ultravioleta a 260 y 280 nm en un

espectrofotómetro para microanálisis de muestras NanoDrop ND‐1000 (Nanodrop,

Wilmington, DE, EE.UU). La pureza del ARN extraído fue determinado como el

cociente A260 / A280 con valores esperados entre 1,8 y 2 (Fleige y cols., 2006). La

otra fracción se conservó a ‐80°C para la posterior realización del RT‐PCR.

7.2. Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT‐PCR)

La técnica RT‐PCR (“quantitative real time polimerase chain reaction”)

consta de las siguientes fases:

a) Tratamiento de las muestras de ARN con ADNasas y retrotranscripción

Mediante este proceso se consigue, a través de la acción de la transcriptasa

inversa (enzima de tipo ADN‐polimerasa,) la transformación del ARN de partida en

ADN (ADN complementario).

El ARN extraído fue tratado con ADNasas con un kit DNA free (Ambion, TX,

EEUU). Se calculó el volumen necesario a utilizar de cada muestra conservada para

disponer de 2 µg de ARN y se llevó a un tubo eppendorf. Luego se agregó la

solución de ADNasas y se llevó la muestra a un termociclador programado con una

temperatura constante de 37°C durante 20 minutos. Después, se añadió una


‐66‐

solución de inactivación a cada muestra, se centrifugó y se llevó el sobrenadante a

un tubo nuevo previamente etiquetado. Posteriormente, los 2 µg de ARN fueron

utilizados como la hebra molde para la síntesis de ADN de hebra simple con una

transcriptasa reversa M‐MLV (Invitrogen Technologies, Canadá).

Se añadió a cada tubo soluciones de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y

de oligodT (DNA sintético que es complementario a la terminación poliadenilada

presente en el ARN mensajero y que se utiliza como cebador universal para la

transcripción reversa) y se incubaron a 65°C durante 5 minutos. Luego se agregó

ditiotreitol (DTT), inhibidor de ARNasa y la enzima retrotranscriptasa y por último

se incubó a 50 minutos a 37°C y se inactivó la reacción tras 15 minutos a 70°C.

b) RT‐PCR: metodología Taqman

Fundamento

Las sonda Taqman contiene un “emisor o reporter” marcado con un

fluoróforo en el extremo 5´ que emite una longitud de onda absorbido por un

“atenuador o quencher” no fluorescente unido en el extremo 3´. Cuando la

secuencia diana de interés está presente en la muestra, dicha sonda se alinea

específicamente entre los cebadores sentido y antisentido. Durante la reacción, se

produce la liberación del “emisor” marcado y como consecuencia, se incrementa

su fluorescencia. La acumulación de productos de PCR se detecta directamente

monitorizando el incremento de la fluorescencia del “emisor”. Cuando la sonda

está intacta y por lo tanto no se ha dado la reacción, la proximidad del “emisor”

marcado al “atenuador”, anula su fluorescencia (Figura 8).


‐67‐

Figura 8. Esquema de la RT‐PCR según la metodología Taqman (modificado de Taqman Gene Expression Assays Protocol)

Procedimiento

Realizamos reacciones de PCR cuantitativa a tiempo real en un sistema de

detección ABI PRISM 7000 HT de acuerdo a las recomendaciones de la casa

comercial (Applied Biosystems, CA, EEUU). Para asegurar el buen resultado de la

reacción de PCR, previamente se realizaron pruebas utilizando distintas diluciones

(1:100, 1:1000 y 1:500) de muestras controles para determinar cual era la dilución

más adecuada para la realización de los experimentos posteriores. La reacción de

PCR se realizó bajo el siguiente programa de temperaturas: 1 ciclo a 50°C durante 2

1.‐) Polimerización

4.‐) Polimerización completada

3.‐) Rotura del “reporter”

2.‐) Desplazamiento de la cadena










‐68‐

minutos, 1 ciclo a 95°C por 10 minutos y por último 40 ciclos a 95°C con duración

de 15 segundos y a 60°C por 1 minuto. Se estudiaron los siguientes genes tanto en

hígado como en tejido adiposo epididimal: Hydroxiacil‐CoA deshidrogenasa

(HADHB; Rn00592435_m1), Glucoquinasa (GCK; Rn00688285_m1), NADH

deshidrogenasa (ubiquinona) 1‐beta subcomplejo 6 (NDUFB6; Rn03416136_m1) y

Ácido graso sintasa (FAS; Rn01463550_m1). Para normalizar los niveles de

expresión de los genes se emplearon Ubiquitina (Rn01789812_g1) y Gliceraldehído

3‐fosfato deshidrogenasa (GAPDH; Rn 99999916_s1) como controles internos

(Applied Biosystems, Austin, TX, EE.UU.) utilizando el software Genorm (Garcia‐

Diaz D y cols., 2007). Todas las sondas Taqman, tanto de los genes de rata como de

los controles internos fueron suministradas por Applied Biosystems, CA, EEUU. La

totalidad las muestras se analizaron por triplicado.

7.3. Cálculo de la expresión génica por el método comparativo 2‐∆∆ct

Los datos de expresión génica se calcularon utilizando el método de

cuantificación relativa, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Applied

Biosystems, EEUU) donde la cantidad de expresión del gen a estudiar, normalizado

a un gen de referencia endógeno y relativa a un calibrador, es expresada por la

fórmula aritmética 2‐∆∆ct.

Para llegar a los resultados de dicha fórmula aritmética, los datos de la

amplificación del gen obtenidos por la RT‐PCR fueron exportados como valores Ct

(threshold cycle, ciclo de amplificación en el cual la señal de fluorescencia emitida

se encuentra considerablemente por encima de los niveles de amplificación

inespecífica y es inversamente proporcional al número de copias iniciales de la

muestra). Posteriormente los valores Ct para el gen de estudio se sustraen a los

valores Ct del gen de referencia endógena para determinar los valores ∆Ct para

cada una de las muestras. El gen de referencia endógeno se utiliza para normalizar

la cantidad de ARN y debe ser propiamente validado de manera que no sea

afectado por el tratamiento experimental (Livak y Schmittgen, 2001).


‐69‐

Finalmente, a los valores ∆Ct del gen en estudio se le restan los valores de

∆Ct de un valor de referencia dando el valor ∆∆Ct. Dicho cálculo se puede realizar

asumiendo que la eficiencia de la amplificación del gen en estudio y el gen de

referencia endógena son iguales, lo cual se consigue si las sondas utilizadas son

diseñadas y optimizadas según las pautas de Applied Biosystems (Applied

Biosystems, EEUU).

De ésta manera, en el presente proyecto de investigación, los cambios en la

expresión de los genes estudiados tras la finalización del tratamiento dietético de

todos los grupos de experimentación se calcularon por el método 2‐∆∆ct,

normalizados a los genes de referencia GAPDH y ubiquitina utilizando el software

Genorm (Garcia‐Diaz y cols., 2007; Vandesompele y cols., 2002 ) y relativizándolos

al grupo control, es decir al que sirve de referencia para los 3 experimentos que

componen éste trabajo.

8. ESTUDIOS DEL PATRÓN DE METILACIÓN DEL ADN:

TECNOLOGÍA MASSARRAY‐SEQUENOM

Fundamento

Esta técnica se basa en el tratamiento del ADN genómico con bisulfito,

seguido de la amplificación por PCR y un proceso patentado de fragmentación

base‐específica. El patrón de corte resultante depende de la presencia de citosinas

metiladas en el ADN genómico original. Los productos de degradación son

automática y cuantitativamente analizados por espectrometría de masas

MALDITOF (Figura 9).


‐70‐

Figura 9. Esquema del proceso de estudio del patrón de metilación del ADN según la metodología Sequenom (modificado de Sequenom DNA Methylation Analysis Protocol)

En el presente trabajo de investigación se estudió el patrón de metilación

en los Experimentos 2 y 3. Los cebadores utilizados para cada uno de los genes por

experimento se detallan en la tabla 8.

Tabla 8.Cebadores utilizados para el estudio de los patrones de metilación en los Experimentos 2 y 3.

Gen

GCK TAGAATTAGGGAGGAAGTAGGAAGG GGATTTTGAGGTATTGTATTGATTTTT

HADHB TTTTTTTATTAGTAGGAAAAGGGTAGT GGGTTGATTTTTGAATAAGATTTGA

FAS GGGTTGATAAGTAAGGTTTTGAGGTTTTGGTTT GTTATAGAAAGGGTGGGTGTTTGAG

NDUFB6 TTTTAGGTTAAGAAGGTGGGAATTT TGGTTGAAGGATTAAGAGTTGAGTT


Cebador sen do (5´→3´) Cebador an sen do (3´→5´)

Experimento 3

Experimento 2

Gen

GCK TAGAATTAGGGAGGAAGTAGGAAGG GGATTTTGAGGTATTGTATTGATTTTT


FAS GGGTTGATAAGTAAGGTTTTGAGGTTTTGGTTT GTTATAGAAAGGGTGGGTGTTTGAG

NDUFB6 TTTTAGGTTAAGAAGGTGGGAATTT TGGTTGAAGGATTAAGAGTTGAGTT


Cebador sen do (5´→3´) Cebador an sen do (3´→5´)

Experimento 3

Experimento 2

ADN metilado ADN no metilado

Tratamiento con Bisulfito

PCR y lavado

Transcripción In vitro

con Polimerasa T7

Fragmentación base‐específica

del ARN

Obtención de datos



PCR y lavado


con Polimerasa T7


del ARN

Obtención de datos



PCR y lavado


con Polimerasa T7


del ARN

Obtención de datos


‐71‐

9. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS

Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar (ó

promedio ± error estándar cuando así se indique) de las medias. La mayoría de las

variables se distribuyeron normalmente. El criterio de normalidad se evaluó por la

prueba de Shapiro‐Wilk. En las variables que no presentaron una distribución

normal se realizó la modificación logarítmica y se realizaron nuevamente las

pruebas de normalidad. En aquellas variables que no cumplieron las condiciones de

normalidad después de la conversión logarítmica se aplicó el test no paramétrico U

de Mann‐Whitney. El resto de datos se analizaron mediante la prueba paramétrica

t de Student. Los análisis de correlación se realizaron mediante el test de Pearson o

Spearman, dependiendo del carácter paramétrico o no paramétrico de la variable

en cuestión, respectivamente.

Aquellas diferencias cuya probabilidad fue superior al 5% (p<0,05) se

consideraron significativas y con tendencia a la significación o marginalmente

significativas aquellas que presentaron una probabilidad superior al 10% (p< 0,1)

(Martínez‐González y cols., 2001).

Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 15.0 para

Windows (Chicago, IL, EE.UU).

RESULTADOS

Resultados

‐73‐

ARTÍCULO 1:

En éste trabajo se incluyen los estudios llevados a cabo para cumplir con el objetivo 1

de esta Tesis Doctoral.

Resultados

‐74‐

Resultados

‐75‐

Resultados

‐76‐

Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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ARTÍCULO 2:



Resultados

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Resultados

‐83‐

Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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ARTÍCULO 3:



Resultados

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Resultados

‐93‐

Resultados

‐94‐

Resultados

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Resultados

‐96‐

DISCUSIÓN GENERAL

Discusión general

‐98‐

1. CONSIDERACIONES GENERALES

La obesidad representa uno de los problemas mas importantes de Salud

Pública, no sólo por el elevado número de personas que la padecen, sino por las

complicaciones metabólicas y costes sociales que conlleva (Salas‐Salvado y cols.,

2007). La presencia de esta enfermedad está relacionada con una serie de

trastornos cardiovasculares y metabólicos como la hipertensión, la diabetes tipo 2,

hiperinsulinemia, dislipidemias, arteriosclerosis, e incluso algunos tipos de cáncer

(Gutierrez Guisado y cols., 2008; Ingelsson y cols., 2009). Además, el tratamiento

de todas sus comorbilidades supone un elevado gasto sanitario, el cual podría

reducirse mediante estrategias terapéuticas adecuadas (Perez‐Rodrigo y cols.,

2006).

En la obesidad están implicados numerosos elementos causales, entre los

que se encuentran factores genéticos, metabólicos, endocrinológicos, ambientales

(hábitos dietéticos y actividad física) y psicosociales. El papel de ciertos

microorganismos, la epigenética, el aumento de la edad materna, la mayor tasa de

fecundidad entre personas que presentan mayor adiposidad y menor nivel

sociocultural, los trastornos del sueño, la iatrogenia farmacéutica, la reducción de

la variabilidad de la temperatura ambiente, e intrauterina y los efectos

intergeneracionales son algunos de los factores que también podrían intervenir en

la epidemia de la obesidad (McAllister y cols., 2009). De hecho, en la mayor parte

de los pacientes que desarrollan obesidad es difícil establecer una única causa,

atribuyéndose en gran medida a la interacción entre la carga genética y los factores

ambientales relacionados con el estilo de vida (Marti y cols., 2008; Weinsier y cols.,

1998). Así, las vías metabólicas involucradas en la homeostasis energética son

especialmente sensibles a los cambios en la composición de la dieta (Prentice y

Poppitt, 1996). Del mismo modo, los factores dietéticos participan, sin lugar a

dudas, en la etiología de dichos trastornos metabólicos en los seres humanos

(Popkin y Gordon‐Larsen, 2004). Los porcentajes y el tipo de macronutrientes de la

dieta no sólo pueden influir en la salud cardiometabólica o en la sensibilidad a la

insulina, sino también en el aumento de peso y adiposidad. En éste sentido, se ha

Discusión general

‐99‐

postulado que la epigenética se encuentra posiblemente involucrada en la

pandemia actual de obesidad (Junien y Nathanielsz, 2007). Así, la regulación

epigenética de la expresión génica ha emergido en los últimos años como un factor

potencialmente importante (Campion y cols., 2009b). En este contexto, la

epigenética se define como los cambios en la transcripción de genes que no son

debidos a modificaciones en la secuencia de ADN (Allis y cols., 2007 ). Así, la

metilación del ADN y las modificaciones de las histonas constituyen procesos

epigenéticos que participan en la regulación de la expresión génica, tanto

impidiendo la unión de factores de transcripción como propiciando una estructura

compacta de la cromatina (Mesa‐Cornejo y cols., 2006). Por tanto, la epigenética

hace referencia a los cambios reversibles del ADN que hacen que unos genes se

expresen más o menos dependiendo de la nutrición y otros factores metabólicos.

Los desequilibrios nutricionales pueden provocar alteraciones orgánicas que

podrían ser explicadas por la hipótesis del “fenotipo ahorrador” (Hales y Barker,

1992) y que a medio o largo plazo son responsables de trastornos metabólicos

como la obesidad y el síndrome metabólico (Waterland, 2008b). De hecho, los

datos obtenidos en modelos animales y en humanos demuestran que las

alteraciones en la regulación a nivel epigenético pueden causar obesidad

(Waterland, 2005). Los continuos avances científicos promueven la investigación

acerca de la implicación de mecanismos epigenéticos en el inicio, desarrollo y

tratamiento de enfermedades como el cáncer, la diabetes tipo 2 y la obesidad

(Dolinoy y Jirtle, 2008).

2. VALORACIÓN DE LOS EFECTOS DE LAS DIFERENTES DIETAS

ISOCALÓRICAS SOBRE EL PESO CORPORAL Y EL

METABOLISMO ENERGÉTICO

Las relaciones entre la ingesta energética, gasto energético, composición

nutricional de la dieta y la adipogénesis determinan el depósito de las reservas

energéticas corporales, la mayor parte de la cuales aparecen como triglicéridos en

Discusión general

‐100‐

el tejido adiposo (Martinez y cols., 2002). Cuando el aporte de energía excede

crónicamente al gasto energético o la distribución nutricional de la dieta favorece

la acumulación de lípidos, se produce un desequilibrio que conlleva el desarrollo de

sobrepeso y a largo plazo de obesidad (Loos y Bouchard, 2003). Diversos estudios

experimentales en ratas han demostrado que no sólo la ingesta calórica, sino

también la distribución de macronutrientes en la dieta juega un papel importante

en la regulación de los niveles de insulina, los cuales pueden constituir un factor de

riesgo asociado a la obesidad, la diabetes y otros trastornos metabólicos (Axen y

cols., 2003; Storlien y cols., 1988). Un considerable número de ensayos en

humanos han estudiado la relación de la composición de la dieta, en cuanto a la

distribución de macronutrientes, con el desarrollo de obesidad (Abete y cols.,

2010). La capacidad del metabolismo de ajustarse a la composición en

macronutrientes de la dieta es posible gracias a que muchas de las células del

organismo son capaces de utilizar sustratos derivados tanto de hidratos de carbono

como de grasas y proteínas. La más notable excepción la representa el sistema

nervioso central, incapaz de utilizar significativamente ácidos grasos como

combustible y, en consecuencia, dependiente de un adecuado aporte de glucosa, o

en su defecto de cuerpos cetónicos como sustrato alternativo (Labayen y Martinez,

2002).

El presente proyecto de investigación estuvo basado en 3 experimentos

realizados conjuntamente, en los que la administración de la dieta se realizó a

través de un modelo pair‐fed para asegurar que el aporte calórico era el mismo en

todos los grupos experimentales respecto al grupo control o de referencia. La

diferencia radica en el porcentaje de macronutrientes suministrado a los animales

de cada uno de los experimentos. En el primero de ellos se evaluaron los efectos de

una dieta con un elevado aporte de azúcares simples (HS), en el segundo se aportó

una excesiva proporción de grasas saturadas y azúcares simples (HFS) y en el

tercero se estudiaron los efectos producidos por una dieta con una proporción de

grasas muy superior a la recomendada (HFD), todos ellos durante 10 semanas.

De acuerdo al diseño experimental, la energía total consumida durante el

estudio fue similar en todos los grupos. Sin embargo, los animales alimentados con

Discusión general

‐101‐

las 3 dietas experimentales aumentaron su peso significativamente en relación al

grupo control (Lomba y cols., 2009; Lomba y cols., 2010). Esto confirma que no

solo la ingesta energética sino también la composición de los alimentos ingeridos

parece influir en la regulación del peso corporal (Horton y cols., 1995).

El consumo de las dietas HS, HFS y HFD indujo una mayor ganancia de peso

y masa grasa que la dieta control a pesar de que la ingesta fue isocalórica. Otros

autores han obtenido resultados similares en roedores alimentados con un modelo

ad libitum de dietas con alta proporción de azúcares simples, grasas o ambas

(Barnard y cols., 1993; Boque y cols., 2009). En modelos de alimentación pair‐fed

en roedores, la bibliografía informa tanto de aumento de peso significativo con

dietas HS (Reiser y Hallfrisch, 1977), HFS (Petro y cols., 2004) y HFD (Atshaves y

cols., 2010) como de ausencia de diferencias en la ganancia de peso entre los

grupos alimentados con estos tipos de dietas y los grupos de referencia (de Meijer

y cols., 2010; Mantha y Deshaies, 2000). Estos datos indican que no sólo la cantidad

de energía, sino también la proporción de macronutrientes en la dieta pueden

estar implicados en la obesidad y la acumulación de grasa (Abete y cols., 2006).

Por otra parte, el gasto energético se incrementó ligeramente en los

animales alimentados con las dietas HS (Experimento 1), HFS (Experimento 2) y

HFD (Experimento 3), sugiriendo que el consumo de una dieta con elevado

porcentaje en éstos sustratos energéticos podría conllevar un incremento del

metabolismo basal o la termogénesis, tratando de combatir la excesiva

acumulación de grasa en el tejido adiposo. Sin embargo, no se vieron efectos sobre

el coeficiente respiratorio. El coeficiente respiratorio se define como la relación

entre el volumen de CO2 eliminado y el del O2 absorbido utilizándose para

determinar la oxidación relativa de los sustratos; normalmente es de 0,8 aunque

depende del tipo de macronutriente que se esté oxidando, pudiendo variar entre

0,7 si se oxidan grasas mayoritariamente, hasta 1 si se oxidan hidratos de carbono

(Leaf, 1985). Un coeficiente respiratorio alto podría reflejar una oxidación de

lípidos inferior, lo cual podría ser un indicador de ganancia de peso (Beer‐Borst y

cols., 2000; Schutz, 1995), aunque otros investigadores (Flatt y Guptta, 1999), han

Discusión general

‐102‐

publicado que la eficiencia metabólica podría jugar un papel menor en el desarrollo

de la obesidad.

En relación a la dieta HS (Experimento 1), nuestros datos ayudan a entender

algunos de los efectos discordantes que se han observado en ratas como

consecuencia del empleo de dietas altas en sacarosa. Así, Kanazawa y cols., (2003)

mostraron que la dieta rica en sacarosa, al contrario que la de alto contenido en

grasas, no aumenta el peso corporal en ratas. El modelo experimental de Goodson

S y cols. (2001) es un buen ejemplo de un diseño experimental similar al nuestro,

ya que utilizaron una dieta isoenergética rica en sacarosa y la compararon con

dietas isoenergéticas control y rica en grasas (HFD). Estos investigadores

observaron que las ratas que recibieron la dieta HS ganaron menos peso que las

controles. Sin embargo, otros autores observaron un aumento de la ingesta y el

peso corporal cuando la sacarosa fue proporcionada a los animales en forma de

solución y separada de la comida (Lawton y Blundell, 1992), o como suplemento

(Blundell y Hill, 1988). Goodson y cols. (2001) explicaron este resultado por el

hecho de que en su experimento la sacarosa fue mezcada en la dieta y de que al

administrar la alimentación empleando un modelo ad‐libitum probablemente los

animales no podían reducir su ingesta de alimentos. Sin embargo, los datos de

Goodson y cols. (2001) no van en la misma dirección que los nuestros, que no

pueden ser explicados por diferencias en la ingesta de alimentos, sino sólo por

causa de cambios metabólicos. En este sentido, estudios previos han demostrado

que las dietas ricas en fibra insoluble son capaces de disminuir la ingesta de

alimentos, el vaciado gástrico, la tasa y los niveles de absorción intestinal de grasas,

e influyen en la oxidación y el almacenamiento de grasa provocando una

disminución de la glucosa postprandial y de los niveles de lípidos (Linko y cols.,

2005), mejorando la sensibilidad a la insulina y provocando un menor aumento de

peso (Isken F y cols., 2009). Otra investigación llevada a cabo por Zhang y cols.

(2009) en ratas alimentadas con arroz salvaje, rico en almidón, concluyó que esta

dieta fue capaz de inhibir el aumento del estrés oxidativo y demostró propiedades

beneficiosas en lo referente a los perfiles de lípidos séricos y al estado antioxidante.

Discusión general

‐103‐

Respecto a la dieta HFS (Experimento 2), nuestros resultados confirman que

la distribución y el tipo de macronutrientes de la dieta (en éste caso sacarosa vs.

almidón y grasas saturadas vs. ácidos grasos insaturados) podrían influir en el

desarrollo de trastornos metabólicos (Lomba A y cols., 2010). Son bien conocidas

las propiedades obesogénicas, hiperinsulinémicas e insulino‐resistentes de este

tipo de dieta (Fonseca y cols., 2000). Existen estudios que demuestran que la dieta

HFS favorece el desarrollo de hipertensión y aumenta los niveles de triglicéridos

plasmáticos (Fonseca y cols., 2000). Además, la intolerancia a la glucosa y la

hiperinsulinemia que inducen las dietas HFS pueden indirectamente tener efectos

perjudiciales sobre el hueso, alterando la absorción de calcio (Li y cols., 1990). En

un estudio en ratas realizado por Barnard y cols. (1993), los autores comprobaron

la presencia estadísticamente significativa de placas de ateroma en las arterias

coronarias de las ratas alimentadas con dieta HFS, lo que no se observó en el grupo

control, confirmando el factor de riesgo cardíaco que supone el consumo de ésta

dieta. Por su parte Grimditch y cols. (1988) llevaron a cabo un estudio en ratas en

el que compararon una dieta HFS estándar con otras 3 dietas HFS en las que

variaron el aporte de fibra, de ejercicio físico y de grasas, respectivamente. Los

autores atribuyeron los efectos descritos para la dieta HFS a la presencia de

sacarosa o la ausencia de hidratos de carbono complejos, no a la elevada

proporción de grasas en la dieta, siendo al parecer la sacarosa la principal

responsable de la resistencia a la insulina que no mejoró mediante la adición de

fibra a la dieta o el entrenamiento físico.

La dieta HFD (Experimento 3) empleada en éste estudio aportó un 58% de la

energía en forma de grasa, de la cual el 54% se proporcionó en forma de ácidos

grasos saturados. Este hecho, unido a la baja proporción de hidratos de carbono

consumidos, puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de obesidad

y resistencia a la insulina. Así, los ácidos grasos saturados pueden promover estrés

en el retículo endoplasmático y disfunción hepática en roedores (Wang y cols.,

2006). Además, una ingesta de grasas saturadas superior al 10% del total de

energía puede provocar resistencia a la insulina en los seres humanos y, por lo

tanto, puede no ser adecuado para los pacientes con NAFLD (hígado graso no

Discusión general

‐104‐

alcohólico) (Musso y cols., 2003). Por otra parte, las dietas ricas en ácidos grasos

saturados inducen una reducción de la tolerancia a la glucosa en ratas Zucker

(Beylot y cols., 2006). Varios estudios en humanos sugieren que las dietas con bajo

contenido en grasas saturadas y elevada proporción de hidratos de carbono y fibra

dietética mejoran de forma significativa la salud mediante el aumento de la

sensibilidad insulínica y reducen el riesgo de enfermedad cardiovascular (Anderson

y cols., 2000).

En la mitad del período experimental (semana 5) se realizó, en los 3 grupos

experimentales y en el grupo control, un test de sobrecarga intraperitoneal de

glucosa para comprobar si los animales presentaban en ese momento alguna

alteración en el metabolismo de la glucosa. Cuando se realizó este test, la curva de

tolerancia a la glucosa fue mas alta y más prolongada en el tiempo en los grupos

HFS (Experimento 2) y HFD (Experimento 3) respecto al control, según lo descrito

por otros autores después del consumo de dietas HFS (Hattori y cols., 2009), HFD

(Timmers y cols., 2010) y HS (Kergoat y cols., 1987) ad libitum. Por su parte, en el

grupo HFD (Experimento 3), el pico máximo de glucosa en sangre se registró

después de 15 minutos de la administración intraperitoneal de la sobrecarga de

glucosa, lo cual ha sido descrito por otros autores (Timmers y cols., 2010). En los

grupo HS (Experimento 1) y HFS (Experimento 2) este pico máximo de glucosa en

sangre se registró a los 30 minutos de recibir la sobrecarga de glucosa. En este

contexto, en los modelos de dietas ad libitum, la resistencia a la insulina aparece

después de 2 semanas, sin cambios importantes en los triglicéridos séricos, glicerol

plasmático, o la presión arterial, incluso antes de cualquier síntoma de obesidad o

hipertrofia del adipocito (Barnard y cols., 1998). En este sentido, Grimditch y cols.

(1988) han publicado que, de los dos principales componentes de la dieta HFS, el

azúcar refinado causa un daño mayor que el alto contenido en grasa durante las

pruebas de tolerancia a la glucosa. Sin embargo, la combinación de azúcar refinado

y alto contenido graso dio lugar a un empeoramiento de la respuesta.

Por otra parte, Barnard y cols. (1998) demostraron que la aparición de

resistencia insulínica se produce antes de que otras manifestaciones del síndrome

metabólico tengan lugar, siendo la ingesta alimentaria, pero no el aumento de

Discusión general

‐105‐

peso excesivo, la causa subyacente. Además, los estudios en humanos han indicado

también que la resistencia a la insulina suele preceder a otros aspectos del

síndrome metabólico como la dislipidemia y la hipertensión (Mitchell y cols., 1992).

En este sentido, es probable que en el momento de la sobrecarga de glucosa

intraperitoneal, los grupos HFS (Experimento 2) y HFD (Experimento 3) hayan

desarrollado ya un estado temprano de resistencia a la insulina que se caracteriza

por una menor sensibilidad a la misma, no pudiendo compensar sobrecargas

puntuales de glucosa. Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles

séricos de insulina en las condiciones de ayuno tras la finalización del experimento.

En relación con el metabolismo de los lípidos, los niveles circulantes de HDL

y colesterol total disminuyeron significativamente en los grupos HS (Experimento

1) y HFS (Experimento 2), de manera similar a como exponen otros autores (Kirino

y cols., 2009). Esta reducción podría ser, en parte, el resultado de los niveles de

colesterol HDL más bajos, como ha sido descrito previamente por Boqué y cols.

(2009) con una dietas similares (ad libitum) en ratas Wistar, aunque estas

diferencias no fueron estadísticamente significativas. El tipo de carbohidrato

(almidón frente sacarosa) (Dumaswala y cols., 1976) y de grasa en la dieta (Beynen

y Lemmens, 1987) afectan el metabolismo del colesterol en ratas. Sin embargo, el

comportamiento de los triglicéridos séricos fue diferente en estos experimentos,

presentando un ligero aumento (p= 0,09) en el grupo HS respecto al grupo control

(Experimento 1) como se ha descrito también en otros estudios (Frayn y Kingman,

1995; Kanazawa y cols., 2003; Robert y cols., 2008) y siendo estadísticamente

inferiores en el grupo HFS en comparación al grupo de referencia (Experimento 2).

En éste sentido, otros autores han obtenido resultados similares: Boqué y cols.

(2009) llegaron a un resultado parecido en ratas Wistar alimentadas con una dieta

HFS ad libitum durante 35 días, Yamamoto y cols. (2006) en ratas Sprague‐Dawley

que recibieron una dieta HFS durante 4 semanas, y Jourdan y cols. (2010) en

ratones alimentados durante más de 20 semanas con esa misma dieta.

Aunque se considera que la fructosa es un azúcar que puede provocar

hipertrigliceridemia y se cree que para contrarrestar este efecto podría ser útil la

sacarosa (2000), el consumo de sacarosa también parece estar asociado a niveles

Discusión general

‐106‐

elevados de triglicéridos en los seres humanos (1998). Sin embargo, en relación con

otras fuentes de hidratos de carbono, los efectos del consumo de azúcar sobre las

lipoproteínas de alta densidad y los niveles de lipoproteína de baja densidad no

están claros. Los principales carbohidratos alimentarios, el almidón o la sacarosa,

pueden afectar de manera diferente al metabolismo lipídico y al estado

antioxidante en ratas, probablemente al influir en el aclaramiento de triglicéridos y

a través del suministro de micronutrientes antioxidantes proporcionados por los

azúcares complejos en relación con los refinados (Robert y cols., 2008).

Probablemente la conversión de los excedentes de azúcar en triglicéridos podría

estar relacionada con un aumento de la lipogénesis hepática.

En éste sentido, los resultados de los Experimentos 1 y 2 sugieren un

aumento del aclaramiento de triglicéridos por el hígado y el tejido adiposo,

confirmando las diferencias en cuanto al metabolismo de los lípidos entre los

modelos roedores y humanos. En el Experimento 3 los niveles de triglicéridos

séricos en el grupo HFD y C fueron similares entre sí, sugiriendo que el efecto era

provocado por el azúcar de la dieta.

En relación con los triglicéridos hepáticos, estos lípidos aumentaron en los 3

experimentos llevados a cabo en éste trabajo, de forma ligera en el grupo HS

(Experimento 1), probablemente mediado por un aumento de la lipogénesis

hepática, y muy marcadamente en los grupos HFS (Experimento 2) y HFD

(Experimento 3). Estos datos sugieren una alteración del metabolismo lipídico y

esteatosis hepática leve. Es bien conocido que el consumo de un tercio más de

calorías en forma de grasa dietética, pero no de carbohidratos, produce esteatosis

en ratas (Ahmed y cols., 2009). Estos autores indican que la distribución y

utilización de este exceso de grasa en el hígado en el grupo HFD ad libitum

proporciona el primer evento en el desarrollo de NAFLD en ratas Sprague‐Dawley.

En algunos estudios en humanos (Ceriello y cols., 1998; Liu y cols., 2002),

pero no en todos (Ma y cols., 2005), un mayor consumo de alimentos y bebidas con

alto contenido en azúcar se asocia con aumento de la inflamación y el estrés

oxidativo. Sin embargo, pocos estudios han evaluado los efectos del consumo de

Discusión general

‐107‐

azúcar a largo plazo en los marcadores de estrés oxidativo y la inflamación

(Johnson y cols., 2009). En éste sentido, el malondialdehído (MDA) es considerado

el principal producto de autooxidación de los ácidos grasos poliinsaturados o sus

ésteres y sus concentraciones plasmáticas se emplean con frecuencia como

marcador de estrés oxidativo en humanos (Grotto y cols., 2007) y roedores (Ahmed

y cols., 2009) Este estado oxidativo sistémico se evaluó mediante la detección de la

peroxidación lipídica de malondialdehído y se determinó como especies reactivas

del ácido tíobarbitúrico (TBARS) (Vetelainen y cols., 2007). Al determinar los niveles

de MDA hepático, en los 3 experimentos se obtuvieron mayores niveles en los

grupos tratados con las dietas experimentales respecto al grupo C, pero estas

diferencias solo resultaron estadísticamente significativas en el grupo HFS

(Experimento 2). Otros autores han observado aumentos similares en el estrés

oxidativo con modelos ad libitum empleando dietas HFS (Yamamoto y Oue E, 2006),

HFD (Dobrian y cols., 2001) y dietas de cafetería (Milagro y cols., 2006). La

peroxidación de lípidos conlleva la reducción de la capacidad oxidativa

mitocondrial hepática y una mayor susceptibilidad al daño hepático y esteatosis

(Thyfault y cols., 2009). En este sentido, los ácidos grasos saturados pueden

promover el estrés del retículo endoplásmático del hepatocito y el daño del mismo,

dando lugar al desarrollo de disfunción hepática en roedores (Wang y cols., 2006).

El estado inflamatorio relacionado con la obesidad también puede ser originado

por el estrés oxidativo, el cual induce lesiones celulares y podría ser capaz de

alterar la producción de adipocitoquinas y la sensibilidad a la insulina (Furukawa y

cols., 2004).

Entre las adipocitoquinas se encuentra la adiponectina, ampliamente

descrita como un factor de sensibilidad a la insulina con efectos antidiabético y

antiaterogénico (Kadowaki y cols., 2006) que sólo se expresa en los adipocitos

maduros (Ahima, 2006; Kadowaki y cols., 2006). De los 3 experimentos realizados,

sólo se obtuvo una tendencia a la significación estadística en relación con la

adiponectina en el Experimento 3 (HFD‐C), resultando mayores sus niveles en el

grupo HFD. En este sentido, la expresión de adiponectina se reduce generalmente

en modelos de roedores obesos y resistentes a la insulina, mientras que los niveles

Discusión general

‐108‐

plasmáticos de adiponectina suelen ser menores en las personas obesas,

particularmente en aquellas con obesidad visceral (Kadowaki y cols., 2006). Sin

embargo, hay informes de que las dietas HFD inducen la expresión de adiponectina

en los adipocitos de roedores en etapas tempranas (Li y cols., 2002) o tardías

(Stroubini y cols., 2009) de la alimentación con dichas dietas. Es probable que el

ligero aumento observado en el grupo HFD pueda estar relacionado con un

mecanismo de compensación contra la resistencia a la adiponectina, como otros

autores han sugerido con anterioridad (Stroubini y cols., 2009).

3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y METILACIÓN DEL

ADN EN GENES CLAVE DEL METABOLISMO LIPÍDICO Y

GLUCÍDICO

El mantenimiento del peso corporal está sometido a un control estricto en

el que participan diversos mecanismos condicionados tanto por la carga genética,

como por factores ambientales relacionados con el estilo de vida (Marti y cols.,

2008; Perusse y cols., 2005). Entre los diferentes mecanismos que podrían provocar

diferencias interindividuales relativas al desarrollo de la obesidad y otras

enfermedades metabólicas, la regulación epigenética de la expresión génica ha

emergido en los últimos años como un factor potencialmente importante

(Campion y cols., 2009b). En este contexto, no sólo la ingesta de los donantes de

grupos metilo (betaína, colina, metionina, zinc y ácido fólico) podría modificar la

metilación del ADN, sino también podrían estar involucrados algunos

macronutrientes tales como los ácidos grasos (Waterland y Rached, 2006). Entre

los inhibidores naturales de las histonas deacetilasas (HDACs) que pueden ser

obtenidos a través de la dieta, el butirato y, en menor medida, el propionato son

los ácidos grasos de cadena corta más relevantes. Ambos son producidos por la

fermentación microbiana de la fibra dietética en el intestino grueso e inhiben las

HDAC tipo I, II y IV (Waldecker y cols., 2008). Otros inhibidores clásicos de HDACs

presentes en los alimentos son el disulfuro de dialilo, presente en el ajo (Druesne‐

Discusión general

‐109‐

Pecollo y cols., 2007), el sulforafano, de las crucíferas (Myzak y cols., 2006) y la

genisteína, una isoflavona de soja con actividades antiestrogénicas (Basak y cols.,

2008).

La posible reversibilidad de la metilación del ADN hace de la epigenética un

blanco atractivo para la intervención terapéutica de enfermedades como el cáncer,

la diabetes tipo 2 y la obesidad (Dolinoy y Jirtle , 2008; Zardo y cols., 2008). En este

contexto, se han descrito diferentes genes humanos en cuya regulación influyen

mecanismos epigenéticos en relación con enfermedades metabólicas (Campion y

cols., 2009b), como HSD11B2 (hipertensión), PPAR‐gamma (arteriosclerosis) o

PPARGC1 (diabetes). Otros genes implicados en el desarrollo de la obesidad, como

la leptina (Milagro y cols., 2009) y TNF‐alfa (Campion y cols., 2009a), parecen estar

regulados también por mecanismos epigenéticos.

En éste sentido, en este proyecto de investigación se estudió la expresión

génica y regulación epigenética de 4 genes directamente implicados en el

mantenimiento de la homeostasis energética: NDUFB6 (oxidación mitocondrial),

FAS (lipogénesis de novo), HADHB (β‐oxidación) y GCK (glucolisis).

Discusión general

‐110‐

Figura 10. Genes y vías metabólicas implicadas en el estudio llevado a cabo en el presente trabajo de investigación.

Respecto a NDUFB6, este gen codifica para una proteína de la membrana

mitocondrial interna que participa en el transporte electrónico mitocondrial

(Smeitink y van den Heuvel, 1999). La proteína codificada por NDUFB6 es una

subunidad del complejo I ubiquinona oxidorreductasa que se encuentra en la

membrana mitocondrial interna. Esta proteína tiene actividades NADH

TEJIDO ADIPOSO

Glucosa

Glucosa‐6P

GCK

Fructosa‐6P

Fructosa 1,6‐bis P

Gliceraldehído‐P

1,3‐bisfosfoglicerato

3‐fosfoglicerato

2‐fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

Piruvato

Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFAS

CITOPLASMA CELULAR

NÚCLEO

NDUFB6

NDUFB6

CICLO DE KREBS

HADHB

MITOCONDRIA

β‐oxidación

Cadena transportadorade electrones

Glucolisis

Lipogénesis

TEJIDO ADIPOSO

Glucosa

Glucosa‐6P

GCKGCK

Fructosa‐6P

Fructosa 1,6‐bis P

Gliceraldehído‐P

1,3‐bisfosfoglicerato

3‐fosfoglicerato

2‐fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

Piruvato

Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFAS

Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFASFAS

CITOPLASMA CELULAR

NÚCLEO

NDUFB6

NDUFB6

CICLO DE KREBS

HADHB

MITOCONDRIA

β‐oxidación



Glucolisis

Lipogénesis

Discusión general

‐111‐

deshidrogenasa y oxidorreductasa, y transfiere electrones desde el NADH a la

cadena respiratoria (Smeitink y van den Heuvel, 1999). El aceptor de electrones

inmediato de la enzima se cree que es la ubiquinona (Willems y cols., 2009). El

complejo I tiene un papel clave en la regulación de la fosforilación oxidativa

(OXPHOS), y NDUFB6 está entre el conjunto de genes que muestran una reducción

significativa de OXPHOS en el músculo de pacientes con diabetes tipo 2 en

comparación con los sujetos control sanos (Bianchi y cols., 2004; Mootha y cols.,

2003).

En éste sentido se obtuvo una reducción significativa de la expresión de

éste gen en el tejido adiposo epididimal con las dietas HS (Experimento 1) y HFD

(Experimento 3), aunque no se observaron diferencias de expresión génica en el

tejido hepático. Estudios previos han documentado que la expresión de este gen

fue menor en el músculo esquelético humano de sujetos diabéticos, estando

probablemente asociado a la resistencia insulínica mediante el control de la

fosforilación oxidativa (Ling y cols., 2007). Este estudio sugiere que una

disminución en la expresión de NDUFB6 podría estar relacionada con el desarrollo

de resistencia a la insulina. En nuestro caso, NDUFB6 presenta una reducción de su

expresión en el tejido adiposo epididimal del grupo alimentado con las dietas HS

(Experimento 1) y HFD (Experimento 3), y aunque no registramos diferencias

estadísticamente significativas en la glucosa circulante y en los niveles de insulina,

ambos parámetros son ligeramente superiores en estos grupos. Por lo tanto,

nuestro estudio es el primero en investigar la expresión de NDUFB6, un

componente clave de la cadena respiratoria, en el tejido adiposo, y su correlación

con una dieta obesogénica. Nuestros resultados sugieren un deterioro en la

fosforilación oxidativa mitocondrial del adipocito que parece ser específico de las

ratas alimentadas con este tipo de dietas, dado que la expresión de NDUFB6 se

modifica en el tejido adiposo visceral, incluso cuando la cantidad de calorías es

similar a la del grupo control, alimentado con una dieta no obesigénica (Lomba y

cols., 2009).

En relación a los estudios epigenéticos en NDUFB6, solo fueron realizados

en el Experimento 3 (C‐HFD), obteniendo una hipermetilación estadísticamente

Discusión general

‐112‐

significativa en el grupo HFD en la posición +143 / +158, mientras que el gen se

encontró significativamente hipometilado en las posiciones ‐7 / +3 / +14 y +34 y

ligeramente hipometilado (p = 0,08) en la posición +36 / +46 /+ 58 en relación al

grupo control. En este sentido, Ling y cols. (2007) demostraron que los patrones de

metilación del ADN en NDUFB6 se asocian con una disminución dependiente de la

edad en su expresión en el músculo esquelético, abriendo la posibilidad de que las

marcas epigenéticas puedan predisponer al individuo a la resistencia a la insulina y

diabetes mellitus tipo 2. No existe hasta el momento ningún otro estudio que

relacione éste gen con variaciones epigenéticas.

Por su parte el enzima FAS cataliza la síntesis de ácidos grasos de cadena

larga a partir de acetil‐CoA y malonil‐CoA y es uno de los pasos que limita la

velocidad de la lipogénesis de novo (Ronti y cols., 2006). En nuestro caso, el estudio

de expresión del gen que codifica para el enzima FAS se llevó a cabo en hígado en

el Experimento 2 (C‐HFS), mientras que en el Experimento 3 (C‐HFD) se analizó este

gen en el tejido adiposo blanco, resultando en ambos casos reducida la expresión

en el grupo tratado respecto al control, aunque ésta reducción solo fue

estadísticamente significativa en el grupo HFD (Experimento 3). El balance

energético es fisiológicamente importante en la regulación de FAS y, por lo general,

las dietas con alta proporción de carbohidratos y baja en grasas aumentan su

expresión (Semenkovich, 1997). La dieta HFD empleada es de composición opuesta,

siendo más elevada en grasas y menor su proporción en hidratos de carbono, y

esto parece explicar la reducción de la expresión de FAS.

Los estudios epigenéticos en FAS se llevaron a cabo en el Experimento 3,

resultando hipometilada significativamente solo la posición ‐833 / ‐839 del

promotor del gen para el grupo alimentado con dieta HFD. Al parecer, este es el

primer trabajo que aborda el estudio epigenético de FAS en relación con la

obesidad. Sin embargo, la expresión y los patrones de metilación de este gen se

han estudiado como factor de predicción en varios tipos de tumores (Nosho y cols.,

2008; Ogino y cols., 2007). En estos estudios, las variaciones en los niveles de

metilación de FAS se han asociado con una mayor susceptibilidad a diferentes tipos

de cáncer.

Discusión general

‐113‐

En relación a HADHB, este gen codifica para una proteína trifuncional (Orii y

cols., 1999) de la membrana mitocondrial interna formada por subunidades α y β

que contribuye a tres de las cuatro reacciones necesarias para la β‐oxidación

mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga (Kamijo y cols., 1994). La deficiencia

de HADHB causa el metabolismo anormal de los ácidos grasos (Yeh y cols., 2006).

La expresión génica de HADHB fue estudiada en los Experimentos 2 (C‐HFS) y 3 (C‐

HFD), pero solo resultó estadísticamente significativa en el Experimento 2, donde

se observó un incremento de su expresión hepática en el grupo alimentado con la

dieta HFS. Sobre la regulación dietética de este gen, Oshida y cols. (1999)

informaron de que la actividad de HADHB en el músculo resultó mayor en ratas

alimentadas con una dieta alta en sacarosa. Según estos investigadores, el grupo

con alta proporción de sacarosa en la dieta mostró un patrón metabólico en los

músculos que favorecía la oxidación de carbohidratos sobre la de grasa. Un estudio

posterior en humanos demostró que la actividad HADHB aumentó cuando se

produjo la oxidación de palmitato (Ribet y cols., 2010). Estos resultados sugieren

que este enzima aumenta su rendimiento en presencia de ácidos grasos. En el caso

del Experimento 3 (C‐HFD), aunque las diferencias no tuvieron relevancia

estadística, se observó una ligera disminución de la expresión de HADHB en el

tejido adiposo epididimal del grupo alimentado con la dieta HFD. Este hallazgo

sugiere que la capacidad de este tejido para la oxidación de triglicéridos se ve

afectada, lo cual contribuye probablemente a la adiposidad inducida por la dieta

HFD. Respecto al estudio epigenético llevado a cabo para HADHB en el

Experimento 2, no se registraron cambios en el patrón de metilación en ninguna de

las 6 islas CpGs analizadas. Al parecer no existen estudios en la bibliografía

relacionados con el patrón de metilación de este gen. Por lo tanto, este trabajo es

el primero en analizar la regulación epigenética de HADHB en respuesta a factores

dietéticos o metabólicos, aunque no se encontraron diferencias ni en el tejido

adiposo epididimal ni en el hígado. De todos modos, como los cambios en la

expresión de genes aparentemente no se correlacionaron con los niveles de

metilación en las regiones promotoras investigadas, deben llevarse a cabo más

estudios para verificar la importancia de los mecanismos epigenéticos inducidos

por la dieta en la regulación de la homeostasis energética.

Discusión general

‐114‐

Finalmente la glucokinasa (GCK) es clave en la homeostasis energética ya

que participa en la fosforilación de la glucosa en el hígado como primer paso de la

vía glucolítica. La glucokinasa cataliza el paso limitante de la glucólisis: la

fosforilación de la glucosa en glucosa‐6‐fosfato. En el hígado, la actividad GCK

determina la tasa de utilización de glucosa y la síntesis del glucógeno (Gorman y

cols., 2008). La importancia de GCK en el ser humano se pone de manifiesto por el

hecho de que las mutaciones heterocigotas de GCK llevan a la pérdida de su

función y causar diabetes MODY 2 (Maturity Onset Diabetes of the Young), una

enfermedad caracterizada por su inicio precoz y la hiperglucemia persistente

(Stoffel y cols., 1992). Su expresión se activa en pacientes con diabetes tipo 2 (Caro

y cols., 1995). El estudio de la expresión de éste gen solo se llevó a cabo en el

experimento 2 (C‐HFS) observándose un ligero aumento (aunque no

estadísticamente significativo) en el grupo HFS, al igual que han observado otros

autores (Perez y cols., 1998). En lo que respecta a los estudios epigenéticos, no se

detectaron cambios en el patrón de metilación de GCK. Sólo una publicación ha

abordado el estudio de la metilación de este gen, aunque en relación con el

proceso de envejecimiento (Jiang y cols., 2008). Aún no existen trabajos que hayan

investigado su papel en estudios nutricionales (Lomba y cols., 2010)

Discusión general

‐115‐

Tabla 9. Resumen de los principales hallazgos obtenidos en los 3 Experimentos llevados a cabo en el presente trabajo de investigación. Todos los grupos de

experimentación fueron comparados respecto al grupo control). Las flechas (↑↓) indican cambios significativos en la variable. =; sin cambios. HS, dieta con alta proporción de azúcares simples y baja de complejos; HFS, dieta con alta proporción de grasas y azúcares simples; HFD, dieta con alto porcentaje en grasas.

Los resultados de este trabajo permiten afirmar que la ingesta de dietas

isocalóricas con diferente distribución de macronutrientes (almidón vs. sacarosa,

hidratos de carbono vs. grasas) sin diferencias en cuanto a la ingesta de energía

(pair‐fed), podrían desempeñar un papel importante en el desarrollo de la

obesidad y enfermedades asociadas. La ingesta crónica de dietas isocalóricas HS,

HFS y HFD afecta a la expresión de genes clave en la regulación del metabolismo

energético tanto en hígado como en tejido adiposo. El consumo continuado de

este tipo de dietas es capaz de modificar el patrón de metilación del ADN de

algunos de estos genes, lo que sugiere la importancia de la epigenética como diana

terapéutica en el estudio de la obesidad y sus comorbilidades asociadas.

DIETAS

RESULTADOS DE MAYOR INTERÉS OBTENIDOS

PESO COLESTEROL

TOTAL HDL

TG

SÉRICOS HEPÁTICOS

MDA(TBARS)

EXPRESIÓNGÉNICA

METILACIÓNDEL ADN

HS

HFS

HFD

Experimento 1

Experimento 2

Experimento 3= =

p=0,09 p=0,09

=

( ) ( )

=

=NDUFB6

Epi

HADHB Hígado

FAS y NDUFB6

Epi

HADHB y GCKHígado

=

1 CpG FAS

3 CpGNDUFB6 1 CpGNDUFB6

No determinada

Epi

DIETAS

RESULTADOS DE MAYOR INTERÉS OBTENIDOS

PESO COLESTEROL

TOTAL HDL

COLESTEROL

TOTAL HDL

TG

SÉRICOS HEPÁTICOS

MDA(TBARS)

EXPRESIÓNGÉNICA

METILACIÓNDEL ADN

HS

HFS

HFD

Experimento 1

Experimento 2

Experimento 3= =

p=0,09 p=0,09

=

( ) ( )( )

=

=NDUFB6

Epi

HADHB Hígado

FAS y NDUFB6

Epi

HADHB y GCKHígado

=

1 CpG FAS

3 CpGNDUFB6 1 CpGNDUFB6

No determinada

Epi

CONCLUSIONES

Conclusiones

‐117‐

El presente trabajo de investigación ha permitido llegar a las siguientes

conclusiones:

1. La ingesta de dietas con exceso en el contenido de grasas (HFD), grasas y

azúcares simples (HFS) o alta proporción de azúcares simples y baja de

complejos (HS) produce un exceso de peso de forma independiente a la

ingesta total de energía, lo que sugiere que la distribución y el tipo de

macronutrientes ingeridos juegan un papel importante en el inicio de la

obesidad y el desarrollo de las complicaciones metabólicas asociadas.

2. La ganancia de peso (g/día) hallada en los distintos grupos dietéticos

alimentados con dietas ricas en grasas (HFD), grasas y azúcares simples

(HFS) o elevada proporción de azúcares simples (HS) fue similar entre sí,

mostrando todos ellos mayor adiposidad visceral y total que el grupo

control.

3. Los grupos experimentales con distinto contenido en grasas y azúcares (HS,

HFS y HFD) presentaron un aumento de los niveles de triglicéridos

hepáticos, sugiriendo un estado de esteatosis hepática leve. Además, el

tratamiento dietético en el grupo HFS (dieta rica en grasas y azúcares

simples) provocó un incremento significativo de los niveles de

malondialdehído hepático, indicando un incremento del estrés oxidativo,

así como una reducción significativa de los triglicéridos séricos.

4. Los estudios de expresión génica en el tejido adiposo epididimal de los

animales, tras la ingesta durante 10 semanas de una dieta isocalórica rica

en sacarosa (HS), mostraron una reducción de la expresión de NDUFB6

(oxidación mitocondrial) en el grupo HS respecto al grupo control. Estos

datos sugieren un deterioro de la fosforilación oxidativa mitocondrial del

adipocito que parece ser específico de las ratas alimentadas con ese tipo de

dieta.

5. La ingesta crónica de una dieta HFS, administrada según un modelo pair‐fed,

cursó con un aumento de la expresión hepática de HADHB, un gen clave en

Conclusiones

‐118‐

la oxidación lipídica, y GCK, regulador de la glucolisis. Sin embargo, los

patrones de metilación de los genes GCK y HADHB en el hígado no

mostraron modificaciones, lo que apunta a que los cambios de expresión

génica probablemente no se deban a cambios en la metilación del ADN sino

que existen otros factores más determinantes en la regulación de la

expresión de estos genes.

6. La ingesta crónica isocalórica de una dieta HFD rica en grasas saturadas,

administrada según un modelo pair‐fed, afecta a la expresión en el tejido

adiposo epididimal de genes clave que regulan el metabolismo energético,

incluyendo la lipogénesis (FAS) y las funciones mitocondriales (NDUFB6).

7. El consumo continuado de una dieta rica en grasas (HFD) y/o la ganancia de

peso asociada, es capaz de modificar el patrón de metilación del ADN de

FAS y NDUFB6 en el tejido adiposo epididimal, aunque también existen

otros factores que podrían influir a éste nivel como son las modificaciones

histónicas y diferentes factores transcripcionales.

La conclusión general de este trabajo es que la distribución de

macronutrientes de la dieta, sin diferencias en cuanto a la ingesta calórica total,

podría desempeñar un papel importante en el aumento de peso y las

manifestaciones del síndrome metabólico, al afectar específicamente a la

expresión de genes clave del metabolismo energético. El consumo mantenido de

dietas con una proporción de macronutrientes no saludable es capaz de modificar

en ciertos casos el patrón de metilación de algunos genes involucrados en el

mantenimiento de la homeostasis energética, lo que podría afectar a la expresión

de genes clave del metabolismo energético implicados en la obesidad y el

síndrome metabólico a través de mecanismos epigenéticos.

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

‐120‐

A

Abete I, Parra MD, Zulet MA, Martinez JA. Different dietary strategies for weight loss in

obesity: role of energy and macronutrient content. Nutr Res Rev 2006; 19: 5‐17.

Abete I, Parra D, Martinez JA. Energy‐restricted diets based on a distinct food selection

affecting the glycemic index induce different weight loss and oxidative response. Clin

Nutr 2008; 27: 545‐51.

Abete I, Astrup A, Martinez JA, Thorsdottir I,Zulet MA. Obesity and the metabolic

syndrome: role of different dietary macronutrient distribution patterns and specific

nutritional components on weight loss and maintenance. Nutr Rev 2010; 68: 214‐31.

Ahamed S, Foster JS, Bukovsky A, Wimalasena J. Signal transduction through the

Ras/Erk pathway is essential for the mycoestrogen zearalenone‐induced cell‐cycle

progression in MCF‐7 cells. Mol Carcinog 2001; 30: 88‐98.

Ahima RS. Metabolic actions of adipocyte hormones: focus on adiponectin. Obesity

(Silver Spring) 2006; 14 Suppl 1: 9S‐15S.

Ahmed FE. Colorectal cancer epigenetics: the role of environmental factors and the

search for molecular biomarkers. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev

2007; 25: 101‐54.

Ahmed U, Redgrave TG, Oates PS. Effect of dietary fat to produce non‐alcoholic fatty

liver in the rat. J Gastroenterol Hepatol 2009; 24: 1463‐71.

Alikhani‐Koopaei R, Fouladkou F, Frey FJ, Frey BM. Epigenetic regulation of 11 beta‐

hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression. J Clin Invest 2004; 114: 1146‐57.

American Diabetes Association. Evidence‐based nutrition principles and

recommendations for the treatment and prevention of diabetes and related

complications. Diabetes Care 2002; 25: 202‐12.

Bibliografía

‐121‐

Anderson JW, Konz EC, Jenkins DJ. Health advantages and disadvantages of weight‐

reducing diets: a computer analysis and critical review. J Am Coll Nutr 2000; 19: 578‐90.

Aranceta‐Bartrina J, Serra‐Majem L, Foz‐Sala M,Moreno‐Esteban B. [Prevalence of

obesity in Spain]. Med Clin (Barc) 2005; 125: 460‐6.

Atshaves BP, McIntosh AL, Storey SM, Landrock KK, Kier AB,Schroeder F. High dietary

fat exacerbates weight gain and obesity in female liver fatty acid binding protein gene‐

ablated mice. Lipids 2010; 45: 97‐110.

Axen KV, Dikeakos A, Sclafani A. High dietary fat promotes syndrome X in nonobese

rats. J Nutr 2003; 133: 2244‐9.

B

Bachman CM, Baranowski T, Nicklas TA. Is there an association between sweetened

beverages and adiposity? Nutr Rev 2006; 64: 153‐74.

Ballesta M, Carral F, Olveira G, Giron JA, Aguilar M. Economic cost associated with type

II diabetes in Spanish patients. Eur J Health Econ 2006; 7: 270‐5.

Bannister AJ, Schneider R, Kouzarides T. Histone methylation: dynamic or static? Cell

2002; 109: 801‐6.

Barnard RJ, Faria DJ, Menges JE, Martin DA. Effects of a high‐fat, sucrose diet on serum

insulin and related atherosclerotic risk factors in rats. Atherosclerosis 1993; 100: 229‐

36.

Barnard RJ, Roberts CK, Varon SM, Berger JJ. Diet‐induced insulin resistance precedes

other aspects of the metabolic syndrome. J Appl Physiol 1998; 84: 1311‐5.

Basak S, Pookot D, Noonan EJ,Dahiya R. Genistein down‐regulates androgen receptor

by modulating HDAC6‐Hsp90 chaperone function. Mol Cancer Ther 2008; 7: 3195‐202.

Bibliografía

‐122‐

Beer‐Borst S, Morabia A, Hercberg S, Vitek O, Bernstein MS, Galan P, Galasso R,

Giampaoli S, Houterman S, McCrum E, Panico S, Pannozzo F, Preziosi P, Ribas L, Serra‐

Majem L, Verschuren WM, Yarnell J,Northridge ME. Obesity and other health

determinants across Europe: the EURALIM project. J Epidemiol Community Health

2000; 54: 424‐30.

Bellentani S, Saccoccio G, Masutti F, Croce LS, Brandi G, Sasso F, Cristanini G,Tiribelli C.

Prevalence of and risk factors for hepatic steatosis in Northern Italy. Ann Intern Med

2000; 132: 112‐7.

Bellido D. La nueva evidencia en el sobrepeso y la obesidad: la clave es el tejido

adiposo. De pasivo almacén de energía a activo regulador metabólico‐cardiovascular.

Implicaciones clínicas y terapéuticas. Supl Rev Esp Obes 2004; 1:3:

Best D, Grainger P. Low‐fat or low‐carbohydrate diet for cardiovascular health. Can J

Cardiovasc Nurs 2007; 17: 19‐26.

Beylot M, Pinteur C,Peroni O. Expression of the adiponectin receptors AdipoR1 and

AdipoR2 in lean rats and in obese Zucker rats. Metabolism 2006; 55: 396‐401.

Beynen AC, Lemmens AG. Type of dietary carbohydrate and liver cholesterol in rats. Z

Ernahrungswiss 1987; 26: 158‐60.

Bianchi C, Genova ML, Parenti Castelli G,Lenaz G. The mitochondrial respiratory chain

is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control

analysis. J Biol Chem 2004; 279: 36562‐9.

Blundell JE,Hill AJ. Do serotoninergic drugs decrease energy intake by reducing fat or

carbohydrate intake? Effect of d‐fenfluramine with supplemented weight‐increasing

diets. Pharmacol Biochem Behav 1988; 31: 773‐8.

Boland LL, Folsom AR, Rosamond WD. Hyperinsulinemia, dyslipidemia, and obesity as

risk factors for hospitalized gallbladder disease. A prospective study. Ann Epidemiol

2002; 12: 131‐40.

Bibliografía

‐123‐

Boque N, Campion J, Paternain L, Garcia‐Diaz DF, Galarraga M, Portillo MP, Milagro FI,

Ortiz de Solorzano C, Martinez JA. Influence of dietary macronutrient composition on

adiposity and cellularity of different fat depots in Wistar rats. J Physiol Biochem 2009;

65: 387‐95.

Bouchard L, Rabasa‐Lhoret R, Faraj M, Lavoie ME, Mill J, Perusse L,Vohl MC.

Differential epigenomic and transcriptomic responses in subcutaneous adipose tissue

between low and high responders to caloric restriction. Am J Clin Nutr 2010; 91: 309‐

20.

Bourgoin F, Bachelard H, Badeau M, Melancon S, Pitre M, Lariviere R,Nadeau A.

Endothelial and vascular dysfunctions and insulin resistance in rats fed a high‐fat, high‐

sucrose diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295: H1044‐H55.

Bray GA. Medical consequences of obesity. J Clin Endocrinol Metab 2004a; 89: 2583‐9.

Bray GA, Paeratakul S, Popkin BM. Dietary fat and obesity: a review of animal, clinical

and epidemiological studies. Physiol Behav 2004b; 83: 549‐55.

C

Calle EE, Thun MJ. Obesity and cancer. Oncogene 2004; 23: 6365‐78.

Campion J, Milagro FI, Goyenechea E, Martinez JA. TNF‐alpha promoter methylation as

a predictive biomarker for weight‐loss response. Obesity (Silver Spring) 2009a; 17:

1293‐7.

Campion J, Milagro FI, Martinez JA. Individuality and epigenetics in obesity. Obes Rev

2009b; 10: 383‐92.

Campion J, Milagro FI and Martinez JA. Epigenetics and obesity. Progress in Molecular

Biology and Translational Science. Conn P.M. and Bouchard C, eds., 2010; Ed. Elsevier

Academic Press (San Diego, USA).

Bibliografía

‐124‐

Cappelletti V, Fioravanti L, Miodini P, Di Fronzo G. Genistein blocks breast cancer cells

in the G(2)M phase of the cell cycle. J Cell Biochem 2000; 79: 594‐600.

Caro JF, Triester S, Patel VK, Tapscott EB, Frazier NL, Dohm GL. Liver glucokinase:

decreased activity in patients with type II diabetes. Horm Metab Res 1995; 27: 19‐22.

Celeste A, Fernandez‐Capetillo O, Kruhlak MJ, Pilch DR, Staudt DW, Lee A, Bonner RF,

Bonner WM,Nussenzweig A. Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the

initial recognition of DNA breaks. Nat Cell Biol 2003; 5: 675‐9.

Ceriello A, Bortolotti N, Crescentini A, Motz E, Lizzio S, Russo A, Ezsol Z, Tonutti

L,Taboga C. Antioxidant defences are reduced during the oral glucose tolerance test in

normal and non‐insulin‐dependent diabetic subjects. Eur J Clin Invest 1998; 28: 329‐33.

Chan JM, Rimm EB, Colditz GA, Stampfer MJ,Willett WC. Obesity, fat distribution, and

weight gain as risk factors for clinical diabetes in men. Diabetes Care 1994; 17: 961‐9.

Chang PY, Lu SC, Lee CM, Chen YJ, Dugan TA, Huang WH, Chang SF, Liao WS, Chen

CH,Lee YT. Homocysteine inhibits arterial endothelial cell growth through

transcriptional downregulation of fibroblast growth factor‐2 involving G protein and

DNA methylation. Circ Res 2008; 102: 933‐41.

Chang YS, Wang L, Liu D, Mao L, Hong WK, Khuri FR,Lee HY. Correlation between

insulin‐like growth factor‐binding protein‐3 promoter methylation and prognosis of

patients with stage I non‐small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2002; 8: 3669‐75.

Chen H, Ke Q, Kluz T, Yan Y,Costa M. Nickel ions increase histone H3 lysine 9

dimethylation and induce transgene silencing. Mol Cell Biol 2006; 26: 3728‐37.

Chicco A, D'Alessandro ME, Karabatas L, Pastorale C, Basabe JC,Lombardo YB. Muscle

lipid metabolism and insulin secretion are altered in insulin‐resistant rats fed a high

sucrose diet. J Nutr 2003; 133: 127‐33.

Chmurzynska A. Fetal programming: link between early nutrition, DNA methylation,

and complex diseases. Nutr Rev 2010; 68: 87‐98.

Bibliografía

‐125‐

Choi SW, Friso S, Keyes MK,Mason JB. Folate supplementation increases genomic DNA

methylation in the liver of elder rats. Br J Nutr 2005; 93: 31‐5.

Chuang JC, Jones PA. Epigenetics and microRNAs. Pediatr Res 2007; 61: 24R‐29R.

Cobiac L. Epigenomics and nutrition. Forum Nutr 2007; 60: 31‐41.

Colditz GA, Willett WC, Rotnitzky A,Manson JE. Weight gain as a risk factor for clinical

diabetes mellitus in women. Ann Intern Med 1995; 122: 481‐6.

Comuzzie AG. The emerging pattern of the genetic contribution to human obesity. Best

Pract Res Clin Endocrinol Metab 2002; 16: 611‐21.

Cummings JH, Englyst HN. Fermentation in the human large intestine and the available

substrates. Am J Clin Nutr 1987a; 45: 1243‐55.

Cummings JH, Pomare EW, Branch WJ, Naylor CP,Macfarlane GT. Short chain fatty

acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut 1987b; 28: 1221‐

7.

D

Damcott CM, Sack P,Shuldiner AR. The genetics of obesity. Endocrinol Metab Clin North

Am 2003; 32: 761‐86.

Dandona S, Roberts R. Creating a genetic risk score for coronary artery disease. Curr

Atheroscler Rep 2009; 11: 175‐81.

Davie JR,Chadee DN. Regulation and regulatory parameters of histone modifications. J

Cell Biochem Suppl 1998; 30‐31: 203‐13.

Davis CD, Uthus EO,Finley JW. Dietary selenium and arsenic affect DNA methylation in

vitro in Caco‐2 cells and in vivo in rat liver and colon. J Nutr 2000; 130: 2903‐9.

Davis TA, Bales CW, Beauchene RE. Differential effects of dietary caloric and protein

restriction in the aging rat. Exp Gerontol 1983; 18: 427‐35.

Bibliografía

‐126‐

Day C. Metabolic syndrome, or What you will: definitions and epidemiology. Diab Vasc

Dis Res 2007; 4: 32‐8.

de Meijer VE, Le HD, Meisel JA, Sharif MR, Pan A, Nose V,Puder M. Dietary fat intake

promotes the development of hepatic steatosis independently from excess caloric

consumption in a murine model. Metabolism 2010; 59: 1092‐105.

DeFronzo RA, Ferrannini E. Insulin resistance. A multifaceted syndrome responsible for

NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic cardiovascular

disease. Diabetes Care 1991; 14: 173‐94.

Delcuve GP, Rastegar M,Davie JR. Epigenetic control. J Cell Physiol 2009; 219: 243‐50.

Dillon SC, Zhang X, Trievel RC, Cheng X. The SET‐domain protein superfamily: protein

lysine methyltransferases. Genome Biol 2005; 6: 227.

Dobrian AD, Davies MJ, Schriver SD, Lauterio TJ,Prewitt RL. Oxidative stress in a rat

model of obesity‐induced hypertension. Hypertension 2001; 37: 554‐60.

Dolinoy DC, Weidman JR, Waterland RA,Jirtle RL. Maternal genistein alters coat color

and protects Avy mouse offspring from obesity by modifying the fetal epigenome.

Environ Health Perspect 2006; 114: 567‐72.

Dolinoy DC, Huang D,Jirtle RL. Maternal nutrient supplementation counteracts

bisphenol A‐induced DNA hypomethylation in early development. Proc Natl Acad Sci U

S A 2007; 104: 13056‐61.

Dolinoy DC, Jirtle RL. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ

Mol Mutagen 2008; 49: 4‐8.

Druesne‐Pecollo N, Chaumontet C, Pagniez A, Vaugelade P, Bruneau A, Thomas M,

Cherbuy C, Duee PH,Martel P. In vivo treatment by diallyl disulfide increases histone

acetylation in rat colonocytes. Biochem Biophys Res Commun 2007; 354: 140‐7.

Bibliografía

‐127‐

Druesne‐Pecollo N, Pagniez A, Thomas M, Cherbuy C, Duee PH, Martel P, Chaumontet

C. Diallyl disulfide increases CDKN1A promoter‐associated histone acetylation in

human colon tumor cell lines. J Agric Food Chem 2006; 54: 7503‐7.

Dumaswala UJ, Dumaswala RU,Venkataraman A. The relative effect of dietary fats and

carbohydrates on lipid metabolism in the albino rat. Ital J Biochem 1976; 25: 289‐303.

E

Elmarakby AA, Imig JD. Obesity is the major contributor to vascular dysfunction and

inflammation in high‐fat diet hypertensive rats. Clin Sci (Lond) 2010; 118: 291‐301.

Englyst HN, Cummings JH. Digestion of the polysaccharides of some cereal foods in the

human small intestine. Am J Clin Nutr 1985; 42: 778‐87.

Englyst HN, Cummings JH. Digestion of the carbohydrates of banana (Musa paradisiaca

sapientum) in the human small intestine. Am J Clin Nutr 1986; 44: 42‐50.

Englyst HN, Cummings JH. Digestion of polysaccharides of potato in the small intestine

of man. Am J Clin Nutr 1987; 45: 423‐31.

Eriksson J, Forsen T, Osmond C,Barker D. Obesity from cradle to grave. Int J Obes Relat

Metab Disord 2003; 27: 722‐7.

EURESTA: Resistant Starch. Proceedings for the 2nd plenary meeting of EURESTA:

European FLAIR Concerted Action No. 11 on physiological implications of the

consumption of resistant starch in man. Crete, 29 May‐2 June 1991. Eur J Clin Nutr

1992; 46 Suppl 2: S1‐148.

Bibliografía

‐128‐

F

Fang MZ, Chen D, Sun Y, Jin Z, Christman JK,Yang CS. Reversal of hypermethylation and

reactivation of p16INK4a, RARbeta, and MGMT genes by genistein and other

isoflavones from soy. Clin Cancer Res 2005; 11: 7033‐41.

Felson DT. Obesity and osteoarthritis of the knee. Bull Rheum Dis 1992; 41: 6‐7.

Flatt JP,Guptta SK. Stature, fat free‐mass, esting energy expenditure and obesity. .

Scand J Nutr 1999; 34: 40.

Fleige S, Walf V, Huch S, Prgomet C, Sehm J,Pfaffl MW. Comparison of relative mRNA

quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real‐time RT‐PCR.

Biotechnol Lett 2006; 28: 1601‐13.

Fonseca V, Dicker‐Brown A, Ranganathan S, Song W, Barnard RJ, Fink L,Kern PA. Effects

of a high‐fat‐sucrose diet on enzymes in homocysteine metabolism in the rat.

Metabolism 2000; 49: 736‐41.

Forshee RA, Anderson PA,Storey ML. Sugar‐sweetened beverages and body mass index

in children and adolescents: a meta‐analysis. Am J Clin Nutr 2008; 87: 1662‐71.

Frayn KN,Kingman SM. Dietary sugars and lipid metabolism in humans. Am J Clin Nutr

1995; 62: 250S‐61S; discussion 61S‐63S.

Freedman MR, King J,Kennedy E. Popular diets: a scientific review. Obes Res 2001; 9

Suppl 1: 1S‐40S.

Friedman N,Fanning EL. Overweight and obesity: an overview of prevalence, clinical

impact, and economic impact. Dis Manag 2004; 7 Suppl 1: S1‐6.

Friso S, Pizzolo F, Choi SW, Guarini P, Castagna A, Ravagnani V, Carletto A, Pattini P,

Corrocher R,Olivieri O. Epigenetic control of 11 beta‐hydroxysteroid dehydrogenase 2

gene promoter is related to human hypertension. Atherosclerosis 2008; 199: 323‐7.

Bibliografía

‐129‐

Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, Iwaki M, Yamada Y, Nakajima Y, Nakayama O,

Makishima M, Matsuda M,Shimomura I. Increased oxidative stress in obesity and its

impact on metabolic syndrome. J Clin Invest 2004; 114: 1752‐61.

G

Gaesser GA. Carbohydrate quantity and quality in relation to body mass index. J Am

Diet Assoc 2007; 107: 1768‐80.

Galinier A, Carriere A, Fernandez Y, Carpene C, Andre M, Caspar‐Bauguil S, Thouvenot

JP, Periquet B, Penicaud L,Casteilla L. Adipose tissue proadipogenic redox changes in

obesity. J Biol Chem 2006; 281: 12682‐7.

Garcia‐Diaz D, Campion J, Milagro FI, Martinez JA. Adiposity dependent apelin gene

expression: relationships with oxidative and inflammation markers. Mol Cell Biochem

2007a; 305: 87‐94.

Garcia‐Diaz DF, Campion J, Milagro FI, Lomba A, Marzo F, Martinez JA. Chronic mild

stress induces variations in locomotive behavior and metabolic rates in high fat fed rats.

J Physiol Biochem 2007b; 63: 337‐46.

Geisel J, Schorr H, Bodis M, Isber S, Hubner U, Knapp JP, Obeid R,Herrmann W. The

vegetarian lifestyle and DNA methylation. Clin Chem Lab Med 2005; 43: 1164‐9.

Gerritsen GC. The role of nutrition to diabetes in relation to age. Nutrition, Longevity

and Aging 1976; 229.

Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis. the road ahead. Cell 2001; 104: 503‐16.

Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Carethers JM, Dowell JM, Wasserman L, Compton C,

Mayer RJ, Bertagnolli MM,Boland CR. Frequent inactivation of PTEN by promoter

hypermethylation in microsatellite instability‐high sporadic colorectal cancers. Cancer

Res 2004; 64: 3014‐21.

Bibliografía

‐130‐

Goldberg AD, Allis CD,Bernstein E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 2007; 128:

635‐8.

Gonzalez‐Zapata LI, Ortiz‐Moncada R,Alvarez‐Dardet C. Mapping public policy options

responding to obesity: the case of Spain. Obes Rev 2007; 8 Suppl 2: 99‐108.

Goodrick CL. Body weight increment and length of life: the effect of genetic

constitution and dietary protein. J Gerontol 1978; 33: 184‐90.

Goodson S, Halford JC, Jackson HC, Blundell JE. Paradoxical effects of a high sucrose

diet: high energy intake and reduced body weight gain. Appetite 2001; 37: 253‐4.

Goris AH, Westerterp KR. Physical activity, fat intake and body fat. Physiol Behav 2008;

94: 164‐8.

Gorman T, Hope DC, Brownlie R, Yu A, Gill D, Lofvenmark J, Wedin M, Mayers RM,

Snaith MR,Smith DM. Effect of high‐fat diet on glucose homeostasis and gene

expression in glucokinase knockout mice. Diabetes Obes Metab 2008; 10: 885‐97.

Gortmaker SL, Must A, Perrin JM, Sobol AM,Dietz WH. Social and economic

consequences of overweight in adolescence and young adulthood. N Engl J Med 1993;

329: 1008‐12.

Greenberg AS, Obin MS. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and

metabolism. Am J Clin Nutr 2006; 83: 461S‐65S.

Grimditch GK, Barnard RJ, Hendricks L,Weitzman D. Peripheral insulin sensitivity as

modified by diet and exercise training. Am J Clin Nutr 1988; 48: 38‐43.

Grotto D, Santa Maria LD, Boeira S, Valentini J, Charao MF, Moro AM, Nascimento PC,

Pomblum VJ, Garcia SC. Rapid quantification of malondialdehyde in plasma by high

performance liquid chromatography‐visible detection. J Pharm Biomed Anal 2007; 43:

619‐24.

Grundy SM, Cleeman JI, Merz CN, Brewer HB, Jr., Clark LT, Hunninghake DB, Pasternak

RC, Smith SC, Jr.,Stone NJ. A summary of implications of recent clinical trials for the

Bibliografía

‐131‐

National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III guidelines.

Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 1329‐30.

Gutierrez‐Fisac JL, Lopez E, Banegas JR, Graciani A,Rodriguez‐Artalejo F. Prevalence of

overweight and obesity in elderly people in Spain. Obes Res 2004; 12: 710‐5.

Gutierrez Guisado J, Lopez Manzano JJ, Rodriguez Cid J, Garces Segura C, Llorens

Rufach MT. [Prevalence of metabolic syndrome (MS) in laboral population. The heart

of Asepeyo]. An Med Interna 2008; 25: 325‐30.

H

Halees AS, Leyfer D, Weng Z. PromoSer: A large‐scale mammalian promoter and

transcription start site identification service. Nucleic Acids Res 2003; 31: 3554‐9.

Hales CN,Barker DJ. Type 2 (non‐insulin‐dependent) diabetes mellitus: the thrifty

phenotype hypothesis. Diabetologia 1992; 35: 595‐601.

Hassan YI, Zempleni J. Epigenetic regulation of chromatin structure and gene function

by biotin. J Nutr 2006; 136: 1763‐5.

Hattori A, Mawatari K, Tsuzuki S, Yoshioka E, Toda S, Yoshida M, Yasui S, Furukawa H,

Morishima M, Ono K, Ohnishi T, Nakano M, Harada N, Takahashi A,Nakaya Y. Beta‐

adrenergic‐AMPK pathway phosphorylates acetyl‐CoA carboxylase in a high‐

epinephrine rat model, SPORTS. Obesity (Silver Spring) 2009; 18: 48‐54.

He M, Cornelis MC, Franks PW, Zhang C, Hu FB,Qi L. Obesity genotype score and

cardiovascular risk in women with type 2 diabetes mellitus. Arterioscler Thromb Vasc

Biol 2010; 30: 327‐32.

He N, Park K, Zhang Y, Huang J, Lu S,Wang L. Epigenetic inhibition of nuclear receptor

small heterodimer partner is associated with and regulates hepatocellular carcinoma

growth. Gastroenterology 2008; 134: 793‐802.

Bibliografía

‐132‐

Henry M, Tregouet DA, Alessi MC, Aillaud MF, Visvikis S, Siest G, Tiret L,Juhan‐Vague I.

Metabolic determinants are much more important than genetic polymorphisms in

determining the PAI‐1 activity and antigen plasma concentrations: a family study with

part of the Stanislas Cohort. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18: 84‐91.

Hirasawa Y, Arai M, Imazeki F, Tada M, Mikata R, Fukai K, Miyazaki M, Ochiai T, Saisho

H,Yokosuka O. Methylation status of genes upregulated by demethylating agent 5‐aza‐

2'‐deoxycytidine in hepatocellular carcinoma. Oncology 2006; 71: 77‐85.

Hirsch S, Ronco AM, Guerrero‐Bosagna C, de la Maza MP, Leiva L, Barrera G, Llanos M,

Alliende MA, Silva F,Bunout D. Methylation status in healthy subjects with normal and

high serum folate concentration. Nutrition 2008; 24: 1103‐9.

Hitchler MJ, Domann FE. Metabolic defects provide a spark for the epigenetic switch in

cancer. Free Radic Biol Med 2009; 47: 115‐27.

Horton TJ, Drougas H, Brachey A, Reed GW, Peters JC,Hill JO. Fat and carbohydrate

overfeeding in humans: different effects on energy storage. Am J Clin Nutr 1995; 62:

19‐29.

Hudgins LC, Seidman CE, Diakun J, Hirsch J. Human fatty acid synthesis is reduced after

the substitution of dietary starch for sugar. Am J Clin Nutr 1998; 67: 631‐9.

Hulman S, Falkner B. The effect of excess dietary sucrose on growth, blood pressure,

and metabolism in developing Sprague‐Dawley rats. Pediatr Res 1994; 36: 95‐101.

I

Iffiu‐Soltesz Z, Wanecq E, Lomba A, Portillo MP, Pellati F, Szoko E, Bour S, Woodley J,

Milagro FI, Alfredo Martinez J, Valet P,Carpene C. Chronic benzylamine administration

in the drinking water improves glucose tolerance, reduces body weight gain and

circulating cholesterol in high‐fat diet‐fed mice. Pharmacol Res 2010; 61: 355‐63.

Bibliografía

‐133‐

Ingelsson E, Arnlov J, Sundstrom J, Riserus U, Michaelsson K,Byberg L. Relative

importance and conjoint effects of obesity and physical inactivity for the development

of insulin resistance. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 2009; 16: 28‐33.

Isken F, Klaus S, Osterhoff M, Pfeiffer AF,Weickert MO. Effects of long‐term soluble vs.

insoluble dietary fiber intake on high‐fat diet‐induced obesity in C57BL/6J mice. J Nutr

Biochem 2009;

J

Jiang MH, Fei J, Lan MS, Lu ZP, Liu M, Fan WW, Gao X,Lu DR. Hypermethylation of

hepatic Gck promoter in ageing rats contributes to diabetogenic potential.

Diabetologia 2008; 51: 1525‐33.

Johnson DS, Mortazavi A, Myers RM,Wold B. Genome‐wide mapping of in vivo protein‐

DNA interactions. Science 2007; 316: 1497‐502.

Johnson IT,Belshaw NJ. Environment, diet and CpG island methylation: epigenetic

signals in gastrointestinal neoplasia. Food Chem Toxicol 2008; 46: 1346‐59.

Johnson RK, Appel LJ, Brands M, Howard BV, Lefevre M, Lustig RH, Sacks F, Steffen

LM,Wylie‐Rosett J. Dietary sugars intake and cardiovascular health: a scientific

statement from the American Heart Association. Circulation 2009; 120: 1011‐20.

Jourdan T, Djaouti L, Demizieux L, Gresti J, Verges B,Degrace P. CB1 antagonism exerts

specific molecular effects on visceral and subcutaneous fat and reverses liver steatosis

in diet‐induced obese mice. Diabetes 2010;

Juan G, Traganos F, James WM, Ray JM, Roberge M, Sauve DM, Anderson

H,Darzynkiewicz Z. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1

measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.

Cytometry 1998; 32: 71‐7.

Bibliografía

‐134‐

Juhan‐Vague I, Alessi MC, Mavri A, Morange PE. Plasminogen activator inhibitor‐1,

inflammation, obesity, insulin resistance and vascular risk. J Thromb Haemost 2003; 1:

1575‐9.

Juhan‐Vague I, Alessi MC, Vague P. Increased plasma plasminogen activator inhibitor 1

levels. A possible link between insulin resistance and atherothrombosis. Diabetologia

1991; 34: 457‐62.

Junien C, Nathanielsz P. Report on the IASO Stock Conference 2006: early and lifelong

environmental epigenomic programming of metabolic syndrome, obesity and type II

diabetes. Obes Rev 2007; 8: 487‐502.

K

Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N, Hara K, Ueki K,Tobe K. Adiponectin and

adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J

Clin Invest 2006; 116: 1784‐92.

Kamijo T, Aoyama T, Komiyama A,Hashimoto T. Structural analysis of cDNAs for

subunits of human mitochondrial fatty acid beta‐oxidation trifunctional protein.

Biochem Biophys Res Commun 1994; 199: 818‐25.

Kanazawa M, Xue CY, Kageyama H, Suzuki E, Ito R, Namba Y, Osaka T, Kimura S,Inoue S.

Effects of a high‐sucrose diet on body weight, plasma triglycerides, and stress

tolerance. Nutr Rev 2003; 61: S27‐33.

Kato K, Long NK, Makita H, Toida M, Yamashita T, Hatakeyama D, Hara A, Mori

H,Shibata T. Effects of green tea polyphenol on methylation status of RECK gene and

cancer cell invasion in oral squamous cell carcinoma cells. Br J Cancer 2008; 99: 647‐54.

Ke Q, Davidson T, Chen H, Kluz T,Costa M. Alterations of histone modifications and

transgene silencing by nickel chloride. Carcinogenesis 2006; 27: 1481‐8.

Kergoat M, Bailbe D, Portha B. Effect of high sucrose diet on insulin secretion and

insulin action: a study in the normal rat. Diabetologia 1987; 30: 252‐8.

Bibliografía

‐135‐

Kirino Y, Kamimoto T, Sato Y, Kawazoe K, Minakuchi K,Nakahori Y. Increased plasma

dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) activity and decreased DPP IV activity of visceral but

not subcutaneous adipose tissue in impaired glucose tolerance rats induced by high‐fat

or high‐sucrose diet. Biol Pharm Bull 2009; 32: 463‐7.

Klose RJ, Bird AP. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. Trends

Biochem Sci 2006; 31: 89‐97.

Kotsopoulos J, Sohn KJ,Kim YI. Postweaning dietary folate deficiency provided through

childhood to puberty permanently increases genomic DNA methylation in adult rat

liver. J Nutr 2008; 138: 703‐9.

Krauss RM, Winston M, Fletcher BJ,Grundy SM. Obesity : impact on cardiovascular

disease. Circulation 1998; 98: 1472‐6.

Kucharski R, Maleszka J, Foret S,Maleszka R. Nutritional control of reproductive status

in honeybees via DNA methylation. Science 2008; 319: 1827‐30.

L

Labayen I, Martinez JA. [Distribution of macronutrients from the diet and regulation of

weight and body composition: role of lipids intake in obesity]. An Sist Sanit Navar

2002; 25 Suppl 1: 79‐90.

Lai JC, Cheng YW, Chiou HL, Wu MF, Chen CY,Lee H. Gender difference in estrogen

receptor alpha promoter hypermethylation and its prognostic value in non‐small cell

lung cancer. Int J Cancer 2005; 117: 974‐80.

Lamas O, Martinez JA,Marti A. Energy restriction restores the impaired immune

response in overweight (cafeteria) rats. J Nutr Biochem 2004; 15: 418‐25.

Lathe R. The individuality of mice. Genes Brain Behav 2004; 3: 317‐27.

Bibliografía

‐136‐

Lawton CL, Blundell JE. The effect of d‐fenfluramine on intake of carbohydrate

supplements is influenced by the hydration of the test diets. Behav Pharmacol 1992; 3:

517‐23.

Lazcoz P, Munoz J, Nistal M, Pestana A, Encio I,Castresana JS. Frequent promoter

hypermethylation of RASSF1A and CASP8 in neuroblastoma. BMC Cancer 2006; 6: 254.

Leaf DA. Fitness: a new look at an old term (measurements of human aerobic

performance). Med Hypotheses 1985; 18: 33‐46.

Lesage J, Blondeau B, Grino M, Breant B,Dupouy JP. Maternal undernutrition during

late gestation induces fetal overexposure to glucocorticoids and intrauterine growth

retardation, and disturbs the hypothalamo‐pituitary adrenal axis in the newborn rat.

Endocrinology 2001; 142: 1692‐702.

Li J, Yu X, Pan W,Unger RH. Gene expression profile of rat adipose tissue at the onset of

high‐fat‐diet obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab 2002; 282: E1334‐41.

Li KC, Zernicke RF, Barnard RJ,Li AF. Effects of a high fat‐sucrose diet on cortical bone

morphology and biomechanics. Calcif Tissue Int 1990; 47: 308‐13.

Liddle RA, Jirtle RL. Epigenetic silencing of genes in human colon cancer.

Gastroenterology 2006; 131: 960‐2.

Lin JM, Collins PJ, Trinklein ND, Fu Y, Xi H, Myers RM,Weng Z. Transcription factor

binding and modified histones in human bidirectional promoters. Genome Res 2007;

17: 818‐27.

Ling C, Poulsen P, Simonsson S, Ronn T, Holmkvist J, Almgren P, Hagert P, Nilsson E,

Mabey AG, Nilsson P, Vaag A,Groop L. Genetic and epigenetic factors are associated

with expression of respiratory chain component NDUFB6 in human skeletal muscle. J

Clin Invest 2007; 117: 3427‐35.

Ling C, Del Guerra S, Lupi R, Ronn T, Granhall C, Luthman H, Masiello P, Marchetti P,

Groop L,Del Prato S. Epigenetic regulation of PPARGC1A in human type 2 diabetic islets

and effect on insulin secretion. Diabetologia 2008; 51: 615‐22.

Bibliografía

‐137‐

Linko AM, Juntunen KS, Mykkanen HM, Adlercreutz H. Whole‐grain rye bread

consumption by women correlates with plasma alkylresorcinols and increases their

concentration compared with low‐fiber wheat bread. J Nutr 2005; 135: 580‐3.

Liu S, Manson JE, Buring JE, Stampfer MJ, Willett WC,Ridker PM. Relation between a

diet with a high glycemic load and plasma concentrations of high‐sensitivity C‐reactive

protein in middle‐aged women. Am J Clin Nutr 2002; 75: 492‐8.

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real‐time

quantitative PCR and the 2(‐Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25: 402‐8.

Lobstein T, Frelut ML. Prevalence of overweight among children in Europe. Obes Rev

2003; 4: 195‐200.

Locker J, Reddy TV, Lombardi B. DNA methylation and hepatocarcinogenesis in rats fed

a choline‐devoid diet. Carcinogenesis 1986; 7: 1309‐12.

Lomba A, Milagro FI, García‐Díaz DF, Campión J, Marzo F, Martínez JA. A high sucrose

isocaloric pair‐fed model induces obesity and impairs the NDUFB6 gene function in rat

adipose tissue. J Nutrigenet Nutrigenomics 2009; 2: 267‐72.

Lomba A, Milagro FI, García‐Díaz DF, Marti A, Campión J,Martínez JA. Obesity induced

by a pair‐fed high fat sucrose diet: Methylation and expression pattern of genes

related to energy homeostasis. Lipids Health Dis 2010; 9: 60.

Loos RJ, Bouchard C. Obesity‐‐is it a genetic disorder? J Intern Med 2003; 254: 401‐25.

Lv S, Fan R, Du Y, Hou M, Tang Z, Ling W,Zhu H. Betaine supplementation attenuates

atherosclerotic lesion in apolipoprotein E‐deficient mice. Eur J Nutr 2009; 48: 205‐12.

Bibliografía

‐138‐

M

Ma SW, Tomlinson B,Benzie IF. A study of the effect of oral glucose loading on plasma

oxidant: antioxidant balance in normal subjects. Eur J Nutr 2005; 44: 250‐4.

Mairesse J, Lesage J, Breton C, Breant B, Hahn T, Darnaudery M, Dickson SL, Seckl J,

Blondeau B, Vieau D, Maccari S,Viltart O. Maternal stress alters endocrine function of

the feto‐placental unit in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007; 292: E1526‐33.

Majid S, Kikuno N, Nelles J, Noonan E, Tanaka Y, Kawamoto K, Hirata H, Li LC, Zhao H,

Okino ST, Place RF, Pookot D,Dahiya R. Genistein induces the p21WAF1/CIP1 and

p16INK4a tumor suppressor genes in prostate cancer cells by epigenetic mechanisms

involving active chromatin modification. Cancer Res 2008; 68: 2736‐44.

Malik VS, Schulze MB, Hu FB. Intake of sugar‐sweetened beverages and weight gain: a

systematic review. Am J Clin Nutr 2006; 84: 274‐88.

Malik VS,Hu FB. Popular weight‐loss diets: from evidence to practice. Nat Clin Pract

Cardiovasc Med 2007; 4: 34‐41.

Mancuso P, Huffnagle GB, Olszewski MA, Phipps J,Peters‐Golden M. Leptin corrects

host defense defects after acute starvation in murine pneumococcal pneumonia. Am J

Respir Crit Care Med 2006; 173: 212‐8.

Manson JE, Willett WC, Stampfer MJ, Colditz GA, Hunter DJ, Hankinson SE, Hennekens

CH,Speizer FE. Body weight and mortality among women. N Engl J Med 1995; 333: 677‐

85.

Mantha L, Deshaies Y. Energy intake‐independent modulation of triglyceride

metabolism by glucocorticoids in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2000;

278: R1424‐32.

Manzo F, Tambaro FP, Mai A,Altucci L. Histone acetyltransferase inhibitors and

preclinical studies. Expert Opin Ther Pat 2009; 19: 761‐74.

Bibliografía

‐139‐

Margueron R, Trojer P,Reinberg D. The key to development: interpreting the histone

code? Curr Opin Genet Dev 2005; 15: 163‐76.

Marti A, Martinez‐Gonzalez MA, Martinez JA. Interaction between genes and lifestyle

factors on obesity. Proc Nutr Soc 2008; 67: 1‐8.

Martinez JA. Body‐weight regulation: causes of obesity. Proc Nutr Soc 2000; 59: 337‐45.

Martinez JA, Moreno MJ, Marques‐Lopes I,Marti A. [Causes of obesity]. An Sist Sanit

Navar 2002; 25 Suppl 1: 17‐27.

Martinez JA, Moreno B, Martinez‐Gonzalez MA. Prevalence of obesity in Spain. Obes

Rev 2004; 5: 171‐2.

Martinez JA, Enriquez L, Moreno‐Aliaga MJ,Marti A. Genetics of obesity. Public Health

Nutr 2007; 10: 1138‐44.

Martinez JA, Parra MD, Santos JL, Moreno‐Aliaga MJ, Marti A,Martinez‐Gonzalez MA.

Genotype‐dependent response to energy‐restricted diets in obese subjects: towards

personalized nutrition. Asia Pac J Clin Nutr 2008; 17 Suppl 1: 119‐22.

Mas S, Lafuente MJ, Crescenti A, Trias M, Ballesta A, Molina R, Zheng S, Wiencke

JK,Lafuente A. Lower specific micronutrient intake in colorectal cancer patients with

tumors presenting promoter hypermethylation in p16(INK4a), p4(ARF) and hMLH1.

Anticancer Res 2007; 27: 1151‐6.

McAllister EJ, Dhurandhar NV, Keith SW, Aronne LJ, Barger J, Baskin M, Benca RM,

Biggio J, Boggiano MM, Eisenmann JC, Elobeid M, Fontaine KR, Gluckman P, Hanlon EC,

Katzmarzyk P, Pietrobelli A, Redden DT, Ruden DM, Wang C, Waterland RA, Wright

SM,Allison DB. Ten putative contributors to the obesity epidemic. Crit Rev Food Sci

Nutr 2009; 49: 868‐913.

McAuley KA, Smith KJ, Taylor RW, McLay RT, Williams SM, Mann JI. Long‐term effects

of popular dietary approaches on weight loss and features of insulin resistance. Int J

Obes (Lond) 2006; 30: 342‐9.

Bibliografía

‐140‐

McMillan‐Price J, Brand‐Miller J. Dietary approaches to overweight and obesity. Clin

Dermatol 2004; 22: 310‐4.

Mesa‐Cornejo VM, Barros‐Nuñez P, Medina‐Lozano C. Metilación del ADN: marcador

diagnóstico y pronóstico de cáncer. Gac Méd Méx 2006; 142: 81‐82.

Metwally M, Ledger WL, Li TC. Reproductive endocrinology and clinical aspects of

obesity in women. Ann N Y Acad Sci 2008; 1127: 140‐6.

Milagro FI, Campion J, Martinez JA. Weight gain induced by high‐fat feeding involves

increased liver oxidative stress. Obesity (Silver Spring) 2006; 14: 1118‐23.

Milagro FI, Campion J, Garcia‐Diaz DF, Goyenechea E, Paternain L,Martinez JA. High fat

diet‐induced obesity modifies the methylation pattern of leptin promoter in rats. J

Physiol Biochem 2009; 65: 1‐9.

Milagro FI, Campión J, Martinez JA. Metabolism and chromatin dynamics/remodelling.

2010.

Mitchell BD, Haffner SM, Hazuda HP, Valdez R,Stern MP. The relation between serum

insulin levels and 8‐year changes in lipid, lipoprotein, and blood pressure levels. Am J

Epidemiol 1992; 136: 12‐22.

Mito N, Hosoda T, Kato C,Sato K. Change of cytokine balance in diet‐induced obese

mice. Metabolism 2000; 49: 1295‐300.

Mootha VK, Lindgren CM, Eriksson KF, Subramanian A, Sihag S, Lehar J, Puigserver P,

Carlsson E, Ridderstrale M, Laurila E, Houstis N, Daly MJ, Patterson N, Mesirov JP,

Golub TR, Tamayo P, Spiegelman B, Lander ES, Hirschhorn JN, Altshuler D,Groop LC.

PGC‐1alpha‐responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately

downregulated in human diabetes. Nat Genet 2003; 34: 267‐73.

Moreno‐Aliaga MJ, Santos JL, Marti A,Martinez JA. Does weight loss prognosis depend

on genetic make‐up? Obes Rev 2005; 6: 155‐68.

Bibliografía

‐141‐

Musso G, Gambino R, De Michieli F, Cassader M, Rizzetto M, Durazzo M, Faga E, Silli

B,Pagano G. Dietary habits and their relations to insulin resistance and postprandial

lipemia in nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2003; 37: 909‐16.

Muzio F, Mondazzi L, Harris WS, Sommariva D,Branchi A. Effects of moderate

variations in the macronutrient content of the diet on cardiovascular disease risk

factors in obese patients with the metabolic syndrome. Am J Clin Nutr 2007; 86: 946‐

51.

Myzak MC, Dashwood WM, Orner GA, Ho E,Dashwood RH. Sulforaphane inhibits

histone deacetylase in vivo and suppresses tumorigenesis in Apc‐minus mice. Faseb J

2006; 20: 506‐8.

N

Niehrs C. Active DNA demethylation and DNA repair. Differentiation 2009; 77: 1‐11.

Noakes M, Clifton P. Weight loss, diet composition and cardiovascular risk. Curr Opin

Lipidol 2004; 15: 31‐5.

Noer A, Boquest AC,Collas P. Dynamics of adipogenic promoter DNA methylation

during clonal culture of human adipose stem cells to senescence. BMC Cell Biol 2007;

8: 18.

Nosho K, Kawasaki T, Ohnishi M, Suemoto Y, Kirkner GJ, Zepf D, Yan L, Longtine JA,

Fuchs CS,Ogino S. PIK3CA mutation in colorectal cancer: relationship with genetic and

epigenetic alterations. Neoplasia 2008; 10: 534‐41.

Nosho K, Shima K, Irahara N, Kure S, Firestein R, Baba Y, Toyoda S, Chen L, Hazra A,

Giovannucci EL, Fuchs CS,Ogino S. SIRT1 histone deacetylase expression is associated

with microsatellite instability and CpG island methylator phenotype in colorectal

cancer. Mod Pathol 2009; 22: 922‐32.

Nottke A, Colaiacovo MP, Shi Y. Developmental roles of the histone lysine

demethylases. Development 2009; 136: 879‐89.

Bibliografía

‐142‐

O

Oberlander TF, Weinberg J, Papsdorf M, Grunau R, Misri S,Devlin AM. Prenatal

exposure to maternal depression, neonatal methylation of human glucocorticoid

receptor gene (NR3C1) and infant cortisol stress responses. Epigenetics 2008; 3: 97‐

106.

Ogino S, Kawasaki T, Ogawa A, Kirkner GJ, Loda M, Fuchs CS. Fatty acid synthase

overexpression in colorectal cancer is associated with microsatellite instability,

independent of CpG island methylator phenotype. Hum Pathol 2007; 38: 842‐9.

Oki M, Aihara H, Ito T. Role of histone phosphorylation in chromatin dynamics and its

implications in diseases. Subcell Biochem 2007; 41: 319‐36.

Orii KE, Orii KO, Souri M, Orii T, Kondo N, Hashimoto T,Aoyama T. Genes for the human

mitochondrial trifunctional protein alpha‐ and beta‐subunits are divergently

transcribed from a common promoter region. J Biol Chem 1999; 274: 8077‐84.

Oshida Y, Kako M, Nakai N, Shimomura Y, Li L, Sato J, Ohsawa I,Sato Y. Troglitazone

improves insulin‐stimulated glucose utilization associated with an increased muscle

glycogen content in obese Zucker rats. Endocr J 1999; 46: 723‐30.

P

Pagliassotti MJ, Prach PA. Quantity of sucrose alters the tissue pattern and time course

of insulin resistance in young rats. Am J Physiol 1995; 269: R641‐6.

Palmer JR, Boggs DA, Krishnan S, Hu FB, Singer M,Rosenberg L. Sugar‐sweetened

beverages and incidence of type 2 diabetes mellitus in African American women. Arch

Intern Med 2008; 168: 1487‐92.

Bibliografía

‐143‐

Perez‐Rodrigo C, Aranceta Bartrina J, Serra Majem L, Moreno B,Delgado Rubio A.

Epidemiology of obesity in Spain. Dietary guidelines and strategies for prevention. Int J

Vitam Nutr Res 2006; 76: 163‐71.

Perez JX, Manzano A, Tauler A, Bartrons R. Effect of starvation on gene expression of

regulatory enzymes of glycolysis/gluconeogenesis in genetically obese (fa/fa) Zucker

rats. Int J Obes Relat Metab Disord 1998; 22: 667‐72.

Perusse L, Rankinen T, Zuberi A, Chagnon YC, Weisnagel SJ, Argyropoulos G, Walts B,

Snyder EE,Bouchard C. The human obesity gene map: the 2004 update. Obes Res 2005;

13: 381‐490.

Petro AE, Cotter J, Cooper DA, Peters JC, Surwit SJ, Surwit RS. Fat, carbohydrate, and

calories in the development of diabetes and obesity in the C57BL/6J mouse.

Metabolism 2004; 53: 454‐7.

Pham TD, MacLennan NK, Chiu CT, Laksana GS, Hsu JL, Lane RH. Uteroplacental

insufficiency increases apoptosis and alters p53 gene methylation in the full‐term IUGR

rat kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 285: R962‐70.

Podolin DA, Gayles EC, Wei Y, Thresher JS, Pagliassotti MJ. Menhaden oil prevents but

does not reverse sucrose‐induced insulin resistance in rats. Am J Physiol 1998; 274:

R840‐8.

Popkin BM, Gordon‐Larsen P. The nutrition transition: worldwide obesity dynamics and

their determinants. Int J Obes Relat Metab Disord 2004; 28 Suppl 3: S2‐9.

Posey KA, Clegg DJ, Printz RL, Byun J, Morton GJ, Vivekanandan‐Giri A, Pennathur S,

Baskin DG, Heinecke JW, Woods SC, Schwartz MW,Niswender KD. Hypothalamic

proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a

high‐fat diet. Am J Physiol Endocrinol Metab 2009; 296: E1003‐12.

Poulain M, Doucet M, Major GC, Drapeau V, Series F, Boulet LP, Tremblay A,Maltais F.

The effect of obesity on chronic respiratory diseases: pathophysiology and therapeutic

strategies. Cmaj 2006; 174: 1293‐9.

Bibliografía

‐144‐

Prentice AM, Poppitt SD. Importance of energy density and macronutrients in the

regulation of energy intake. Int J Obes Relat Metab Disord 1996; 20 Suppl 2: S18‐23.

R

Raben A, Tagliabue A, Christensen NJ, Madsen J, Holst JJ, Astrup A. Resistant starch:

the effect on postprandial glycemia, hormonal response, and satiety. Am J Clin Nutr

1994; 60: 544‐51.

Raben A. Should obese patients be counselled to follow a low‐glycaemic index diet? No.

Obes Rev 2002; 3: 245‐56.

Ravelli AC, van Der Meulen JH, Osmond C, Barker DJ,Bleker OP. Obesity at the age of

50 y in men and women exposed to famine prenatally. Am J Clin Nutr 1999; 70: 811‐6.

Reiser S, Hallfrisch J. Insulin sensitivity and adipose tissue weight of rats fed starch or

sucrose diets ad libitum or in meals. J Nutr 1977; 107: 147‐55.

Ribet C, Montastier E, Valle C, Bezaire V, Mazzucotelli A, Mairal A, Viguerie N,Langin D.

Peroxisome proliferator‐activated receptor‐alpha control of lipid and glucose

metabolism in human white adipocytes. Endocrinology 2010; 151: 123‐33.

Riccardi G, Rivellese AA,Giacco R. Role of glycemic index and glycemic load in the

healthy state, in prediabetes, and in diabetes. Am J Clin Nutr 2008; 87: 269S‐74S.

Robert L, Narcy A, Rayssiguier Y, Mazur A,Remesy C. Lipid metabolism and antioxidant

status in sucrose vs. potato‐fed rats. J Am Coll Nutr 2008; 27: 109‐16.

Rodríguez MC, Morentin BEMd, Parra MD, Pérez S, Martínez JA. Nutrientes y otros

componentes de los alimentos implicados en la regulación del peso corporal. Rev Chil

Obes 2005; 8: 5‐11.

Bibliografía

‐145‐

Ronti T, Lupattelli G,Mannarino E. The endocrine function of adipose tissue: an update.

Clin Endocrinol (Oxf) 2006; 64: 355‐65.

Roupret M, Hupertan V, Catto JW, Yates DR, Rehman I, Proctor LM, Phillips J, Meuth M,

Cussenot O,Hamdy FC. Promoter hypermethylation in circulating blood cells identifies

prostate cancer progression. Int J Cancer 2008; 122: 952‐6.

S

Sadoul K, Boyault C, Pabion M, Khochbin S. Regulation of protein turnover by

acetyltransferases and deacetylases. Biochimie 2008; 90: 306‐12.

Salas‐Salvado J, Rubio MA, Barbany M,Moreno B. [SEEDO 2007 Consensus for the

evaluation of overweight and obesity and the establishment of therapeutic

intervention criteria]. Med Clin (Barc) 2007; 128: 184‐96; quiz 1 p following 200.

Sanchez‐Lozada LG, Mu W, Roncal C, Sautin YY, Abdelmalek M, Reungjui S, Le M,

Nakagawa T, Lan HY, Yu X,Johnson RJ. Comparison of free fructose and glucose to

sucrose in the ability to cause fatty liver. Eur J Nutr 2010; 49: 1‐9.

Schuffler P, Mikeska T, Waha A, Lengauer T,Bock C. MethMarker: user‐friendly design

and optimization of gene‐specific DNA methylation assays. Genome Biol 2009; 10:

R105.

Schulze MB, Manson JE, Ludwig DS, Colditz GA, Stampfer MJ, Willett WC,Hu FB. Sugar‐

sweetened beverages, weight gain, and incidence of type 2 diabetes in young and

middle‐aged women. Jama 2004; 292: 927‐34.

Schutz Y. Abnormalities of fuel utilization as predisposing to the development of

obesity in humans. Obes Res 1995; 3 Suppl 2: 173S‐78S.

Seidell JC. Obesity in Europe: scaling an epidemic. Int J Obes Relat Metab Disord 1995;

19 Suppl 3: S1‐4.

Bibliografía

‐146‐

Semba S, Itoh N, Ito M, Youssef EM, Harada M, Moriya T, Kimura W,Yamakawa M.

Down‐regulation of PIK3CG, a catalytic subunit of phosphatidylinositol 3‐OH kinase, by

CpG hypermethylation in human colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 2002; 8: 3824‐

31.

Semenkovich CF. Regulation of fatty acid synthase (FAS). Prog Lipid Res 1997; 36: 43‐53.

Sinclair KD, Allegrucci C, Singh R, Gardner DS, Sebastian S, Bispham J, Thurston A,

Huntley JF, Rees WD, Maloney CA, Lea RG, Craigon J, McEvoy TG,Young LE. DNA

methylation, insulin resistance, and blood pressure in offspring determined by

maternal periconceptional B vitamin and methionine status. Proc Natl Acad Sci U S A

2007; 104: 19351‐6.

Slavin J. Why whole grains are protective: biological mechanisms. Proc Nutr Soc 2003;

62: 129‐34.

Slavin JL. Dietary fiber and body weight. Nutrition 2005; 21: 411‐8.

Smeitink J,van den Heuvel L. Human mitochondrial complex I in health and disease. Am

J Hum Genet 1999; 64: 1505‐10.

Spurling CC, Suhl JA, Boucher N, Nelson CE, Rosenberg DW, Giardina C. The short chain

fatty acid butyrate induces promoter demethylation and reactivation of RARbeta2 in

colon cancer cells. Nutr Cancer 2008; 60: 692‐702.

Steegers‐Theunissen RP, Obermann‐Borst SA, Kremer D, Lindemans J, Siebel C,

Steegers EA, Slagboom PE,Heijmans BT. Periconceptional maternal folic acid use of 400

microg per day is related to increased methylation of the IGF2 gene in the very young

child. PLoS One 2009; 4: e7845.

Stenvinkel P, Karimi M, Johansson S, Axelsson J, Suliman M, Lindholm B, Heimburger O,

Barany P, Alvestrand A, Nordfors L, Qureshi AR, Ekstrom TJ,Schalling M. Impact of

inflammation on epigenetic DNA methylation ‐ a novel risk factor for cardiovascular

disease? J Intern Med 2007; 261: 488‐99.

Bibliografía

‐147‐

Stoffel M, Patel P, Lo YM, Hattersley AT, Lucassen AM, Page R, Bell JI, Bell GI, Turner RC,

Wainscoat JS. Missense glucokinase mutation in maturity‐onset diabetes of the young

and mutation screening in late‐onset diabetes. Nat Genet 1992; 2: 153‐6.

Storlien LH, Kraegen EW, Jenkins AB,Chisholm DJ. Effects of sucrose vs starch diets on

in vivo insulin action, thermogenesis, and obesity in rats. Am J Clin Nutr 1988; 47: 420‐

7.

Stroubini T, Perelas A, Liapi C, Perrea D, Dontas I, Tzavara C, Galanopoulou P. Serum

adiponectin and resistin in rats under three isocaloric diets: The effect of sibutramine.

Cytokine 2009; 46: 171‐5.

Strychar I. Diet in the management of weight loss. Cmaj 2006; 174: 56‐63.

Sullivan KE, Reddy AB, Dietzmann K, Suriano AR, Kocieda VP, Stewart M,Bhatia M.

Epigenetic regulation of tumor necrosis factor alpha. Mol Cell Biol 2007; 27: 5147‐60.

T

Takahashi H, McCaffery JM, Irizarry RA, Boeke JD. Nucleocytosolic acetyl‐coenzyme a

synthetase is required for histone acetylation and global transcription. Mol Cell 2006;

23: 207‐17.

Tang WY,Ho SM. Epigenetic reprogramming and imprinting in origins of disease. Rev

Endocr Metab Disord 2007; 8: 173‐82.

Thaler R, Karlic H, Rust P, Haslberger AG. Epigenetic regulation of human buccal

mucosa mitochondrial superoxide dismutase gene expression by diet. Br J Nutr 2009;

101: 743‐9.

Thorburn AW, Storlien LH, Jenkins AB, Khouri S,Kraegen EW. Fructose‐induced in vivo

insulin resistance and elevated plasma triglyceride levels in rats. Am J Clin Nutr 1989;

49: 1155‐63.

Bibliografía

‐148‐

Thorne JL, Campbell MJ, Turner BM. Transcription factors, chromatin and cancer. Int J

Biochem Cell Biol 2009; 41: 164‐75.

Thresher JS, Podolin DA, Wei Y, Mazzeo RS,Pagliassotti MJ. Comparison of the effects

of sucrose and fructose on insulin action and glucose tolerance. Am J Physiol Regul

Integr Comp Physiol 2000; 279: R1334‐40.

Thyfault JP, Rector RS, Uptergrove GM, Borengasser SJ, Morris EM, Wei Y, Laye MJ,

Burant CF, Qi NR, Ridenhour SE, Koch LG, Britton SL,Ibdah JA. Rats selectively bred for

low aerobic capacity have reduced hepatic mitochondrial oxidative capacity and

susceptibility to hepatic steatosis and injury. J Physiol 2009; 587: 1805‐16.

Timmers S, de Vogel‐van den Bosch J, Towler MC, Schaart G, Moonen‐Kornips E,

Mensink RP, Hesselink MK, Hardie DG, Schrauwen P. Prevention of high‐fat diet‐

induced muscular lipid accumulation in rats by alpha lipoic acid is not mediated by

AMPK activation. J Lipid Res 2010; 51 (2): 352‐9.

Tobey TA, Mondon CE, Zavaroni I,Reaven GM. Mechanism of insulin resistance in

fructose‐fed rats. Metabolism 1982; 31: 608‐12.

Toida S, Takahashi M, Shimizu H, Sato N, Shimomura Y,Kobayashi I. Effect of high

sucrose feeding on fat accumulation in the male Wistar rat. Obes Res 1996; 4: 561‐8.

Torrisani J, Hanoun N, Laurell H, Lopez F, Maoret JJ, Souque A, Susini C, Cordelier

P,Buscail L. Identification of an upstream promoter of the human somatostatin

receptor, hSSTR2, which is controlled by epigenetic modifications. Endocrinology 2008;

149: 3137‐47.

U

Uekawa A, Katsushima K, Ogata A, Kawata T, Maeda N, Kobayashi K, Maekawa A,

Tadokoro T,Yamamoto Y. Change of epigenetic control of cystathionine beta‐synthase

gene expression through dietary vitamin B12 is not recovered by methionine

supplementation. J Nutrigenet Nutrigenomics 2009; 2: 29‐36.

Bibliografía

‐149‐

Urnov FD. Methylation and the genome: the power of a small amendment. J Nutr

2002; 132: 2450S‐56S.

Uthus EO, Ross SA, Davis CD. Differential effects of dietary selenium (se) and folate on

methyl metabolism in liver and colon of rats. Biol Trace Elem Res 2006; 109: 201‐14.

V

Valinluck V, Sowers LC. Inflammation‐mediated cytosine damage: a mechanistic link

between inflammation and the epigenetic alterations in human cancers. Cancer Res

2007; 67: 5583‐6.

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A,Speleman F.

Accurate normalization of real‐time quantitative RT‐PCR data by geometric averaging

of multiple internal control genes. Genome Biol 2002; 3: RESEARCH0034.

Vartanian LR, Schwartz MB, Brownell KD. Effects of soft drink consumption on nutrition

and health: a systematic review and meta‐analysis. Am J Public Health 2007; 97: 667‐

75.

Vetelainen R, van Vliet A, van Gulik TM. Essential pathogenic and metabolic differences

in steatosis induced by choline or methione‐choline deficient diets in a rat model. J

Gastroenterol Hepatol 2007; 22: 1526‐33.

Vickers MH. Developmental programming and adult obesity: the role of leptin. Curr

Opin Endocrinol Diabetes Obes 2007; 14: 17‐22.

Vogeser M, Konig D, Frey I, Predel HG, Parhofer KG,Berg A. Fasting serum insulin and

the homeostasis model of insulin resistance (HOMA‐IR) in the monitoring of lifestyle

interventions in obese persons. Clin Biochem 2007; 40: 964‐8.

Bibliografía

‐150‐

W

Waldecker M, Kautenburger T, Daumann H, Busch C, Schrenk D. Inhibition of histone‐

deacetylase activity by short‐chain fatty acids and some polyphenol metabolites

formed in the colon. J Nutr Biochem 2008; 19: 587‐93.

Wang D, Wei Y,Pagliassotti MJ. Saturated fatty acids promote endoplasmic reticulum

stress and liver injury in rats with hepatic steatosis. Endocrinology 2006; 147: 943‐51.

Waterland RA. Does nutrition during infancy and early childhood contribute to later

obesity via metabolic imprinting of epigenetic gene regulatory mechanisms? Nestle

Nutr Workshop Ser Pediatr Program 2005; 56: 157‐71; discussion 71‐4.

Waterland RA, Rached MT. Developmental establishment of epigenotype: a role for

dietary fatty acids? . Scand J Food & Nutrition 2006; 50: 21‐26.

Waterland RA, Travisano M, Tahiliani KG, Rached MT,Mirza S. Methyl donor

supplementation prevents transgenerational amplification of obesity. Int J Obes (Lond)

2008a; 32: 1373‐9.

Waterland RA. Epigenetic epidemiology of obesity: application of epigenomic

technology. Nutr Rev 2008b; 66 Suppl 1: S21‐3.

Weindruch RH, Kristie JA, Cheney KE,Walford RL. Influence of controlled dietary

restriction on immunologic function and aging. Fed Proc 1979; 38: 2007‐16.

Weinsier RL, Hunter GR, Heini AF, Goran MI,Sell SM. The etiology of obesity: relative

contribution of metabolic factors, diet, and physical activity. Am J Med 1998; 105: 145‐

50.

WHO/OMS. Diet, nutrition and the prevention of chronic diseases. Report of a Joint

WHO/FAO Expert Consultation. World Health Organ Tech Rep Ser 2003; 1‐148.

Bibliografía

‐151‐

Wild L, Flanagan JM. Genome‐wide hypomethylation in cancer may be a passive

consequence of transformation. Biochim Biophys Acta 2010;

Willems PH, Smeitink JA, Koopman WJ. Mitochondrial dynamics in human NADH:

ubiquinone oxidoreductase deficiency. Int J Biochem Cell Biol 2009; 41: 1773‐82.

Worthley DL, Whitehall VL, Buttenshaw RL, Irahara N, Greco SA, Ramsnes I, Mallitt KA,

Le Leu RK, Winter J, Hu Y, Ogino S, Young GP,Leggett BA. DNA methylation within the

normal colorectal mucosa is associated with pathway‐specific predisposition to cancer.

Oncogene 2010; 29: 1653‐62.

Y

Yamamoto Y,Oue E. Antihypertensive effect of quercetin in rats fed with a high‐fat

high‐sucrose diet. Biosci Biotechnol Biochem 2006; 70: 933‐9.

Yeh CS, Wang JY, Cheng TL, Juan CH, Wu CH, Lin SR. Fatty acid metabolism pathway

play an important role in carcinogenesis of human colorectal cancers by Microarray‐

Bioinformatics analysis. Cancer Lett 2006; 233: 297‐308.

Z

Zapisek WF, Cronin GM, Lyn‐Cook BD, Poirier LA. The onset of oncogene

hypomethylation in the livers of rats fed methyl‐deficient, amino acid‐defined diets.

Carcinogenesis 1992; 13: 1869‐72.

Zardo G, Cimino G, Nervi C. Epigenetic plasticity of chromatin in embryonic and

hematopoietic stem/progenitor cells: therapeutic potential of cell reprogramming.

Leukemia 2008; 22: 1503‐18.

Zeisel SH. Importance of methyl donors during reproduction. Am J Clin Nutr 2009; 89:

673S‐7S.

Bibliografía

‐152‐

Zhang H, Cao P, Agellon LB, Zhai CK. Wild rice ( Zizania latifolia (Griseb) Turcz) improves

the serum lipid profile and antioxidant status of rats fed with a high fat/cholesterol

diet. Br J Nutr 2009; 102: 1723‐7.

Zhou X, Li Q, Arita A, Sun H, Costa M. Effects of nickel, chromate, and arsenite on

histone 3 lysine methylation. Toxicol Appl Pharmacol 2009; 236: 78‐84.

Zulet MA, Puchau B, Navarro C, Marti A,Martinez JA. [Inflammatory biomarkers: the

link between obesity and associated pathologies]. Nutr Hosp 2007; 22: 511‐27.

ANEXOS

Anexos

‐154‐

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‐155‐

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‐156‐

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