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Evaluación del potencial del cultivo de células en suspensión de papa

(Solanum tuberosum subsp. andígena) como plataforma de

producción de proteínas recombinantes

Luisa Fernanda Granger Serrano

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Medellín, Colombia

2016

Evaluación del potencial del cultivo de células en suspensión de papa

(Solanum tuberosum subsp. andígena) como plataforma de

producción de proteínas recombinantes

Luisa Fernanda Granger Serrano

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Biotecnología

Director (a):

Ph.D. Rafael Arango Isaza

Codirector (a):

Ph.D. Mario Arias Zabala

Línea de Investigación:

Cultivo de células vegetales en suspensión para producción de proteínas recombinantes

Grupos de Investigación:

Biotecnología vegetal y Biotecnología industrial

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Medellín, Colombia

2016

A mis padres, familia y amigos, quienes creen

tanto en mí que me hacen mover mis propios

límites cuando yo he llegado a creer que mi

capacidad ha llegado a su tope.

Resumen VII

Resumen

La ingeniería genética ha permitido la producción de proteínas recombinantes en diversos

sistemas heterólogos, entre los cuales el cultivo de células vegetales ha ganado gran

importancia en la última década. En la búsqueda de plataformas altamente productivas,

se propone a Solanum tuberosum L. como una alternativa promisoria, por sus

características fisiológicas y genéticas. El objetivo de esta investigación fue establecer

cultivos de células en suspensión de la nueva variedad colombiana Pastusa Suprema

(Solanum tuberosum subsp. andígena), a partir de plantas transformadas con el gen

cry1Ac de Bacillus thurigiensis. Este sistema modelo permitió explorar el potencial de esta

variedad vegetal como alternativa a los sistemas tradicionales de producción de proteínas

heterólogas. Se determinó la composición hormonal del medio de cultivo que favorece la

inducción de callos (ANA 1,5 mg/L) y el establecimiento de suspensiones (ANA 0,5 mg/L)

en medio Murashigue y Skoog (MS). Se evaluó la cinética de crecimiento de los cultivos

en suspensión, obteniendo un tiempo de duplicación de 8,15 días y una concentración

máxima de biomasa de 12,11 g/L. Se detectó la expresión de la proteína recombinante

Cry1Ac en los cultivos en suspensión establecidos a partir de plantas transformadas

mediante el ensayo DAS-ELISA. Los bajos requerimientos hormonales, la alta tasa

específica de crecimiento y la expresión de la proteína Cry1Ac, sugieren el potencial de

Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema como plataforma de

producción de proteínas recombinantes de interés biotecnológico. El presente trabajo

constituye el primer reporte del cultivo de callos y células en suspensión de esta nueva

variedad vegetal.

Palabras clave: Cultivo de células vegetales en suspensión, proteínas

recombinantes, Solanum tuberosum L.

Contenido VIII

Contenido

Pág.

Resumen ................................................................................................................... VIIVII

Lista de figuras ............................................................................................................... X

Lista de tablas ............................................................................................................... XII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Estado del arte ......................................................................................................... 5 1.1 Proteínas terapéuticas ..................................................................................... 5 1.2 Sistemas de producción de proteínas terapéuticas ......................................... 7 1.3 Cultivo in vitro y producción de proteínas terapéuticas en papa ...................... 9 1.4 Antecedentes de Solanum tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa Suprema .................................................................................................................. 11

2. Objetivos ................................................................................................................ 13 2.1 Objetivo general ............................................................................................ 13 2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 13

3. Metodología ............................................................................................................ 14 3.1 Material vegetal ............................................................................................. 14 3.2 Inducción de callos ........................................................................................ 14 3.3 Establecimiento de suspensiones celulares .................................................. 16 3.4 Cinética de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato.......................... 16 3.5 Establecimiento de suspensiones celulares a partir de plantas transformadas .......................................................................................................... 17 3.6 Métodos analíticos ........................................................................................ 18

3.6.1 Viabilidad celular .................................................................................. 18 3.6.2 Volumen de células sedimendatas ....................................................... 18 3.6.3 Concentración de biomasa en peso seco ............................................. 18 3.6.4 Concentración de azúcares residuales ................................................. 18 3.6.5 Detección de la expresión de proteína recombinante ........................... 19

4. Resultados y discusión .............................................. ¡Error! Marcador no definido.1 4.1 Inducción de callos ........................................................................................ 21 4.2 Establecimiento de suspensiones celulares .................................................. 27 4.3 Cinética de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato.......................... 32 4.4 Establecimiento de suspensiones celulares a partir de plantas transformadas .......................................................................................................... 37

Contenido IX

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 43 5.1 Conclusiones ................................................................................................. 43 5.2 Recomendaciones ......................................................................................... 43

Bibliografía .................................................................................................................... 45

Contenido X

Lista de figuras

Pág.

Figura 1-1: Mapa linear del cassette con los genes nptII y cry1Ac .......................... 12

Figura 4-1: Inducción de callos de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa

suprema a partir de cortes de tallo en condiciones de oscuridad y fotoperiodo 16 h luz .. 21

Figura 4-2: Efecto del tipo de explante (nudo/entrenudo) sobre la respuesta a los

tratamientos de inducción in vitro de callos. .................................................................... 23

Figura 4-3: Inducción de callos a partir de entrenudos. ............................................ 26

Figura 4-4: Efecto de la concentración de ácido α-naftalenacético (ANA) en el medio

de cultivo sobre el crecimiento de las suspensiones celulares de Solanum tuberosum

subsp. andígena var. Pastusa suprema .......................................................................... 27

Figura 4-5: Morfología de los cultivos de células en suspensión de Solanum tuberosum

subsp. andígena variedad Pastusa Suprema en los primeros meses del establecimiento,

aumento total 200X ......................................................................................................... 28

Figura 4-6: Cultivo de células en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena

variedad Pastusa Suprema tras 10 meses del establecimiento, aumento total 100X. ..... 29

Figura 4-7: Suspensiones de Solanum tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa

Suprema de alta densidad celular obtenidas mediante inducción de callos en medio MS +

1,5 mg/l de ANA y establecimiento de suspensiones en medio MS + 0,5 mg/l de ANA ... 30

Figura 4-8: Suspensiones celulares que produjeron compuestos de coloración roja

que se observó en el medio extracelular y en la biomasa .............................................. 31

Figura 4-9: Cinética de crecimiento de biomasa del cultivo de células en suspensión

de Solanum tuberosum L. subsp. andígena var. Pastusa Suprema cultivadas in vitro. ... 33

Figura 4-10: Cinética de consumo de azúcares del cultivo de células en suspensión de

Solanum tuberosum L. subsp. andígena var. Pastusa Suprema cultivadas in vitro. ........ 34

Contenido XI

Figura 4-11: Ensayo DAS-ELISA de entrenudos de plantas de la línea PS 40.27 de

Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema para la detección de proteína

recombinante Cry1Ac. .................................................................................................... 37

Figura 4-12: Ensayo DAS-ELISA del cultivo de células en suspensión de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema para la detección de proteína

recombinante Cry1Ac ..................................................................................................... 38

Figura 4-13: Morfología y viabilidad del cultivo de células en suspensión de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, línea PS 40.27 .............................. 40

Contenido XII

Lista de tablas

Pág.

Tabla 4-1: Porcentaje de formación de callos friables a partir de entrenudos de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, en medio MS suplementado con

diferentes composiciones hormonales. ........................................................................... 24

Tabla 4-2: Comparación de la composición hormonal del medio de cultivo en diferentes

reportes de inducción de callos de Solanum tuberosum L., según la variedad y tipo de

explante……. .................................................................................................................. 25

Tabla 4-3: Comparación de la tasa específica máxima de crecimiento (µmáx) y el tiempo

de duplicación en la fase exponencial (td) del cultivo de células en suspensión de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, con otros reportes de cultivo de células

vegetales …... ................................................................................................................. 35

Tabla 4-4: Resultados del ensayo DAS-ELISA para la detección de la expresión de la

proteína recombinante Cry1Ac en la biomasa de los cultivos de células en suspensión

establecidos a partir de plantas de la línea PS 40.27 de Solanum tuberosum L. subsp.

andígena variedad Pastusa Suprema. ............................................................................ 39

Introducción

La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible la manipulación de genomas para

introducir y expresar genes heterólogos, herramienta que se constituye en la base de la

biotecnología actual. Hoy en día es posible utilizar las técnicas de ingeniería genética para

combinar características deseables de organismos distintos. Se han podido desarrollar,

por ejemplo, variedades vegetales que producen toxinas bacterianas en contra de insectos

patógenos o aprovechar la alta tasa de crecimiento de microorganismos para producir

grandes cantidades de enzimas con aplicación industrial a un costo global de producción

muy bajo.

Las proteínas producidas en sistemas heterólogos por técnicas de ingeniería genética son

muy diversas y tienen aplicaciones en la industria de fármacos, alimentos, detergentes,

textiles, cuero, papel, polímeros y plásticos (Demain & Vaishnav, 2009). En medicina,

además de ser útiles en las pruebas de diagnóstico, las proteínas recombinantes son

usadas como fármacos para el tratamiento de enfermedades, haciendo posible mejorar la

calidad y esperanza de vida de muchas personas con graves afecciones de salud. Las

proteínas terapéuticas han permitido desarrollar tratamientos de reemplazo enzimático,

vacunas y anticuerpos para enfermedades como la diabetes, la enfermedad de Gaucher,

la anemia, la hepatitis, la esclerosis múltiple y el cáncer (Leader, Baca, & Golan, 2008). En

comparación al aislamiento de tejidos animales, la obtención de estas proteínas por las

técnicas de ADN recombinante ofrece significativas ventajas como disponibilidad por

procedimientos más eficientes y menos costosos, actividad específica, reducido riesgo de

causar rechazo inmunológico y de transmitir enfermedades contagiosas causadas por

virus o priones que podrían estar presentes en las fuentes de aislamiento (Doran, 2000).

A pesar de que durante muchos años las células de mamíferos han sido el sistema de

preferencia para obtener biofármacos recombinantes, con un 45% del total producidos en

2009 (Huang & McDonald, 2009), en la última década se ha girado la atención hacia las

células vegetales debido al bajo costo global de producción y a la ausencia de riesgo de

2 Introducción

contaminación y transmisión de patógenos humanos como virus y priones. Sin embargo,

la baja productividad y la falta de autenticidad del producto aún son obstáculos por superar

(J. Xu, Ge, & Dolan, 2011), principalmente debido a que existen diferencias en el patrón

de glicosilación de las plantas y de los mamíferos, lo cual puede producir variaciones

significativas en la estabilidad y antigenicidad de las glicoproteínas recombinantes

humanas producidas en estos sistemas heterólogos.

La ventaja de los procesos fermentativos controlados, por su parte, es que se dispone de

múltiples enfoques para optimizar parámetros como la productividad y el costo global,

recurriendo a estrategias como la manipulación de la composición del medio y condiciones

de cultivo, modificando el diseño del biorreactor, el modo de operación, las técnicas de

ingeniería genética y metabólica, los métodos de separación y purificación, entre otras. De

esta manera se pueden encontrar casos exitosos que han logrado aumentar notablemente

la productividad de algunas proteínas heterólogas en sistemas vegetales (Huang &

McDonald, 2009; J. Xu et al., 2011) y a la bandera está la única proteína comercializada

que se produce en cultivo de células vegetales, la β-glucocerobrosidasa, producida en

células de zanahoria (Daucus carota L.) y comercializada en Israel, Estados Unidos, Brasil

y Uruguay por la empresa Protalix BioTherapeutics© (www.protalix.com).

Dado el relativamente reciente interés en las células vegetales como plataforma de

producción, la investigación ha estado centrada en unas pocas especies, principalmente

zanahoria (Daucus carota L.), tabaco (Nicotiana tabacum L.) y arroz (Oryza sativa L.). Cada

organismo cuenta con una maquinaria metabólica diferente, lo que conlleva a diferencias

en los niveles de expresión y productividad. Así, por ejemplo, la expresión y rendimiento

de interleuquina-12 fue mejorada cambiando únicamente la plataforma de producción de

células de tabaco a arroz (Shin, Chong, Han, Yang, & Kwon, 2010). De esta manera, se

hace necesario buscar otras alternativas que podrían resultar fuertes competidoras de las

plataformas tradicionales, teniendo en cuenta que no existe un único sistema capaz de

alcanzar el mayor rendimiento/productividad en la producción de todas las proteínas

heterólogas.

Se han destacado las siguientes características deseables en los sistemas vegetales que

pretendan explorarse como plataformas de producción de proteínas recombinantes

(Huang & McDonald, 2009): fácil transformación celular, robustez/vitalidad, baja

http://www.protalix.com/

Introducción 3

sensibilidad a las condiciones de crecimiento, alta tasa específica de crecimiento, habilidad

de expresar alta cantidad de proteína, baja actividad proteolítica extracelular (proteínas

secretadas), baja producción de metabolitos secundarios (fenoles y/o quinonas),

capacidad de modificación post-transduccional, patrón correcto y uniforme de glicosilación

y estabilidad genética.

En este escenario el cultivo de células en suspensión de papa (Solanum tuberosum L.)

aparece como una alternativa promisoria para la producción de proteínas recombinantes.

La importancia agronómica de esta planta ha hecho que se haya acumulado gran cantidad

de información sobre sus características bioquímicas y fisiológicas y las técnicas de cultivo

in vitro y de manipulación genética. Se han establecido cultivos in vitro de células de papa

desde hace casi tres décadas para realizar estudios bioquímicos y genéticos de variedades

resistentes, y estudios de estabilidad genética y rutas metabólicas implicadas en

respuestas a condiciones de estrés o ataque por patógenos. Se ha reportado el crecimiento

de las células en suspensión en diferentes medios y con composiciones hormonales que

varían significativamente de una investigación a otra, evidenciando que esta especie

responde de manera robusta al cultivo in vitro. Además, debido a su importancia

agronómica, se han desarrollado numerosos estudios de transformación para

mejoramiento genético de variedades silvestres, por lo que se sabe que la especie es fácil

de transformar; se ha reportado, por ejemplo, 37% de eficiencia en la transformación de

papa Pastusa Suprema (Torres, Torres, Moreno, & Arango, 2012). La manipulación

genética también ha permitido desarrollar plantas transgénicas productoras de proteínas

terapéuticas con actividad biológica, como la interleuquina 2 (IL-2) (Park & Cheong, 2002),

revelando que este sistema tiene la capacidad de hacer las modificaciones post-

transduccionales correctas para que el biofármaco sea funcional.

Teniendo en cuenta las características mencionadas de Solanum tuberosum L. y que

además existen en el país grupos de investigación que han desarrollado importantes

fortalezas en las técnicas de manipulación genética de plantas de interés agronómico como

la papa, se plantea la siguiente pregunta de investigación: ¿Es el cultivo de células en

suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa Suprema una

promisoria plataforma de producción de proteínas recombinantes?

1. Estado del arte

1.1 Proteínas terapéuticas

Las proteínas son quizás las biomoléculas más versátiles de la naturaleza, involucradas

en diversos procesos celulares como la duplicación del material genético, la transducción

de señales del ambiente, la catálisis de todas las reacciones del metabolismo y el

transporte de moléculas entre tejidos. Se ha estimado que el genoma humano contiene

entre 30.000 y 40.000 genes que transcriben a proteínas funcionales (Lander et al., 2001);

si a esto se le suma el efecto del splicing alternativo del ARNm y las modificaciones post-

transduccionales (como corte, fosforilación, acetilación y glicosilación), el número de

proteínas distintas es probablemente mucho mayor (Leader et al., 2008). La función que

cada una de ellas cumple es altamente específica y compleja, a partir de una relación

estrecha entre secuencia y estructura tridimensional que determina su actividad biológica.

Aunque el papel que cumplen las proteínas es vital, puede ser alterado por la fijación de

mutaciones, desencadenando enfermedades asociadas al mal funcionamiento, cantidades

anormales o ausencia de la proteína. Por esta razón, muchas investigaciones han hecho

esfuerzos para aprovechar los avances en técnicas de ingeniería genética e ingeniería de

procesos, para diseñar tratamientos más efectivos de enfermedades. Tal vez el ejemplo

más reconocido es el caso de la insulina, una hormona administrada a pacientes que

sufren de diabetes mellitus tipo I (DM-I) y tipo II (DM-II). Sin tratamiento, la DM-I es una

enfermedad que causa un debilitamiento severo del paciente e incluso la muerte, por

alteraciones en el metabolismo de la glucosa (Leader et al., 2008). Desde la purificación

de la insulina en 1922, a partir de páncreas bovino y porcino, esta proteína se convirtió en

el tratamiento diario que permitió mejorar la calidad y esperanza de vida de las personas

con diabetes. Sin embargo, existen múltiples desventajas en el uso de insulina de origen

animal, principalmente la disponibilidad, el costo de purificación y la inmunogenicidad.

Estos problemas fueron superados gracias a los avances de ingeniería genética, que

6 Evaluación del potencial del cultivo de células en suspensión de papa (Solanum

tuberosum subsp. andígena) como plataforma de producción de proteínas

recombinantes

permitieron la expresión del gen de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli,

posibilitando la producción in vitro a gran escala.

Al igual que la insulina, muchas proteínas terapéuticas han revolucionado la medicina

moderna, ofreciendo un tratamiento para una larga lista de enfermedades, entre las que

se encuentran además de la diabetes, la enfermedad de Gaucher, la anemia, la hepatitis,

la esclerosis múltiple, la leucemia mieloide aguda y el cáncer (Xu et al., 2011). Entre ellas,

muchas son enfermedades huérfanas, que afectan a un número muy bajo de personas en

la población y, por tanto, muchas veces son olvidadas en las investigaciones y en las

políticas de salud pública gubernamentales.

Las proteínas terapéuticas obtenidas por técnicas de ADN recombinante ofrecen varias

ventajas. En primer lugar, la producción a gran escala permite tener mayor disponibilidad

por procedimientos más eficientes y menos costosos. Un claro ejemplo de esto se

encuentra en la enfermedad de Gaucher, un defecto congénito del metabolismo lipídico,

cuyo tratamiento es la enzima glucocerebrosidasa, y antes de la producción de la proteína

recombinante, era necesario procesar 50.000 placentas humanas para suministrar el

tratamiento anual de un paciente. En segundo lugar, gracias a que se utilizan genes

humanos, la actividad de la proteína recombinante es más específica y hay un reducido

riesgo de causar rechazo inmunológico, en comparación con las que provienen de fuentes

animales. Finalmente, la producción de proteínas terapéuticas por técnicas recombinantes

también elimina el riesgo de transmitir enfermedades contagiosas causadas por virus o

priones que podrían estar presentes en las fuentes de aislamiento.

Las proteínas terapéuticas tienen aplicación en muchos campos, como tratamiento de

reemplazo enzimático de muchas enfermedades, pero también son producidas con el

objetivo de usarlas como vacunas y anticuerpos para el tratamiento de cáncer. Pueden

clasificarse de acuerdo al mecanismo de acción en cuatro categorías (Leader et al., 2008):

Grupo I: Proteínas con actividad enzimática o regulatoria

Grupo II: Proteínas con actividad de reconocimiento específico

Grupo II: Vacunas

Capítulo 1 7

Grupo IV: Proteínas para diagnóstico

1.2 Sistemas de producción de proteínas terapéuticas

Tradicionalmente la mayoría de proteínas recombinantes, incluyendo las usadas como

biofármacos, son producidas en sistemas eucarióticos como células de mamífero (45%),

particularmente células de Ovario de Hámster Chino – CHO (35%), levaduras (15%) y

células de insecto (sistemas de baculovirus) o en sistemas bacterianos (40%) (Rader,

2008). Sin embargo, las células vegetales presentan muchas ventajas y en la última

década se han transformado en un sistema de producción muy promisorio.

En más de cinco décadas de trabajo con cultivos de células vegetales en suspensión para

la producción de metabolitos secundarios se han establecido decenas de líneas celulares

y se ha logrado acumular una gran cantidad de conocimiento del metabolismo de la célula

vegetal, de su comportamiento en cultivo y de la optimización del crecimiento de las

mismas. Las células vegetales son capaces de llevar a cabo casi todas las modificaciones

pos-traduccionales que ocurren en las células humanas, pueden llevar a cabo un

plegamiento correcto y ensamblar proteínas multiméricas (Wang & Ma, 2012). Esto

representa una ventaja significativa frente a los sistemas de producción procarióticos y de

levaduras.

Durante muchos años las células de mamífero fueron el sistema de preferencia para

obtener proteínas biofarmacéuticas en particular por la autenticidad del producto, a pesar

de esto presentan como desventajas el alto riesgo de contaminación y transmisión de

patógenos humanos (principalmente virus y priones) y los altos costos del cultivo, debido

a que se requieren medios de cultivo muy elaborados, ricos en vitaminas, factores de

crecimiento y otros componentes (Huang & McDonald, 2011; Wang & Ma, 2012). Estos

medios con alto contenido proteico también dificultan las operaciones de separación y

purificación haciendo que el procesamiento corriente abajo tenga también un costo

elevado (Huang & McDonald, 2009).

Las células vegetales se fortalecieron como plataforma para la producción de proteínas

recombinantes probablemente en 2009, luego de que la empresa biotecnológica Genzyme

tuvo que interrumpir la producción de la droga Cerezyme® para la terapia de la enfermedad



recombinantes

de Gaucher, debido a la contaminación de la línea celular CHO con un calicivirus (Rybicki,

2010). Después de esto, Protalix Biotherapeutics reconoció y aprovechó el potencial de las

células vegetales y actualmente produce en cultivos de células de zanahoria la

glucocerebrosidasa, que es la primera proteína recombinante producida en células

vegetales que ha salido al mercado (Shaaltiel et al., 2007). Más aún, el perfil

farmacocinético de la enzima producida en células de zanahoria mostró que ésta tiene una

mayor vida media que su contraparte producida en células de mamífero (Aviezer et al.,

2009), demostrando el potencial de las plataformas vegetales para producir proteínas

terapéuticas de buena calidad.

Otro sistema de producción de proteínas recombinantes son las plantas transgénicas, con

muy bajos costos del proceso, comparable con los sistemas procarióticos. Sin embargo,

en este caso el tiempo de cultivo es muy prolongado y existe riesgo de contaminación por

micotoxinas, pesticidas, herbicidas y metabolitos secundarios endógenos (Franconi et al.,

2010; Shih & Doran, 2009). Adicionalmente, la producción en cultivos de células vegetales

permite un mayor control del ambiente, ofreciendo rendimientos reproducibles y mayor

consistencia en la homogeneidad y calidad el producto (Doran, 2013; Huang & McDonald,

2011; Xu et al., 2011). La producción en biorreactores permite, además, la optimización de

las condiciones del cultivo, del modo de operación, el uso de promotores inducibles para

separar las fases de crecimiento de la biomasa y de producción de la proteína (Huang &

McDonald, 2011; Wang & Ma, 2012). Todo lo anterior contribuye a que, mediante la

producción in vitro, sea más sencillo cumplir las normas de buenas prácticas de

manufactura que regulan la producción del biofármacos. Es importante considerar que un

sistema de producción no es necesariamente el mejor en todos los casos; se requiere el

análisis particular de cada proteína teniendo en cuenta el costo de producción, el volumen

del mercado, la eficacia, la seguridad, la estabilidad del producto y si la proteína

recombinante tiene propiedades bioquímicas y farmacológicas diferentes a la proteína

nativa (Doran, 2000). El cultivo de células vegetales en suspensión puede ser el sistema

de producción más adecuado cuando se requieren cantidades pequeñas a medianas de

una proteína especial, de alto valor comercial y con requerimientos de pureza muy

elevados, como es el caso de muchas aplicaciones terapéuticas (Doran, 2013).

Capítulo 1 9

1.3 Cultivo in vitro y producción de proteínas terapeúticas en papa

Muchas investigaciones han tenido como objeto de estudio las especies pertenecientes a

la familia Solanaceae debido a su importancia económica. En particular, los estudios

genéticos y genómicos se han enfocado principalmente en la papa y el tomate ya que, a

diferencia de otras especies modelo como Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum,

producen órganos de interés comercial (el fruto en el caso del tomate y el tubérculo en la

papa) (Rigano et al., 2013). La papa (Solanum tuberosum L.) es la especie de la familia

Solanaceae más cultivada en todo el mundo (International Solanaceae Initiative, n.d.). Esta

planta ha sido modelo para el estudio de diversos procesos biológicos como la tuberización

(Bachem et al., 1996; Jackson, 1999; Müller et al., 1992; Taylor et al., 1992), la síntesis de

almidón (Riesmeier et al., 1994; Roessne et al., 2000; Visser et al., 1991) y la respuesta a

ataques de patógenos (Kombrink et al., 1988; Leister et al., 1996).

Hace más de tres décadas se han establecido cultivos in vitro de Solanum tuberosum L.,

en la mayoría de los casos con el objetivo último de mejorar características agronómicas.

Las suspensiones celulares han sido utilizadas como un modelo para estudiar rutas

metabólicas (Romano et al., 2003; Zacharius et al., 1985), epigenética (Law & Suttle,

2005), variación somaclonal (Munir et al., 2011), expresión génica (Ambrosone et al., 2012;

El-Banna et al., 2010; Johnson, 2001), entre otros aspectos genéticos, bioquímicos y

fisiológicos relevantes (Mullins et al., 2006). Sin embargo hasta el momento no se han

establecido bioprocesos a partir de cultivos de células en suspensión de papa por lo que

se desconocen reportes de parámetros que serían fundamentales como la cinética de

crecimiento (tasa específica de crecimiento, tiempo de duplicación), sensibilidad al estrés

hidrodinámico, demanda de oxígeno, capacidad de acumular proteína extracelular, entre

otros. Además, se ha reportado que la composición adecuada del medio de cultivo para

lograr un establecimiento de callos friables y de crecimiento rápido, depende del genotipo

(Shahab-ud-din et al., 2011; Turhan, 2004). Para establecer cultivos de células en

suspensión de una nueva variedad de papa es necesario entonces encontrar la

composición del medio que favorece el crecimiento del callo y la suspensión de este

genotipo.



recombinantes

La comprensión de la genética también ha sido el objetivo de muchas investigaciones en

papa para ganar herramientas de manipulación y mejoramiento de las características

genéticas (Mullins et al., 2006). El genoma completo de la papa, que ya fue secuenciado,

tiene un tamaño relativamente pequeño (844 Mb), con alrededor de 39.000 genes que

codifican proteínas (Xu et al., 2011). Esta especie tiene además un tiempo de generación

corto, se adapta bien a las condiciones de cultivo in vitro y se han establecido numerosos

protocolos de transformación (Rigano et al., 2013). En Colombia, se han logrado manipular

genéticamente variedades de la subespecie andígena utilizando Agrobacterium

tumefaciens y obteniendo eficiencias de transformación superiores al 30% (López &

Chaparro, 2007; Torres et al., 2012). Todas estas características permiten el desarrollo

rápido y exitoso de herramientas genéticas y genómicas que contribuyen a hacer de esta

especie una plataforma vegetal promisoria para la producción de proteínas recombinantes.

La manipulación genética también ha permitido desarrollar plantas de papa productoras de

proteínas terapéuticas con actividad biológica. Tacket et al. (1998) produjeron una proteína

antigénica de E. coli en tubérculos de papa para ser administrada como vacuna oral. Los

ensayos clínicos mostraron la estimulación en la producción de inmunoglobulinas IgG e

IgA en los pacientes que ingirieron los tubérculos transformados. También se ha reportado

la expresión de vacunas orales de uso agropecuario, como es el caso del antígeno VP1

del virus de la fiebre aftosa (He et al., 2007).

La interleuquina-2 (IL-2) y la interleuquina-4 (IL-4) humanas se han producido

exitosamente en plantas de papa transgénicas (Ma et al., 2005; Park & Cheong, 2002).

Estas proteínas son citoquinas de importancia farmacológica y tienen gran potencial en el

tratamiento del cáncer, enfermedades virales y desórdenes autoinmunes por su papel en

la regulación del sistema inmunológico. El bioensayo reportado por Park & Cheong (2002)

reveló que la proteína humana expresada en los tubérculos estimuló la proliferación de

células dependientes de IL-2 (CTLL-2). En el estudio de Ma et al. (2005) también se reportó

proliferación de células T en los ensayos in vitro, mostrando que la proteína recombinante

producida en papa conservó su actividad biológica.

Capítulo 1 11

Otras proteínas terapéuticas expresadas en plantas de papa son la estafiloquinasa

(Gerszberg et al., 2012), que es un activador plasminógeno de origen bacteriano utilizado

en terapias trombolíticas, y el antígeno superficial del virus de la hepatitis B (Rukavtsova

et al., 2015).

1.4 Antecedentes de Solanum tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa Suprema

Los sistemas vegetales en muchos casos son la mejor alternativa para la producción a

gran escala de proteínas recombinantes; sin embargo, se requieren largos períodos de

tiempo (entre meses y años) para el desarrollo y la optimización de la técnica de

transformación, la selección de un evento independiente de transformación y la

regeneración de plantas (Huang & McDonald, 2009; Twyman et al., 2003). Por esta razón,

para este estudio fue importante explorar el potencial como plataforma de producción de

proteínas recombinantes de una variedad de papa en la cual se han obtenido previamente

resultados de transformación genética y regeneración in vitro de plantas.

Un equipo de investigadores de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá

desarrolló tres nuevas variedades de papa de la subespecie andígena, entre las que se

destaca la variedad Pastusa Suprema obtenida mediante técnicas convencionales de

mejoramiento genético, por el cruce de un clon interespecífico (Solanum stoloniferum

230490 × Solanum phureja var. Yema de huevo) con Solanum tuberosum subsp. andígena

var. Parda pastusa (López & Chaparro, 2007).

En general hay muy pocos reportes de transformación genética en cultivares

suramericanos de la subespecie andígena, probablemente debido a la baja eficiencia de

regeneración de brotes en estos genotipos (Trujillo et al., 2001). Sin embargo, ya se ha

logrado introducir y expresar genes foráneos en la variedad androestéril Pastusa Suprema,

alcanzando incluso eficiencias de transformación superiores al 30% (López & Chaparro,

2007; Torres et al., 2012). López & Chaparro (2007) lograron la transformación y expresión

del gen reportero de la β-glucoronidasa, mientras que Torres et al. (2012) lo hicieron con

el gen cry1Ac de Bacillus thuringiensis, obteniendo líneas potencialmente resistentes a

Tecia solanivora.



recombinantes

En el reporte de Torres et al. (2012) se utilizó el vector p1AcPRD con un promotor 2X

CaMV35S (Figura 1). Lograron obtener un 44% de regeneración de brotes transfectados

gracias la modificación del tiempo y medio de infección en el protocolo reportado

previamente por Trujillo et al. (2001) para variedades de la subespecie andígena. La

adición de acetosiringona que es un activador transcripcional de los genes vir (Stachel et

al., 1986) en el medio de infección fue probablemente uno de los factores más importantes.

La eficiencia de transformación obtenida fue de 22 y 37%. El porcentaje de la proteína

Cry1Ac estuvo entre 2,5 y 6,4% del total de proteína soluble, que corresponde a niveles

de expresión entre 88 y 639 ng/mg de tejido fresco.

Figura 1-1. Mapa linear del cassette con los genes nptII y cry1Ac. RB, borde derecho de

la region T-DNA; LB, borde izquierdo de la región T-DNA; CaMV35S-2X, promotor del virus

mosaico del coliflor 2X; P nos, promotor de la nopalin sintetasa; T nos, terminador de la

nopalin sintetasa; nptII, gen de la neomicin fosfotransferasa; Cry1Ac, gen cry1Ac B.

thuringiensis (Tomado de Torres et al., 2012).

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Establecer cultivos de células en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena var.

Pastusa Suprema y explorar su potencial como plataforma de producción de proteínas

recombinantes utilizando Bt-Cry1Ac como proteína modelo.

2.2 Objetivos específicos

Evaluar el fotoperiodo, tipo de explante y composición hormonal que favorecen la

inducción de callos de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema

en medio basal MS.

Evaluar la composición hormonal que favorece el crecimiento de suspensiones

celulares de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema en medio

basal MS.

Caracterizar la cinética de crecimiento y consumo de sustrato del cultivo de células

en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema en

medio basal MS.

Establecer cultivos de células en suspensión a partir de plantas de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema transformadas con el gen

cry1Ac de Bacillus thuringiensis y evaluar si hay producción de la proteína

recombinante.

3. Metodología

3.1 Material vegetal

El material vegetal de partida fueron plantas libres de virus de Solanum tuberosum subsp.

andígena var. Pastusa Suprema proporcionadas por la Corporación para Investigaciones

Biológicas – CIB. La propagación in vitro se realizó en medio MS (Murashige & Skoog,

1962) sólido (agar 7 g/l), suplementado con 30 g/l de sacarosa y pH ajustado a 5.7 antes

de la esterilización en autoclave (121ºC, 15 psi, 15 min.). Los cultivos se incubaron a 20°C

y fotoperiodo 16 horas luz/ 8 horas oscuridad (Torres et al., 2012).

3.2 Inducción de callos

Se realizaron experimentos exploratorios para evaluar la condición de fotoperiodo y el tipo

de explante que favorecen la formación de callo friable. Se tomaron cortes de tallo como

explantes y se sembraron en dos frascos con medio de igual composición hormonal; en

total 25 parejas de cultivos correspondientes a los tratamientos hormonales descritos más

adelante. De cada pareja un cultivo se expuso al fotoperiodo 16 horas luz/8 horas

oscuridad y el otro se mantuvo en oscuridad permanente durante dos semanas.

Transcurrido este tiempo se evaluó cualitativamente el efecto de estas dos condiciones

lumínicas sobre la respuesta de los explantes al cultivo in vitro, en un análisis de muestras

pareadas de cada cultivo incubado en fotoperiodo frente a su contraparte en oscuridad.

Los cortes de tallo fueron tomados como explante para todos los experimentos por ser el

tejido de mayor abundancia y más rápido crecimiento en las plantas de la variedad de

interés cultivadas in vitro, en comparación con las hojas y los tubérculos que también han

sido reportados como explantes en otras variedades de S. tuberosum (Naik & Widholm,

1993; Zacharius et al., 1985). Se comparó la respuesta a la inducción de callos de nudos

y entrenudos, marcando una división en cada frasco de cultivo correspondiente a los



recombinantes

tratamientos de composición hormonal y sembrando de un lado nudos y del otro,

entrenudos. Al igual que en el análisis del efecto del fotoperiodo, el análisis de muestras

pareadas hizo posible separar el efecto de la composición hormonal del medio y el tipo de

tejido. La respuesta fue evaluada cualitativamente en términos de organogénesis y

formación de callo friable.

Una vez encontradas el fotoperiodo y tipo de explante que favorecen la inducción de callos

se evaluó el efecto de la composición hormonal sobre la formación de callos friables. Se

sembraron cortes de entrenudos de 2 a 5 mm de longitud en medio MS suplementado con

30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de ácido ascórbico y distintas composiciones hormonales de

una auxina y/o una citoquinina. Se determinó el efecto de la composición hormonal del

medio de cultivo sobre la inducción de callos friables en un total de 25 tratamientos, cada

uno con una combinación de una auxina y una citoquinina, en un diseño de bloques

completos al azar con dos repeticiones y cada unidad experimental de 10 explantes. Las

fitohormonas empleadas fueron ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido α-

naftalenacético (ANA), 6-bencil aminopurina (BAP) y 6-furfurilaminopurina (quinetina), en

concentraciones de 0; 1,5 y 3,0 mg/l cada una. El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes

de la esterilización en autoclave (121ºC, 15 psi, 15 min.). La inducción y cultivo de callos

se hizo a 20°C en oscuridad.

Tras dos semanas de cultivo, se determinó el porcentaje de formación de callos friables,

así:

𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑜 𝑓𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑞𝑢𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑟𝑜𝑛 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑜 𝑓𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠×

100 (1)

Los explantes fueron transferidos cada dos semanas a medio fresco. En el tercer

subcultivo, transcurridas seis semanas desde la inducción, se rasparon los callos para

separarlos del explante inicial. Los callos friables se transfirieron cada dos semanas a

medio fresco.

3. Metodología 17

En el análisis de resultados se realizó un análisis de varianza, previa verificación de los

supuestos de normalidad según la prueba de Shapiro-Wilk, y comparación de medias con

la prueba de Duncan para determinar si existía diferencia estadísticamente significativa

entre los tratamientos. En todos los casos se utilizó un nivel de significancia α= 0,05.

3.3 Establecimiento de suspensiones celulares

Los cultivos en suspensión se establecieron transfiriendo el callo friable a un matraz de

150 ml con 50 ml de medio MS líquido suplementado con 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de

ácido ascórbico y pH ajustado a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121ºC, 15 psi,

15 min.). Las suspensiones celulares fueron tapadas con papel aluminio, selladas con

vinipel y mantenidas en agitador rotatorio a 120 rpm, 20°C y oscuridad. Cada dos semanas

se cambió el medio gastado por medio fresco.

Se determinó el efecto de la composición hormonal sobre el crecimiento de las células en

suspensión, en un diseño completamente al azar con tres repeticiones y cuatro

tratamientos: ANA 0; 0,5; 1,5 y 3,0 mg/L. Estos tratamientos se escogieron de acuerdo con

los resultados obtenidos en la etapa de inducción de callos friables. Se utilizó un inóculo

de aproximadamente 1 g/l (peso seco), con un volumen final de 20 ml de medio de cultivo

en matraz Erlenmeyer de 100 ml de volumen útil. Luego de cuatro semanas se midió el

peso seco de la biomasa final, para determinar el tratamiento en el que hubo mayor

crecimiento.

3.4 Cinética de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato

Se determinó la curva de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato de los cultivos de

células en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema. Se

preparó el inóculo mezclando tres cultivos vigorosos y de alta viabilidad y realizando dos

lavados con medio MS fresco suplementado con 30 g/L de sacarosa y 0,5 g/L de ANA. La

concentración inicial de biomasa en cada cultivo fue aproximadamente de 2 g/L en peso

seco (5 ml de inóculo en 15 ml de medio fresco). El volumen de trabajo fue de 20 ml en

matraces Erlenmeyer de 100 ml de volumen útil. Los cultivos se mantuvieron a las mismas

condiciones descritas anteriormente. Se realizaron mediciones de concentración de

biomasa y de azúcares residuales por duplicado cada dos días durante 30 días.



recombinantes

Los parámetros cinéticos en la etapa de crecimiento exponencial se calcularon así (Doran,

1995):

𝜇𝑚á𝑥 =𝐿𝑛 (𝑋𝑓 𝑋𝑖⁄ )

(𝑡𝑓 − 𝑡𝑖)⁄ (2)

𝑡𝑑 = 𝐿𝑛 2𝜇𝑚á𝑥

⁄ (3)

𝜇𝑚á𝑥: Tasa específica de crecimiento en la fase exponencial (d-1)

𝑋𝑓: Concentración final de biomasa en la fase exponencial (g/l)

𝑋𝑖: Concentración inicial de biomasa en la fase de crecimiento exponencial (g/l)

𝑡𝑓: Tiempo final de biomasa en la fase exponencial (d)

𝑡𝑖: Tiempo inicial de biomasa en la fase de crecimiento exponencial (d)

𝑡𝑑: Tiempo de duplicación en la fase de crecimiento exponencial (d)

3.5 Establecimiento de suspensiones celulares a partir de plantas transformadas

La línea PS 40.27 de plantas de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa

Suprema transformadas con el gen Cry1Ac de Bacillus thuringiensis, fue reportada

previamente como la línea de más alta expresión de proteína recombinante (Torres et al.,

2012) por lo que se escogió como modelo de sistema transgénico para este trabajo.

Se realizó inducción de callos y establecimiento suspensiones utilizando el procedimiento

estandarizado para las plantas no transformadas (Solanum tuberosum subsp. andígena

var. Pastusa Suprema). Las plantas fueron provistas por la Unidad de Biotecnología

Vegetal de la Corporación para Investigaciones Biológicas – CIB.

3. Metodología 19

3.6 Métodos analíticos

3.6.1 Viabilidad celular

La viabilidad celular se estimó mediante el método de exclusión de colorante vital con Azul

de Evans, mezclando en volúmenes iguales la suspensión celular y una solución 0,05%

(p/v) del colorante. Las células coloreadas fueron consideradas no viables y las hialinas

viables (Bhojwani & Razdan, 1996).

3.6.2 Volumen de células sedimentadas

El volumen de células sedimentadas (VCS) se determinó transfiriendo por lo menos 20ml

de la suspensión celular a una probeta (incertidumbre ±1 ml). Luego de 20 minutos de

sedimentación, se midió el volumen de la biomasa y el volumen total. El volumen de células

sedimentadas es expresado así (Mustafa et al., 2011):

𝑉𝐶𝑆 (%) = (𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙)⁄ × 100 (4)

3.6.3 Concentración de biomasa en peso seco

Se separó la biomasa del medio extracelular utilizando filtración al vacío y papel filtro

cualitativo (gramaje 84 g/m2, tamaño de poro 12-15 µm). La concentración de biomasa en

peso seco fue determinada secando la biomasa fresca filtrada en horno a 60ºC durante 24

horas.

𝑋 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜⁄ (5)

3.6.4 Concentración de azúcares residuales

La medición de azúcares residuales se hizo por HPLC acoplado a un detector de índice de

refacción (rid-10ª) usando una columna amino, fase móvil de acetonitrilo/agua (80:20), flujo

de 2 ml/min a 30ºC, resolviendo picos de fructosa (tR = 7.013 min) y glucosa (tR = 8.037

min). El análisis de las muestras se realizó junto con estándares de fructosa y glucosa a

20 g/L cada uno.



recombinantes

3.6.5 Detección de la expresión de proteína recombinante

Se evaluó la expresión de la proteína recombinante Cry1Ac en el entrenudos de las

plantas, callos y suspensiones, por medio del ensayo DAS-ELISA según el procedimiento

descrito por Torres et al. (2012). Se utilizó el kit Bt-Cry1Ab/1Ac (PSP 06200, Agdia Inc.,

Elkhart, IN, USA), siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante con algunas

modificaciones. Las muestras fueron preparadas macerando 100 mg de material vegetal

(tejido o biomasa fresca) en 1 ml de buffer de sales fosfato con Tween-20 (PBST). Se

sirvieron 100 µl del sobrenadante resultante del macerado en el plato de ELISA, seguidos

de 100 µl del conjugado de la enzima. Se incubó en cámara húmeda durante 2 horas, tras

lo cual se realizaron lavados con buffer PBST, se sirvieron 100 µl de sustrato TMB por

pozo y después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente se determinó la

absorbancia a 660 nm utilizando un lector de microplacas (Model 680, Bio Rad

Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Visualmente se podía pudo determinar el resultado

cualitativo de la prueba mediante la aparición del color azul como indicativo de la presencia

del antígeno de Bt-Cry1Ac en la muestra. Para el ensayo se utilizó el control positivo

Cry1Ab/Cry1Ac del kit y como controles negativos, el buffer PBST y una suspensión no

transformada. Se determinó el valor de corte para reportar un resultado positivo de

expresión de proteína Bt-Cry1Ac con una significancia α= 0,05 así:

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑡𝑒 = 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 + 3 ∗ 𝐷𝐸 (6)

Media: promedio de los valores de absorbancia de los controles negativos

DE: desviación estándar de los controles negativos.

4. Resultados y discusión

4.1 Inducción de callos

La respuesta de los tejidos vegetales al cultivo in vitro obedece a mecanismos celulares

complejos que dependen de un gran número de variables. Además de la especie vegetal

y el genotipo, algunas de las más importantes son la cantidad y relación auxina/citoquinina,

el fotoperiodo y el tipo de explante (Bhojwani & Razdan, 1996). Estas variables fueron

evaluadas para estandarizar un protocolo eficiente de obtención de callos friables a partir

de plantas de S. tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa Suprema.

La evaluación del efecto de dos condiciones de exposición a la luz, oscuridad y fotoperiodo

16 horas luz/8 horas oscuridad, mostró que en todos los tratamientos de diferente

composición hormonal donde hubo formación de callos, el crecimiento de los explantes

incubados en oscuridad fue mayor que aquellos incubados en fotoperiodo 16 h luz (Figura

4-1).

Figura 4-1. Inducción de callos de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa

Suprema a partir de cortes de tallo en condiciones de oscuridad (izquierda) y fotoperiodo

16 h luz (derecha). Se observó consistentemente un mayor crecimiento en los cultivos

mantenidos en condiciones de oscuridad permanente.



recombinantes

Esta respuesta diferenciada ocurre debido a que la luz regula casi todos los procesos

fisiológicos y bioquímicos en las plantas (Kreslavski et al., 2009); la longitud de onda, la

intensidad y los ciclos de luz/oscuridad inciden en las diversas respuestas (Neff et al.,

2000), que además varía entre genotipos y tejidos de una misma planta. En cultivos de S.

tuberosum L. se ha reportado ampliamente el efecto del tipo de luz y el fotoperiodo en el

crecimiento, morfogénesis y tuberización durante el cultivo in vitro de plantas (Seabrook,

2005). El cultivo de callos friables se ha establecido en condiciones de oscuridad para

algunas variedades (Hawkins & Lips, 1997; Naik & Widholm, 1993) y en ciclos de

luz/oscuridad para otras (Lu et al., 2006; Queirós et al., 2007). Sin embargo, en la variedad

Pastusa Suprema no se encuentran reportes previos de la evaluación del efecto de

diferentes condiciones de exposición a la luz sobre la formación de callos friables. Dados

los resultados obtenidos se decidió fijar la condición de oscuridad en el protocolo de

inducción de callos.

En la evaluación del efecto del tipo de explante se encontró que en general los nudos

presentaron mayor organogénesis en comparación con los entrenudos (Figura 4-2), por lo

cual en adelante se utilizaron los entrenudos como tejido de explante para la inducción de

callos. El estado fisiológico del tejido meristemático de los nudos le confiere una mayor

capacidad de respuesta regenerativa ante los estímulos hormonales porque este en la

planta, tiene precisamente la función de formar nuevos tejidos (Taiz & Zeiger, 2002). Al

igual que en otras especies, se ha evidenciado que los requerimientos hormonales para el

cultivo in vitro de S. tuberosum L. son dependientes del tipo de explante (Anjum & Ali,

2004). Se ha reportado la obtención de callos friables a partir de diferentes tejidos como

hojas (Gottstein & Schliemann, 1994; Naik & Widholm, 1993; Queirós et al., 2007; Torabi

et al., 2008), tubérculos (Hawkins & Lips, 1997; Zacharius et al., 1985) y tallos (Lu et al.,

2006; Vargas et al., 2005; Vargas et al., 2008). Hay un reporte de inducción de callos en

la variedad Pastusa Suprema en el que se utilizan entrenudos como explantes (Jiménez

et al., 2009); sin embargo no se conocen reportes previos de la evaluación del tipo de

explante en la callogénesis de esta variedad.

4. Resultados y discusión 23

Figura 4-2. Efecto del tipo de explante (nudo/entrenudo) sobre la respuesta a los

tratamientos de inducción in vitro de callos. En MS suplementado con diferentes

composiciones hormonales se observó siempre mayor tendencia hacia la organogénesis

(formación de tallos y raíces adventicias) en los nudos (N) en comparación con los

entrenudos (EN).

Fijando la condición de oscuridad permanente y los entrenudos como explante en el

protocolo de inducción de callos, se procedió a evaluar la suplementación del medio. Se

encontró que la respuesta varió significativamente según la composición hormonal (Tabla

4-1); en general la formación de callos friables predominó en los tratamientos de medio

suplementado únicamente con una auxina. Luego de dos semanas de cultivo en los

tratamientos ANA 1,5 mg/l y 3 mg/l se logró obtener abundante formación de callo friable

en el 90 y 95% de los explantes cultivados, respectivamente (Tabla 4-1). No hubo

diferencia significativa en el porcentaje de inducción obtenido en estos dos tratamientos

(α=0,05), por lo que se escogió como medio de inducción el medio MS suplementado con

la menor concentración de ANA, es decir 1,5 mg/l. En los tratamientos de medio

suplementado únicamente con 2,4-D (1,5 y 3,0 mg/L) también se encontró formación de

callos fiables pero con un crecimiento más lento, ya que sólo fue evidente luego de cuatro

semanas de cultivo (datos no mostrados). La presencia de la auxina ANA se ha reportado

previamente que favorece la formación de callos a partir de entrenudos en la variedad

Pastusa Suprema (Jiménez et al., 2009).

N

EN

N

EN

(a) (b)



recombinantes

Tabla 4-1. Porcentaje de formación de callos friables a partir de entrenudos de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, en medio MS suplementado con

diferentes composiciones hormonales.

* Los porcentajes de inducción con la misma letra no tienen diferencia significativa con

α=0,05.

Auxina Concentración

auxina

(mg/L)

Citoquinina Concentración

citoquinina

(mg/L)

Porcentaje de

formación de callos*

(%)

Ninguna -- Ninguna -- 0d

BAP 1,5 0d

3,0 0d

Quinetina 1,5 0d

3,0 0d

ANA 1,5 Ninguna -- 90a

BAP 1,5 0d

3,0 0d

Quinetina 1,5 0d

3,0 0d

3 Ninguna -- 95a

BAP 1,5 0d

3,0 0d

Quinetina 1,5 0d

3,0 0d

2,4-D 1,5 Ninguna -- 0d

BAP 1,5 0d

3,0 0d

Quinetina 1,5 5d

3,0 0d

3 Ninguna -- 45b

BAP 1,5 0d

3,0 25c

Quinetina 1,5 0d

3,0 0d


En la Tabla 4-2 se compara la composición hormonal del medio de cultivo para la inducción

de callos de diferentes variedades de Solanum tuberosum L. Debido al efecto del genotipo

sobre la respuesta al cultivo in vitro, la composición hormonal para la formación de callos

es dependiente de la variedad vegetal. Entre las variedades de S. tuberosum comparadas

en la Tabla 4-2, se evidencia que la variedad Pastusa Suprema requiere de forma neta

menor cantidad de hormonas para el crecimiento de callos, lo cual en un bioproceso

significa una reducción del costo total de producción. Más aún, queda abierta la posibilidad

de evaluar en experimentos posteriores si se forman callos friables de crecimiento rápido

y vigoroso a concentraciones inferiores a 1,5 mg/l de ANA, de tal manera que se logre

disminuir en mayor medida los requerimientos de suplementación del medio de cultivo.

Tabla 4-2. Comparación de la composición hormonal del medio de cultivo en diferentes

reportes de inducción de callos de Solanum tuberosum L., según la variedad y tipo de

explante.

Referencia Variedad Explante Auxina Citoquinina

(Zacharius et al.,

1985)

Kennebec y

Merrimack

Tubérculo

2,4-D 2 mg/L

ANA 6 mg/L

Quinetina

0,21 mg/L

(Naik &

Widholm, 1993)

Kennebec,

Norchip, Red

Pontiac, Russet

Burbank, Russet

Norkotah,

Superior

Raquis de

hoja

ANA 5 mg/L --

(Lu et al., 2006) Chieftain Tallo 2,4-D 0,5mg/L BAP 2 mg/L

(Torabi et al.,

2008)

White Desiree Tallo 2,4-D 2 mg/L

ANA 2 mg/L

Quinetina

2 mg/L

Granger (2016)

(Este trabajo)

Pastusa Suprema Tallo

(entrenudos)

ANA 1,5 mg/L --



recombinantes

Las condiciones evaluadas de tipo de explante, fotoperiodo y composición hormonal del

medio permitieron llegar a un protocolo eficiente de obtención de callos friables. Las

plantas propagadas a partir de esquejes rápidamente crecen hasta alcanzar alrededor de

8 cm en sólo cuatro semanas, formando tallos jóvenes con entrenudos largos (Figura 4-

3a). De estas plantas se logran sacar entre uno y dos cultivos para iniciar callos,

sembrando 10 explantes por frasco (Figura 4-3b). En el medio MS suplementado con 1,5

mg/l de ANA y en oscuridad, luego de dos semanas se comienza a evidenciar la formación

de callo friable y entre la semana tres y cuatro es lo suficientemente abundante para hacer

el raspado (Figura 4-3c). Se evidenció que el raspado es un paso crítico en estos cultivos

porque a partir de ahí los callos se oxidan y, aunque continúan creciendo, esto puede

reducir la viabilidad de las células y disminuir la eficiencia en la obtención de suspensiones.

Este fenómeno se podría controlar utilizando aditivos como el carbón activado (Bhojwani

& Razdan, 1996) o ensayando un protocolo alternativo para establecer suspensiones en

el que se evite el paso de raspado de los callos.

Figura 4-3. (a) Plantas de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema

cultivadas in vitro. (b) Entrenudos utilizados como explantes para la inducción de callos en

medio Murashige & Skoog (MS). (c) Callos friables obtenidos luego de tres semanas de

cultivo en medio MS suplementado con ácido naftalenacético (ANA) 1,5 mg/l.

(b)

(c)

(a)


4.2 Establecimiento de suspensiones celulares

A partir de los callos friables se establecieron suspensiones celulares en medio MS líquido.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la inducción de callos, se evaluó el efecto

de la concentración de ANA sobre el crecimiento de los cultivos de células en suspensión.

La mayor concentración de biomasa final fue 6,71 ± 1,65 g/l y se obtuvo en el medio

suplementado con ANA 0,5 mg/l. Esto quiere decir que en el medio con la menor

concentración evaluada se logró aumentar más de seis veces la concentración inicial de

biomasa tras cuatro semanas de cultivo. En los tratamientos se observó una tendencia a

aumentar el crecimiento de la biomasa a medida que la concentración de hormona

disminuye (Figura 4-4); por esta razón se recomienda evaluar el comportamiento de los

cultivos con concentraciones de ANA menores a 0,5 mg/l, ya que de obtenerse una mayor

producción de biomasa se favorece aún más el costo total del bioproceso.

Figura 4-4. Efecto de la concentración de ácido α-naftalenacético (ANA) en el medio de

cultivo sobre el crecimiento de las suspensiones celulares de Solanum tuberosum subsp.

andígena var. Pastusa Suprema.



recombinantes

El protocolo de inducción de callos en medio MS suplementado con ANA 1,5 mg/l y

establecimiento de suspensiones en medio MS suplementado con ANA 0,5 mg/l se utilizó

durante 10 meses para hacer un seguimiento a los cultivos obtenidos, en cuanto a la

viabilidad, morfología y concentración de biomasa. Se encontró que la morfología de las

células en suspensión en los primeros dos meses del establecimiento fue altamente

heterogénea, presentándose agregados macroscópicos, células amorfas de gran tamaño,

células cilíndricas individuales y formando cadenas, y algunas células esféricas formando

microagregados (Figura 4-5a); también se presentaron con frecuencia cadenas de 4 a 8

células cilíndricas en forma de espiral (Figura 4-5b).

Figura 4-5. Morfología de los cultivos de células en suspensión de Solanum tuberosum

subsp. andígena variedad Pastusa Suprema en los primeros meses del establecimiento,

aumento total 200X. (a) Se observan microagregados de células esféricas de distintos

tamaños, células cilíndricas y amorfas individuales, y (b) cadenas de células cilíndricas que

con frecuencia se encontraron formando espirales.

Esta variedad de morfologías podría explicarse en gran medida porque el explante a partir

del cual se obtienen los cultivos tiene distintos tipos de tejidos (dérmico, fundamental y

vascular) (Taiz & Zeiger, 2002) cada uno con un papel estructural y funcional en la planta,

y que al introducirse al cultivo in vitro presentan comportamientos metabólicos y

(a) (b)


morfológicos diferentes (Rodríguez & Galindo, 2003). La morfología de las células es

además una función de la especie vegetal, el método de preparación del inóculo, la

composición del medio, las condiciones del cultivo, la etapa de crecimiento y el tipo de

biorreactor; su caracterización es importante porque tiene efectos sobre los procesos de

transferencia de masa, energía y cantidad de movimiento (Huang & McDonald, 2009;

Kieran et al., 1997).

Figura 4-6. Cultivo de células en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena

variedad Pastusa Suprema tras 10 meses del establecimiento, aumento total 100X. Tinción

con azul de Evans, las células no viables están coloreadas mientras que las viables

permanecen hialinas.

En los cultivos en suspensión de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa

Suprema de más de diez meses aún se observó mucha heterogeneidad en la morfología

de las células, aunque con cierta predominancia de los microagregados tanto de células

cilíndricas como de células esféricas (Figura 4-6). Estos microagregados son comunes en

los cultivos de células vegetales en suspensión y se han reportado previamente en

diferentes especies vegetales como Solanum chrysotrichum (Trejo et al., 2001), Thevetia

peruviana (Arias, 2013), Oryza sativa, Nicotiana benthamiana y Trichosanthes kirilowii

(McDonald et al., 2001).



recombinantes

Mediante el protocolo estandarizado para el establecimiento de cultivos de células en

suspensión, y luego de alrededor de cuatro meses de adaptación a las condiciones del

medio líquido, se logró obtener suspensiones celulares de muy alta densidad celular y

crecimiento vigoroso (Figura 4-7).

Figura 4-7. Suspensiones de Solanum tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa

Suprema de alta densidad celular obtenidas mediante inducción de callos en medio MS +

1,5 mg/l de ANA y establecimiento de suspensiones en medio MS + 0,5 mg/l de ANA. (a)

Cultivo en matraz de 100 ml con volumen de células sedimentadas del 100%. (b)

Suspensiones en matraces de 250 ml con alta cantidad de biomasa.

(a)

(b)


Los cultivos alcanzaron concentraciones de alrededor de 12 g/l de biomasa (peso seco)

con un volumen de células sedimentadas del 95 al 100%. Dada la alta viscosidad

observada en el medio de cultivo de las suspensiones con alta densidad celular, se

presume además que las células podrían estar produciendo polisacáridos extracelulares,

que no sólo mantendrían las interacciones intercelulares favoreciendo la formación de

agregados, sino que también aumentan la viscosidad del medio, disminuyendo el estrés

hidrodinámico (Kieran et al., 1997).

Durante el establecimiento de suspensiones se observó la eventual producción de

compuestos de coloración roja, que se presumen son de naturaleza fenólica, tanto en el

medio extracelular como en la biomasa de algunos de los cultivos (Figura 4-8). No fue

posible encontrar las causas que desencadenan la producción de estos compuestos e

incluso luego de la división de una suspensión celular en dos, bajo las mismas condiciones,

ocurrió que una de ellas se tornaba roja y la otra no. Este proceso ya ha sido reportado

previamente en cultivos de Taxus igualmente como un fenómeno aleatorio (Wickremesinhe

& Arteca, 1994). Una vez se producía este fenómeno no fue posible recuperar las

suspensiones mediante lavados y remplazo del medio, y como se observó que siempre se

frenaba el crecimiento celular se optó por descartar los cultivos una vez aparecía esta

coloración.

Figura 4-8. Suspensiones celulares que produjeron compuestos de coloración roja que se

observó (a) en el medio extracelular y (b) en la biomasa.

(a) (b)



recombinantes

4.3 Cinética de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato

En la evaluación de la cinética de crecimiento de la biomasa se encontró una fase de

aceleración del crecimiento hasta alcanzar la fase exponencial, probablemente por

adaptación a las condiciones de cultivo durante los primeros cuatro días (Figura 4-9). Esta

primera fase se relaciona con el aumento de fructosa y glucosa en cantidades casi

equivalentes que se evidencian en la cinética de consumo de sustrato (Figura 4-10), lo que

bien podría explicarse como un proceso de hidrólisis de sacarosa mediado por la secreción

de enzimas extracelulares. Esta etapa finaliza en el día ocho cuando la glucosa y la

fructosa alcanzan su concentración máxima. A partir del día seis se evidencia el

crecimiento exponencial de la biomasa hasta el día 24, con una tasa específica de

crecimiento máxima (µmáx) de 0,085 d-1, correspondiente a un tiempo de duplicación (td) de

8,15 días y una concentración máxima de biomasa (Xmáx) de 12,11 g/l. Así mismo, en la

curva de consumo de sustrato se evidencia un consumo neto de los azúcares desde el día

ocho al día 30 de cultivo, más rápidamente de la glucosa en comparación con la fructosa.

El día 22 el cultivo entra en una fase estacionaria corta de cuatro días y finalmente en fase

de muerte entre el día 22 y 30, lo cual se relaciona con el agotamiento de la fuente de

carbono y energía que el día 24 llega a cero.


Figura 4-9. Curva de crecimiento de biomasa del cultivo de células en suspensión de

Solanum tuberosum L. subsp. andígena var. Pastusa Suprema cultivadas in vitro. La

concentración de biomasa se obtuvo por medición de peso seco.

0 5 10 15 20 25 30

2

4

6

8

10

12

14

Concentr

ació

n d

e b

iom

asa (

g/l)

Tiempo (días)



recombinantes

Figura 4-10. Curva de consumo de azúcares del cultivo de células en suspensión de

Solanum tuberosum L. subsp. andígena var. Pastusa Suprema cultivadas in vitro. En la

gráfica se observan las concentraciones residuales de sacarosa, glucosa y fructosa

medidas en el medio extracelular utilizando HPLC.

En los bioprocesos a partir de cultivos de células vegetales en suspensión típicamente se

encuentran tasas de duplicación entre 20 y 100 h (Kieran et al., 1997; Xu et al., 2011). Sin

embargo, la tasa específica de crecimiento es una variable que depende de las condiciones

de cultivo y que se puede lograr aumentar mediante diferentes variables susceptibles de

ser optimizadas como la composición del medio de cultivo, la estrategia de cultivo (lote,

lote alimentado, continuo), el diseño del biorreactor, las condiciones de agitación y

aireación, etc. (Doran, 2000; Huang & McDonald, 2011; Xu et al., 2011).

0 5 10 15 20 25 30

0

5

10

15

20

25

Concentr

ació

n d

e a

zúcar

(g/l)

Tiempo (días)

Fructosa

Glucosa


Tabla 4-3. Comparación de la tasa específica máxima de crecimiento (µmáx) y el tiempo de

duplicación en la fase exponencial (td) del cultivo de células en suspensión de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, con otros reportes de cultivo de células

vegetales.

Referencia Especie vegetal Escala

(L)

Tipo de

biorreactor

µmáx

(d-1)

td

(d)

(Ullisch et al.,

2012)

Nicotiana

tabacum L.

cv. BY-2

0,25 Matraz 0,864 0,802

(Hanchinal et al.,

2008)

Daucus carota 0,05

(volumen

de trabajo)

Matraz 0,259 2,676

(Arias, 2013) Thevetia

peruviana

0,25 Matraz 0,215 3,220

(Naill & Roberts,

2005)

Taxus cuspidata 0,25 Matraz 0,150 4,620

(Li & Tao, 2009) Taxus cuspidata 0,5 Matraz 0,123 5,635

(Zhang et al.,

2013)

Taxus media

línea celular 58

15 Tanque

agitado

0,092 7,528

Granger (2016)

(Este trabajo)

S. tuberosum

subsp.

andígena

var. Pastusa

Suprema

0,1 Matraz 0,085 8,155

(Son et al., 2000) Taxus cuspidata 20 Biorreactor de

burbuja tipo

balón

0,058 12,000

En la Tabla 4-3 se puede observar que la tasa específica de crecimiento obtenida en los

cultivos de células en suspensión es similar a la de otros reportes de cultivo de células

vegetales, incluso algunos de ellos siendo el resultado de procesos de optimización.

Considerando que la única variable que se ha evaluado en los cultivos es la concentración

de auxina, se puede decir que el proceso de establecimiento de suspensiones celulares

fue exitoso ya que los cultivos tienen crecimiento vigoroso y, más aún, se puede lograr

disminuir el tiempo de duplicación a medida que se exploren las condiciones óptimas de

crecimiento de esta variedad vegetal.



recombinantes

Una muestra del alcance que se puede tener mediante procesos de optimización se puede

ver en el cultivo de células vegetales del género Taxus, que es muy reconocido como

bioproceso para la producción de paclitaxel y por lo tanto un punto de referencia en las

plataformas vegetales de producción. Se han reportado, por ejemplo, tasas específicas de

crecimiento entre 0,10 y 0,13 d-1 en el cultivo de suspensiones de Taxus chinensis a escala

de matraz agitado, que variaron dependiendo de la concentración inicial de sustrato y el

tipo de alimentación (lote y lote alimentado) (Wang et al., 1999). El mismo grupo de

investigación logró duplicar la tasa específica de crecimiento al cambiar el biorreactor de

un tanque agitado a una columna de burbujeo (Pan et al, 2000). Otra aproximación ha sido

elaborar modelos del crecimiento de la biomasa para utilizarlos en la optimización del

bioproceso. Se ha reportado el modelo no estructurado del crecimiento de Taxus media y

la optimización del bioproceso de producción de taxol, obteniendo como parámetros del

modelo Xmáx 9,7233 g/l y µmáx 0,1779 d-1 (Zhang et al., 2013).

Se considera que S. tuberosum subsp. andígena variedad Pastusa Suprema es una

plataforma promisoria al haber obtenido una respuesta robusta al cultivo in vitro, bajos

requerimientos hormonales para la inducción de callos y crecimiento de suspensiones y

parámetros cinéticos de crecimiento comparables a los que se han obtenido en otras

plataformas vegetales después de procesos de optimización. Más aún, múltiples enfoques

pueden ser utilizados en adelante para aumentar el crecimiento de la productividad de las

proteínas recombinantes de interés, desde la manipulación de la composición del medio y

de las condiciones del ambiente de cultivo (agitación, aireación, etc.), hasta el diseño y

modo de operación del biorreactor en el escalado. Sólo manipulando la concentración de

componentes del medio basal (nitrógeno, fósforo y micronutrientes) y la fuente de carbono

(sacarosa, glucosa) se puede incrementar entre 3 y 20 veces la productividad (Doran,

2000; Holland et al., 2010; Xu et al., 2011).


4.4 Establecimiento de suspensiones celulares a partir de plantas transformadas y evaluación de la producción de la proteína Bt-Cry1Ac

Los entrenudos de las plantas de la línea transformadas PS 40.27 dieron positivo para la

expresión del gen Cry1Ac (Figura 4-11), al igual que los callos obtenidos a partir de estos

explantes (datos no mostrados). Este resultado permitió descartar pérdida de la expresión

del gen recombinante por diferentes causas como eventos de variación somaclonal,

pérdida del gen y silenciamiento postranscripcional que han sido reportados previamente

en plantas cultivadas in vitro (Huang & McDonald, 2011; Shih & Doran, 2009; Wang & Ma,

2012) o cambios de ploidía celular durante la formación de callos, que ya ha sido

previamente reportado en papa (Vargas et al., 2008).

Figura 4-11. Ensayo DAS-ELISA de entrenudos de plantas de la línea PS 40.27 de

Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema para la detección de proteína

recombinante Cry1Ac. Los pozos 1 y 2 corresponden a los controles negativos de buffer

PBST, 3 y 4 al control positivo de proteína Cry1Ab/1Ac del kit DAS-ELISA, 5 y 6 a plantas

no transformadas y 7 y 8 a plantas transformadas. Se evidencia cualitativamente el

resultado positivo para la expresión (coloración azul).

La inestabilidad genética de las células desdiferenciadas es un factor potencialmente

limitante en el desarrollo de cultivos para producción de proteínas recombinantes (Reiss,

2003). Se han reportado reducciones significativas en el rendimiento de producto

atribuidas a inestabilidad genética, pérdida del transgen, cambios en la estructura

cromosómica, variación de la tasa de crecimiento y otros cambios genéticos no deseados

en cultivos de células vegetales mantenidas en subcultivo constante (Doran, 2013; Gao et

al., 1991; van der Maas et al., 1994). La expresión de la proteína recombinante en estas

plantas que tienen más de cuatro años de haber sido establecidas in vitro, siendo repicadas



recombinantes

cada cuatro a seis meses, refleja tanto la estabilidad genética intrínseca del genotipo como

la del método de transformación mediada por Agrobacterium tumefasciens.

El protocolo estandarizado en las plantas silvestres para establecer cultivos de células en

suspensión se utilizó en la línea PS 40.27 de plantas transformadas para obtener cultivos

en medio líquido. Al igual que en los cultivos de callos y suspensiones obtenidos a partir

de las plantas silvestres, se obtuvo oxidación de las células luego del raspado de los callos

y la consecuente obtención de cultivos con pardeamiento cuando éstos se transfirieron a

medio líquido. Se esperaba entonces que el crecimiento vigoroso de las suspensiones se

observaría luego de alrededor de 10 meses desde el establecimiento, que fue lo que tomó

a los cultivos no transformados adaptarse a las condiciones de medio líquido y aumentar

progresivamente la población de células viables. Sin embargo, se decidió evaluar la

expresión de la proteína recombinante en etapas muy tempranas. Mediante el ensayo de

DAS-ELISA se detectó la expresión de la proteína recombinante Bt-Cry1Ac en todas las

suspensiones evaluadas (Figura 4-12).

Figura 4-12. Ensayo DAS-ELISA del cultivo de células en suspensión de la línea PS 40.27

de Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema para la detección de

proteína recombinante Cry1Ac. Las fila 1 y 2 son duplicados de las muestras de ocho

suspensiones; las filas 3 y 4 son duplicados, donde los pozos A y B corresponden a los

controles negativos y del C al G son concentraciones crecientes del control positivo. Se

evidencia cualitativamente el resultado positivo para la expresión (coloración azul).

1

2

3

4


La Tabla 4-4 muestra los resultados de la medición de absorbancia que corroboran los

resultados positivos observados cualitativamente en el ensayo DAS-ELISA. Aunque este

kit comercial no permite la cuantificación de la proteína recombinante, se puede evidenciar

que en cuatro de las ocho suspensiones evaluadas la cantidad de proteína recombinante

es mayor a la del control positivo de Cry1Ab/1Ac.

Tabla 4-4. Resultados del ensayo DAS-ELISA para la detección de la expresión de la

proteína recombinante Cry1Ac en la biomasa de los cultivos de células en suspensión

establecidos a partir de plantas de la línea PS 40.27 de Solanum tuberosum L. subsp.

andígena variedad Pastusa Suprema

*Los cultivos con resultado positivo tuvieron una absorbancia superior al valor de corte

(OD660nm>0,452).

Esta plataforma recombinante tiene el promotor constitutivo derivado del virus Mosaico

del Coliflor (2X CaMV 35S), lo cual implica que la expresión de la proteína está ligada al

crecimiento. La expresión en un sistema constitutivo es una carga metabólica para la

célula, por lo que puede reducir la tasa específica de crecimiento (Xu et al., 2010) y hacer

más lento el proceso de adaptación a las condiciones de medio líquido. Además, la

acumulación intracelular de la proteína produce en general un ambiente tóxico para las

células, por lo que se recomienda considerar como una alternativa la secreción del

producto recombinante (Huang & McDonald, 2009).

Muestra OD660nm

(media ± DE)

Resultado*

Control negativo (no transformadas) 0,414 ± 0,013 Negativo

Control positivo 1,256 ± 0,025 --

PS 40.27-1 1,385 ± 0,033 Positivo

PS 40.27-2 1,419 ± 0,052 Positivo

PS 40.27-3 1,002 ± 0,018 Positivo

PS 40.28-4 0,508 ± 0,027 Positivo

PS 40.27-5 1,388 ± 0,041 Positivo

PS 40.27-6 0,571 ± 0,010 Positivo

PS 40.27-7 1,316 ± 0,047 Positivo

PS 40.27-8 0,735 ± 0,128 Positivo



recombinantes

Se considera que el proceso de establecimiento de suspensiones celulares fue exitoso

porque se conservó la expresión de la proteína recombinante. Más aún, el potencial del

cultivo de células en suspensión transformadas es mucho mayor si se toma en

consideración que al momento de realizar el ensayo DAS-ELISA las suspensiones aún

estaban en etapas tempranas del establecimiento, adaptándose a las condiciones de

cultivo en medio líquido y en consecuencia con baja viabilidad celular (Figura 4-13). Una

vez estas suspensiones alcancen la vigorosidad y altas densidades de biomasa logradas

en los cultivos de células no transformadas, se esperaría superar ampliamente los

niveles de expresión.

Figura 4-13. Morfología y viabilidad del cultivo de células en suspensión de Solanum

tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema, línea PS 40.27. Tinción con el

colorante azul de Evans, las células no viables están teñidas por el colorante, mientras las

células viables permanecen hialinas. El porcentaje de viabilidad del cultivo se estimó entre

el 20 y el 30%.

Si bien los resultados obtenidos en la línea PS 40.27 de Solanum tuberosum subsp.

andígena constituyen únicamente un modelo de producción de proteínas recombinantes,

sí permiten evidenciar el potencial de esta plataforma vegetal para la producción de


proteínas terapéuticas. En esta primera fase se logró con éxito establecer un protocolo

efectivo de obtención de cultivos en suspensión transformadas con expresión del gen

Cry1Ac. En una siguiente fase se evaluarán condiciones que permitan optimizar la

producción de biomasa y de proteína heteróloga.

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

Este es el primer reporte de establecimiento de cultivos de células en suspensión de la

nueva variedad vegetal Pastusa Suprema. Las condiciones evaluadas de tipo de explante,

fotoperiodo y composición hormonal del medio permitieron llegar a un protocolo eficiente

de obtención de células en suspensión, utilizando entrenudos como explante, en medio

MS suplementado con ANA y en oscuridad permanente.

Se logró obtener suspensiones celulares de muy alta densidad celular y crecimiento

vigoroso. La cinética de crecimiento mostró una tasa específica de crecimiento máxima

(µmáx) de 0,085 d-1, correspondiente a un tiempo de duplicación (td) de 8,15 días y una

concentración máxima de biomasa (Xmáx) de 12,11 g/l. Estos parámetros son comparables

a los que se han obtenido en otras plataformas vegetales, incluso en algunos casos

después de procesos de optimización.

Los bajos requerimientos hormonales, la respuesta robusta al cultivo in vitro, la alta tasa

específica de crecimiento y la estabilidad genética evidenciada en la expresión de la

proteína Bt-Cry1Ac en las suspensiones celulares, ponen en evidencia el potencial de

Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa Suprema como plataforma de

producción de proteínas recombinantes de interés biotecnológico.

5.2 Recomendaciones

Se detectó que el raspado de los callos es un paso muy crítico en el que se produce

oxidación de la biomasa y se piensa que está relacionado con la baja viabilidad celular en

el establecimiento de las suspensiones. Es probable que, si se encuentran mecanismos

para reducir el pardeamiento de los callos, bien sea mediante aditivos en el medio sólido

o eliminando el paso de raspado, se obtengan cultivos en mejores condiciones fisiológicas

44 Evaluación del potencial del cultivo de células en suspensión de papa

(Solanum tuberosum subsp. andígena) como plataforma de producción de

proteínas recombinantes

y por tanto se disminuya el tiempo de adaptación y la eficiencia en el establecimiento de

suspensiones celulares. En el establecimiento de suspensiones se observó una tendencia

a aumentar el crecimiento de la biomasa a menor concentración de auxina; por esta razón

se recomienda evaluar el comportamiento de los cultivos con concentraciones de ANA

menores a 1,5 mg/l en callos y menores a 0,5 mg/l en suspensiones, con miras a reducir

los costos globables del bioproceso.

Bibliografía

Ambrosone, A., Di Giacomo, M., Leone, A., Grillo, M. S., & Costa, A. (2012). Identification of early induced genes upon water deficit in potato cell cultures by cDNA-AFLP. Journal of Plant Research. doi:10.1007/s10265-012-0505-7

Anjum, M. A., & Ali, H. (2004). Effect of Culture Medium on Shoot Initiation from Calluses of Different Origin in Potato (Solanum tuberosum L.). Biotechnology, 3(2), 194–199.

Arias, J. P. (2013). Optimización de parámetros de cultivo en suspensión de células de la especie vegetal Thevetia peruviana y su efecto en la producción de metabolitos secundarios. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.

Aviezer, D., Brill-almon, E., Shaaltiel, Y., Hashmueli, S., Bartfeld, D., Liberman, Y., Galun, E. (2009). A Plant-Derived Recombinant Human Glucocerebrosidase Enzyme — A Preclinical and Phase I Investigation. PLoS ONE, 4(3), 1–6. doi:10.1371/journal.pone.0004792

Bachem, C. W. B., Hoeven, R. S. Van Der, Bruijn, S. M. De, Vreugdenhil, D., Zabeau, M., Visser, R. G. F., Visser, R. G. F. (1996). Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP: analysis of gene expression during potato tuber development. The Plant Journal, 9(5), 745–753. doi:10.1046/j.1365-313X.1996.9050745.x

Bhojwani, S. S., & Razdan, M. K. (1996). Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier Science B.V.

Demain, A. L., & Vaishnav, P. (2009). Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 27, 297–306. doi:10.1016/j.biotechadv.2009.01.008

Doran, P. M. (1995). Bioprocess engineering principles. Elsevier Science & Technology Books.

Doran, P. M. (2000). Foreign protein production in plant tissue cultures. Current Opinion in Biotechnology, 11(2), 199–204. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10753768

Doran, P. M. (2013). Therapeutically important proteins from in vitro plant tissue culture systems. Current Medicinal Chemistry, 20, 1047 – 1055. Retrieved from http://www.sinab.unal.edu.co:2109/login.aspx?direct=true&db=mnh&AN=23210789&lang=es&site=ehost-live

El-Banna, A., Hajirezaei, M.-R., Wissing, J., Ali, Z., Vaas, L., Heine-Dobbernack, E., Kiesecker, H. (2010). Over-expression of PR-10a leads to increased salt and osmotic tolerance in potato cell cultures. Journal of Biotechnology, 150, 277–87. doi:10.1016/j.jbiotec.2010.09.934

46 Título de la tesis o trabajo de investigación

Franconi, R., Demurtas, O. C., & Massa, S. (2010). Plant-derived vaccines and other therapeutics produced in contained systems. Expert Review of Vaccines, 9(8), 877–892. doi:10.1586/erv.10.91

Gao, J., Lee, J. M., & An, G. (1991). The stability of foreign protein production in genetically modified plant cells. Plant Cell Reports, 10(10), 533–536. doi:10.1007/BF00234589

Gerszberg, A., Wiktorek-Smagur, A., Hnatuszko-Konka, K., Łuchniak, P., & Kononowicz, A. K. (2012). Expression of recombinant staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator of bacterial origin, in potato (Solanum tuberosum L.) plants. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(3), 1115–1123. doi:10.1007/s11274-011-0912-2

Gottstein, D., & Schliemann, W. (1994). Purine glucosylating activity in cell suspension cultures of Solanum tuberosum L. Plant Cell Reports, 36, 265–267.

Hanchinal, V. M., Survase, S. A., Sawant, S. K., & Annapure, U. S. (2008). Response surface methodology in media optimization for production of β-carotene from Daucus carota. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 93, 123–132. doi:10.1007/s11240-008-9350-8

Hawkins, H. J., & Lips, S. H. (1997). Cell Suspension Cultures of Solanum tuberosum L . as a Model System for N and Salinity Response Effect of Salinity on N0 3 - Uptake and PM-ATPase Activity zrc. Journal of Plant Physiology, 150, 103–109. doi:10.1016/S0176-1617(97)80188-5

He, D.-M., Qian, K.-X., Shen, G.-F., Li, Y.-N., Zhang, Z.-F., Su, Z.-L., & Shao, H.-B. (2007). Stable expression of foot-and-mouth disease virus protein VP1 fused with cholera toxin B subunit in the potato (Solanum tuberosum). Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 55, 159–163. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2006.11.043

Holland, T., Sack, M., Rademacher, T., Schmale, K., Altmann, F., Stadlmann, J., Hellwig, S. (2010). Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture. Biotechnology and Bioengineering, 107(2), 278–289. doi:10.1002/bit.22800

Huang, T. K., & McDonald, K. a. (2011). Bioreactor systems for in vitro production of foreign proteins using plant cell cultures. Biotechnology Advances, 30(2), 398–409. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.07.016

Huang, T. K., & McDonald, K. A. (2009). Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering Journal, 45(3), 168–184. doi:10.1016/j.bej.2009.02.008

International Solanaceae Initiative. (n.d.). Sol Genomics Network. Retrieved June 30, 2016, from https://solgenomics.net/

Jackson, S. D. (1999). Multiple Signaling Pathways Control Tuber Induction in Potato. Plant Physiology, 119, 1–8. doi:10.1104/pp.119.1.1

Jiménez Barreto, J. P., Chaparro-Giraldo, A., & Blanco, J. (2009). Evaluación de diferentes combinaciones fitohormonales en la regeneración de Solanum tuberosum (Solanaceae) Var. Pastusa Suprema a partir de explantes internodales. Revista Colombiana de Biotecnología, XI(2), 66–74.

Johnson, A. A. T. (2001). Effect of ploidy elevation, copy number and parent-of-origin on

Bibliografía 47

transgener expression in potato. Virginia Polytechnic Institute and State University.

Kieran, P. M., MacLoughlin, P. F., & Malone, D. M. (1997). Plant cell suspension cultures: Some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 59, 39–52. doi:10.1016/S0168-1656(97)00163-6

Kombrink, E., Schröder, M., & Hahlbrock, K. (1988). Several “pathogenesis-related” proteins in potato are 1,3-beta-glucanases and chitinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85(3), 782–786. doi:10.1073/pnas.85.3.782

Kreslavski, V. D., Carpentier, R., Klimov, V. V., & Allakhverdiev, S. I. (2009). Transduction mechanisms of photoreceptor signals in plant cells. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, 10, 63–80. doi:10.1016/j.jphotochemrev.2009.04.001

Lander, E. S., Linton, L. M., Birren, B., Nusbaum, C., Zody, M. C., Baldwin, J., … Szustakowki, J. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409(February), 860–921. doi:10.1038/35057062

Law, R. D., & Suttle, J. C. (2005). Chromatin remodeling in plant cell culture: patterns of DNA methylation and histone H3 and H4 acetylation vary during growth of asynchronous potato cell suspensions. Plant Physiology and Biochemistry, 43, 527–34. doi:10.1016/j.plaphy.2005.03.014

Leader, B., Baca, Q. J., & Golan, D. E. (2008). Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nature Reviews. Drug Discovery, 7(1), 21–39. doi:10.1038/nrd2399

Leister, D., Ballvora, A., Salamini, F., & Gebhardt, C. (1996). A PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nature Genetics, 14, 421–429. doi:10.1038/ng1296-421

Li, Y.C., & Tao, W.Y. (2009). Effects of paclitaxel-producing fungal endophytes on growth and paclitaxel formation of Taxus cuspidata cells. Plant Growth Regulation, 58, 97–105. doi:10.1007/s10725-008-9355-7

López, A., & Chaparro, A. (2007). Propuesta de un sistema de transformación de plantas de papa ( Solanum tuberosum sp . andigena var . Pastusa Suprema ) mediado por Agrobacterium tumefaciens. Agronomía Colombiana, 25(1), 16–25.

Lu, Q., Yang, Q., & Zou, H. (2006). Effects of Cerium on Accumulation of Anthocyanins and Expression of Anthocyanin Biosynthetic Genes in Potato Cell Tissue Cultures. Journal of Rare Earths, 24(4), 479–484. doi:10.1016/S1002-0721(06)60147-6

Ma, S., Huang, Y., Davis, A., Yin, Z., Mi, Q., Menassa, R., Jevnikar, A. M. (2005). Production of biologically active human interleukin-4 in transgenic tobacco and potato. Plant Biotechnology Journal, 3, 309–318. doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00125.x

McDonald, K. a., Jackman, A., & Hurst, S. (2001). Characterization of plant suspension cultures using the focused beam reflectance technique. Biotechnology Letters, 23(4), 317–324.

Müller-Röber, B., Sonnewald, U., & Willmitzer, L. (1992). Inhibition of the ADP-glucose


pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. The EMBO Journal, 11(4), 1229–1238. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC556571/\nhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC556571/pdf/emboj00089-0015.pdf

Mullins, E., Milbourne, D., Petti, C., Doyle-Prestwich, B. M., & Meade, C. (2006). Potato in the age of biotechnology. Trends in Plant Science, 11(5), 254–260. doi:10.1016/j.tplants.2006.03.002

Munir, F., Naqvi, S. M. S., & Tariq, M. (2011). In vitro culturing and assessment of somaclonal variation of Solanum tuberosum var . desiree. Turkish Journal of Biochemistry, 36(4), 296–302.

Muñoz-Cruz, W., Vanegas-Monterrosa, O. A., Guzmán-Rosas, A. A., Capataz-Tafur, J., Hoyos-Sánchez, R. A., & Orozco-Sánchez, F. (2006). Estimación de variables de operación de un biorreactor con células de Azadirachta indica A. Juss. Revista de La Facultad Nacional de Agronomía, 59(2), 3467–3478.

Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473–497.

Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., & Verpoorte, R. (2011). Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols, 6(6), 715–42. doi:10.1038/nprot.2010.144

Naik, P. S., & Widholm, J. M. (1993). Comparison of tissue culture and whole plant responses to salinity in potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33(3), 273–280. doi:10.1007/BF02319012

Naill, M. C., & Roberts, S. C. (2005). Cell cycle analysis of Taxus suspension cultures at the single cell level as an indicator of culture heterogeneity. Biotechnology and Bioengineering, 20(4), 491–500.

Neff, M. M., Fankhauser, C., & Chory, J. (2000). Light: an indicator of time and place. Genes & Development, 14, 257–271. doi:10.1101/gad.14.3.257

Pan, Z. W., Wang, H. Q., & Zhong, J. J. (2000). Scale-up study on suspension cultures of Taxus chinensis cells for production of taxane diterpene. Enzyme and Microbial Technology, 27, 714–723. doi:10.1016/S0141-0229(00)00276-3

Park, Y., & Cheong, H. (2002). Expression and production of recombinant human interleukin-2 in potato plants. Protein Expression and Purification, 25, 160–165. doi:10.1006/prep.2002.1622

Queirós, F., Fidalgo, F., Santos, I., & Salema, R. (2007). In vitro selection of salt tolerant cell lines in Solanum tuberosum L. Biologia Plantarum, 51(4), 728–734.

Reiss, B. (2003). Homologous Recombination and Gene Targeting in Plant Cells. International Review of Cytology, 228, 85–139. doi:10.1016/S0074-7696(03)28003-7

Riesmeier, J. W., Willmitzer, L., & Frommer, W. B. (1994). Evidence for an essential role of the sucrose transporter in phloem loading and assimilate partitioning. The EMBO Journal, 13(1), 1–7. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=394773&tool=pmcentrez&

Bibliografía 49

rendertype=abstract

Rigano, M. M., Guzman, G. De, Walmsley, A. M., & Frusciante, L. (2013). Production of Pharmaceutical Proteins in Solanaceae Food Crops. International Journal of Molecular Sciences, 14, 2753–2773. doi:10.3390/ijms14022753

Rodríguez-Monroy, M., & Galindo, E. (2003). Las células vegetales, ¿frágiles para crecer en biorreactores? Biotecnología, 8(2), 6–17. Retrieved from http://scholar.google.com/scholar?hl=en&btnG=Search&q=intitle:Las+c?lulas+vegetales,+?fr?giles+para+crecer+en+biorreactores?#0

Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., & Willmitzer, L. (2000). Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal, 23(1), 131–42. doi:10.1046/j.1365-313x.2000.00774.x

Romano, A., Vreugdenhil, D., Jamar, D., van der Plas, L. H. W., de Roo, G., Witholt, B., Mooibroek, H. (2003). Evidence of medium-chain-length polyhydroxyoctanoate accumulation in transgenic potato lines expressing the Pseudomonas oleovorans Pha-C1 polymerase in the cytoplasm. Biochemical Engineering Journal, 16, 135–143. doi:10.1016/S1369-703X(03)00030-5

Rukavtsova, E. B., Rudenko, N. V., Puchko, E. N., Zakharchenko, N. S., & Buryanov, Y. I. (2015). Study of the immunogenicity of hepatitis B surface antigen synthesized in transgenic potato plants with increased biosafety. Journal of Biotechnology, 203, 84–88. doi:10.1016/j.jbiotec.2015.03.019

Rybicki, E. (2010). Plant-made vaccines for humans and animals. Plant Biotecnology Journal, 8(5), 620–637.

Seabrook, J. E. A. (2005). Light effects on the growth and morphogenesis of potato (Solanum tuberosum) in vitro: a review. American Journal of Potato Research, 82(5), 353–367.

Shaaltiel, Y., Bartfeld, D., Hashmueli, S., Baum, G., Brill-almon, E., Galili, G., Aviezer, D. (2007). Production of glucocerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme replacement therapy of Gaucher’s disease using a plant cell system. Plant Biotechnology Journal, 5, 579–590. doi:10.1111/j.1467-7652.2007.00263.x

Shahab-ud-din, Sultan, I. N., Kakar, M. A., Yousafzai, A., Sattar, F. A., Ahmmad, F., Arif, B. (2011). The Effects of Different Concentrations and Combinations of Growth Regulators on the Callus Formation of Potato (Solanum tubrosum) Explants. Current Research Journal of Biological Sciences, 3(5), 499–503.

Shih, S. M.-H., & Doran, P. M. (2009). Foreign protein production using plant cell and organ cultures: Advantages and limitations. Biotechnology Advances, 27(6), 1036–42. doi:10.1016/j.biotechadv.2009.05.009

Shin, Y.-J., Chong, Y.-J., Han, K.-B., Yang, M.-S., & Kwon, T.-H. (2010). N-linked glycan analysis of glycoproteins secreted from rice cell suspension cultures under sugar starvation. Enzyme and Microbial Technology, 47, 189–193. doi:10.1016/j.enzmictec.2010.06.007

Son, S. H., Choi, S. M., Lee, Y. H., Choi, K. B., Yun, S. R., Kim, J. K., Park, Y. G. (2000).


Large-scale growth and taxane production in cell cultures of Taxus cuspidata (Japanese yew) using a novel bioreactor. Plant Cell Reports, 19(6), 628–633.

Stachel, S. E., Nester, E. W., & Zambryski, P. C. (1986). A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83, 379–383.

Tacket, C., Mason, H., Losonsky, G., Clements, J., Levine, M., & Arntzen, C. (1998). Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato. Nature Medicine, 4(5), 607–609. doi:http://dx.doi.org/10.1038/nm0598-607

Taiz, L., & Zeiger, E. (2002). Plant physiology (3 edition.). Sinauer Associates.

Taylor, M. A., Arif, S. A., Kumar, A., Davies, H. V, Scobie, L. A., Pearce, S. R., & Flavell, A. J. (1992). Expression and sequence analysis of cDNAs induced during the early stages of tuberisation in different organs of the potato plant (Solanum tuberosum L.). Plant Molecular Biology, 20(4), 641–51.

Torabi, F., Majad, A., & Ehsanpour, A. A. (2008). Plant regeneration from cell suspension culture of potato (Solanum tuberosum L.). Pakistan Journal of Biological Sciences, 11(5), 778–782.

Torres, E. S., Torres, J., Moreno, C., & Arango, R. (2012). Development of transgenic lines from a male-sterile potato variety , with potential resistance to Tecia solanivora Povolny Desarrollo de líneas transgénicas de una variedad androestéril de papa , potencialmente resistentes a Tecia solanivora Povolny. Agronomía Colombiana, 30(2), 163–171. Retrieved from http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/19395

Trejo-Tapia, G., Jiménez-Aparicio, A., Villarreal, L., & Rodríguez-Monroy, M. (2001). Broth rheology and morphological analysis of solanum chrysotrichum cultivated in a stirred tank. Biotechnology Letters, 23, 1943–1946. doi:10.1023/A:1013789918463

Trujillo, C., Rodriguez-Arango, E., Jaramillo, S., Hoyos, R., Orduz, S., & Arango, R. (2001). One-step transformation of two Andean potato cultivars (Solanum tuberosum L . subsp . andigena). Plant Cell Reports, 20, 637–641. doi:10.1007/s002990100381

Turhan, H. (2004). Callus induction and growth in transgenic potato genotypes. African Journal of Biotechnology, 3(8), 375–378.

Twyman, R. M., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., & Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: Host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21(12), 570–578. doi:10.1016/j.tibtech.2003.10.002

Ullisch, D. A., Müller, C. A., Maibaum, S., Kirchhoff, J., Schiermeyer, A., Schillberg, S., Büchs, J. (2012). Comprehensive characterization of two different Nicotiana tabacum cell lines leads to doubled GFP and HA protein production by media optimization. Journal of Bioscience and Bioengineering, 113(2), 242–248. doi:10.1016/j.jbiosc.2011.09.022

van der Maas, H. M., de Jong, E. R., Rueb, S., Hensgens, L. a, & Krens, F. a. (1994). Stable transformation and long-term expression of the gusA reporter gene in callus lines of perennial ryegrass (Lolium perenne L.). Plant Molecular Biology, 24, 401–5. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8111042

Bibliografía 51

Vargas, T. E., De García, E., & Oropeza, M. (2005). Somatic embryogenesis in Solanum tuberosum from cell suspension cultures: histological analysis and extracellular protein patterns. Journal of Plant Physiology, 162, 449–456. doi:10.1016/j.jplph.2004.07.001

Vargas, T. E., Xena, N., Vidal, M. del C., Oropeza, M., & de García, E. (2008). Genetic stability of Solanum tuberosum l. cv. désirée Plantlets obteined from embryogenic cell suspension cultures. Interciencia, 33(3), 213–218.

Visser, R. G. F., Somhorst, I., Kuipers, G. J., Ruys, N. J., Feenstra, W. J., & Jacobsen, E. (1991). Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Molecular & General Genetics, 225(2), 289–296. doi:10.1007/BF00269861

Wang, A., & Ma, S. (Eds.). (2012). Molecular farming in plants: Recent advances and future prospects. Molecular Farming in Plants: Recent Advances and Future Prospects (Vol. 9789400722). Springer. doi:10.1007/978-94-007-2217-0

Wang, H. Q., Yu, J. T., & Zhong, J. J. (1999). Significant improvement of taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry, 35, 479–483.

Wickremesinhe, E. R. M., & Arteca, R. N. (1994). Taxus Cell Suspension Cultures: Optimizing Growth and Production of Taxol. Journal of Plant Physiology, 144, 183–188. doi:10.1016/S0176-1617(11)80541-9

Xu, J., Ge, X., & Dolan, M. C. (2011). Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances, 29(3), 278–99. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.01.002

Xu, J., Okada, S., Tan, L., Goodrum, K. J., Kopchick, J. J., & Kieliszewski, M. J. (2010). Human growth hormone expressed in tobacco cells as an arabinogalactan-protein fusion glycoprotein has a prolonged serum life. Transgenic Research, 19, 849–867. doi:10.1007/s11248-010-9367-8

Xu, X., Pan, S., Cheng, S., Zhang, B., Mu, D., Ni, P., Visser, R. G. F. (2011). Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature, 475, 189–195. doi:10.1038/nature10158

Zacharius, R. M., Kalan, E. B., & Kimoto, W. I. (1985). Biotransformation of potato stress metabolites rishitin, lubimin, and 15-dihydro lubimin by potato and soybean cell cultures. Plan Cell Reports, 4, 1–3.

Zhang, C.-Y., Dong, Y.-S., Li, Y.-L., Fu, C.-H., Zhao, C.-F., & Yu, L.-J. (2013). Unstructured models for suspension cultures of Taxus media cells in a bioreactor under substrate-sufficient conditions. Biochemical Engineering Journal, 71, 62–71. doi:10.1016/j.bej.2012.11.014

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