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Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la interacción plantas -

microorganismos rizosféricos

Kenne Marcel Rico Fragozo

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Maestría en Toxicología Bogotá D.C., Colombia

2017

Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la interacción plantas -

microorganismos rizosféricos

Kenne Marcel Rico Fragozo

Trabajo presentado como requisito parcial para obtener el título de: Magister en Toxicología

Director Hermann Restrepo Díaz

Codirectoras

Nancy Patiño Reyes

Diana Carolina Chaves Silva

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina

Maestría en Toxicología Bogotá D.C., Colombia

2017

Dedico este trabajo a mis padres, hermana, familiares y amigos

que estuvieron siempre con su apoyo incondicional en cada una de las etapas

de este trabajo de investigación, fueron muchos los obstáculos recorridos en el camino,

pero con la ayuda de Dios se pudo sobre pasar cada uno de ellos.

Muchas gracias a todos.

Agradecimientos

Agradezco al profesor Hermann Restrepo Díaz director de este trabajo de investigación

de la Facultad de Ciencias Agrarias, a las codirectoras Nancy Patiño reyes, Diana

Carolina Chaves Silva de la Facultad de Medicina, a la Doctora Claudia Carvajar, a la

Doctora Alba Rodriguez Pulido, a Luz Adriana Ruiz Pérez de la Secretaría Distrital de

Salud de Bogotá, a Alefsis David Sanchéz y a todos los que hicieron posible el desarrollo

de esta investigación por su apoyo incondicional.

Muchas gracias.

Resumen y Abstract VII

Resumen

El plomo es un elemento metálico tóxico que se encuentra presente en el suelo y en el

agua de forma natural en concentraciones trazas. Su explotación a escala industrial ha

llevado al aumento de su concentración en el ambiente y tomado por las plantas para

luego pasar a organismos superiores como el ser humano a través del consumo directo o

mediante la cadena trófica (IARC, 1980; FAO, 2011).

Este trabajo evaluó el efecto agudo y crónico del plomo sobre semillas, plantas de acelga,

lechuga y Pseudomonas fluorescens como microorganismo rizosférico en diferentes dosis

de exposición, fundamentadas en las normas legales vigentes de Colombia para simular

en condiciones controladas el efecto tóxico y bioacumulación del plomo en un

agroecosistema hortícola durante 45 días.

En esta investigación se observaron efectos tóxicos agudos y crónicos sobre semillas,

plantas de acelga, lechuga en los diferentes experimentos de exposición, causando

efectos tóxicos sobre la germinación y crecimiento de semillas mostrando disminución de

la longitud de hipocótilo, radícula y un porcentaje de germinación inferior al 90%, en la

dosis de 0,2 mg·L-1 en acelga, mientras que, en semillas de lechuga no se observaron tales

diferencias.

En el experimento de exposición crónica a plomo en condiciones controladas, se observó

el efecto tóxico nocivo sobre el crecimiento de las plantas de ambas especies, así como

también en el crecimiento de Pseudomonas fluorescens. La exposición crónica a plomo causó

disminución de la biomasa vegetal en todas las dosis de exposición a plomo con respecto al

control, así como también, bioacumulación del metal en el tejido vegetal de las plantas

expuestas al finalizar los experimentos. En condiciones de hidroponía el plomo en hoja

bioacumulado en hoja para acelga y lechuga fue de 0,7; 1,1 mg∙kg-1 Pb, mientras que, en

condiciones de invernadero los valores de plomo fueron de 0,60; 0,66 mg∙kg-1 Pb en acelga

para los tratamientos con fertilización con quelatos y sin quelatos, y en lechuga de 0,2; 0,4

mg∙kg-1 Pb en los mismos tratamientos, respectivamente. También, se observaron efectos

tóxicos sobre el crecimiento de las bacterias (Pseudomonas fluorescens) a los 30 y 45 días de

exposición con disminución del diámetro de las colonias y retraso en su crecimiento.

Palabras claves: Agroecosistema, cadena trófica, fitotoxicidad, exposición aguda,

exposición crónica, plomo, Pseudomonas fluorescens.

VIII Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la interacción

plantas - microorganismos rizosféricos

Abstract

Lead is a toxic metallic element that is present in soil and water naturally in trace

concentrations. Its exploitation on an industrial scale has led to an increase in its

concentration in the environment and taken by the plants to later pass to higher

organisms such as the human being through direct consumption or through the trophic

chain (IARC, 1980, FAO, 2011).

This work evaluated the acute and chronic effects of lead on seeds, Swiss chard, lettuce

and Pseudomonas fluorescens as a rhizospheric microorganism in different exposure

doses, based on the current Colombian legal regulations for simulating the toxic effect

and bioaccumulation of lead under controlled conditions. in a horticultural agroecosystem

for 45 days.

In this research, acute and chronic toxic effects were observed on seeds, Swiss chard

plants and lettuce in the different exposure experiments, causing toxic effects on

germination and seed growth, showing a decrease in hypocotyl length, radicle and a

lower percentage of germination. to 90%, in the dose of 0,2 mg·L-1 in chard, while, in

lettuce seeds, no such differences were observed.

In the experiment of chronic exposure to lead under controlled conditions, the noxious

toxic effect on the growth of the plants of both species was observed, as well as the

growth of Pseudomonas fluorescens. Chronic exposure to lead caused a decrease in

plant biomass in all doses of lead exposure with respect to control, as well as

bioaccumulation of the metal in the plant tissue of the plants exposed at the end of the

experiments. In hydroponic conditions, the lead in bioaccumulated leaves in leaf for chard

and lettuce was 0,7; 1,1 mg∙kg-1 Pb, while, under greenhouse conditions, the lead values

were 0,60; 0,66 mg∙kg-1 Pb in Swiss chard for treatments with chelated and chelate-free

treatments, and in 0,2 lettuce; 0,4 mg∙kg-1 Pb in the same treatments, respectively. Also,

toxic effects on the growth of the bacteria (Pseudomonas fluorescens) were observed at

30 and 45 days of exposure with decrease in the diameter of the colonies and delay in

their growth.

Keywords: Agroecosystem, trophic chain, phytotoxicity, acute exposure, chronic

exposure, lead, Pseudomonas fluorescens.

Contenido IX

Contenido

Pág. Resumen y Abstract .................................................................................................... VIIII

Lista de figuras ............................................................................................................... XI

Lista de tablas .............................................................................................................. XIII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Planteamiento del problema .................................................................................... 5

2. Justificación ............................................................................................................. 7

3. Pregunta de investigación ....................................................................................... 9

4. Marco teórico .......................................................................................................... 11

4.1. Hortalizas en Colombia ........................................................................................ 11

4.2. Producción de hortalizas en Colombia ................................................................. 12

4.2.1 Acelga (Beta vulgaris) ..................................................................................... 13

4.2.2. Valor nutricional de la acelga .......................................................................... 14

4.2.3. Lechuga (Lactuca sativa L.) ............................................................................ 15

4.2.4. Valor nutricional de la lechuga ........................................................................ 15

4.3. Contaminantes en la agricultura ........................................................................... 16

4.3.1. Quelatos en la agricultura ............................................................................... 17

4.3.2. Metales contaminantes en suelos agrícolas ................................................... 18

4.4. Plomo en el Agroecosistema ................................................................................ 19

4.4.1. Toxicidad del plomo en plantas ...................................................................... 21

4.4.2. Plomo y las bacterias del suelo ...................................................................... 22

4.4.3. Plomo y su efecto en los seres humanos ....................................................... 24

4.5. Límites máximos permisibles de plomo en agua de riego y hortalizas en Colombia.

................................................................................................................................... 26

4.6. Riesgo tóxico por consumo de hortalizas con plomo. ........................................... 27

5. Objetivos ................................................................................................................. 29

5.1. Objetivo General .................................................................................................. 29

X Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la

interacción plantas - microorganismos rizosféricos

5.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 29

6. Materiales y métodos ..............................................................................................31

6.1. Experimento 1: Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas de acelga

y lechuga. .................................................................................................................... 32

6.2 Experimento 2 (a) Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y

lechuga en medio hidropónico ........................................................................................... 33

6.3. Experimento 2 (b). Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de

acelga, lechuga y Pseudomonas fluorescens en condiciones de invernadero. ............ 35

6.4. Experimento 3. Evaluación de la exposición crónica a plomo en bacterias. .......... 39

6.5. Diseño estadístico ................................................................................................ 41

7. Resultados ..............................................................................................................43

7.1. Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas .............................................. 43

7.2. Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y lechuga bajo

condiciones de hidroponía ........................................................................................... 45

7.3. Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y lechuga, bajo

condiciones de invernadero. ........................................................................................ 49

8. Discusión .................................................................................................................57

9. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................65

9.1 Conclusiones ......................................................................................................... 65

9.2 Recomendaciones ................................................................................................. 66

Bibliografía .....................................................................................................................69

Contenido XI

Lista de figuras

Pág.

Figura 4.1. Superficie cosechada de acelga (Beta vulgaris) (A) y lechuga

(Lactuca sativa L.) (B) en los principales departamentos productores de

Colombia durante el periodo 2007 -2014

Figura 4.2. Ciclo del plomo en el agroecosistema

Figura 4.3. Efecto de la exposición a plomo en bacterias nativas asociadas a

plantas Arroz en Montería, Córdoba, Colombia

Figura 4.4. Inhibición de la hemoglobina por exposición a plomo

Figura 6.1. Experimentos desarrollados para la evaluación de la exposición

aguda y crónica a diferentes concentraciones de plomo en plantas de acelga

(cv común) y lechuga (cv crispa)

Figura 6.2. Fundamento de las diferentes dosis de plomo utilizadas en los

experimentos de exposición aguda y crónica

Figura 6.3. Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas de acelga

y lechuga durante 120 horas

Figura 6.4. Establecimiento del experimento de exposición crónica a plomo en

solución nutritiva (Hidroponía)

Figura 6.5. Establecimiento del experimento de exposición crónica a plomo

en invernadero

Figura 6.6. Curva de calibración para plomo en equipo de EAA ICE 3300

Figura 6.7. Digestión, filtrado de material vegetal y lectura en equipo de EAA

Figura 6.8. Rizósfera (área de influencia de la raíz de las plantas) para

la determinación de la población de Pseudomonas fluorescens en las dosis

0,025; 0,05; 0,1; 0,2 mg·L-1 Pb

Figura 6.9. Recuento y determinación de Pseudomonas fluorescens. (a)

Colonias bacterianas aisladas (b) bacilos cortos Gram negativos (c) Siembra

en medio King B (d) Fluorescencia en cámara oscura y luz UV

13

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XII Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la

interacción plantas - microorganismos rizosféricos

Figura 6.10. Toma de lectura de pH en suelo expuesto a plomo

Figura 7.1. Efecto de la exposición aguda de cinco concentraciones de plomo

(0,0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 mg∙L-1) sobre la longitud del hipocótilo (A) y radícula

(B), en plántulas de acelga (cv. común) y lechuga (cv. crispa) durante 120 horas

Figura 7.2. Concentración de plomo bioacumulado en hojas (A), raíces (B), de

plantas de acelga y lechugas cultivadas en un medio hidropónico.

Figura 7.3. Contenido en µg de Pb bioacumulado en hojas (A), en raíces (B), y

total (C) en plantas de acelga y lechuga cultivadas en medio hidropónico

Figura 7.4. Concentración de plomo bioacumulado en acelga y lechuga en hoja

(A, B), raíz (C, D)

Figura 7.5. Contenido de plomo (µg) bioacumulado en plantas de acelga y

lechuga en hoja (A, D), raíz (B, E), total (C, F)

Figura 7.6. Concentración de plomo al término del experimento de exposición

crónica en invernadero

Figura 7.7. Valores de pH a los 15, 30 y 45 (DIT) sin adición y con adición de

quelatos

Figura 7.8. Efecto del plomo sobre el crecimiento de las colonias bacterianas

de Pseudomonas fluorescens en la dosis de exposición de 0,025; 0,05; 0,1; 0,2

mg∙L-1 Pb y testigo

41

44

46

48

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56

Contenido XIII

Lista de tablas

Pág.

Tabla 4.1. Clasificación de hortalizas por grupos según su clima, partes

comestibles o duración del ciclo de cultivo en Colombia

Tabla 4.2. Resumen de la producción nacional de hortalizas en los años, 2014-

2015

Tabla 4.3. Valor nutricional de la acelga

Tabla 4.4. Valor nutricional de la lechuga

Tabla 4.5. Procesos metabólicos y enzimas afectadas por la exposición a

plomo en plantas

Tabla 4.6. Efectos tóxicos del plomo de acuerdo a su concentración en sangre

Tabla 4.7. Consumo por persona de acelga y lechuga en el departamento de

Cundinamarca

Tabla 6.3. Ajuste para linealidad del equipo EAA, ICE 3300

Tabla 7.1. Porcentaje de germinación de semillas de acelga y lechuga expuestas

de manera aguda a diferentes dosis de plomo

Tabla 7.2. Biomasa total de plantas de acelga y lechuga expuestas a plomo bajo

condiciones de hidroponía

Tabla 7.3. Efecto de la exposición crónica a plomo y tipo de fertilizante sobre la

biomasa de las plantas cultivadas bajo condiciones de invernadero

Tabla 7.4. Efecto de la exposición crónica a plomo y tipo de fertilizante sobre la

biomasa de las plantas cultivadas bajo condiciones de invernadero

Tabla7.5. Efecto del plomo sobre la biomasa de Pseudomonas fluorescens

11

12

14

15

22

26

27

37

43

45

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53

Introducción

La producción de hortalizas en Colombia se desarrolla principalmente en los

departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Nariño y Cauca, siendo el departamento de

Cundinamarca el mayor productor (Ministerio de Agricultura de Colombia, 2014). Dentro

de las hortalizas de hojas, las acelgas y lechugas son altamente apreciadas por aportar

cantidades importantes de agua, minerales y vitaminas en porciones diarias de entre 100

y 250 gramos, además de, ser recomendadas por nutricionistas por su bajo contenido

carbohidratos, colesterol y grasas trans (Moreiras, 2013).

El sistema de producción de hortalizas en el país, está expuesto a factores

contaminantes como metales tóxicos provenientes del agua del riego (Miranda, et al.

2008). La sabana del occidente del departamento de Cundinamarca es una de las

mayores zonas productora de hortalizas del país. Sin embargo, se encuentra irrigada por

uno de los ríos más contaminados del país con una importante carga orgánica e

inorgánica proveniente de toda la actividad doméstica e industrial de la ciudad de Bogotá

(Ministerio de agricultura, 2014). Estudios realizados por Miranda et al, (2008); Fischer et

al., (2008) han reportado la presencia de metales tóxicos como Pb, Cd, As y Hg en el

agua que posiblemente puede utilizarse en el riego de cultivos de consumo directo en

humanos.

El agroecosistema está conformado por plantas y otros organismos como los

microorganismos del suelo, que ayudan al mantenimiento y equilibrio de los suelos.

Metales tóxicos presente en el suelo pueden afectar a dicha comunidad, causando en

ellos cambios en su biomasa, en su crecimiento y desarrollo (Zhenli, 2005; Liu et al,

2017). Debido a que, metales como el plomo no poseen función metabólica específica en

el ecosistema, pueden perdurar causando bioacumulación en el suelo y en los

organismos expuestos como animales y plantas (Schwertfeger et al, 2013). El plomo

tiene carga positiva, lo que favorece para formar complejos con las diferentes moléculas

del suelo con cargas negativas como las arcillas, que a su vez, y con base en su

2 Introducción

contenido podrían dejarlo disponible para las plantas, que luego lo transportarían a

diferentes órganos mediante mecanismos de transporte como la vía simplástica y

apoplástica (Barceló, 2005; Chen et al, 2015; Thakur et al, 2016).

No obstante, el plomo puede llegar al organismo de los seres humanos por vía oral

cuando consume alimentos de tipo vegetal y animal que lo han acumulado y cuyo origen

puede estar relacionado con altos niveles de concentración y disponibilidad en los suelos

(Al-Selah et al, 2017). Un consumo continuo de alimentos con plomo incluso en bajas

concentraciones, puede traer consecuencias nocivas para la salud del ser humano a

mediano y largo plazo (Bradberry et al, 2014). El plomo al ser ingerido mediante la

alimentación llega inicialmente al torrente sanguíneo, luego al tejido adiposo y órganos

como el cerebro, riñón, entre otros para depositarse en los huesos como su reservorio

final (Cameán et al, 2006; Repetto, 2009).

El efecto tóxico a la exposición continua a plomo en los seres humanos se observa

principalmente en niños y específicamente en su salud mental, limitando su capacidad de

aprendizaje, en adultos puede causar aumento en la presión arterial, infertilidad y

anemia, entre otras consecuencias (Costa et al, 2004; ATSRD, 2005; Orisakwe et al,

2012). La tasa de absorción en niños es mayor que en adultos con aproximadamente el

65 % del total de la exposición, mientras que, en adultos la tasa de absorción puede

llegar hasta el 10% (Repetto, 2009).

Debido a las consecuencias de la exposición a plomo en vegetales que son consumidos

por los seres humanos, se han establecido normas en el ámbito nacional e internacional

como la resolución 4506 de 2013 del Ministerio de Salud de Colombia y codex

alimentarius, lo cual establece el límite máximo permisible de plomo en los vegetales de

consumo humano de 0,3 mg∙kg-1 Pb en peso fresco.

Sin embargo, en Colombia existen normas para el uso y vertimiento de agua en sistemas

de alcantarillado como la resolución 0631 de 2015 del Ministerio de Medio Ambiente y

desarrollo Sostenible, así como el Acuerdo CAR 043 de 2006 de la Corporación

Autónoma Regional de Cundinamarca – CAR para el logro de metas en el año 2020 en el

uso de agua para riego y uso agrícola y el decreto 1584 de 1984 del ministerio de

Agricultura de la Republica de Colombia.

Introducción 3

El presente trabajo de investigación fue desarrollado para determinar el efecto de la

exposición y bioacumulación de plomo en las diferentes dosis de exposición (0,0; 0,025;

0,05; 0,1 y 0,2 mg∙L-1) permitidas en las normas nacionales para vertimiento y exposición

en plantas de interés agronómico como acelga (cv. común) y lechuga (cv. crispa), así

como también, observar el efecto en las poblaciones de microorganismos importantes

para el equilibrio en el agroecosistema y promotores del crecimiento vegetal como

Pseudomonas fluorescens.

1. Planteamiento del problema

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización de las Naciones

Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), el consumo de hortalizas en la

población mundial es deficiente, muchas enfermedades se han atribuido a la falta del

consumo de vitaminas y micronutrientes esenciales presentes en los vegetales. Por lo

tanto, fomentar el consumo de hortalizas alrededor de cinco a diez porciones al día indica

la OMS/FAO que puede ayudar a prevenir enfermedades congénitas (OMS/FAO, 2003).

Las hortalizas de hoja como acelga y lechuga aportan una gran cantidad de nutrientes

como vitamina C, hierro, fibra, vitamina A entre otros; estas son altamente consumidas y

cultivadas en Colombia (Cámara de Comercio de Bogotá, 2015), según la Encuesta

Nacional Agropecuaria (ENA) (2014) y la Dirección Nacional de Estadísticas de Colombia

(DANE) (2014-2015), el departamento de Cundinamarca es el mayor productor de

hortalizas en el país con una participación del total nacional del 98,08% en el año 2014.

Sin embargo, la OMS/FAO y codex aliemntarius han hecho énfasis en la seguridad e

inocuidad de los alimentos, debido a los efectos a la salud que pueden causar por la

exposición a sustancias nocivas presentes en ellos (OMS/FAO, 2003).

La presencia de contaminantes metálicos en el agua de riego en los sistemas agrícolas

de producción, puede ser un factor de riesgo para la salud de los consumidores de

vegetales cultivados, ya que, pueden ser bioacumulados por las plantas y animales para

posteriormente pasar a los seres humanos a través de la alimentación (Khan et al, 2015;

Smolders et al, 2015).

El plomo ha sido considerado como el metal más importante de exposición toxicológica

(Villarejo, 2006; Azario, 2014) debido a su fácil manipulación y bajo punto de fusión ha

sido utilizado en la fabricación de herramientas, armas, utensilios de cocina, tuberías,

aditivos para pinturas, baterías, fotografía, cosméticos entre otros, lo que lo ha

6 Evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo en acelgas (Beta vulgaris) y lechugas (Lactuca sativa L.) y su efecto generado en la interacción


constituido como la principal fuente de exposición a los seres humanos (Al-Selah et al,

2017).

Este metal está presente en el ambiente de manera natural en concentraciones traza

(Cooper et al, 2017), sin embargo, se encuentra en altas concentraciones debido a la

actividad antropogénica. Este metal no participa en los procesos metabólicos y

bioquímicos de los seres vivos, por lo cual su tendencia es acumularse en los diferentes

órganos y tejidos de las plantas y animales (Guo et al, 2013; Cao et al, 2015).

El consumo de vegetales contaminados con plomo puede causar a largo plazo efectos

nocivos principalmente en niños, y causar efectos como retraso en el crecimiento,

disminución de la capacidad intelectual y en adultos efectos como el aumento de la

presión arterial, efectos en la reproducción entre otras consecuencias (Orisakwe, et al,

2012). Por lo tanto, la exposición de plomo tanto en vegetales de consumo directo en

humanos como las hortalizas y forrajes para consumo animal a través del agua de riego

debe tener especial atención, debido a que, sustancias toxicas pueden tener como

reservorio final al ser humano.

2. Justificación

La exposición a bajas concentraciones de elementos tóxicos en el agua de riego en

plantas de consumo directo como acelga (Beta vulgaris) y lechuga (Lactuca sativa L.)

puede ser un factor de riesgo de exposición, dado a la bioacumulación de metales en sus

tejidos que luego pueden pasar a los seres humano mediante la alimentación (Miranda et

al, 2008).

La producción de alimentos libre de sustancias tóxicas debe tener relevancia en los

sistemas de salud pública de cada país, dado que, elementos nocivos provenientes de

las industrias pueden llegar a los sistemas de producción agrícola como pecuarios para

finalmente llegar a la cadena alimenticia de los seres humanos. No obstante, se hace

referencia de manera significativa al uso de Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) en los

sistemas de producción de alimentos debido a la importancia de una alimentación segura

y un ambiente sano.

A pesar de que en Colombia se regula el vertimiento y uso agrícola de sustancias tóxicas

proveniente de la actividad agroindustrial, minera, farmaceuta, calzado, joyería entre

otras a través de la resolusión 0631 de 2015 del Ministerio de Ambiente y el acuerdo

CAR 043 de 2006, aún existen dudas sobre el vertimiento y la exposición de sustancias

químicas tóxicas como el plomo en los seres vivos, dado que, son pocos los estudios

realizados en el país a lo referente.

Con esta investigación se busca evaluar el efecto tóxico generado por la exposición a

plomo en un sistema de producción hortícola con plantas de alto consumo en el país

como la acelga y la lechuga para estimar los efectos tóxicos y concentración

bioacumulable en el tejido vegetal, además de, ser un punto de referencia para nuevos

estudios de exposición a metales de interés toxicológico en plantas destinadas al

consumo humano en Colombia.

3. Pregunta de investigación

¿Cuál es el efecto del plomo en un agroecosistema y los factores que favorecen su

bioacumulación en acelga y lechuga?

4. Marco teórico

Las hortalizas son aquellas plantas herbáceas que se cultivan para el consumo humano

sin requerir un proceso de transformación y que en general pueden ser consumidas

frescas o cocinadas (FAO, 2011). Las hortalizas constituyen una fuente importante de

agua, minerales, fibra y vitaminas, favoreciendo el buen funcionamiento y equilibrio del

organismo humano (Ministerio de Agricultura, 2014). La mayor parte de las hortalizas son

hipocalóricas, es decir, aportan poco valor calórico y la mayoría de ellas no superan las 50

calorías por 100 gramos. En este sentido, todas estas propiedades hace que sea recomendable

el consumo diario de una ración de 100 y 250 gramos (FAO, 2011; Moreira, 2013).

4.1. Hortalizas en Colombia

En Colombia, según el Ministerio de Agricultura (2014), las hortalizas pueden clasificarse

de acuerdo al clima donde se cultivan, partes comestibles y duración de su cultivo. En la

tabla 4.1 se muestra la clasificación de las hortalizas.

Tabla 4.1. Clasificación de hortalizas por grupos según su clima, partes comestibles o

duración del ciclo de cultivo en Colombia.

Clasificación por clima Clasificación por partes

comestibles Clasificación por

duración de cultivo

Clima cálido (0-1000 msnm): ají, berenjena, melón y tomate.

Peciolos u hojas: Acelgas, apio, cebolla larga, col,

espinacas, lechugas, repollo y cilantro.

Perennes: Alcachofa, cebolla larga, espárrago y

ruibarbo.

Clima medio (1000-1800 msnm): cebolla de bulbo, habichuela, lechuga, pepino cohombro, pimentón, repollo y tomate.

Flor: Alcachofa, brócoli y coliflor

Anuales: Arracacha

Clima frio (1800-2800 msnm): Acelga, apio, arveja, brócoli, cebollas, col, coliflor, espinaca, lechuga, rábano, remolacha, repollo, alcachofas, coles, habas, y zanahorias.

Fruto: Ají, pimentón, berenjena, tomate, pepino,

ahuyama, calabacín.

Semestrales: Ajo, apio, cebolla de bulbo, puerro,

tomate, y zanahoria.

Vaina y semilla: Arveja,

habichuela, y habas

Uno a tres meses: Acelga, espinaca, lechuga, rábano

y cilantro.

Raíz: Arracacha, nabo, rábano,

y remolacha.

Fuente: Ministerio de Agricultura de Colombia, 2014



4.2. Producción de hortalizas en Colombia

La producción de hortalizas en Colombia durante los años 2014 y 2015 según el

Departamento Nacional de Estadísticas (DANE) y la Encuesta Nacional Agropecuaria

(ENA) fue alrededor de 1,296.908 y 1,137.585 Ton, respectivamente, lo que indica una

participación de 12% en 2014 y 10,5% en 2015 del total de la producción agrícola

nacional. Con respecto a las hortalizas de hoja, su participación en el total nacional fue

de 49,5 % y 56,2 % en 2014 y 2015, respectivamente (Tabla 4.2).

Tabla 4.2. Resumen de la producción nacional de hortalizas en los años, 2014 - 2015

(1) Ahuyama, berenjena, calabaza, melón, papa sidra, pepino cohombro, pimentón

(2) Acelga, cilantro, col, espinaca, lechuga, perejil, repollo

(3) Rábano, remolacha

(4) Brócoli, coliflor

(5) Ajo

(6) Esparrago, puerro

Fuente: DANE – ENA 2014 – 2015

HORTALIZAS

AÑO 2014 PARTICIPACIÓN % AÑO 2015 PARTICIPACIÓN %

1,296,908

12

1,137.585

10,5

Hortalizas de fruto (1)

153032

36,2

106116,1

29,6

Hortalizas de hoja(2)

209411,1

49,5

201173

56,2

Hortalizas de raíz (3)

23102,7 5,5 12817,8 3,6

Hortalizas de flor (4)

23851 5,6 27287,3 7,6

Hortalizas de bulbo(5)

12295 2,9 10431 2,9

Hortalizas de tallo (6)

1190,3 0,3 425 0,1

Marco teórico 13

Figura 4.1 (A) Superficie cosechada de acelga (Beta vulgaris) y (B) lechuga (Lactuca

sativa L) en los principales departamentos productores de Colombia durante el periodo

2007 – 2014.

Una de las principales hortalizas de hoja cultivadas en el país por su preferencia

gastronómica y propiedades organolépticas son la acelga y la lechuga. En el año 2014 el

área cosechada de acelga fue de 58 ha, mientras que, para lechuga la superficie

ocupada fue de 2,621 ha, en el departamento de Cundinamarca, siendo una de las

hortalizas de hoja mayormente cultivada y cosechada en el país (Figura 5.1, A y B)

(Ministerio de Agricultura, 2014).

Fuente: Ministerio de Agricultura, 2014

4.2.1 Acelga (Beta vulgaris)

Las acelgas son originarias de Asia y han sido cultivadas por las árabes desde el año

800 A.C (Costa et al, 2003). Su cultivo es tradicional en las regiones costeras de Europa

y norte de África con costas en el mar Mediterráneo. La acelga es una planta herbácea

de la familia de las quenopodiáceas, con hojas de color verde brillante y peciolos blancos

y carnosos, llamados pencas. La parte comestible de la acelga es la hoja, el peciolo y la

nerviación central (Costa et al, 2003). El número de variedades cultivadas es escaso y su

clasificación se establece en función de su color y tamaño de sus hojas (Costa et al,

2003).

A

B A



4.2.2. Valor nutricional de la acelga

La acelga es una fuente importante de vitaminas y de minerales como la vitamina A, C,

además de yodo, hierro y magnesio, posee alto valor nutricional pero bajo valor calórico y

constituye una excelente fuente de fibra. Las acelgas son recomendadas por su alto

contenido de calcio en la dieta de personas mayores, niños, mujeres embarazadas y

deportistas (Moreira, 2013). Sin embargo, está contraindicada en personas propensas a

padecer cálculos renales. En la tabla 5.3 se muestra el aporte nutricional en raciones de

entre 100 y 250 gramos.

Tabla 4.3. Valor nutricional de la acelga.

Aporte nutricional de la acelga en porciones de 100 y 250 gramos

Ración de 100 g Ración de 250 g Recomendación

día-hombres

Recomendación día-

mujeres

Energía (kcal) 41 72 3 2,3

Proteína (g) 2 3,5 54 41

Lípidos totales 0,4 0,7 100-117 77-89

AG saturados 0,03 0,12 23-27 18-20

AG mono insaturados 0,04 0,07 67 51

AG poliinsaturados 0,07 0,12 17 13

C18:2 linoleíco _ _ 10 8

Colesterol 0 _ menor a 300 menor a 230

Hidratos de carbono 4,5 7,9 375-413 288-316

Fibra (g) 5,6 9,8 mayor a 35 mayor a 25

Agua (g) 87,5 153 2,5 2,000

Calcio (mg) 113 198 1 1,000

Hierro (mg) 3 5.3 10 18

Yodo (µg) 35 61,3 140 110

Magnesio (mg) 71 124 350 330

Zinc (mg) 0,02 0 15 15

Sodio (mg) 147 257 menor a 2000 menor a 2.000

Potasio (mg) 550 963 3,5 3,5

Fósforo (mg) 40 70 700 700

Selenio (µg) 0,9 1,6 70 55

Tiamina (mg) 0,07 0,12 1,2 0,9

Riboflavina (mg) 0,06 0,11 1,8 1,4

Adaptado de: Moreira, 2013

Marco teórico 15

4.2.3. Lechuga (Lactuca sativa L.)

La lechuga es una herbácea anual que pertenece a la familia Compositae y corresponde

a la especie Lactuca sativa, presenta gran variedad genética debido a que existen

diferentes tipos de especies caracterizados por sus tipos de hojas. La lechuga tiene su

origen en las regiones templadas de Europa, Asia y América del norte y fue domesticada

por los egipcios en el 4500 A.C (García, 2013).

Las lechugas se clasifican en diferentes especies en las que encuentran las de hoja

sueltas, Lactuca sativa cv. Crispa, que poseen hojas de borde irregularmente recortado,

su ciclo es corto entre 55 a 75 días aproximadamente, lechugas de cabeza, Lactuca

sativa L cv. Capitata (L) Janchen que presentan hojas lisas, orbiculares y de textura

suave o mantecosa con hojas internas que forman un cogollo al envolver las hojas más

jóvenes que pueden o no formar una cabeza (Cámara de Comercio de Bogotá - CCB,

2015).

4.2.4. Valor nutricional de la lechuga

La lechuga es fuente importante de vitaminas y minerales, rica en calcio, hierro y

vitamina A, por su bajo valor calórico proporciona poca energía, proteína, ácido

ascórbico, tiamina, riboflavina y niacina. En la tabla 5.4 se muestra el aporte nutricional

por cada 100 gramos.

Tabla 4.4. Valor nutricional de la lechuga

Aporte nutricional de la lechuga en porciones de 100 gramos

Componente Cantidad aportada en 100

gramos Componente

Cantidad aportada en 100

gramos

Agua 88,9 Riboflavina 0,0006

Proteína 8,4 Carbohidratos 20,1

Calcio 0,4 Tiamina 0,0003

Fósforo 0,14 Grasa 1,3

Hierro 0,0075 Vitamina A 1,155 UI

Niacina 0,0013

Fuente: Programa de apoyo agrícola y agroindustrial, Cámara de Comercio de Bogotá -

CCB, 2015



4.3. Contaminantes en la agricultura

La producción de hortalizas en Colombia se ha caracterizado por la alta incidencia de

plagas, la degradación del medio ambiente y mal manejo de los suelos, que en su

conjunto ha influido negativamente en los rendimientos y la calidad de la producción

(Miranda et al., 2008; Ministerio de Agricultura, 2014). La presencia de contaminantes en

los alimentos potencialmente tóxicos para la salud de los seres humanos, proviene en su

mayoría del uso del agua contaminada con sustancias tóxicas provenientes de la

actividad industrial (Cooper et al, 2017).

La utilización de agua contaminada, podría ser una fuente de introducción de

contaminantes en la agricultura, dado que, sustancias potencialmente tóxicas podrían ser

transmitidas a sus consumidores mediante la cadena trófica o consumo directo (Thakur

et al, 2016; Al-Saleh et al, 2017).

El uso de agua contaminada para el riego de cultivos como las hortalizas en la sabana de

Bogotá, podría representar un riesgo para la salud de los seres humanos, dado que, las

plantas pueden incorporar en sus tejidos contaminantes como metales altamente tóxicos

para la salud provenientes de la actividad industrial (Corporación Autónoma Regional de

Cundinamarca - CAR, 2010; Ministerio de Agricultura, 2014).

La contaminación del suelo y por ende en la agricultura puede definirse como la

concentración de elementos o sustancias químicas a partir se producen efectos

desfavorables en la actividad biológica (Arroyabe et al, 2009). El suelo actúa como un

sumidero en el que los contaminantes se filtran o se transforman, dado que, por su

actividad biológica es considerado un depurador natural de los contaminantes.

Dependiendo del volumen y toxicidad de los contaminantes se puede presentar

sobresaturación y excesiva acumulación de sustancias químicas en el suelo, causando

degradación del mismo y por consiguiente contaminación (FAO, 2015, 2030 – Agricultura

Mundial hacia los años 2015/2030). Entre los poluentes más comunes se encuentran:

Pesticidas

Elementos inorgánicos

Marco teórico 17

Desechos orgánicos

Sales

Lluvia ácida

Entre otros

Dentro de los pesticidas se consideran los insecticidas, fungicidas, herbicidas,

nematicidas de la cual algunos no pueden ser biodegradados y persisten en el suelo o el

agua (DDT, organofosforados, carbamatos, entre otros). Dentro de los elementos

inorgánicos se pueden se encuentran principalmente los mestales como cadmio (Cd),

Niquel (Ni), Mercurio (Hg), Molibdeno (Mb), Boro (B), Cobre (Cu), Zinc (Zn) debido a que

están adsorbidos o en forma intercambiable y están disponibles para las plantas

(Mackenzie et al, 2005).

La salinidad por su parte, es un contaminante de origen agrícola dado por la calidad del

agua de riego, la lluvia ácida se debe a la oxidación del N y S principalmente cuando se

forma ácido nítrico y ácido sulfúrico en la atmósfera. También el exceso de NO3 y PO4 es

un contaminante en la agricultura debido a que, puede causar efectos como la

eutrofización en el agua (Mackenzie et al, 2005).

4.3.1. Quelatos en la agricultura

La bioacumulación de metales en el tejido comestible de las plantas, también puede ser

favorecida por algunas prácticas agrícolas como la adición de quelatos sintéticos (EDTA)

incorporados a la fertilización convencional. Los quelatos favorecen la toma de elementos

menores del suelo necesarios para la nutrición de las plantas como hierro (Fe), Magnesio

(Mg), Cobre (Cu) entre otros (Lee, et al, 2014; Naghipour et al, 2016) mejorando la

apariencia de las plantas y su desarrollo. Sin embargo, la adición de quelatos junto con

un pH moderadamente ácido podría favorecer la absorción y transporte de elementos

hacía las hojas de las plantas (Jarvis et al, 2002; Perea, 2010).

Los quelatos son compuestos químicos que al reemplazar las moléculas de agua

(Ligando) en los metales forman una estructura compleja en anillo que se denomina

quelatación (Brown et al, 2013). La quelatación es la habilidad que posee un compuesto



para formar una nueva sustancia con propiedades químicas diferentes a las del metal

original (Jez et al, 2016).

Algunos ligando más importantes son ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido

glucónico, ácido láctico, el ácido acético, el ácido Nitrilo-Tri-Acético (NTA), ácido Etilen-

Diamino-Tetra-Acético (EDTA) y ácido Tri-Poli- Fosfórico (TPPA), entre otros (Jez et al,

2016). Sólo los metales con una valencia igual o superior a +2 forman quelatos en

presencia de ligando, pero, iones metálicos con valencia +1 no forman quelatos sino

sales con el ligando en forma de anión o complejo sin estructura de anillo siendo soluble

o insoluble en agua (Naghipour et al, 2016). No obstante, los quelatos podrían favorecer

no solo la toma de elementos esenciales para la nutrición de las plantas, sino que también,

podrían favorecer la toma de metales potencialmente tóxicos para la el funcionamiento de

los seres vivos.

4.3.2. Metales contaminantes en suelos agrícolas

La contaminación por metales del agua subterránea, superficial y suelo constituye un

problema generalizado y representa una amenaza para las plantas, animales y seres

humanos (Zhao et al, 2016). Algunos metales considerados tóxicos para los seres vivos

como mercurio (Hg), Cadmio (Cd), Arsénico (As), Cromo (Cr), Talio (Tl) y Plomo (Pb)

entre otros, se encuentran en el suelo de manera natural en concentraciones trazas

formando parte de componentes naturales de la corteza terrestre en forma mineral como

las sales, sin embargo, han aumentado su concentración en el ambiente debido a su

explotación (Zhenli, 2005; Cooper et al, 2017).

La concentración de estos metales en el ambiente puede llegar a incrementarse

mediante la actividad industrial de las ciudades causando efectos tóxicos nocivos a la

salud de los organismos expuestos (Smolders et al, 2015). Su baja movilidad e

inexistente requerimiento en las funciones metabólicas de los seres vivos puede llevar a

su bioacumulación en los suelos, debido a, su imposibilidad de ser degradados o

distribuidos en la naturaleza de manera simple en los sistemas biológicos (Cooper et al,

2017).

Marco teórico 19

Los metales adicionados a los suelos se redistribuyen lentamente entre los componentes

de la fase sólida como arcilla, limo, arena pudiendo ser inmovilizados y acumulados para

posteriormente ser tomados por las plantas (Abollino et al., 2002; Han et al., 2003).

La exposición a plomo en el agua de riego en sistemas de producción de hortalizas en la

sabana de Bogotá podría constituir un importante problema salud pública, dado que,

hortalizas de hoja como acelga y lechuga cultivadas con agua de riego contaminada

podrían ser fuente de exposición a seres humanos mediante la alimentación, dado que,

las plantas poseen la habilidad de acumular en sus tejidos en concentraciones trazas del

metal. En el departamento de Cundinamarca el consumo de hortalizas como la mencionadas

anteriormente, el consumo según el Perfil Nacional de consumo de Frutas y Verduras de

Colombia (2013), es de aproximadamente de 18 a 20 gramos diarios por persona para acelga

y lechuga respectivamente (Miranda et al, 2008; Corporación Autónoma Regional de

Cundinamarca, 2010,).

4.4. Plomo en el Agroecosistema

El plomo es probablemente el primer metal extraído por el hombre desde la antigüedad y

su uso generalizado ha llevado a una extensa contaminación del suelo, desde 7000 a.C

ya era utilizado por los egipcios en cerámicas (Steinnes, 2013). El plomo está presente

de forma abundante en el ambiente y por consiguiente en la cadena trófica, siendo

prácticamente el metal de mayor interés toxicológico (Villarejo, 2006; Smolders et al,

2015). La utilización de plomo en la fabricación de contenedores de alimentos, vidrios,

baterías, aditivo pinturas, proceso de manufactura, además de, su presencia en red

doméstica de agua potable antigua lo han convertido en un metal de alto riesgo de

exposición tóxica para seres humanos (Roberts et al, 2014; Cooper et al, 2017).

El plomo es un elemento metálico que pertenece al grupo 14 de la tabla periódica, posee

dos estados de oxidación Pb (II) y Pb (IV) (IUPAC), y un bajo punto de fusión (324°C)

que ha permitido ser usado en la fabricación números elementos (Lu et al, 2017).

Las vías frecuentes de mayor exposición a plomo en los humanos pueden ser, la vía

digestiva y la respiratoria, sin embargo, existen otras formas de exposición como la



cutánea (Azario, 2014). En la Figura 5.2 se muestra el ciclo del plomo y sus principales

fuentes de exposición.

Figura 4.2. Ciclo del plomo en el agroecosistema

Tomado de: Villarejo, 2006

El plomo así como otros elementos metálicos como Cr, Cd, Ni entre otros, no son

considerados elementos esenciales para las plantas y animales incluido el ser humano,

pero podría llegar a ser tóxico en altas concentraciones (Hamels et al, 2014) causando

efectos negativos sobre el crecimiento y desarrollo en las plantas (Sharma, 2005; Cheyns

et al, 2012). En este sentido, al no tener una función metabólica específica en los

sistemas dentro de los procesos metabólicos de las plantas, puede ser tomado y

bioacumulado en bajas concentraciones (Cooper et al., 2017).

Los efectos tóxicos generados en las plantas por metales, depende en gran medida de la

concentración y el tiempo de exposición (Norton, et al, 2014). En altas concentraciones

se pueden generar efectos tóxicos agudos como inhibición de la germinación de semillas

y muerte celular (Alpizar, 2012), mientras que, la exposición a bajas concentraciones por

Marco teórico 21

un periodo de tiempo determinado puede causar la disminución de la biomasa vegetal,

disminución del crecimiento de tallo, hojas y raíces (Sobrero et al., 2008; Schwertfeger et

al, 2013).

4.4.1. Toxicidad del plomo en plantas

La toxicidad en las plantas causada por metales se manifiesta principalmente en suelos

ácidos afectando principalmente el crecimiento, la formación de raíces laterales y

secundarias (Tian et al, 2014). La absorción de metales por las plantas, se realiza

mediante flujo de masa e intercambio catiónico en las raíces (Abollino et al, 2005;

Azimzadeh et al, 2014).

Las raíces poseen cargas negativas y al unirse al espacio de la rizósfera con cargas

positivas del plomo, forman una interface de equilibrio lo que facilita su transporte por vía

apoplástica y simplástica (Azimzadeh et al, 2014).

Luego que el plomo ingresa a la planta, el mecanismo de toxicidad generado inhibe el

flujo de electrones de la cadena de transporte del ciclo de Calvin, causando que se

requiera mayor energía lumínica para llevar a cabo reacciones metabólicas normales en

la planta (Malar et al, 2014). Como consecuencia de lo mencionado, el aparato

fotosintético transfiere energía a los aceptores de electrones disponibles en los

cloroplastos cuyo producto final es el anión superóxido que forma finalmente peróxido de

hidrogeno (H2O2), causando finalmente la muerte celular (Malar et al, 2014; Cheyns et al,

2012).

También, el plomo inhibe el voltaje medio de la actividad de los canales de calcio

causando trasporte competitivo con el calcio, además de, inhibir la actividad enzimática

con los grupos sulfhídrilos (-SH) presente en el centro activo de los enzimas,

desestabilizando la estructura terciaria y por consiguiente la formación de nuevas

reacciones metabólicas (Malar et al, 2014).

En la tabla 4.5 se muestran los procesos metabólicos y los enzimas afectados por

exposición a plomo en plantas expuestas.



Tabla 4.5. Procesos metabólicos y enzimas afectadas por la exposición a plomo en plantas.

PROCESOS METABÓLICOS ENZIMAS EFECTO

Síntesis de clorofila alfa amino levulinato deshidrogenasa

-

Fijación de CO2 Ribulosa -1,5 bisfosfáto -

Ciclo de Calvin

Fosfoenol piruvato carboxilasa

-

Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa

-

Vía pentosa fosfato Ribulosa 5-fosfato kinasa -

Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa

-

Asimilación de N2 Nitrato reductasa -

Glutamina sintetasa -

Enzimas nucleolíticas Deoxyribonucleasa +

Ribonucleasa +

Hidrolisis de proteínas Proteasa +

Fosfohidrolasa Alcalina fosfatasa +

Acido fosfatasa +

Metabolismo de glucosa

alfa amilasa -

ATP sintetasa -

ATPasa -

Metabolismo antioxidativo

Catalasa -

Glucol peroxidasa +

Ascorbato oxidasa +

Ascorbato peroxidasa +

Adaptado y modificado de, Sharma et al., 2005.

Signo (+) incremento de la actividad, signo (-) decrecimiento de la actividad enzimática.

Los síntomas de toxicidad visibles en las plantas expuestas, pueden dividirse en

síntomas no específicos y específicos. Los síntomas visuales no específicos consisten en

una inhibición de germinación de semillas, crecimiento de la raíz, reducción del área

foliar, clorosis y aparición de manchas pardo rojizas fenólicas en tallos, peciolos, hojas y

necrosis foliar (Burton et al., 1994). Los síntomas específicos consisten en la disminución

del porcentaje e índice de germinación, disminución de la longitud de la radícula y

disminución del peso seco de las raíces y hojas (Burton et al, 1994; Mishra, 1998).

4.4.2. Plomo y las bacterias del suelo

Son muchos los microorganismos que habitan en el suelo, algunos son de vida libre y

otros que viven en simbiosis con las plantas en interacción mutualista para el intercambio

Marco teórico 23

de nutrientes (Esitken et al, 2010). Los microorganismos de vida libre llamados

diazótrofos son aquellos que no se asocian físicamente con las raíces de las plantas, sin

embargo, mantienen una relación mutualista para el intercambio de nutrientes (Watson et

al, 2017).

Pseudomonas fluorescens son bacterias Gram negativas de vida libre o diazótrofas que

se encuentran en el suelo de forma natural junto con diferentes poblaciones de

microorganismos (Godino et al, 2016). Estas bacterias están relacionadas con la

producción de fitohormonas como las auxinas y giberelinas que favorecen el crecimiento

de las plantas, de ahí su nombre como bacterias promotoras del crecimiento vegetal o

PGPB (Biocontrol-PGPB-Plant Growth Promoting Bacteria) (Fischer et al, 2013).

Algunos metales como el plomo interfieren en la ecología y el equilibrio del suelo,

afectando la actividad de los microorganismos y por consiguiente el rendimiento de las

plantas (Luo et al, 2014; Zheng et al, 2017). Algunos estudios han reportado el efecto

nocivo de los metales sobre las propiedades del suelo (pH, CIC, materia orgánica entre

otros), el crecimiento de las plantas y finalmente en la calidad de los alimentos (Pontoni

et al, 2016). Los indicadores de la calidad del suelo pueden ser observados por las

actividades microbianas (Parelho et al, 2016). Algunos estudios han demostrado que los

microorganismos del suelo son más sensibles a la mayoría de los metales que los

animales o las plantas que crecen en el mismo suelo, lo que los hace considerablemente

indicadores tempranos de contaminación (Colin et al, 2012).

La actividad de los microorganismos del suelo depende en gran medida de muchos

factores como la disponibilidad de elementos como el nitrógeno, pH, contenido de

materia orgánica, sin embargo, la presencia de metales tóxicos afectan negativamente

procesos como la nitrificación, solubilización de fósforo inorgánico, importantes para el

mantenimiento y equilibrio de los suelos (Zheng et al, 2017). El incremento del contenido

de metales tóxicos en el suelo puede causar efectos sobre las bacterias saprófitas,

nitrificantes y de vida libre, causando disminución de la biomasa microbiana (Guo et al,

2013). Algunos metales considerados tóxicos pueden causar efectos nocivos en los

microorganismos como inhibición de la elongación celular e inhibición de la división

celular lo que termina finalmente en el retraso del crecimiento de la bacteria y cambios en

la morfología celular (Liu et al, 2017).



En estudios realizados por Pérez et al, 2015 en experimentos con bacterias endófitas en

plantas de arroz en el Municipio de Montería - Córdoba, Colombia, encontró que

bacterias nativas del suelo y asociadas en las raíces de las plantas cómo Pseudomonas

pútida (M1 Tfm) y Burkhorderia cepacea (M2Tf733) disminuyeron su crecimiento al aumento

de la concentración de plomo en solución. Figura 5.3.

4.4.3. Plomo y su efecto en los seres humanos

La contaminación por metales es una preocupación a nivel mundial, dado que, no son

biodegradables y poseen una vida media extendida (Khan et al, 2015; Thakur et al, 2016)

y tienden a acumularse con el tiempo, se biomagnifican y en última instancia representan

una amenaza potencial para la salud humana (Tchounwou et al, 2012). La exposición

incluso a bajos niveles de plomo se ha asociado con efectos neurológicos,

inmunológicos, cardiovasculares, renales y/o reproductivos (Wang et al, 2013).

Los efectos de la exposición a plomo en seres humanos pueden también clasificarse en

agudos y crónicos (Goyer et al, 2001). Entre los efectos agudos sobre seres humanos

encontramos náuseas, vómitos, encefalopatía con cefaleas, convulsiones, ataxia, letargo,

mientras que la exposición crónica causa anemia, dolor abdominal, nefropatía, alteración

en las articulaciones de pies y muñecas, encefalopatía, aumento de la presión arterial y

disminución del volumen de los espermatozoides en el hombre y en mujeres

embarazadas puede generar el nacimiento de niños prematuros (Soghoian et al, 2008).

Figura 4.3. Efecto de la exposición a plomo en bacterias nativas asociadas a plantas de

arroz, Montería, Córdoba, Colombia

Marco teórico 25

La primera manifestación toxicológica del plomo es la anemia, debido que, impide la

formación de hemoglobina en bajas concentraciones y en dosis elevadas puede generar

manifestaciones neurológicas y encefalopatías (Bradberry, 2014). La toxicidad del plomo

se manifiesta en la inhibición de las enzimas AAL sintetasa, AAL dehidratasa y

hemosintasa y como resultado final es la inhibición de la formación de la hemoglobina.

En este sentido, los metabolitos resultantes AAL (Ácido amino-levulínico), PBG

(Porfobilinógeno) y PPIX (Protoporfirina) son eliminados por la orina y pueden servir

como indicadores de exposición a plomo o bioamarcadores.

En la figura 4.3 se muestra el proceso de inhibición de la formación de la hemoglobina

por exposición a plomo en seres humanos.

Figura 4.4. Inhibición de la hemoglobina por exposición a plomo.

Tomado de: Bradberry, 2014

Los órganos susceptibles a daño por exposición aguda a plomo son: el sistema nervioso

central en desarrollo y maduro, sistema hematológico y el sistema cardiovascular.

Mientras que, en exposiciones crónicas el plomo afecta los sistemas gastrointestinal,

renal, neuromuscular y hematopoyético (ATSRD, 2005; Flora, 2008).



La concentración de plomo en sangre indica una exposición reciente en comparación con

la concentración de plomo en hueso que indica una exposición en el tiempo (Bradberry,

2014). La concentración en sangre por debajo de 10 μg∙dL-1 ha sido considerada

aceptable, sin embargo, debido a su carácter acumulativo, ninguna dosis de exposición

es considerada como segura y sus efectos causados a largo plazo (Villarejo, 2006; Flora,

2008; JECFA/WHO, 2013).

En la tabla 4.6 se muestra el efecto del plomo de acuerdo con su concentración en

sangre.

Tabla 4.6. Efectos tóxicos del plomo de acuerdo a su concentración en sangre.

CONC. SANGRE EFECTOS POBLACIÓN

> 40 µg·dL-1

ANEMIA NIÑOS

> 50 µg·dL-1

ANEMIA ADULTOS

> 50-60 µg·dL-1

DISFUNCION ENCEFÁLICA NIÑOS

> 60-70 µg·dL-1

DISFUNCION ENCEFÁLICA ADULTOS

> 60-70 µg·dL-1

ENCEFALOPATÍAS NIÑOS

> 80 µg·dL-1

ENCEFALOPATÍAS ADULTOS

Adaptado de: Villarejo, 2006

4.5. Límites máximos permisibles de plomo en agua de riego y hortalizas en Colombia.

Los alimentos son una fuente importante de contaminación por metales en la población

en general (Kabata, 2000; Orisakwe, et al, 2012) y son considerados la principal fuente

de exposición directa seguida de la ambiental, dado que, metales como el plomo se

absorben directamente por las mucosas y el tracto digestivo, siendo esta última donde se

obtiene mayor tasa de absorción (Vega, 1990; Subset, 2003; Ma, 2002; Patrick, 2006).

En consecuencia, entidades de salud gubernamentales, Ministerios y organizaciones

internacionales han establecido límites máximos permisibles de exposición a diferentes

contaminantes tóxicos en los alimentos, en el agua potable y el agua para riego de

cultivos (Ministerio de Agricultura, 1984; CAR, 2010). En Colombia se ha establecido

Marco teórico 27

como límite máximo permisible el contenido de plomo de 0,3 mg∙kg-1 de peso fresco en

hortalizas de consumo directo en humanos en la resolución 4506 del 30 de octubre de

2013 por el Ministerio de Salud y Protección Social y otras sustancias consideradas

tóxicas en los alimentos, así como también, se ha tomado como partida la Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la alimentación (FAO) y la Organización

Mundial de la Salud (OMS) en el Codex alimentarius (CX/FAC 00/24, Diciembre de

1999).

También, ha sido establecido el contenido de plomo en el agua de riego para cultivos y

vertimiento puntual a cuerpos de agua y alcantarillado en el acuerdo 043 de 2006 de la

Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca (CAR) y la resolución 0631 de 2015

del Ministerio de Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible de la República de Colombia de

0,1 y 0,2 mg∙L-1 de plomo, respectivamente.

4.6. Riesgo tóxico por consumo de hortalizas con plomo.

Según el Perfil Nacional de Consumo de Frutas y Verduras de Colombia (PNCFV) 2013,

el consumo promedio de acelga y lechuga en el departamento de Cundinamarca es de

aproximadamente 20 gramos por persona al día (Tabla 4.7).

Tabla 4.7. Consumo por persona de acelga y lechuga en el departamento de

Cundinamarca

Tomado de: Perfil Nacional de Consumo de Frutas y Verduras de Colombia, 2013.

Para la identificación de la peligrosidad de una sustancia se requieren datos básicos que

permitan evaluar los efectos tóxicos (peligrosidad y relación dosis-respuesta) con ello se

CONSUMO PROMEDIO POR PERSONA EN

CUNDINAMARCA

HORTALIZA

ACELGA LECHUGA

20 g día·persona-1

18 g día·persona-1



pueden clasificar y decidir sobre sus restricciones de uso y límites máximos permitidos

(Cameán, 2006).

Para evaluar los riesgos tóxicos en humanos de una sustancia se requieren datos que

permitan, a) evaluar la exposición real del riesgo como consecuencia del uso de la

sustancia, b) la relación dosis respuesta para el establecimiento del nivel de efecto

adverso observable (Cameán, 2006). Para la estimación del riesgo tóxico por ingesta de

plomo, se emplea la Dosis de Referencia (DREF) en alimentos según la FAO – JECFA

(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives) 2011.

entona

entoa alPesocorpor

FPFEiónconcentracconsumoExposicion

lim

1lim

***

Ecuación

(1)

Donde, exposición es igual a la sumatoria del consumo (gramos diarios), concentración

(en mg·kg-1 del contaminante), FE, factor de exposición (1), FP, factor de procesamiento

(1), dividido entre el peso corporal del individuo, donde se estima en promedio 60

kilogramos para adultos.

Según la DREF la dosis máxima sugerida para plomo, es de 25 µg·kg-1 de peso corporal

semanal, equivalente a 3,5 µg·kg-1 día. Sin embargo, en su última norma la FAO-JECFA,

2013 no recomienda ninguna concentración de plomo como segura en los alimentos

debido a su carácter acumulativo. Una ingesta de plomo en adultos entre 0,02 a 3 µg·kg-1

de peso corporal/día y de 0,03 a 9 µg·kg-1 en niños de peso corporal/día podría generar

efectos nocivos a la salud (Cameán, 2006; Repetto, 2006).

5. Objetivos

5.1. Objetivo General

Evaluar el efecto y la bioacumulación del plomo en plantas de acelga (cv común) y

lechuga (cv crispa) y su efecto generado en el crecimiento de microorganismos

rizosféricos (Pseudomonas fluorescens).

5.2. Objetivos específicos

Determinar la influencia de la exposición aguda a plomo sobre la germinación y

elongación de radícula e hipocótilo en semillas de acelga (cv común) y lechuga (cv

crispa).

Cuantificar el efecto de la exposición crónica sobre el crecimiento y bioacumulación

de plomo en plantas de acelga (cv común) y lechuga (cv crispa) bajo condiciones

controladas.

Evaluar el uso de microorganismos rizosféricos (Pseudomonas fluorescens) como

bioindicador a la exposición crónica a plomo en un agroecosistema hortícola.

6. Materiales y métodos

Con el propósito de dar cumplimiento a los objetivos propuestos en el presente estudio,

se desarrolló en el laboratorio de Malherbología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la

Universidad Nacional de Colombia tres experimentos de exposición a plomo, los cuales

son relacionados en la figura 6.1. También, en la figura 6.2 se fundamenta el uso de las

diferentes dosis de plomo utilizadas en los ensayos.

Figura 6.1. Experimentos desarrollados para la evaluación de la exposición aguda y

crónica en diferentes dosis de exposición a plomo en plantas de acelga (cv común) y

lechuga (cv crispa).

Invernadero

Evaluación de la exposición

aguda a plomo

Semillas de acelga y

lechuga

Evaluación de la exposición

crónica a plomo

Hidroponía

Recuento de

bacterias

1 2

EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN A PLOMO EN PLANTAS

DE ACELGA Y LECHUGA

3

Determinación de la bioacumulación

de plomo en hoja y raíz de plantas de

acelga y lechuga



Figura 6.2. Fundamento de las diferentes dosis de plomo utilizadas en los experimentos

de exposición aguda y crónica.

6.1. Experimento 1: Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas de acelga y lechuga.

En el presente experimento, se utilizaron semillas certificadas de acelgas (cv. común) y

lechuga (cv. crispa) con un porcentaje de germinación del 90% y pureza del 99%

proveniente de casa comercial con lote número 00210054, 39774647 para acelga y

lechuga respectivamente (Fercon, Colombia). Se utilizaron 20 semillas para cada especie

de plantas con tres réplicas por dosis de exposición en cajas Petri de 100 mm de

diámetro y papel filtro (2W, Sigma-Aldrich, Co, USA) para un total de 300 semillas por

ensayo. Las semillas contenidas en las cajas Petri fueron impregnadas con 4 ml

aproximadamente de solución de nitrato de plomo Pb (NO3)2 (Panreac, Darmstadt,

ACUERDO CAR –

CUNDINAMARCA 043 DE 17

OCT DE 2006 – “POR EL

CUAL SE ESTABLECEN LOS

OBJETIVOS DE CALIDAD

DEL AGUA A LOGRAR EN

EL AÑO 2020”

RESOLUCIÓN 0631 DE 17

MARZO DE 2015 DE MINISTERIO

DE AMBIENTE Y DESARROLLO

SOSTENIBLE “DÓNDE SE

ESTABLACEN LOS

PARÁMETROS Y LÍMITES

PERMISIBLES PARA

VERTIMIENTO”

Dosis 0,2 mg.L

-1

Parámetros físico químico y sus

valores máximos permisibles en

los vertimientos puntuales

provenientes de Agroindustria,

Minería, Alimentos y Bebidas

entre otros.

Dosis 0,025 mg.L

-1

Concentración en

promedio rio Bogotá,

basados en los

reportes CAR en los

diferentes tramos

del rio.

Dosis 0,05 mg.L

-1

Condiciones ideales

para el año 2020 de

acuerdo con los

recursos para el

desarrollo

económico.

Dosis 0,1 mg.L

-1

Clasificación de usos

del agua de la cuenca

del río Bogotá. Clase

IV. Uso agrícola con

restricciones y

pecuario.

Como tratamiento control se usó agua proveniente del

acueducto con una concentración de plomo de 0,78 µg.L

-1.

Materiales y métodos 33

Alemania) para cada una de las dosis establecidas (Figura 7.3 a). Posteriormente, fueron

colocadas en cámara de germinación (BD 115, Binder, Alemania) a una temperatura de

22°C ± 2 durante 120 horas (Figura 7.3 b), siguiendo la metodología de Sobrero, et al.

2008. Después del tiempo de exposición, fue tomado el porcentaje de germinación

mediante el conteo directo, toma de lectura de la longitud de hipocótilo y radícula

(Micrómetro, DIGITAL CALIPER 0-150 MM, USA) (Figura 6.3 c, d).

Figura 6.3. Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas de acelga y lechuga

durante 120 horas.

a) Montaje de ensayo de exposición aguda b) Incubación a 22°C ± 2

c) Germinación de semillas d) Lectura de la elongación de hipocótilo y radícula

6.2 Experimento 2 (a) Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y lechuga en medio hidropónico

Este experimento fue llevado a cabo en el laboratorio de Fisiología de Cultivos de la

Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia ubicado en la

ciudad de Bogotá a una altura de 2556 msnm, (4°35’56’’ y 74°04’51’’) durante 60 días



(marzo a mayo de 2016). Para la realización de este experimento se utilizaron un total de

120 plántulas por duplicado de acelga (cv común) y lechuga (cv crispa) con

aproximadamente 30 días de germinadas proveniente de vivero de un mismo lote de

plántulas, cada dosis de exposición incluido el control contenía 12 plántulas, tanto para

acelga y lechuga (12 plántulas x 5 tratamientos). Este experimento tuvo una duración

total de 60 días, iniciando a los 15 días después del periodo de aclimatación y/o

adaptación de las plantas al nuevo medio de crecimiento.

Las condiciones de crecimiento de las plántulas en el laboratorio fueron: Temperatura

promedio de 22°C, humedad relativa de 60 a 80% fotoperiodo artificial con lámparas de

luz incandescente de 12 h y con una radiación fotosintética activa de 800 µmol m2∙s-1.

Las plantas fueron evaluadas en un sistema de hidroponía flotante con recipientes de

vidrio de 80 L de capacidad (Figura 6.4).

Figura 6.4. Establecimiento del experimento de exposición crónica a plomo en solución

nutritiva (Hidroponía).

Las plántulas fueron fertilizadas tomando la recomendación de la casa comercial de 0,5

ml·L-1 de solución. La solución de hidropónica para el crecimiento de las plántulas (Nutri-

Ponic, Walco S.A., Bogotá D.C., Colombia) contenía: Nitrógeno nítrico, 40,3 g∙L-1, Nitrógeno

amoniacal, 4 g∙L-1; P asimilable (P2O5), 20,4 g∙L-1; K soluble (K2O), 50,6 g∙L-1; 28,8 g∙L-1 Ca;

11,4 g∙L-1 Mg; 1,0 g∙L-1 S; 1120 mg∙L-1 Fe; 112 mg∙L-1 Mn; 12,0 mg ∙L-1 Cu; 26,4 mg∙L-1 Zn;

106 mg∙L-1 B; 1,2 mg∙L-1 Mo y 0,36 mg∙L-1 conductividad eléctrica (C.E) de 2,0 mmhos∙cm-3 y

un pH de 5.8.


El sustrato líquido de cada una de las piscinas fue reemplazado cada 15 días con la

finalidad de mantener tiempos exactos de exposición al contaminante y teniendo en

cuenta el desarrollo de los cultivos seleccionados. Se mantuvo un volumen aproximado

de 10 L de solución nutritiva y la dosis de plomo establecida para cada tratamiento, el

cual contó con cuatro repeticiones (planta experimental) como unidad de muestreo para

cada tratamiento incluido el testigo.

Luego, se determinó el peso seco de cada unidad experimental a los 15, 30 y 45 días

mediante el uso de la balanza analítica (100 A XE Series, Denver, USA) realizando

muestreo destructivo hasta terminar el ensayo. El experimento tuvo una duración de 60

días, iniciando a los 15 después del proceso de aclimatación. Para la recolección de los

datos se tomaron 4 plantas para cada punto de muestreo (15, 30 y 45 DIT) después de la

exposición a plomo en cada uno de los tratamientos incluido el testigo, tomando cada

planta como una unidad experimental.

6.3. Experimento 2 (b). Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga, lechuga y Pseudomonas fluorescens en condiciones de invernadero.

Este ensayo se desarrolló en el invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias de la

Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá a una altura de 2,556 msnm, ubicado a

4° 35’56’’LN y 74°04’51’’LO, entre los meses de febrero y abril de 2016. Al igual que en el

experimento anterior, este ensayo tuvo una duración total de 60 días, iniciando 15 días

después del periodo de adaptación de las plantas al nuevo medio de crecimiento. Las

condiciones ambientales del invernadero durante el ensayo fueron: Temperatura diurna

de 25°C, humedad relativa de 60% y fotoperiodo natural de 12 horas. En este ensayo, se

utilizaron un total de 180 plántulas, 90 de acelga y 90 de lechuga correspondiente a

variedades común y crispa, respectivamente. Cada tratamiento incluido el testigo contó

con tres plántulas modificando la metodología empleada por Miranda et al, 2008.

Estás plántulas fueron adquiridas en vivero con aproximadamente 30 días de germinadas

provenientes de un mismo lote, las cuales fueron trasplantadas en macetas de 500 ml



con suelo de textura franco-limoso proveniente de casa comercial (ANASAC, Colombia)

con una concentración inicial de plomo de 5,00 mg∙kg-1 (Figura 6.5).

Los tratamientos de fertilización y exposición crónica a plomo fueron establecidos

después de un periodo de aclimatación de 15 días. Las plántulas de acelga (cv común) y

lechuga (cv crispa) fueron divididas en dos grupos según los tratamientos de fertilización

con elementos menores. Las dosis establecidas de los fertilizantes para la nutrición de

las plantas fueron tomadas por recomendación de la casa comercial de los fertilizantes

mayores (Triple 15), elementos menores y quelatos. El primer grupo (90 plántulas)

consistió de plántulas de ambas especies fertilizadas con elementos menores (Boro,

Cobre, Manganeso, Zinc), sin quelatos (Micromate, Colinagro, Colombia). El segundo

grupo (90 plántulas) consistió de plántulas de ambas especies fertilizadas con

microelementos en forma quelatada con EDTA (Cosmoquel, Cosmoagro, Colombia). La

dosis usada en ambos fertilizantes de elementos menores y en forma quelatada fue de

0.16 gramos·maceta-1 (Dosis tomada de la casa comercial)

Figura 6.5. Establecimiento del experimento de exposición crónica a plomo en invernadero

Adicionalmente, todas las plantas fueron fertilizadas con triple quince (Fertilizante

convencional) en una composición de 15% N-P-K (Fertilika, Ferricompuestos Ltda.,

Colombia) a una dosis de 0,5 gamos por planta (Tomada de la ficha casa comercial para

hortalizas). Después de la fertilización, ambas especies de plantas fueron irrigadas tres

veces por semana con 50 ml de la dosis de exposición a plomo para cada tratamiento en

el agua de riego, la cual contó con tres repeticiones para cada tratamiento incluido el

testigo tomando a cada planta como unidad experimental (Figura 6.5).


Se tomaron 3 plantas de cada uno de los tratamientos en cada punto de muestreo (15,

30 y 45 DIT) con fertilización convencional y fertilización con quelatos.

Determinación de la concentración de plomo bioacumulado en el tejido vegetal y

en suelo en el experimento 2.

La determinación de plomo bioacumulado en las plantas de acelga y lechuga se llevó a

cabo mediante el equipo de Espectroscopia de Absorción Atómica (EAA) con horno de

grafito (Thermo ICE 3000, Thermo Fisher Scientific, USA) en el laboratorio de Toxicología

de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá

utilizando el método AOAC 999.10. El fundamento del método analítico consistió en la

lectura de la radiación generada por el metal excitado en la lámpara de plomo de cátodo

hueco en el equipo de EAA mediante el software SOLAAR ® del equipo Thermo ICE

3400. La determinación de plomo se realizó a una longitud de onda de 217 nanómetros

(nm) con un rango de trabajo de 2,5 a 50 µg·L-1. Se realizó curva de calibración para

ajustar la linealidad del equipo en una concentración de 2,5 – 10 – 20 y 50 µg·L-1 de

plomo y se obtuvo finalmente un R2 de 0,993 (Tabla 6.3 - Figura 6.6).

Tabla 6.3. Ajuste para la linealidad del equipo EAA, ICE 3300

Soluciones para la calibración

Concentración estándar de calibración (µg·L

-1)

Promedio absorbancias

Blanco 0,0 0,0023

Estándar 1 2,5 0,0939

Estándar 2 10 0,2365



Figura 6.6. Curva de calibración para plomo en equipo de EAA ICE 3300.



Procedimiento

Se tomaron un total de 210 muestras vegetales expuestas a plomo de cada uno de los

tratamientos incluyendo el testigo y se procedió a secar a cada planta como unidad

experimental en horno de secado (BD 115, Binder, Alemania) a 70° Celsius durante 72 horas

(Figura 7.7. a) para luego macerar y pesar. Luego, se pesaron 0,5 gramos tanto de suelo

como del material vegetal seco y macerado en balanza analítica (100 A XE Series, Denver,

USA), después se adicionaron 5 ml de ácido nítrico HNO3 al 65% Suprapur (Merck, Millipore,

Alemania) y 2 ml de peróxido de hidrogeno H2O2 (EMSURE, Alemania) en tubo de

polipropileno de 50 ml (Falcon, Corning Life Sciences, USA) para su digestión en equipo

digestor microondas (MARS 6, CEM, USA) durante 40 minutos a una temperatura de 90°

Celsius (Figura 7.7. b). Luego, fue filtrado mediante embudo de polipropileno y papel filtro

(2W, Sigma-Aldrich, Co, USA) todas las muestras digeridas (Figura 6.7. c) para lectura en

equipo (EAA) Thermo ICE 3300 (Figura 6.7. d).

Figura 6.7. Digestión, filtrado de material vegetal y lectura en equipo de EAA.

Preparación de la muestra

Absorb

ancia

s

Concentración µg·L-1

a) Macerado y triturado del material vegetal b) Digestión en microondas


Se tomó 1 ml de la muestra digerida la cual se dispensó en un balón aforado de 10 ml,

luego, se adicionó 500 µL de modificador de matriz Mg (NO3)2 al 5%, y se llevó a volumen

con agua destilada des ionizada (Tipo 1), siguiendo la metodología AOAC 999.10. Las

muestras así preparadas fueron inyectadas en el EAA para lectura.

Lectura e interpretación

El valor de absorbancia arrojado por el equipo para cada una de las muestras se

interpoló en la curva de calibración para determinar el valor de la concentración de plomo

correspondiente. El software del equipo realiza el cálculo estimando la curva de

calibración estableciendo la concentración del plomo en µg·L-1 (Figura 6.6).

6.4. Experimento 3. Evaluación de la exposición crónica a plomo en bacterias.

La evaluación del crecimiento y biomasa de Pseudomonas fluorescens fue evaluado a

los 0, 15, 30 y 45 días del inicio de la exposición a plomo siguiendo la metodología de

Alonso et al., 2008. Se tomaron 10 gramos de suelo rizosférico (área de influencia de la

raíz) de cada una de las plantas expuestas a plomo en las diferentes dosis (Figura 6.8 a

y b).

Figura 6.8. Rizósfera (área de influencia de la raíz de las plantas) para la determinación

de la población de Pseudomonas fluorescens en las dosis 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 mg·L-1 Pb

c) Filtrado del material vegetal y suelo d) Lectura en equipo EAA



a) Suelo rizosférico b) Suelo para diluciones seriadas

Posteriormente se tomaron 10 gramos de suelo rizosférico expuesto en los distintos

tratamientos y se adicionaron a 90 ml de agua destilada tipo 1 para la realización de diluciones

seriadas en tubos de ensayo (Pyrex, Alemania). Luego, se realizó siembra masiva vertiendo

0,5 µL de la dilución (1:10) en medio de cultivo en Agar nutritivo (Merck, Millipore, Alemania)

para su posterior incubación en cámara de crecimiento a una temperatura de 28° Celsius (ED

115/E2, Binder, Alemania) durante 72 h (Figura 7.9 a) Luego, se realizó tinción Gram y

observación directa en microscopio óptico (Alphashot 2, Nikkon, Japón) en objetivo 100x

(Figura 7.9 b). Posteriormente, se realizó siembra masiva por agotamiento con asa bacteriana

en agar King B (Pseudomonas Agar Base, Mast group, USA) para la observación

fluorescencia en cámara oscura y luz UV (figura 6.9 c, d). Se determinó el diámetro bacteriano

mediante la toma del diámetro de las colonias (Micrometro, DIGITAL CALIPER 0-150 MM,

USA).

Figura 6.9. Recuento y determinación de Pseudomonas fluorescens. (a) Colonias bacterianas

en ufc·g-1 de suelo (b) bacilos cortos Gram negativos (c) Siembra en medio King B (d)

Fluorescencia en cámara oscura y luz UV.

(a) Colonias aisladas de Pseudomonas fluorescens (b) Observación de bacilos cortos Gram negativos


(c) Siembra en placa en medio de cultivo King B (d) Producción de fluorescencia bajo luz UV

Por otro lado, la toma de lectura del pH del suelo expuesto a plomo en el experimento de

exposición crónica (Experimento 2, Invernadero), fue tomada mediante lectura en

pHmetro (OAKTON Instruments, PC 700, USA) a los 15, 30 y 45 días de exposición en

solución 1:1, 10 gramos de suelo fueron disueltos en 10 ml de agua destilada por

triplicado de cada uno de los tratamientos de exposición, siguiendo el método de pasta

de saturación de Andrades et al, 2015 (Figura 6-10).

Figura 6-10. Toma de lectura de pH al suelo expuesto a plomo.

6.5. Diseño estadístico

El estudio realizado en esta investigación fue de tipo experimental, ya que se

manipularon los sujetos de estudio, en este caso como se explica en la metodología

desde la germinación hasta la cosecha.



El diseño estadístico fue completamente aleatorizado aplicando análisis de varianza y

arreglo factorial con contrastes polinómicos, así como Test de Tukey para determinar las

diferencias de medias de cada uno de los tratamientos. Se emplearon valores de P ≤

0,05; 0,01 y 0,001. Los datos generados por el equipo EAA – HG se captaron con el

software SOLAAR marca Thermo®. Para la tabulación de los datos del contenido de

plomo en las muestras vegetales analizadas, se utilizó Microsoft Office Excel 2010.

Para el tratamiento de los datos se utilizó un software Statistix 9.0 (Analytical Software,

Tallahassee, FL, EUA), y la elaboración de los gráficos se realizó mediante el software

Sigma Plot 12.0 (Systat Software, Inc, Poland).

7. Resultados

7.1. Evaluación de la exposición aguda a plomo en semillas

En la tabla 7.1. Se observaron diferencias estadísticas significativas únicamente en

semillas de acelga (cv. común). En semillas de acelga el porcentaje de germinación

disminuyó al incrementarse la concentración de plomo, observándose menor germinación

(73%) en la dosis de exposición de 0,2 mg∙L-1 con respecto al testigo. En semillas de

lechuga, la germinación no fue afectada por los diferentes tratamientos de exposición a

plomo y no se observaron tales diferencias.

Tabla 7.1. Porcentaje de germinación de semillas de acelga y lechuga expuestas de

manera aguda a diferentes dosis de plomo.

Porcentaje de germinación (%)

Dosis de

exposición a Pb ACELGA DE LECHUGA DE

(mg∙L-1

Pb)

0,000 91,66 ± 2,89 95,00 ± 5,00

0,025 86,66 ± 2,89 91,66 ± 2,89

0,050 88,33 ± 2,89 91,66 ± 2,89

0,100 88,33 ± 5,77 91,66 ± 2,89

0,200 73,33 ± 2,89 90 ± 5,00

1Significancia L**

NS

2CV

(%) 4,26 4,21

1NS y L**: No significativo y Lineal a P ≤ 0,01.

2Coeficiente de variación

DE: Desviación Estándar

Cada valor corresponde a la media ± la desviación estándar.



El crecimiento del hipocótilo fue afectado por la exposición aguda en las semillas de

acelga, evidenciándose disminución de su longitud con respecto al testigo. En lechuga no

fueron observados diferencias estadísticamente significativas (Figura 8.1 A).

El crecimiento de radícula en ambas especies fue afectado negativamente por la

exposición a plomo en los tratamientos, donde se observó menor longitud en la dosis de

0,2 mg∙L-1 en ambas especies (figura 7.1 B).

Figura 7.1. Efecto de la exposición aguda de cinco concentraciones de plomo (0,0;

0,025; 0,05; 0,1; 0,2 mg∙L-1) sobre la longitud del hipocótilo (A) y radícula (B), en plántulas

de acelga (cv. común) y lechuga (cv. crispa) durante 120 horas

Longitu

d d

e h

ipocótil

o (

cm

)

0

1

2

3

4

5ACELGA

LECHUGA

Dosis de exposición aguda a Pb (mg.L-1

)

0 0.025 0.05 0.1 0.2

Longitu

d d

e r

adíc

ula

(cm

)

0

1

2

3

4

5ACELGA

LECHUGA

A

B

CV:8.43

NS

L**,C*

CV: 10.89

CV:6.69

L***, C**

CV:12.65L*

CV: Coeficiente de variación. L y C: lineal y cubica. *,** y *** significancia a P 0,05; 0,01 y

0,001, respectivamente.

Hipocótilo

Radícula

Resultados 45

7.2. Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y lechuga bajo condiciones de hidroponía

La tabla 7.2 muestra el peso seco o biomasa total de las plantas de acelga y lechuga que

fueron expuestas a plomo en solución nutritiva (Hidroponía). De manera general fueron

observados diferencias estadísticas a los 30 y 45 DIT. En las plantas de acelga se

observó una respuesta lineal negativa, con un peso seco (1,0 g) en la dosis de

exposición de 0,2 mg∙L-1 con respecto a las plantas control (1,84 g), a los 30 DIT. A los

45 DIT también se observó una tendencia similar a la descrita anteriormente, con

disminución de la biomasa vegetal en todas las dosis de exposición a plomo con respecto

al testigo. En cuanto a las plántulas de lechuga, solo a los 15 DIT fueron observadas

diferencias entre los tratamientos y a los 30 y 45 DIT tales diferencias no se mantuvieron.

Tabla 7.2. Biomasa total de plantas de acelga y lechuga expuestas a plomo bajo

condiciones de hidroponía.

Peso seco total de plantas (g)

Días de inicio de los tratamientos (DIT)

ACELGA

(mg·L-1

Pb) 15 DE 30 DE 45 DE

0,000 0,3 ± 0,10 1,84 ± 0,61 7,9 ± 1,50

0,025 0,21 ± 0,03 1,56 ± 0,30 5,45 ± 1,16

0,050 0,22 ± 0,07 1,53 ± 0,29 4,7 ± 1,62

0,100 0,22 ± 0,04 1,3 ± 0,18 3,86 ± 2,21 0,200 0,23 ± 0,03 1,0 ± 0,65 3,18 ± 1,40

SIGNIFICANCIA NS L* L**

CV (%)1 26,55 31,02 32,33

LECHUGA

(mg·L-1

Pb) 15 DE 30 DE 45 DE

0,000 0,21 ± 0,02 1,52 ± 0,29 3,88 ± 0,54 0,025 0,16 ± 0,03 1,19 ± 0,39 3,62 ± 1,66

0,050 0,20 ± 0,02 1,22 ± 0,49 3,47 ± 0,56

0,100 0,26 ± 0,04 1,34 ± 0,12 3,44 ± 0,67 0,200 0,25 ± 0,05 1,39 ± 0,15 3,37 ± 0,66

SIGNIFICANCIA2 L*, C* NS NS

CV (%) 17,27 24,36 25,98 1CV: coeficiente de variación

2NS y L, C: No significativo. Lineal, cuadrático. *, ** Significativamente diferente en los

niveles de probabilidad 0,05 y 0,01 respectivamente.

Cada valor corresponde a la media de cada tratamiento ± Desviación Estándar (DE).



En la figura 7.2 se muestra la concentración de plomo bioacumulado en hoja y raíz de las

plantas de acelga y lechuga después de la exposición crónica a plomo en medio

hidropónico. En ambas especies de plantas, la concentración foliar de plomo fue

favorecida por los tratamientos tanto en hojas como raíces.

En la dosis de exposición de 0,1 mg∙L-1 se observó la mayor concentración de plomo

foliar al término del experimento, con valores de 0,7 y 1,1 mg∙kg-1 tanto para acelga como

lechuga, respectivamente (Figura 8.2 A). Sin embargo, la concentración de plomo en las

raíces fue mayor en comparación con la parte aérea de ambas especies de plantas con

valores de 12 mg∙kg-1 en acelga en la dosis de 0,05 mg∙L-1, mientras que, en lechuga la

máxima concentración de plomo acumulado tuvo lugar en la dosis de 0,1 mg∙L-1 con un

valor de 11 mg∙kg-1 de plomo (Figura 7.2 B).

Figura 7.2. Concentración de plomo bioacumulado en hojas (A), raíces (B), de plantas de

acelga y lechugas cultivadas en un medio hidropónico.

Con

cent

raci

ón d

e P

b en

hoj

a (m

g. k

g-1)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

ACELGA

LECHUGA

0 0.025 0.05 0.1 0.2

Con

cent

raci

ón d

e P

b en

raí

z (m

g. k

g-1)

0

2

4

6

8

10

12ACELGA

LECHUGA

A

B

L***,Q**,C**

L***,Q***,C***

L***,Q***,C***

L***,Q***,C***

CV:4.55

CV:8.47

CV:3.23

CV:4.19

Concentraciones de Pb en la solución de hidroponía (mg.L-1)

CV: Coeficiente de variación. L, Q y C: Lineal, cuadrático y cúbico. *, **, *** Significante

en niveles de probabilidad de ≤ 0,05; 0,01 y 0,001, respectivamente.

Hoja

Raíz

Resultados 47

En la figura 7.3 se observa el contenido de plomo (µg) en los diferentes órganos de las

plantas de acelga y lechuga que fueron expuestas. De manera general se observó una

respuesta lineal positiva (P≤ 0,05) sobre el contenido en función de los tratamientos en

ambas especies de plantas. La bioacumulación fue mayor en la parte aérea en plantas

de lechuga que en plantas acelga (Figura 7-3 A).

En la dosis de 0,2 mg∙L-1, el contenido de plomo en hojas de lechugas fue de 2,83 µg,

mientras que, en acelga fue de alrededor de 2,35 µg, mostrando mayor contenido de

plomo acumulado en lechugas. Sin embargo, el plomo contenido en las raíces fue

mayor en las plantas de acelgas que en las plantas de lechuga, con un valor de 5,31

µg en la dosis de 0,05 mg∙L-1 y de 3,34 µg en la dosis de 0,1 mg∙L-1 en lechuga

(Figura 7.3 B).

Finalmente, el contenido total de plomo en ambas especies plantas fue similar a lo

encontrado en las raíces, mostrando mayor bioacumulación del metal en las plantas

de acelga con respecto a las plantas de lechuga, con valores de 7,02 y 4,44 µg de Pb

en la dosis de exposición de 0,05 mg∙L-1 tanto para acelga y lechuga,

respectivamente. (Figura 7.3 C).



Figura 7.3. Contenido en µg de Pb bioacumulado en hojas (A), en raíces (B), y total (C)

en plantas de acelga y lechuga cultivadas en medio hidropónico. C

onte

nid

o d

e P

b e

n h

oja

g)

0

2

4

6

8 ACELGA

LECHUGA

Conte

nid

o d

e P

b e

n r

aíz

g)

0

2

4

6

8ACELGA

LECHUGA

0 0.025 0.05 0.1 0.2

Conte

nid

o tota

l de P

b

g)

0

2

4

6

8ACELGA

LECHUGA

A

B

C

L*

L**,Q***,C**

L***,Q***,C**

L**,Q**,C**

L***,Q**,C*

CV: 67.48

CV: 27.32L**

CV:21.86

CV:18.15

CV:28.91

CV:17.73

Concentraciones de Pb en solución de hidroponía (mg.L-1)

L, Q y C: Lineal, cuadrático y cúbico. *, **, *** Significante en niveles de probabilidad de

0,05; 0,01 y 0,001, respectivamente.

Hoja

Raíz

Total

Resultados 49

7.3. Evaluación de la exposición crónica a plomo en plantas de acelga y lechuga, bajo condiciones de invernadero.

En la tabla 8.3 se muestran los valores de la biomasa vegetal de las plantas de acelga

expuestas a plomo en el agua de riego. En general se observó una respuesta lineal

negativa sobre el peso seco y/o biomasa total de las plantas.

Se observó reducción de la biomasa cuando se aumentó la concentración de plomo en el

agua de riego en todos los tratamientos, sin embargo, sólo se encontraron diferencias a

los 15 y 45 DIT. El testigo presentó mayor biomasa comparado con las plantas que

fueron irrigadas con diferentes dosis de plomo en todos los puntos de muestreo (15, 30,

45 DIT). Sin embargo, a los 30 DIT no se evidenció diferencias con respecto al testigo

(Tabla 7.3). La utilización de quelatos en la fertilización sólo fue estadísticamente

significativa a los 30 DIT, donde se observaron valores de 2,44 g y 1,55 g. Finalmente no

se observaron diferencias en la interacción del plomo con los quelatos (Pb x Q).

Tabla 7.3. Efecto de la exposición crónica a plomo y tipo de fertilizante sobre la biomasa

de plantas de acelga cultivadas bajo condiciones de invernadero.

Peso seco total (g) de plantas de acelga

Concentración de Pb en el agua de riego

DIAS DE EXPOSICIÓN A PLOMO

15 DE 30 DE 45 DE

(mg∙L-1

)

0,000 0,3 ± 0,04 2,07 ± 0,56 5,26 ± 0,83

0,025 0,16 ± 0,05 1,90 ± 0,51 4,59 ± 1,10

0,050 0,18 ± 0,04 2,37 ± 0,79 4,33 ± 0,41

0,100 0,17 ± 0,06 1,76 ± 0,69 3,96 ± 0,89 0,200 0,19 ± 0,05 1,88 ± 0,81 3,55 ± 0,87

2SIGNIFICANCIA L**, Q**

NS

L**

Quelatos

Con 0,20 ± 0,06 2,44 ± 0,40 4,45 1,14 Sin 0,19 ± 0,07 1,55 ± 0,58 4,22 0,83

Significancia NS L*** NS 3Pb x Q NS NS NS

1CV 24,25 25,72 21,49

1 CV: coeficiente de variación, cada valor corresponde a media de cada tratamiento

2 NS: no significante. L, Q: Lineal, Cuadrático. *,**,***: Significante en niveles de

probabilidad de 0,05; 0,01; 0,001, respectivamente.

3 Interacción entre concentración de Pb y tipo de fertilizante. DE: Desviación Estándar



En las plantas de lechuga no se evidenciaron diferencias en la biomasa después de la

exposición a plomo en el agua de riego, así como tampoco se evidenciaron diferencias

estadísticas entre las dosis de exposición a plomo y la adición de agente quelante (Pb x

Q) (Tabla 7.4).

Tabla 7.4. Efecto de la exposición crónica a plomo y tipo de fertilizante sobre la biomasa

total de plantas de lechuga cultivadas bajo condiciones de invernadero.

Peso seco total (g) de plantas de lechuga

Concentración de Pb en el agua de riego

DIAS DE EXPOSICIÓN A PLOMO

15 DE 30 DE 45 DE

(mg∙L-1

)

0,000 0,30 ± 0,22 1,62 ± 0,34 4,08 ± 0,50

0,025 0,19 ± 0,07 1,49 ± 0,14 4,01 ± 0,71

0,050 0,20 ± 0,08 1,33 ± 0,17 3,77 ± 0,69

0,100 0,31 ± 0,22 1,50 ± 0,13 3,44 ± 0,74

0,200 0,18 ± 0,04 1,33 ± 0,17 3,11 ± 0,70

2SIGNIFICANCIA NS

NS

NS

Quelatos

Con 0,21 ± 0,20 1,51 ± 0,18 3,66 ± 0,68

Sin 0,26 ± 0,07 1,39 ± 0,25 3,7 ± 0,79

Significancia NS NS NS 3Pb x Q NS NS NS

1CV 63,78 13,1 20.12

1 CV: coeficiente de variación, cada valor corresponde a la media de cada tratamiento ±

la desviación estándar

2 NS: no significante.

3 Interacción entre concentración de Pb y tipo de fertilizante


El efecto de la exposición crónica a plomo en el agua de riego junto con la aplicación

edáfica de elementos menores en forma quelatada en la fertilización se muestra en la

figura 7.4. En general, la utilización de quelatos (EDTA-menores) favoreció la

bioacumulación de plomo foliar en ambas especies de plantas.

Resultados 51

Los valores máximos de plomo fueron hallados en la dosis de exposición de 0,1 mg∙L-1 en

ambas especies de plantas, con valores de 0,66 y 0,60 mg∙kg-1 para acelga y de 0,4 y 0,2

mg∙kg-1 para lechuga en la fertilización con y sin quelatos, respectivamente (Figura 8.4 A y, B).

En las raíces, por el contrario, los valores máximos de plomo se encontraron en la dosis

de 0,2 mg∙L-1 en las plantas que no tuvieron fertilización con quelatos (Figura 7.4, C y D).

Figura 7.4. Concentración de plomo bioacumulado en acelga y lechuga en hoja (A, B), raíz (C, D)

CV: Coeficiente de variación. L, Q, C: Lineal, cuadrático y cúbico *,**,***: Significativo en

niveles de probabilidad de 0,05; 0,01; 0,001, respectivamente.

El contenido (µg) de plomo hallado en los diferentes órganos de las plantas, presentó

tendencias similares a las encontradas en la concentración foliar y radicular descrita

anteriormente (Figura 8.5). En ambas especies, el mayor contenido de plomo foliar

también estuvo bajo una fertilización con quelatos en la dosis de 0,1 mg∙L-1 de plomo.

Mientras que, en las raíces se observó mayor contenido en las plantas sin adición

Hoja

Raíz



quelatos en la fertilización, mostrando mayor tendencia acumulativa del metal en las plantas

de acelga (Figura 8.5 A y D; B y E). Por otro lado, el contenido total de plomo mostró mayor

tendencia acumulativa en la dosis de exposición de 0,1 mg·L-1 (Figura 7.5 C, F).

Figura 7.5. Contenido de plomo (µg) bioacumulado en plantas de acelga y lechuga en

hoja (A, D), raíz (B, E), total (C, F).

CV: Coeficiente de variación. L, Q, C: Lineal, cuadrático, cúbico. *,**,***: Significativo en

los niveles de probabilidad 0,05; 0,01 y 0,001.

La concentración de plomo retenido por las partículas del suelo al término del

experimento de exposición crónica en invernadero se muestra en la figura 7.6. El suelo

Hoja

Raíz

Total

Resultados 53

tratado sin quelatos presentó menor concentración de plomo en comparación con el

suelo tratado con quelatos encontrándose valores de 4,9 y 6,4 mg∙kg-1 en las dosis de 0,0

y 0,2 mg∙L-1. Mientras que, en suelos con adición de quelatos se encontraron valores de

5,8 y 6,5 mg∙kg-1 en las mismas dosis de exposición, mostrando que utilización de

quelatos favoreció la acumulación de plomo en el suelo a través del tiempo.

Figura 7.6. Concentración de plomo al término del experimento de exposición crónica en

invernadero

0,000 0,025 0,050 0,100 0,200

Concentr

ació

n d

e P

b e

n s

uelo

(m

g. k

g-1

)

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6 SUELO CON QUELATOS

SUELO SIN QUELATOS

L***,Q**

CV: 2.64

L**,Q¨**

CV:4.30

Concentraciones de Pb en el agua de riego (mg.L-1)

L, Q: Lineal, cuadrático. *,**,*** Significante en niveles de probabilidad de ≤ 0,05; 0;01 y

0,001, respectivamente.

El comportamiento del pH del suelo durante el experimento de exposición crónica a

plomo en invernadero se muestra en la figura 8.7. En general, se observó una reducción

del pH en ambos tipos de suelos tratados con quelatos y sin quelatos a los 15, 30 y 45

DIT. Se observó aumento de la acidez del suelo al incrementarse la dosis de exposición

a plomo en el agua de riego tanto en los suelos tratados con quelatos y sin quelatos.

A los 15 DIT, se encontró un pH de 5,7 y 5,8 en la dosis de exposición de 0,0 mg∙L-1, sin

embargo, en la dosis de 0,2 mg∙L-1 se observó reducción del pH con valores de 5,2 y 5,4

en suelos con y sin quelatos, respectivamente (Figura 8.7 A). A los 30 DIT, se observó la

misma tendencia con ganancia de acidez en ambos casos con valores de 5,6; 5,5 y de



4,8; 4,4 en las mismas dosis de exposición. A los 45 DIT se observaron tendencias

similares de acidez a los obtenidos en los muestreos anteriores (Figura 8.7 B, C).

Figura 7.7. Valores de pH a los 15 (A), 30 (B( y 45 (C) (DIT) sin adición y con adición de quelatos

CV: coeficiente de variación. L, Q, C: Lineal, cuadrático, cúbico. *,**,***. Significante en

niveles de probabilidad de 0,05; 0,01 y 0,001, respectivamente.

15 DIT

30 DIT

45 DIT

Resultados 55

En cuanto al efecto del plomo sobre el crecimiento de Pseudomonas fluorescens en el

experimento de la exposición crónica en invernadero se resume en la tabla 8.5.

No se observó diferencia estadística significativa en el diámetro de las colonias

bacterianas a los 0 y 15 DIT de exposición a plomo con respecto al testigo (0,0 mg∙L-1).

Sin embargo, se observó una tendencia lineal negativa a los 30 y 45 DIT, con un valor de

0,63; 0,55 en la dosis de 0,0 mg·L-1 y de 0,61; 0,36 en las dosis de exposición de 0,2

mg∙L-1 de plomo, mostrando disminución del diámetro bacteriano con respecto al testigo.

En cuanto a la utilización de quelatos, solo se observaron diferencias a los 45 DIT de

exposición al metal (Tabla 7.5).

Tabla 7.5. Efecto del plomo sobre el crecimiento de Pseudomonas fluorescens

LOGARITMO (LOG10) DEL DIAMETRO DE COLONIAS

Concentración de Pb en el agua

de riego

DÍAS DE RECUENTO

0 DE 15 DE 30 DE 45 DE

(mg∙L-1

)

0,000 0,62 ± 0,01 0,60 ± 0,04 0,63 ± 0,02 0,61 ± 0,02

0,025 0,62 ± 0,01 0,62 ± 0,01 0,59 ± 0,02 0,60 ± 0,03

0,050 0,62 ± 0,01 0,59 ± 0,02 0,61 ± 0,02 0,61 ± 0,02

0,100 0,62 ± 0,01 0,60 ± 0,02 0,59 ± 0,02 0,58 ± 0,04

0,200 0,62 ± 0,01 0,59 ± 0,03 0,55 ± 0,03 0,36 ± 0,28

1SIGNIFICANCIA NS

NS

L**

L***

Quelatos

Con 0,62 ± 0,01 0,60 ± 0,03 0,60 ± 0,03 0,49 ± 0,20

Sin 0,62 ± 0,02 0,60 ± 0,02 0,59 ± 0,04 0,61 ± 0,01

Significancia NS NS NS L*** 3Pb x Q NS NS NS ***

2CV 3,39 5

4,3 7,33

1NS: No significativo. L: Lineal. **,***: Significativo en los niveles de probabilidad ≤ 0,05;

0,001.

2CV: Coeficiente de variación

3Interacción entre concentración de Pb y tipo de fertilizante




Cada valor corresponde a la media de cada uno de los tratamientos ± la desviación

estándar.

En la figura 7.8 se observa el efecto del plomo sobre el diámetro de las colonias

bacterianas de Pseudomonas fluorescens en la dosis de exposición de 0,025; 0,005; 0,1

y 0,2 mg∙L-1 de plomo con respecto al testigo. En la imagen se observa disminución en el

diámetro de las colonias bacterianas en la dosis de exposición 0,2 mg·L-1 Pb con

respecto a las demás dosis de exposición, mostrando visiblemente efecto tóxico nocivo

sobre las bacterias.

Figura 7.8. Efecto del plomo sobre el crecimiento de las colonias bacterianas de

Pseudomonas fluorescens en la dosis de exposición de 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 mg∙L-1 Pb y

testigo.

8. Discusión

Según la Agencia de Protección Ambiental Americana (EPA), la investigación con

semillas para la evaluación de la toxicidad de sustancias químicas representa un

indicador de contaminación ambiental importante para el análisis de exposición de

sustancias tóxicas en el ambiente (Sobrero et al, 2008).

(Cooper et al, 2017).

Según Malar et al, 2014 el plomo inhibe el voltaje de la actividad de los canales de

calcio mediante transporte competitivo lo cual puede inhibir la proliferación celular y

causar apoptosis. El plomo puede causar inhibición de la actividad enzimática e

interacción con los grupos sulfhídrilos causando disminución del ATP en las

mitocondrias y por consiguiente desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, lo que

afecta directamente a la fotosíntesis e inhibe el desarrollo de nuevos tejidos de la

nueva planta (Cheyns et al, 2012). Lo que indica el efecto del plomo sobre el

crecimiento y elongación de nuevos tejidos de la nueva planta, en la exposición

aguda sobre semillas.

Estudios sobre la exposición de Pb (NO3)2 sobre el células radiculares en Allium cepa

L. mostraron alteraciones en la forma del núcleo y descomposición del material

genético nuclear en las células, mostrando destrucción de los microtúbulos del huso

mitótico, además de, causar c-mitosis caracterizada por el bloqueo celular en

prometofase, lo que induce a la inhibición del crecimiento de la raíz de las plantas

(Chen et al, 2015). La inhibición del crecimiento radicular e hipocótilo bajo toxicidad

por plomo en plántulas de acelga y lechuga puede ser resultado del efecto causado

por el plomo en la división celular (Chen et al, 2015).



Por otro lado, los efectos de la exposición crónica a plomo en los experimentos de

hidroponía e invernadero se observó sobre la biomasa vegetal de las plantas de

acelga y lechuga en cada uno de los muestreos (Tablas 8.2; 8.3). De manera general

se pudo observar que el plomo causó efectos tóxicos a los 30 y 45 DIT sobre la

biomasa vegetal de las plantas, observándose diferencias estadísticas en cada uno

de los tratamientos de exposición a plomo en hidroponía, mientras que, en lechuga,

sólo se observaron efectos a los 15 después del inicio de la exposic ión.

Lo anterior podría indicar que, uno los síntomas específicos de exposición a plomo en

plantas se caracteriza por la reducción del peso seco de las raíces y parte aérea,

dado que, el plomo causa disminución del contenido proteico en los tejidos y

alteración en la composición de lípidos (Chyens et al, 2012; Cao et al, 2015). En

investigaciones con plantas de P. vulgaris y Z. mays expuestas a plomo, se

observaron cambios en la concentración de glucolípidos como monogalactosil y

diacilgliceroles responsables del aumento de la masa vegetal (Hu, et al, 2015). Sin

embargo, la disminución del peso seco en plantas expuestas a plomo presenta

variabilidad dependiendo de la especie. En plantas de Platango major se observó

disminución del peso seco, sin embargo, en Z. mays se observó un aparente

aumento del peso seco con incremento de la síntesis de polisacáridos en la pared

celular (Hu et al, 2015), lo que nos indica que, el efecto de plomo va ligado

directamente a la especie de plantas expuestas y en este caso el plomo afectó tanto a

las acelgas como a las lechugas después de la exposición.

En las figuras 8.2 y 8.4 se muestra la bioacumulación de plomo en el tejido vegetal de

las plantas expuestas en los ensayos de hidroponía e invernadero. De manera

general se observó que a mayor dosis de exposición mayor concentración del metal

en el tejido de ambas especies de plantas. Sin embargo, la mayor bioacumulación del

plomo se presentó en raíces con un valor de 12 mg·kg -1. Esto puede deberse a que,

el plomo se mueve predominantemente dentro del apoplasto de la raíz en una forma

radial a través del córtex y se acumula cerca de la endodermis formando depósitos de

precipitación como carbonato de plomo en la pared celular (Sharma et al, 2005; Ali, et

al, 2013).

Discusión 59

La endodermis también actúa como una barrera parcial al movimiento del plomo entre

la raíz y la parte aérea, siendo la banda de Caspari el factor limitante que restringe el

transporte del plomo (Tian et al, 2014). En ensayos realizados con plantas de Oryza

sativa L. los niveles de localización de plomo acumulado fueron de 1,7 a 3,3 mayor en

las raíces que en la parte aérea, dado que, el transporte del plomo hacia otros

órganos es limitado por la endodermis en la raíz (Sharma et al, 2005; Tian et al,

2014). De manera general la concentración de plomo en las plantas de acelga y

lechuga que fueron expuestas en los experimentos de hidroponía e invernadero tuvo

mayor bioacumulación en las raíces que en las hojas de ambas especies plantas

(Figura 8.2 y 8.4).

Por otro lado, aunque la absorción del plomo está limitada por la endodermis en la raíz, la

utilización de quelatos sintéticos en la fertilización puede favorecer la toma de metales

del suelo a través de las raíces de las plantas (Ferreyroa et al, 2014). En la figura 8.4 y

8.5 se observa la bioacumulación del plomo con adición de quelatos en el tejido vegetal

en mg·kg-1 y en µg de plomo en las plantas expuestas en el experimento de invernadero.

Se observó que las plantas de acelga y lechuga que fueron tratadas con quelato sintético

(EDTA), acumularon el metal en mayor concentración en hojas en comparación con las

plantas que no fueron tratadas con quelatos. La adición de quelatos sintéticos al suelo

como H-EDTA o EDTA aunque no es una práctica común en la agricultura, son utilizados

por los agricultores cuando se han identificado deficiencias nutricionales en el suelo de

elementos menores en el suelo como Fe, Cu, Mg, Mn importantes para la nutrición

vegetal.

La adición de quelatos al suelo junto con un pH bajo, impide la retención del plomo en

la pared celular y permite su absorción y translocación hacia la parte aérea de las

plantas (Jarvis et al, 2002). Los mecanismos de defensa de las plantas impiden que

partículas grandes como el plomo no puedan cruzar fácilmente la banda de Caspari

debido a su tamaño, carga y unión a los grupos carboxilos del ácido galacturónico de

la pared celular. Sin embargo, cuando el metal forma el complejo con los quelatos, la

solubilidad aumenta y el tamaño de las partículas disminuye haciéndose invisible a

los mecanismos de defensa de las plantas, tales como la unión a la pared celular y la

precipitación con fosfatos (Lee et al, 2014). Algunos experimentos de quelación han

reportado que la concentración del plomo en la parte aérea de las plantas podría ser



incrementada en 1% (P/P) en la biomasa seca de la parte aérea de las plantas por

adición de un agente quelante en un suelo contaminado (Epelde et al, 2008;

Mühlbachova, 2011).

En cuanto al plomo acumulado y el pH en el suelo luego de la exposición crónica a

plomo en el ensayo de exposicón crónica en condicioines controladas en

invernadero se pudo observar de manera general, que la concentración de plomo

retenido fue mayor en el suelo con adición de quelatos que en el suelo sin

quelatos. Esto puede deberse a que, el plomo está clasificado como un ácido débil

de Lewis dado que es una sustancia que no contiene oxigeno y se comporta como

un ácido y es capaz de aceptar electrones mediante la formación de enlaces

covalentes (Naghipour et al, 2016) causando eventualmente acidificación del

suelo. El plomo está estrechamente ligado a la materia orgánica o material

coloidal del suelo como precipitado por su carga electroquímica y elementos

sinteticos como EDTA podrían reterner el metal en el suelo y aumentar su

concentración (Kim, et al, 2003; Finzgar et al, 2007).

Blaylock et al, 1997 ha reportado que en un suelo con un pH de entre 5,5 y 7,5 la

solubilidad del plomo aumenta y está controlada por fosfatos o precipitados de

carbonatos en el suelo lo que lo hace poco disponible y propenso a la acumulación.

Nikasar et al, 2005 en ensayos con columnas y plantas de trigo demostró que la

adsorción del plomo en el suelo aumenta al incrementar el pH y disminuye cuando

cuando aumenta la temperatura y la velocidad de flujo de la solución, concluyendo

que la retención del plomo en el suelo está ligada a la acidéz y a la presencia de la

materia orgánica.

En la tabla 8.5 se describe el efecto de la exposición crónica a plomo sobre las

colonias de Pseudomonas fluorescens tomadas del suelo rizosferico de las plantas

expuestas en el ensayo de exposición crónica de invernadero. Se encontraron

diferencias estadisticas en el diámetro de las colonias bacterianas a los 30 y 45 días

después de iniciado los tratamientos (DIT), evidenciandose disminución en el

crecimiento bacteriano al aumento de la dosis de exposición (Figura 8.8).

Discusión 61

Los microorganismos constituyen una herramienta fundamental en la investigación

de contaminantes ambientales, dado que, pueden ser indicadores de

contaminación ambiental por su alta sensibilidad a los cambios del ambiente (Liu

et al, 2017). Algunos estudios han reportado disminución tanto de la diversidad

como de la actividad de los microorganismos en el suelo como la respiración y la

biomasa microbiana. Estos factores pueden ser indices importantes para la

evaluación de contaminación ambiental basados en estandares internacionales

como la ISO, 2002; ISO, 1997 (Bond-Lamberty et al, 2010; Muñoz et al, 2012).

Eisenia fetida es el microorganismo que generalemte es usado para los ensayos

de toxicidad en el laboratorio debido a su facil crecimiento y alta sensibilidad a

elementos de contaminación como metales OECD, 1984 (Jusselme et al. 2012).

No obstante, el efecto tóxico causado por metales se ve reflejado sobre la

respiración y el mecanismo celular de transformación de la materia orgánica en el

suelo (Liu et al, 2017).

Algunos microorganismos como Arthrobacter, Azospirillium, Azotobacter, Bacillus,

Pseudomonas sp son llamados promotores del crecimiento vegetal y biocontroladores

(PGPB) dado a sus beneficios en el crecimiento de las plantas y mecanismos de

fijación de nitrógeno atmosférico, solubilización de fosfato inorgánico y mineralización

de la materia orgánica ente otros (Esitken et al, 2010; Pantoni et al, 2016), sin

embargo, la exposición a metales como Cadmio, Cromo, Plomo entre otros, causa

disminución en el número y tamaño de las cepas bacterianas e inhibición del

crecimiento.

Los efectos tóxicos causados por metales generalmente se dan sobre la respiración

celular y el ADN causando efectos genotóxicos en la sustitución de nucleótidos en el

material genético causando finalmente mutagenicidad (Azario, 2014). Por lo tanto, el

efecto del plomo sobre Pesudomonas fluorescens en el alcance esta investigación se

pudo observar efectos tóxicos nocivos sobre de las colonias, ocasionando

disminución del crecimiento e inhibición del diámetro de las colonias en la dosis de

exposición de 0,2 mg·L-1 de plomo, mostrando que, a mayor concentración de

exposición mayor el efecto tóxico sobre las bacterias (Figura 8.8).



Finalmente, los diferentes ensayos de exposición a plomo de manera aguda y crónica

tanto en semillas como en hidroponía e invernadero, mostraron efectos nocivos

causados por la exposición a plomo en plantas de acelga y lechuga, así como

bioacumulación en el tejido vegetal y efectos sobre crecimiento de colonias de

Pseudomonas fluorescens. Los efectos nocivos del plomo se observan de manera

proporcional al aumento de la dosis de exposición, mostrando efectos visibles en las

plantas, así como también, efectos en las bacterias.

Se pudo determinar que existieron efectos tóxicos nocivos en la dosis de 0,2 mg·L -1

de plomo sobre la biomasa de las plantas evaluadas en los experimentos de

hidroponía e invernadero, así como, efectos sobre el crecimiento bacteriano en la

misma dosis de exposición. Se observó que la utilización de quelatos sintéticos en la

fertilización podría facilitar la toma del plomo hacia la parte aérea de las plantas y

aumentar su concentración con respecto a las raíces. Sin embargo, aunque la

endodermis representa una barrera de entrada del plomo, el uso de quelatos

sintéticos en prácticas agrícolas convencionales podría favorecer la bioacumulación

de metales tóxicos nocivos en las hojas de las plantas representando una fuente de

exposición a los seres humanos.

Se pudo determinar con la exposición a plomo en los diferentes experimentos que, las

plantas de lechuga son menos susceptibles a los efectos tóxicos causados por este

metal que las plantas de acelga coincidiendo con los resultados obtenidos por

Miranda et al, (2008).

Las plantas han desarrollado mecanismos altamente específicos para absorber,

traslocar y acumular nutrientes, sin embargo, algunos metales y metaloides que no

son esenciales para las plantas son absorbidos, traslocados y acumulados en las

plantas, debido que, presentan un comportamiento electroquímico similar a los de los

elementos requeridos por las plantas (Lasat, 2000).

Discusión 63

En estudios realizados por Hoyos et al, 2014 demuestran que las plantas de Brassica

oloreacea subsp. Capitata regadas con diferentes dosis de plomo y cadmio (0, 150 y

300 mg·L-1) demostraron mediante el método de absorción atómica que las plantas

bioacumularon en mayor concentración los metales en la máxima concentración de

exposición, mostrando una relación direccional ascendente con las soluciones

concentradas de los diferentes tratamientos.

Cabezas et al, 2004 demostraron que plantas de tres especies vegetales Vicia sativa

L. (Veza), Hordeum vulgare (Cebada) y Helianthus annuus L. (Girasol) que fueron

sembradas en suelos enmendados con lodos de una depuradora en condiciones de

invernadero, las concentraciones totales de Cu, Zn, Cr y Pb se incrementaron

linealmente en parte aérea de las tres especies vegetales, demostrando que las

plantas pueden tomar del suelo y traslocar metales hacia las hojas y frutos y que

pueden entrar a la cadena alimenticia.

Las plantas capaces de absorber y acumular metales por encima del límite máximo

permisible que otras especies de plantas en un mismo suelo se le denominan

hiperacumuladoras y se encuentran principalmente en suelos que son ricos en

metales por condiciones geoquímicas naturales o contaminación antropogénica

(Moral et al, 1994). Las plantas hiperacumuladoras generalmente tienen poca

bioamasa debido que, ellas utilizan más energía en los mecanismos necesarios para

adaptarse a las altas concentraciones del metal en sus tejidos (Kabata-pendias,

2000), no obstante, la capacidad de las plantas de tomar y bioacumular metales y

otros posibles contaminantes a través de las raíces depende en gran medida de la

especie vegetal y la naturaleza de los contaminantes.

Finalmente, dado que el plomo es un metal que representa alto riesgo para la salud

del ser humano, se puede estimar el riesgo tóxico por ingesta del metal en proporción

a la concentración y consumo del alimento en el tiempo. Sin embargo, los efectos

nocivos por consumo están relacionados con la edad y el peso corporal de cada

individuo entre otras variables intrínsecas de cada organismo. Los efectos tóxicos del

plomo pueden generar a largo plazo problemas de salud y es necesario realizar de



manera constante investigaciones sobre las dosis de exposición de metales como el

plomo en plantas que podrían estar expuestas al agua de riego y suelo contaminados

con plomo.

9. Conclusiones y recomendaciones

9.1 Conclusiones

La exposición aguda a plomo causó efectos tóxicos sobre la germinación de semillas y el

crecimiento de las plántulas de acelga y lechuga evidenciándose disminución en la

formación y crecimiento de nuevos tejidos en la plántula, mostrando reducción de la

germinación y crecimiento a mayor concentración de exposición.

El efecto tóxico del plomo en las plantas expuestas de cada uno de los experimentos de

exposición crónica, se evidenció mediante la reducción de la bioamasa vegetal en cada

uno de las dosis de exposición con respecto al testigo. Los efectos observados en las

plantas evaluadas pueden ser de manera creciente a medida que se aumenta la

concentración de exposición. Sin embargo, el crecimiento vegetal también puede ser

afectado por las propiedades físico-químicas del suelo como el pH, contenido de materia

orgánica entre otros, que pueden facilitar la retención y disponibilidad de cationes como

el plomo en el suelo.

La adición de quelatos en la fertilización aunque no es una práctica común, se utiliza

cuando existen deficiencias de elementos menores en el suelo como hierro, Manganeso,

Cobre entre otros fundamentales para la nutrición de las plantas, sin embargo, se

evidenció que la adición de estas sustancias a los fertilizantes puede favorecer la toma

de otros elementos potencialmente tóxicos como cationes de metales como el plomo,

debido a su valencia positiva son fácilmente fijados y transportados a los tejidos de las

plantas.

Se identificaron microorganismos rizosféricos como Pseudomonas fluorescens que

cumplen un papel esencial con las plantas en la rizosféra, debido a la producción de

fitohormonas de crecimiento vegetal, mantenimiento, reciclaje y equilibrio del



agroecosistema. Se pudo observar disminución del crecimiento y proliferación de las

colonias bacterianas después de la exposición a plomo. Lo que indica que el plomo

causa efectos tóxicos no solo a plantas de consumo humano, sino que también, a

organismos con baja complejidad orgánica.

Hortalizas como acelga y lechuga pueden tomar el plomo a través de las raíces y

transportarlo a tejidos comestibles como las hojas donde se acumulará y que finalmente

será tomado por el ser humano mediante la alimentación. No obstante, ninguna

concentración de plomo puede considerarse como segura, debido a que la ingesta de

manera continua de plomo contenida en los vegetales incluso a bajas concentraciones

puede causar efectos nocivos a la salud de los seres humanos a mediano y largo plazo.

Finalmente, la estimación de las concentraciones de plomo y sus efectos tóxicos puede

ser evaluada mediante bioensayos con semillas y organismos con baja complejidad

orgánica para estimar las concentraciones de vertimiento y exposición. También, metales

como el plomo contenido en el tejido vegetal puede determinarse mediante el empleo de

el método analítico recomendado por la AOAC la cual emplea la técnica analítica de

Espectroscopia de Absorción Atómica con horno de grafito lo cual determina

concentraciones trazas del metal.

9.2 Recomendaciones

Se recomienda realizar un control de calidad de los recursos naturales utilizados como el

agua y el suelo, así como también, establecer buenas prácticas agrícolas en el cultivo de

hortalizas, debido a que elementos metálicos contenidos en ellos pueden estar presentes

en bajas concentraciones y ser tomados por las plantas a través de la raíz.

Se deben realizar análisis del contenido de metales del suelo, para la posterior utilización

de quelatos en la agricultura, ya que la aplicación de estos agentes quelantes pueden

facilitar la toma de metales por las plantas y transportarlo a tejidos como las hojas y

raíces, que luego pasarían finalmente al ser humano mediante el consumo directo e

indirecto.

Conclusiones y Recomendaciones 67

Adicionalmente se recomienda el uso de microorganismos como bacterias de baja

complejidad orgánica para la evaluación de dosis de exposición a sustancias tóxicas

como el plomo entre otros, ya que debido a su baja complejidad orgánica, pueden ser

bioindicadores de contaminación ambiental.

Se deben realizar investigaciones complementarias de exposición al plomo y otros

metales con nuevas especies de plantas destinados a consumo humano para determinar

la concentración bioacumulable y compararla con los límites máximos permitidos por la

normatividad colombiana.

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evaluación de rasgos fitotóxicos y bioacumulación de plomo...

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