estudio preliminar de producciÓn de bioetanol a …
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ESTUDIO PRELIMINAR DE PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE
DESECHOS LIGNOCELULÓSICOS DE PALMA AFRICANA POR MEDIO DE UN
PROCESO DE SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEA
JUAN PABLO BURAGLIA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
MAYO DE 2008
IQ-2009-I-5
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ESTUDIO PRELIMINAR DE PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE
DESECHOS LIGNOCELULÓSICOS DE PALMA AFRICANA POR MEDIO DE UN
PROCESO DE SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEA
JUAN PABLO BURAGLIA
Proyecto de grado para optar por el titulo de Ingeniero Químico.
ASESOR
ANDRÉS FERNANDO GONZÁLEZ BARRIOS Ph. D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
MAYO DE 2008
IQ-2009-I-5
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por brindarme todas las oportunidades necesarias para alcanzar mis metas.
A mis papas, por haberme apoyado durante este largo trayecto.
A mis abuelos, mis hermanos y el resto de mi familia: gracias.
A Jose, Luz y Sonia por su cooperación.
Andrés e Isabel por su paciencia, asesoría y acompañamiento.
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CONTENIDO
RESUMEN……………………………………….………………………………..……………8
1. INTRODUCCION ………………...……………………………………………………….9
2. OBJETIVOS ……………………………………………………………………………….11
2.1 Objetivo General ………………….…………………………………………….11
2.2 Objetivos Específicos. …………...…………………………………………….11
3. MARCO TEORICO…………………………….………………………………………….13
3.1 Generalidades. ……………………………………………...………………….13
3.2 Producción de Etanol a partir de biomasa lignocelulolitica..……………….14
3.3 Producción de coproductos…………………………...……………………….20
3.4 Sacarificación y Fermentación Simultánea. ………………...……………….21
3.5 Consideraciones para el futuro ……………………………………………….23
4. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………………….25
4.1 Selección del consorcio de sacarificación…………………………..……….25
4.2 SSF en reactor……………………….………………………………………….25
4.3 SSF en shaker………………………………………………………………….27
4.4 Técnicas analíticas……………………………..………………………………27
5. RESULTADOS Y DISCUSION……………………………………………………….…28
5.1 Selección del consorcio de sacarificación...……………………...………….28
5.2 SSF en reactor…………………………………………….…………………….30
5.3 SSF en erlenmeyers…………..………………………………………………..34
5.4 Rendimientos de etanol, glucosa y azucares reductores …………………..38
6. CONCLUSIONES…………………….………………………………………………….41
7. RECOMENDACIONES………………………………………………………………….43
8. REFERENCIAS……………...…………………………………………………………….44
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INDICE DE IMÁGENES
Imagen 1. Reacción enzimática del kit de glucosa……………………….……………….28
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Resultados de la selección del consorcio de sacarificación. Concentración de
glucosa. ………………………………………..………………………………………….…..29
Figura 2. Resultados de la selección del consorcio de sacarificación. Concentración de
azucares reductores. ………………………………….……………………………………..30
Figura 3. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial de
panadería. Producción de etanol. ……………………………….….……………………..31
Figura 4. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial de
panadería. Concentración de glucosa. …………………………..………...……………..31
Figura 5. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial de
panadería. Concentración de azucares reductores. ………………………...…………..31
Figura 6. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial degradadora
de fenol. Producción de etanol. …………………...……...………………...……………..33
Figura 7. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial degradadora
de fenol. Concentración de glucosa. ……………...………………………….…………..33
Figura 8. Resultados de las SSF en bioreactor, con la levadura comercial degradadora
de fenol. Concentración de azucares reductores. …………..…………………………..33
Figura 9. Resultados de la SSF en shaker, con la levadura comercial de panadería.
Producción de etanol. ……………………………………………………...………………..34
Figura 10. Resultados de las SSF en shaker, con la levadura comercial de panadería.
Concentración de glucosa. ……………………………...…………………………………..35
Figura 11. Resultados de las SSF en shaker, con la levadura comercial de panadería.
Concentración de azucares reductores. …………………………………………………..35
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Figura 12. Resultados de las SSF en shaker, con la levadura degradadora de fenol.
Producción de etanol. ………………………………...……………………………………..36
Figura 13. Resultados de las SSF en shaker, con la levadura degradadora de fenol.
Concentración de glucosa. ………………………………………………………...………..36
Figura 14. Resultados de las SSF en shaker, con la levadura degradadora de fenol.
Concentración de azucares reductores. …………….……………………...……………..37
Figura 15. Rendimientos de las SSF en bioreactor. Concentración de azucares
reductores. …………………………………….……………………………….……………..38
Figura 16. Rendimientos de las SSF en bioreactor. Concentración de glucosa.
………………………………………………...………………………………………………..38
Figura 17. Rendimientos de las SSF en bioreactor. Producción de etanol.
………………………………………………….............……………………………………..39
Figura 18. Rendimientos de las SSF en shaker. Concentración de azucares
reductores. ……………………………………………………..……………………………..39
Figura 19. Rendimientos de las SSF en shaker. Concentración de glucosa.
…………………………………………………...………………………..…………………..40
Figura 20. Rendimientos de las SSF en shaker. Producción de etanol.
…………………………………………………...……………………………………..……..40
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RESUMEN
El clima está cambiando y es necesario que el planeta deje de calentarse; tal vez la
principal causa del calentamiento global sea el efecto invernadero ocasionado por la
emisión de gases [28]. Dichos gases son producidos como consecuencia de la
actividad humana, principalmente la combustión de combustibles fósiles.
Biocombustibles como el etanol y el biodiesel han tenido mucha acogida en los últimos
años por ser amigables con el ambiente, como alternativas que se presentan como
candidatos atractivos para ser empleados como fuente de energía para el transporte.
Una opción es la producción de bioetanol a partir de desechos lignocelulósicos
remanentes de la producción de aceite de palma. En el presente trabajo se estudiaron
cuatro cepas de hongos celulóliticos nativos de páramo en Cundinamarca, Colombia
para llevar acabo la sacarificación de la tusa de palma africana, biomasa
lignocelulósica. A partir de estas cuatro se seleccionó una cepa de Cladosporium
tenussimum, la cual presentó los mayores valores de glucosa y azucares reductores
(1.3 g/L y 16.56 g/L respectivamente) en el medio de crecimiento. Se empleó esta
cepa para hacer ensayos de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) tanto en
reactor como en shaker. Se emplearon dos cepas diferentes de Saccharomyces
cerevisae para llevar acabo las fermentaciones y producir etanol. La mayor cantidad
de alcohol se produjo empleando la cepa de S. cerevisae, degradadora de fenol y
empleada en bioremediación, al llevarse acabo la SSF en un shaker con un
rendimiento de 0.17% y una concentración de 0.94 % (p/p).
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1. INTRODUCCION
En la actualidad existe una gran polémica a nivel mundial en lo que refiere al
calentamiento global, pues se ha acumulado un sin número de evidencias a favor y en
contra de dicha creencia. El clima está cambiando y es necesario que el planeta deje
de calentarse; tal vez la principal causa del calentamiento global sea el efecto
invernadero ocasionado por la emisión de gases [28]. Dichos gases son producidos
como consecuencia de la actividad humana, principalmente la combustión de
combustibles fósiles. Sea cierto o no, el papel que juegan los combustibles fósiles en
el detrimento ambiental, el precio del petróleo (ejemplar por excelencia de este tipo de
combustibles) ha alcanzado niveles considerables que ha obligado a la búsqueda de
alternativas. Entre las alternativas están los biocombustibles que se presentan como
candidatos atractivos para ser empleados como fuente de energía para el transporte.
Biocombustibles como el etanol y el biodiesel han tenido mucha acogida en los últimos
años por ser amigables con el ambiente [1,12, 13, 21]. Sin embargo, no basta con que
los biocombustibles sean amigables con el ambiente para su implementación masiva.
Se requiere que además sean competitivos en costo y auto sostenibles [1]. El gran
problema que presentan estos combustibles, se debe a que grandes cantidades de
tierra, destinadas a la agricultura para producir comida, sean empleadas produciendo
cultivos que sean materia prima para los biocombustibles. Esto ha tenido efectos
notorios en los últimos días, dado que los precios de los alimentos han subido [29]. Por
esto es necesario encontrar materias primas adicionales con el fin de lograr producir
biocombustibles sin afectar el suministro de alimentos. Una opción es la producción de
bioetanol a partir de desechos lignocelulósicos remanentes de la producción de aceite
de palma. Se requiere entonces de estudios a nivel de planta piloto para establecer la
operación de producción de etanol a partir de dichos desechos. Las ventajas del
bioetanol incluyen la capacidad de producirlo a partir de una gran cantidad de
sustratos, no es tóxico y puede ser incorporado con facilidad en las infraestructuras
existentes. Inicialmente se trabajaba con bioetanol de primera generación, en la que
este se obtenía a partir de productos agrícolas ricos en azúcares como el almidón y la
caña de azúcar. Para poder cumplir con las proyecciones de demanda en el futuro
para este biocombustible es necesario encontrar materias primas adicionales.
Adicionalmente, la reducción en la emisión de gases de invernadero a partir del uso de
bioetanol, producido de cosechas de almidón no es tan significativo [2].
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Aunque la fracción volumétrica de energía del etanol es menor que la de la gasolina,
la combustión del primero produce una eficiencia 15% mayor [1]. El etanol presenta un
mayor octanaje que la gasolina, permitiendo que el combustible se queme a una
mayor razón de compresión, lo cual se representa en una mayor obtención de
potencia y eficiencia. Además, debido a su mayor calor latente de vaporización, el
enfriamiento del motor es más eficiente, cuestión que resulta en una menor emisión de
compuestos del tipo de CO y NOx [1]. Se plantea entonces el estudio de una
metodología de producción de etanol, a partir de biomasa lignocelulósica.
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2. OJETIVOS
2.1 Objetivo General
Estudiar la viabilidad de la producción de bioetanol a partir de biomasa
lignocelulósica, obtenida de desechos de palma africana en un proceso de
sacarificación y fermentación simultánea.
2.2 Objetivos específicos
� Seleccionar el consorcio adecuado de hongos para la sacarificación de
la tusa de la palma de aceite, resultante del pre tratamiento.
� Evaluar el efecto del tipo de microorganismo fermentador en la
fermentación y sacarificación simultánea (SSF) para la producción de
etanol.
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3. MARCO TEORICO
3.1 Generalidades
Se necesitan alternativas a combustibles derivados del petróleo. La fuente más común
de energía renovable para combustibles de transporte, consiste en emplear el maíz
(compuesto principalmente por almidón) y la caña de azúcar (compuesta de sucrosa)
para la producción de bioetanol [14].
Existen limitaciones para suplir la demanda proyectada de bioetanol producido
exclusivamente a partir de estos cultivos (maíz y caña) haciendo necesario el empleo
de otras fuentes de producción. Entre éstas aparece la biomasa lignocelulósica como
una fuente atractiva para cumplir con los requerimientos de etanol. Sin embargo, la
tecnología aún no está disponible para obtener etanol a partir de biomasa
lignocelulósica en una manera económicamente rentable [1, 4, 6, 12]. Esto hace que
se requiera de estudios para avanzar en métodos de producción que ayuden a aliviar
la dependencia en los combustibles fósiles.
La producción de bioetanol a partir del maíz no es la misma que a partir de la biomasa
lignocelulósica. El maíz está compuesto principalmente por almidón, mientras que la
biomasa contiene celulosa, hemicelulosa y lignina [14]. El almidón es un compuesto
naturalmente utilizado como reserva de energía, mientras que la celulosa y
hemicelulosa son compuestos con funciones estructurales. Esto presenta un reto, ya
que los compuestos de energía han evolucionado para una fácil degradación, mientras
que los compuestos estructurales tienen como función resistir al ataque de organismos
fitopatogenos y de condiciones ambientales por lo que requieren poseer su rigidez y
ser de difícil digestión. Mientras el procesamiento de almidón requiere de una
licuefacción seguida por una sacarificación (produciendo una corriente rica en glucosa
la cual puede ser fácilmente fermentada a etanol), la biomasa celulósica requiere de
diferentes tipos de hidrólisis, con varios tipos de enzimas que al actuar, producen
diferentes tipos de monosacáridos sujetos a fermentación. Además, la presencia de
fibra como la lignina (que no puede ser procesada con la tecnología actual en una
manera económicamente viable), dificulta el procesamiento [2, 3,12].
En Colombia hay un gran potencial para la producción de etanol como biocombustible
debido a una gran disponibilidad de materia prima como la cana de azúcar,
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compuestos de almidón y biomasa lignocelulósica [21]. Las ventajas de los
biocombustibles a partir de lignocelulosa están basadas en que son una fuente
doméstica y no dependen de importaciones, lo que garantiza una seguridad en el
suministro. Además se minimiza el conflicto entre el uso de tierra para comida y el uso
para energía. Otra de estas ventajas consiste en que la biomasa lignocelulósica es
mas económica como materia prima y su producción requiere de un menor uso de
fertilizantes, pesticidas y energía, que generan menor emisiones de gases causantes
del efecto invernadero; además de ofrecer alternativas de desarrollo como empleos en
zonas rurales [23].
3.2 Producción de Etanol a partir de biomasa lignocelulolitica
La necesidad de cumplir con las metas de uso de biocombustibles, hace necesario el
desarrollo de alternativas para la producción de bio-etanol que garanticen su
suministro en el futuro. La producción de etanol a partir de biomasa lignocelulólisica es
una de las alternativas mas estudiadas. Se han reconocido tres etapas principales en
el proceso de producción de bio-etanol a partir de biomasa: un pre tratamiento inicial,
seguido por una sacarificación enzimática y finalmente una fermentación de los
monosacáridos por parte de microorganismos [14].
En la etapa inicial de pretratamiento se toma la biomasa (altamente resistente al
ataque enzimático), y por medio de métodos químicos, físicos, biológicos y
fisicoquímicos se mejora la digestibilidad del material, mejorando el resultado de la
etapa siguiente: la hidrólisis enzimática. Se hace necesaria la remoción de la
hemicelulosa y de la lignina para mejorar la acción enzimática sobre la celulosa. En
esta etapa se da la producción y/o liberación de sustancias que resultan inhibitorias
para la fermentación, por lo que toca tener especial cuidado. La etapa siguiente
consiste en una hidrólisis enzimática de la celulosa y hemicelulosa. Estos biopolímeros
son objeto de ataque por diferentes tipos de enzimas, algunas de las cuales han sido
modificadas para cumplir de manera más eficiente su función. Esta etapa puede ser
llevada acabo por medio de la adición de las enzimas purificadas, o empleando
hongos con capacidades celuloliticas adquiridas bien sea por medios naturales o por
haber sido modificados para tal fin. Luego de la hidrólisis, se produce un número de
monosacáridos, que varían en tipo y concentraciones (según tipos de biomasa
empleada como sustrato inicial). Se encuentran tanto azucares tipo hexosas como
pentosas. La siguiente etapa consiste en la fermentación de dichos azucares, por
medio de microorganismos. Aunque la mayoría de organismos fermentan con mayor
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facilidad las hexosas, existen algunos que también fermentan las pentosas. Diversas
estrategias se han implementado para lograr la fermentación del mayor número de
monosacáridos posibles, ya que esto mejora el rendimiento de la producción de bio-
etanol. Finalmente se ha estudiado la posibilidad de realizar la sacarificación y
fermentación de manera simultánea, en un mismo bioreactor [8, 19, 20, 22, 24,25].
Para una reducción de costos se requiere de un uso eficiente de la materia prima, que
resulte en un mayor rendimiento de etanol, en una alta concentración de etanol en el
destilado así como una adecuada producción de coproductos de valor agregado [3]. La
producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica tiene dos pasos claves: el
primero en el que ocurre la hidrólisis de la celulosa y de la hemicelulosa, y el segundo
en el que se fermentan lo azucares producidos en la primera etapa.
Se requiere de una etapa de pre tratamiento que facilite y acelere la hidrólisis
enzimática. El pre tratamiento ideal debe permitir una alta recuperación de
carbohidratos, una alta digestibilidad de las células y que la fermentación ocurra sin
necesidad de detoxificar el sustrato. A su vez debe producir pocos productos
inhibidores, una alta concentración de sólidos y azucares libres y una baja demanda
de energía, costos de operación y de capital [2]. Lo que se busca con el pre
tratamiento es hidrolizar la celulosa y hemicelulosa a monosacáridos, aumentar el
tamaño del poro y reducir la cristalización de la celulosa.
Para determinar la efectividad del pre tratamiento se puede llevar a cabo la evaluación
del contenido de azucares, la hidrólisis enzimática, y el resultado de la fermentación
del líquido, tanto de manera independiente, como simultáneamente con la
sacarificación.
3.2.1 Pre tratamiento
Galbe et al, 2007 [2] describe los principales métodos de pre tratamiento más
empleados en la actualidad. Los métodos físicos se caracterizan por lograr una
facilitación de la hidrólisis enzimática al aumentar el área superficial, pero requieren de
un consumo energético muy alto. Entre los más usados se encuentran la irradiación
con rayos gamma, que logra clivar los enlaces glucosídicos, pero es costoso y no muy
amigable con el ambiente. En cuanto a los métodos químicos, el uso de ácido diluido
logra una hidrólisis efectiva de la hemicelulosa, pero se detecta una mayor cantidad de
sustancias inhibitorias. Los métodos alcalinos resultan ser más efectivos cuando se
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trabaja con biomasa que contiene un bajo contenido de lignina. También se emplean
solventes orgánicos, que conjuntamente con catalizadores inorgánicos, logran romper
enlaces de la lignina y hemicelulosa. Se logra así la recuperación de la lignina en la
fase orgánica, pero los solventes empleados son explosivos, altamente inflamables lo
que hace que su manejo sea difícil y costoso. En cuanto a los métodos fisicoquímicos
el uso de vapor es el más empleado debido a que se logra solubilizar la hemicelulosa,
pero se requiere el uso de un ácido para obtener los mejores resultados. Cuando el
contenido de lignina es bajo, se emplea una oxidación húmeda, que presenta
problemas de recuperación de la lignina en etapas posteriores. Por último los métodos
biológicos que emplean microorganismos capaces de degradar la lignina, son
considerados como amigables para el ambiente, pero hay pérdida de carbohidratos
debido al consumo de estos por los microorganismos, reduciéndose así los productos
de la fermentación. Se ha investigado el uso de pre tratamientos que involucren dos
etapas, en la primera se buscaría la hidrólisis de la hemicelulosa y en la segunda el
pre tratamiento del material sólido, resultante de la primera. Este método de pre
tratamiento tiene la ventaja de que genera un mayor rendimiento de etanol, pero se
incurre en mayores costos de capital y energía. Se ha reportado, que bajo tratamientos
con pH ácidos, la concentración de furfurales es mayor en la fase líquida, mientras que
en pre tratamientos alcalinos se produce una alta concentración de acetato y ferulato
en el hidrolizado líquido [14]. Estos compuestos tienen efectos inhibitorios para
algunos microorganismos actuando en etapas posteriores del proceso.
Muchos estudios se han realizado sobre el sustrato para cuantificar y optimizar los
métodos de pre tratamiento, con el fin de lograr condiciones que maximicen el
rendimiento de etanol [3]. El objetivo del pre tratamiento debe ser lograr que el sustrato
pueda ser objeto de una degradación enzimática adecuada sin la producción o
liberación de compuestos inhibitorios para las etapas posteriores. Esto está ligado con
el contenido de lignina y hemicelulosa que presenta el sustrato. La lignina, la cual varía
en cantidades presentes en cada sustrato de biomasa, mantiene unidas la celulosa y
la hemicelulosa que le da la rigidez característica a cada tejido vegetal.
Adicionalmente, se le ha asociado con la inhibición de enzimas celulolitícas; no es un
biopolímero homogéneo en el reino vegetal, ya que su conformación varía entre tipos
de plantas. Los métodos de pre tratamiento que se han de emplear deberán
considerar el contenido de lignina en cada tipo de sustrato con el fin de plantear
formas para minimizar la inhibición que este compuesto aromático presenta tanto física
como químicamente. Un aspecto importante a considerar es el hecho de que la lignina
puede ser obtenida como un coproducto del proceso, la cual puede ser empleada,
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entre otras cosas, como una fuente energética para el proceso. Al igual que con la
lignina, en diferentes fuentes de biomasa lignocelulósica se encuentran diferentes
tipos de hemicelulosas. La hemicelulosa es un biopolímero compuesto de hexosas,
pentosas y azucares acetilados. El pre tratamiento debe garantizar la remoción de la
hemicelulosa, la cual actúa como una barrera para la hidrolisis y así garantizar una
sacarificación eficiente. Sin embargo, la hemicelulosa es una fuente de
monosacáridos, que debe ser considerada a la hora de fermentar para garantizar la
economía del proceso de producción de bioetanol.
3.2.2 Hidrólisis Enzimática
Las enzimas juegan un papel fundamental en la producción de etanol a partir de
biomasa lignocelulósica, ya que se requiere descomponer dichos compuestos en
compuestos fácilmente fermentables (generalmente monosacáridos). Tal vez el rubro
más importante en términos de economía en el proceso de producción de bioetanol,
son los costos de las enzimas necesarias para llevar acabo la hidrólisis [4]. Para poder
lograr dicha conversión a monosacáridos fermentables se hace necesario el empleo
de diferentes tipos de enzimas que conjuntamente rompen el complejo tejido vegetal.
Las celulasas, que consisten de tres tipos de enzimas: endoglucanasas,
exoglucanasas y B-glucosidasas. Las primeras se encargan del clivaje de los enlaces
glucosídicos internos, las segundas rompen las cadenas de celulosa a oligosacáridos
y las ultimas desdoblan estos oligosacáridos en glucosa [14]. Un segundo grupo de
enzimas consiste de hemicelulasas, en las cuales se encuentran enzimas que rompen
enlaces glucosídicos internos (como las xylanasas y B-xylosidasas), y las enzimas que
degradan cadenas laterales (como las α-galactosidasas, α-glucorinadasas), entre
otras [14]. El costo de estas enzimas, y su efecto sobre la economía total del proceso
ha llevado al desarrollo de varias alternativas con el fin de buscar soluciones
económicamente viables para la producción de etanol a nivel industrial. Se ha
trabajado en la ingeniería de las enzimas con el fin de mejorar su actividad y por ende
disminuir los requerimientos de cantidad de enzimas necesarias para llevar acabo el
proceso de sacarificación. Otra estrategia consiste en el empleo de microorganismos
para realizar la sacarificación. El uso de dichos microorganismos ofrece la ventaja de
no requerir la adición de enzimas. Sin embargo, los microorganismos empleados para
la sacarificación consumen parte de los carbohidratos que han de ser fermentados a
etanol. Esto reduce el rendimiento de etanol producido en el proceso. Se hace
necesario evaluar las ventajas de emplear microorganismos en vez de las enzimas
para realizar la etapa de sacarificación. La etapa de sacarificación ha sido objeto de
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varios estudios [4, 5,14], y se han propuesto estrategias novedosas para mejorar el
rendimiento de etanol a partir de esta etapa. El uso de ingeniería genética, para
modificar microorganismos y hacerlos más eficientes en la etapa de sacarificación es
una de las estrategias propuestas. Otra alternativa es el uso de tratamientos oxidativos
empleando lacasa, capaces de modificar las superficies de la lignina, además de
demostrar los incrementos en la hidrólisis de la lignocelulosa [14]. Posibles
microorganismos candidatos incluyen hongos y bacterias fitopatógenos, los cuales por
su calidad de patógenos han evolucionado estrategias para degradar efectivamente
los compuestos vegetales. Dichos organismos tienen gran potencial para ser
empleados en la producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica.
Pero no solo se requiere de enzimas eficientes para llevar acabo la sacarificación,
dado que las temperaturas a las cuales ocurre el proceso son considerablemente
elevadas, sino que se hace necesario el desarrollo de enzimas termoestables. El
desarrollo de dichas enzimas significa una mayor estabilidad de las mismas, lo cual
permitiría una mayor flexibilización en cuanto a la configuración de los procesos así
como un mejor desempeño en la hidrólisis [5].
Por otro lado, el tipo de pre tratamiento seleccionado tiene un impacto sobre la
cantidad y tipos de enzimas requeridas para llevar acabo la sacarificación. Esto hace
necesario una integración de procesos en planta piloto para así desarrollar
combinaciones adecuadas, que globalmente, aumenten el rendimiento en la
producción de etanol [4].
3.2.3 Fermentación de azucares para producir etanol
Una vez se ha dado la sacarificación, se tienen monosacáridos que necesitan ser
fermentados para producir el etanol. El tipo de monosacáridos obtenidos difieren
según la fuente de biomasa, pero generalmente está compuesto de hexosas y
pentosas. Las primeras comprometen principalmente a la glucosa y las últimas a la
xilosa [14]. Para obtener un adecuado rendimiento de etanol, no se puede prescindir
de fermentar de manera eficiente la mayor cantidad posible de monosacáridos
presentes. Sin embargo la fermentación de pentosas no es muy frecuente como sí lo
es la de hexosas, como ejemplo la glucosa. La levadura comercial S. cerevisae no
tiene la capacidad de fermentar la xilosa. Esto ha llevado al desarrollo de dos
aproximaciones para lograr la cofermentación de hexosas y pentosas [14]. Primero se
trabaja en la ingeniería genética, para adicionar rutas metabólicas a estas levaduras
con el fin de que sean capaces de fermentar las pentosas. La segunda alternativa
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consiste en la selección de cepas silvestres capaces de fermentar ambos tipos de
monosacáridos y aumentar mediante modificaciones la capacidad fermentativa de
dichos microorganismos. Otros monosacáridos que pueden estar presentes en menor
cantidad en el hidrolizado a fermentar incluyen arabinosa, galactosa y manosa. Una
vez más el aprovechamiento de estos monosacáridos van a llevar a un mayor
rendimiento de la producción de etanol, mejorando así la economía del proceso.
Durante la etapa de pre tratamiento a la biomasa, se puede dar origen a compuestos
los cuales resultan inhibitorios para la fermentación. Esto hace necesario que, o dichos
compuestos sean removidos del sustrato a fermentar, o el desarrollo de cepas lo
suficientemente robustas que no vean afectada su capacidad fermentativa por la
presencia de dichas sustancias [14].
La levadura Saccharomyces cerevisae ha sido objeto de diversas modificaciones con
el fin de obtener mejores resultados en la fermentación. Entre las modificaciones
realizadas se incluye el uso de pentosas como sustrato de la fermentación. La
capacidad para utilizar la xilosa y la arabinosa, así como el aumento en la eficiencia en
las diferentes etapas de la fermentación de pentosas y mayor tolerancia a sustancias
inhibitorias han sido objeto de diversos estudios [6,7].
Un aspecto a considerar, el cual no ha sido de gran significancia aún, debido al poco
rendimiento de etanol a partir de biomasa lignocelulósica, es la tolerancia de los
microorganismos fermentadores a altas concentraciones de etanol. Con los avances
en la producción y en tecnología, se aumenta cada vez más la cantidad de bioetanol
producido y se vuelve más relevante encontrar formas para que dicho producto, al
encontrarse en cantidades elevadas en el medio, no inhiba la fermentación.
3.2.4 Separación de los productos obtenidos en la fermentación
Una vez se ha concluido la etapa de fermentación, el etanol producido se encuentra
disuelto en el medio de cultivo. En dicho medio no sólo está presente el alcohol, sino
que adicionalmente se encuentra microorganismos, azucares (que no fueron
fermentados), residuos sólidos, y lignina, entre otros. Todo esto en un medio acuoso.
Se hace necesario además el empleo de procesos de separación como filtración y
destilación para lograr separar el etanol del medio. Esto permite recircular
microorganismos y azucares que no fueron objeto de fermentación, así como de
obtención de la lignina para ser usada como combustible, lo cual mejora la economía
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del proceso. Al diseñar las etapas de pre tratamiento, sacarificación y fermentación
toca considerar que es deseable producir un flujo de etanol lo mas concentrado
posible en el producto final, con el fin de no incurrir en costos excesivos en las etapas
de separación. Además se debe buscar formas para evitar la formación de productos
afines con el etanol, y que dificulten la separación y purificación del mismo. El etanol
como biocombustible, ya sea para ser empleado en motores que funcionan
exclusivamente con etanol o como aditivo a la gasolina, requiere de ciertas
condiciones de pureza que deben tratar de ser obtenidas a partir de las etapas
iníciales del proceso.
3.3 Producción de coproductos
Debido a las limitaciones que existen para la fermentación del total de la biomasa
lignocelulósica a etanol, se hace necesario el desarrollo de alternativas, que permitan
el aprovechamiento de la totalidad de dicha biomasa. Ejemplo de esto es el uso de la
lignina como un coproducto, el cual al no poder ser digerido y procesado de manera
económica, resulta en una buena alternativa para ser usado como combustible y
cumplir así con parte de los requerimientos energéticos del proceso en una integración
energética eficiente. Con este fin se hace necesario garantizar que durante las etapas
del proceso la lignina mantenga sus condiciones que la hacen adecuada como
combustible energético. Otra alternativa es el uso de Zymomonas mobilis para la
generación de productos de valor agregado [10]. La modificación genética del
mencionado organismo busca la producción de coproductos como otros azucares,
ácidos orgánicos y enzimas las cuales aprovechan de manera mas eficiente la
biomasa y mejoran una vez más la economía del proceso de producción de bioetanol.
Coproductos inhibitorios: Uno de los mayores problemas de la producción de etanol a
partir de desechos lignocelulósicos es la aparición de compuestos inhibitorios, los
cuales afectan la fermentación y la hidrólisis enzimática, que resulta en un menor
rendimiento en la producción de etanol. Dichos compuestos se pueden clasificar en
volátiles y no volátiles, siendo los últimos a los que se les atribuye una inhibición
significativa [26]. Dentro de los compuestos inhibitorios los más comunes son el ácido
acético, el furfural, el hidroximetil-furfural, ácido p-hidroxibenzoico, la celubiosa, entre
otros. Algunos de estos compuestos pueden ser metabolizados por los
microorganismos, pero esto requiere tiempo y retrasan la fermentación. Existen
técnicas como el overliming, que permiten reducir el efecto de compuestos inhibitorios
sobre la producción de etanol. Sin embargo, dichos procedimientos requieren de
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21
costos adicionales que deben ser justificados con base en una mayor producción de
etanol, al fermentar mayor tipo de azucares.
Cuando se emplea un pre tratamiento con ácido diluido se ha observado ausencia de
concentraciones detectables de compuestos inhibitorios como furfural e hidroximetil-
furfural [18]. Además, este estudio reporta que cuando se realiza overliming, se
observa una reducción significativa en el tiempo de fermentación. Esto podría deberse
a posibles efectos que tiene dicho procedimiento sobre los compuestos inhibitorios,
haciendo menos hostil el ambiente para los microorganismos fermentadores.
Otra solución propuesta para la inhibición, es emplear variedades vegetales que
presenten menor contenido de productos los cuales dan origen a compuestos
inhibitorios [24].
Organismos modificados: Los organismos más comúnmente modificados para la
producción de etanol incluyen, pero no se limitan, a E. coli, K. Oxytoca, Z. Mobilis, S.
Cerevisae, entre otros [23]. Es factible aumentar la tolerancia de levaduras a los
ambientes hostiles que presenten el producto del pre tratamiento [24]. El uso de
levaduras más robustas otorgan ventajas al proceso de producción de bioetanol, como
la posibilidad de emplear sustratos con mayor contenido de sólidos, así como la
posibilidad de recircular corrientes de proceso [25].
3.4 Sacarificación y Fermentación Simultánea
La posibilidad de desarrollar de manera simultánea los procesos de sacarificación y
fermentación ha sido objeto de varios estudios [8, 19, 20, 22, 24,25]. La sacarificación
y fermentación simultánea (SSF) han sido estudiadas debido a su potencial para
reducir los costos en la producción de bioetanol a partir de biomasa [8]. Para que este
proceso ocurra se requiere que primero se de una producción de las enzimas para la
sacarificación, luego la hidrólisis de los polisacáridos provenientes del pre tratamiento
y por último, la fermentación de todos los azucares resultantes de la hidrólisis [8]. Todo
esto debe ocurrir en un reactor de manera simultánea. Sin embargo, se reconoce que
no existe microorganismo en la naturaleza capaz de cumplir con todas las funciones
descritas arriba, por lo que se necesita la formulación de consorcios. Estos
conjuntamente se encargan de la producción de bioetanol y otros productos de valor
agregado a partir del sustrato proveniente del pre tratamiento. Dentro de los
organismos candidatos para ser empleados en el consorcio se debe incluir
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22
microorganismos celulolíticos así como fermentadores. Los primeros se obtienen a
partir de bacterias y hongos fitopatógenos, los cuales presentan eficientes sistemas de
ataque a tejidos vegetales. Los fermentadores deben tener la capacidad de fermentar
diferentes tipos de azucares (pentosas y hexosas) y no ser inhibidos ni por altas
concentraciones de etanol ni de otras sustancias inhibitorias. van Zyl et al, 2007 [8]
reporta las características requeridas por la levadura del pan S. cerevisae para llevar a
cabo una SSF efectiva se muestran a continuación.
� Habilidad para fermentar hexosas y pentosas
� Alta rendimiento y productividad de etanol
� Alta tolerancia a la inhibición por etanol y otros compuestos inhibitorios.
� Suficientemente robusta para poder ser empleado en proceso a nivel industrial.
� Alto nivel de expresión de genes heterologos.
� Alto nivel de secreción de proteínas heterologas.
� Fermentación concurrente de azucares
� Que requiera suplementacion mínima de nutrientes.
� Ser susceptible a la manipulación del ADN.
Se ha observado que al realizar la sacarificación y fermentación de manera simultanea
se obtiene hasta 13% mayor rendimiento de Etanol, que al realizarlas por separado
[22]. Adicionalmente este estudio demostró que la SSF es un proceso mas adecuado
que hacer la sacarificación y fermentación por separado, debido a que durante el
primero se reduce la inhibición de la glucosa durante la hidrólisis enzimática, la
presencia de inhibidores ejerce un efecto positivo sobre la fermentación y la
fermentación tiene un efecto detoxificante. Sin embargo, se ha reportado que el tiempo
que se demora para la producción de etanol es significativamente menor cuando se
realiza la sacarificación y fermentación por separado [18].
Varios estudios han demostrado la efectividad de cultivar las levaduras a emplear para
la SSF en el mismo sustrato que aquel a fermentar: producto hidrolizado obtenido a
partir del pre tratamiento. [19, 20, 24, 25]. Un problema encontrado al realizar SSF, es
la existencia de una fase de adaptación del microorganismo al sustrato a fermentar
[19]. Dicha fase significa que hay que esperar un tiempo entre el cambio del cultivo de
los microorganismos a la fase de fermentación. El tiempo que tiene la levadura para
adaptarse a las condiciones del flujo proveniente del pre tratamiento tiene un efecto
sobre la fermentación y por ende, sobre la producción final de Etanol.
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23
Entre las principales desventajas que se encuentra al realizar SSF, se describe la
presencia de compuestos inhibitorios que no pueden ser removidos en etapas
intermedias y problemas de transferencia de masa que se originan en la viscosidad del
material pre tratado [19].
Se recomienda emplear una carga de levaduras baja con el fin de evitar que las
mismas consuman la glucosa y no la fermenten. Se ha reportado el uso de una etapa
de pre hidrólisis, que aunque no mejora significativamente el rendimiento de la
producción de etanol sí reduce la viscosidad y se facilita la agitación dentro del
fermentador [19]. La productividad de etanol varía según el protocolo de alimentación
de los productos, obtenidos a partir del pre tratamiento, lo que hace necesario
encontrar una relación óptima entre la tolerancia a compuestos inhibitorios y la
cantidad de sólido insoluble en agua alimentada [20].
Al aumentar la cantidad de sustrato se requiere de un mayor título de microorganismos
fermentadores. Esto genera problemas cuando se esta trabajando en SSF, debido a
dificultades para re circular las levaduras, así como un mayor consumo de levaduras
afecta la economía del proceso [24]. Se requiere entonces buscar mantener la
concentración de levaduras en los niveles más bajos posibles.
3.5 Consideraciones para el futuro
Se requiere aumentar la tolerancia de etanol de los microorganismos, ya que esto
afecta la producción de etanol por parte de éstos. Además, la generación de co-
productos con valor agregado para hacer que el proceso sea atractivo desde el punto
de vista económico [21].
Estas son algunas consideraciones que se requieren para la producción de bioetanol a
partir de fuentes lignocelulósicas y no de almidón; el desarrollo de depolimerizaciónes
efectivas de la celulosa y hemicelulosa a azucares solubles; una fermentación efectiva
de tanto hexosas como pentosas, así como de los compuestos inhibidores; un uso
efectivo de la lignina producida como coproducto; y una integración de procesos para
reducir la demanda de energía [23].
Adicionalmente se requiere de mejoras en la hidrólisis enzimática, por medio de
enzimas más eficientes y más baratas de producir; bioingeniería de microorganismos
para hacerlos más tolerantes a la inhibición y capaces de fermentar un mayor tipo de
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azucares para obtener así un mayor rendimiento de etanol. Además, se hace
necesario la integración de procesos con el fin de obtener un menor número de etapas
en la producción y un menor consumo de energía [23].
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4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Selección del consorcio de sacarificación
A partir del cepario de hongos endófitos celulolíticos del laboratorio LAMFU, se
escogieron 3 hongos. Estos fueron seleccionados en base a una revisión bibliográfica,
en la que se buscó aquellos que han sido empleados previamente en estudios
similares. Los tres hongos seleccionados fueron crecidos en agar PDA. Con el fin de
escoger aquel hongo que produzca mayor cantidad de glucosa y azucares reductores
empleando la tusa de palma africana, se realizaron ensayos de sacarificación. Para los
ensayos de sacarificación se preparó un medio de cultivo, el cual consistía del residuo
líquido y sólido del pretratamiento de la tusa de palma africana (128.5mL) y un medio
mínimo de crecimiento (13mL) (medio Fries (NH4NO2 0.1%, K2HPO4 0.5%, MgSO4
0.05%, NaCl 0.01%, CaCl 0.013%, MnSO4 0.0001%, CuSO4 0.001%, FeSO4 0.2%,
ZnSO4 0.001%)). Los ensayos se realizaron en recipientes de vidrio de 500 mL,
teniendo en cuenta que el volumen total de medio de cultivo no puede ser mayor al
30% del volumen del recipiente. Esto con el fin de garantizar las condiciones
adecuadas de aireación. El medio y el recipiente fueron esterilizados a 121°C por 15
minutos, y posteriormente se inoculó el hongo a partir de las cepas crecidas en PDA.
Cada hongo se inoculó en 2 recipientes, para obtener los resultados de cada uno de
los hongos por duplicado. Además se prepararon dos tipos de blancos. El primer
blanco consistió en el medio mínimo Fries más cada uno de los tres hongos (tres
recipientes). El segundo consistió de medio de cultivo, residuo de tusa pretratada y
Fries; no se inoculó hongo en este blanco. Todos fueron mantenidos a 25°C, en
agitación constante de 100 RPM por 15 días. Cada 4 días se tomaban muestras, las
cuales eran analizadas para cuantificar la cantidad de glucosa y azúcares reductores
presentes en el medio.
4.2 SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEA (SSF) EN EL REACTOR
4.2.1 CRECIMIENTO DEL HONGO SACARIFICADOR
El hongo fue crecido y mantenido en medio sólido PDA. Éste facilita el crecimiento del
microorganismo así como permite la detección de contaminación con facilidad. Para la
obtención de biomasa para llevar acabo la sacarificación en el reactor, se empleó el
medio enriquecido SDY (Dextrosa 4%, Peptona 1% y Extracto de levadura 1%). Éste
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26
es un medio líquido, el cual fue preparado con un 5% (en peso) de tusa de palma
africana.
Se inoculó el medio SDY, a partir de la cepa crecida en PDA. Se dejó por 5 días a
25°C, tiempo al cual el hongo está listo para ser inoculado en el reactor.
4.2.2 CRECIMIENTO DE LA LEVADURA PARA LA FERMENTACIÓN
Se utilió levadura comercial marca Levapan; se resuspendió 1 g de esta levadura en
100 mL de agua destilada estéril por una hora. Luego se transfirió la levadura
resuspendida al medio extracto de malta. Este último es un medio liquido el cual
permite el crecimiento de la levadura para obtener biomasa; se prepara con un 5% (en
peso) de tusa. Se dejó el medio inoculado incubando a 25°C por 5 días, y luego se
transfirió al reactor.
4.2.3 INOCULACION Y OPERACIÓN EN EL REACTOR
Una vez seleccionado el hongo a emplear, se montó una serie de SSF en un
bioreactor (New Brunswick Scientific). Como sustrato para la fermentación se empleo
tusa de palma africana pretratada, el medio mínimo Fries y un buffer de acetato de
sodio. La tusa de palma africana fue pretratada física y químicamente como describe
Diana Diaz (Uniandes 2008) y se empleo todo el residuo del pretratamiento (líquido y
solidó). El medio mínimo Fries, el mismo que se empleo en la selección del hongo
para la sacarificación, se utiliza para proveer al hongo de sales necesarias para su
crecimiento. Adicionalmente cuenta con una fuente de nitrógeno y glucosa en bajas
cantidades, para inicializar al microorganismo en la degradación del sustrato. Por
último el buffer de acetato de sodio se emplea para facilitar la regulación del pH en el
reactor; amortizar cambios drásticos de pH en el medio y reducir las cantidades de
ácido y base requeridas para mantener el pH en el valor deseado.
Los tres componentes del sustrato (tusa, medio Fries y buffer) fueron cargados en el
reactor y se autoclavó a 121°C por 15 minutos para garantizar la esterilización del
medio de cultivo. Se inoculó el hongo, y se opero el reactor a 25°C, pH de 6.5, 50 RPM
y flujo de aire de 1.3. Se mantuvieron las condiciones por 8 días, durante los cuales se
tomó una muestra diaria con el fin de cuantificar la cantidad de azucares reductores y
glucosa presentes en el medio. A los 8 días se adicionó la levadura y la temperatura y
el pH del reactor fueron cambiadas a 37°C y 5.5 respectivamente, mientras que el
flujo de aire y la agitación se mantuvieron iguales. Se operó por 5 días dichas
condiciones, y diariamente se tomaron muestras para cuantificar glucosa, azucares
reductores y etanol. La cuantificación de glucosa se realiza mediante el empleo del kit
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de BioSystems, los azucares reductores por la técnica de DNS y la producción de
etanol por Cromatografía de gases.
4.3 Sacarificación y Fermentación Simultánea (SSF) en erlenmeyers
Para la SSF en erlenmeyers, se emplearon recipientes de 250 mL teniendo en cuenta,
una vez más, que el volumen final de medio no debe ser mayor al 30% del volumen
total. Como medio de fermentación se empleo todo el residuo del tratamiento químico
y físico de la tusa de palma africana. Adicionalmente se emplea el medio mínimo Fries
por las razones descritas anteriormente. Los erlenmeyes junto con el medio de cultivo
fueron esterilizados a 121°C por 15 minutos, y posteriormente el hongo se inoculo a
partir de colonias crecidas en PDA. Los erlenmeyers inoculados se mantuvieron a
temperatura y agitación constante; 25°C y 25 RPM respectivamente. Se siguieron dos
metodologías para la inoculación de la levadura fermentativa. En la primera
metodología, la levadura se inoculo a los tres días de inocular el hongo sacarificador.
En la segunda metodología, la levadura se inoculo a los 8 días de haber inoculado el
hongo sacarificador. Ambos metodologías fueron realizadas por triplicado, y se
tomaron muestras diarias de ambas para cuantificar glucosa, azucares reductores y
etanol. La metodología para el crecimiento de la levadura fermentativo fue igual al
empleado en la SSF en el reactor.
4.4 Técnicas analíticas
4.4.1 Àcido Dinitrosalicílico (DNS)
Esta técnica fue empleada para la cuantificación de azucares reductores presentes en
la muestra. Los azucares reductores reaccionan con el acido 3,8-dinitrosalisilico y
producen 3-amino-5-nitrosalicilico. El segundo presenta un color rojo más oscuro,
mientras que el primero es de color amarillo.
Se adiciono 2 mL de muestra y 5 mL de solución de DNS, y se dejaba en un baño de
maría con agua en ebullición por 15 minutos. Al finalizar el tiempo se deja enfriar y se
midió la absorbancia de las muestras. Se midió la absorbancia en el espectrofotómetro
a 600nm, y se compara con la curva de calibración para determinar la concentración
de azucares reductores en la muestra. El blanco empleado consistió en emplear 2 mL
de agua destilada y 5 mL de solución de DNS y realizar el procedimiento mencionado
anteriormente. La curva de calibración se construyo empleando diluciones de
soluciones de glucosa en agua y midiéndoles la absorbancia por la técnica de DNS.
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4.4.2 Kit de Glucosa
El kit de glucosa de Biosystems fue empleado para cuantificar la concentración de
glucosa en todos los ensayos realizados. Es un ensayo enzimático, en el cual se
adiciona el reactivo A a la muestra analizada y se cuantifica mediante
espectrofotometría la formación de quinonaimina. La absorbancia se lee a 500nm, y la
intensidad del color rosado indica la cantidad de glucosa presente en la muestra.
Se adiciona 1 mL del reactivo A, 10 µL de la muestra y se deja en agitación por 10
minutos. Luego se lee la absorbancia a 500nm, y se compara con los datos obtenidos
a a partir de la curva de calibración. La curva de calibración se realiza empleando
soluciones de glucosa con concentración conocida y midiéndoles las respectivas
absorbancias.
Imagen 1. Reacción enzimática del kit de glucosa de Biosystems. Tomado de Biosystems
Reagents & Instruments.
4.4.3 Cuantificación de Etanol
La cuantificación de etanol se realizo mediante el empleo de un cromatógrafo de
gases SHIMADZU GC2010 equipado con una columna XDS, y la detección mediante
un detector de ionización de llama (FID). La inyección de la muestra se lleva acabo de
manera automática por un equipo head space, el cual calienta a 40°C y agita a 250
rpm por 10 min. Luego solo se inyecta la fase vapor. Las condiciones de operación
fueron establecidas para la cuantificación de etanol; temperatura de inyección de
150°C, 50°C en la columna y 150°C en el detector.
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4 RESULTADOS Y DISCUSION
4.1 Selección del consorcio de sacarificación
Del cepario de hongos endófitos disponible en el laboratorio LAMFU, se seleccionaron
a partir de la revisión bibliográfica los hongos Chaetomium globosum (2544),
Cladosporium tenuissimum (2528), Chaetomium globosum (2507) y Chadosporium
cladosporoides (2530). Todos estos presentaron actividad celulolítica en el laboratorio
(datos no mostrados). El hongo Chadosporium cladosporoides (2530), no mostró
crecimiento en agar PDA, al hacer pases del cepario por lo que fue descartado. El
estudio se realizó durante un periodo de 3 semanas, y los datos de cuantificación de
glucosa y azucares reductores se presentan en las figuras 1 y 2.
FIGURA 1. Selección del consorcio de sacarificación. Resultados obtenidos para los tres hongos comparados, en términos de concentración de glucosa. El hongo 2528, Cladosporium tenuissimum presentó una mayor concentración de
azucares reductores durante las primeras tres muestras. Adicionalmente este hongo
presentó la mayor concentración de glucosa en la muestra 3. Por esta razón se
decidío emplear este microorganismo para los estudios posteriores. La concentración
máxima de glucosa fue de 1.3 g/L, mientras que la de azucares reductores fue de 16.5
g/L para el hongo seleccionado. Estos valores máximos no fueron alcanzados al
mismo tiempo; El pico de azucares reductores se obtuvo 3 dias antes que el de
glucosa. De acuerdo a esto es necesario dejar el hongo suficiente tiempo en contacto
con el sustrato, para garantizar que se lleve acabo la máxima sacarificación posible.
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FIGURA 2. Selección del consorcio de sacarificación. Resultados obtenidos para los tres hongos comparados, en términos de concentración azucares reductores.
4.2 SSF en reactor
Se realizaron dos replicas de la SSF en el reactor. La levadura fermentativa fue
inoculada en el día 5, momento a partir del cual se empieza a detectar la presencia de
etanol en el medio de fermentación. El hongo sacarificador es incapaz de fermentar
azucares con producción de etanol, por lo que solo se lleva acabo la producción del
alcohol cuando se encuentra la levadura presente en el medio. Las figuras 3, 4 y 5
muestra los resultados de etanol, DNS y glucosa para las dos replicas. La cantidad de
etanol detectada no es considerable, y en ambas replicas se alcanza el valor máximo
del compuesto orgánico en el medio a las 24 horas de la inoculación de la levadura. La
concentración de glucosa en el medio de fermentación comienza en valores cercanos
a los 5 g/L, pero rápidamente se observa un descenso en dicha concentración. Es
importante recordar que inicialmente el medio fermentativo contiene 0.5% (en peso) de
glucosa. Sin embargo ésta es rápidamente consumida por el hongo. La glucosa que
pudiese ser liberada por la sacarificación de la tusa es consumida casi de inmediato,
razón por la cual no se aprecia cantidades significativas de este azúcar durante el
resto de la SSF. Con los azucares reductores se observa un comportamiento similar al
de la concentración de glucosa. Los valores altos detectados inicialmente por la
técnica de DNS, podrían corresponder a la glucosa suministrada en el medio
fermentativo.
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FIGURA 3. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por Saccharomyces cerevisae, comúnmente empleada en panadería. Resultados de la producción de etanol.
FIGURA 4. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por Saccharomyces cerevisae, comúnmente empleada en panadería. Resultados de la concentración de glucosa.
FIGURA 5. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por Saccharomyces cerevisae, comúnmente empleada en panadería. Resultados de la concentración de azucares reductores.
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La producción de etanol por la levadura fermentativa confirma la presencia de
azucares en el medio de fermentación, a pesar de que la cuantificación de estos
azúcares sea casi nula. Esto se puede deber a que en ausencia de la levadura, los
azucares liberados por la sacarificación de la tusa son consumidos por el hongo.
Cuando la levadura se encuentra en el medio, esta compite con el hongo por el
consumo de estos azucares y emplea parte de ellos para la producción de etanol.
Además de las dos replicas presentadas anteriormente se realizaron 4 SSF
adicionales en el reactor (datos no mostrados), pero en ninguna de estas se logró
detectar la presencia de etanol. Se ensayó con diferentes condiciones de operación
(temperatura, pH, protocolo de inoculación y protocolos de crecimiento de los
microorganismos) y las condiciones empleadas en las réplicas presentadas,
corresponden aquellas en las cuales se pudo detectar etanol.
Cuando se realizaron las SSF con una levadura activada capaz de degradar
hidrocarburos, se obtuvo una mayor producción de etanol. Sin embargo, en la segunda
réplica no hubo producción de etanol en el fermentado. Las figuras 6, 7 y 8 muestran
los resultados de obtención de etanol, DNS y glucosa para estas dos replicas. La
mayor producción de etanol por la levadura activada, se puede deber a una mayor
adaptación a condiciones adversas en el medio por parte del microorganismo lo cual le
facilita el proceso fermentativo.
Al comparar los datos de glucosa y azucares reductores en el reactor con aquellas de
los ensayos de selección del consorcio de sacarificación, se observa que en el primero
son significativamente menores. Esto se puede deber a problemas de escalamiento al
reactor; el esfuerzo cortante generado por la agitación dentro del reactor estresa al
hongo. Esto resulta en un menor crecimiento y por ende una menor producción de
enzimas para degradar la tusa. Debido a esto se realizaron las SSF en shakers,
repitiendo las condiciones bajo las cuales se selecciono el consorcio de sacarificación
y reduciendo el estrés en el hongo.
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FIGURA 6. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol, empleada en bioremediacion. Resultados de la producción de etanol.
FIGURA 7. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol, empleada en bioremediacion. Resultados de la concentración de glucosa.
FIGURA 8. Sacarificación y fermentación simultánea (SSF) en bioreactor. La fermentación fue llevada acabo por una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol, empleada en bioremediacion. Resultados de la concentración de azucares reductores.
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4.3 SSF en erlenmeyes
Se realizó las SSF en erlenmeyers de vidrio de 250 mL, siguiendo los dos
procedimientos de inoculación descritos en la metodología. Las figuras 9, 10 y 11
muestran los resultados de obtención de etanol, DNS y glucosa para las dos
metodologías de inoculación. Se observa que cuando se inocula simultáneamente el
hongo sacarificador y la levadura fermentativa, se puede detectar la producción de
etanol en tan solo 24 horas. Dicha concentración de etanol se mantiene más o menos
estable por el resto de la fermentación.
En el segundo procedimiento de inoculación, se obtuvo un pico de etanol a las 48
horas de introducida la levadura, pero éste aparece a los 9 días de inoculado el hongo
sacarificador. Es necesario considerar si justifica o no dejar el hongo sacarificador solo
en el reactor durante una semana como se plantea en la segunda metodología, a
sabiendas de los costos implicados y el bajo rendimiento de etanol. Sin embargo en
cualesquiera de los dos casos se obtienen mejores resultados, en cuanto a la
producción de etanol, comparado con los ensayos en el reactor.
FIGURA 9. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando Saccharomyces cerevisae de panadería como organismo fermentador. La primera metodología (SSF) consistio en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; en la segunda metodología (S+F) la inoculación de los microorganismos se da en diferentes tiempos. Resultados de la producción de etanol.
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FIGURA 10. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando Saccharomyces cerevisae de panadería como organismo fermentador. La primera metodología (SSF) consistio en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; en la segunda metodología (S+F) la inoculación de los microorganismos se da en diferentes tiempos. Resultados de la concentración de glucosa.
FIGURA 11. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando Saccharomyces cerevisae de panadería como organismo fermentador. La primera metodología (SSF) consistio en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; en la segunda metodología (S+F) la inoculación de los microorganismos se da en diferentes tiempos. Resultados de la concentración de azucares reductores. En cuanto a la glucosa presente en el medio, para el procedimiento de inoculación de
ambos microorganismos simultáneo, la glucosa permanece en concentraciones bajas
durante todo el ensayo. Para el segundo procedimiento de inoculación hay cantidades
considerables de glucosa en el medio, pero una vez se inocula la levadura los niveles
disminuyen. Esto se debe a que la glucosa que se encuentra libre en el medio es
empleada por la levadura para fermentar y producir etanol. En cuanto a los azucares
reductores, la presencia de la levadura no afecta el comportamiento de estos
monosacáridos en ninguno de los dos procedimientos de inoculación
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Al emplear la levadura activada como organismo fermentador, al igual que con las SSF
se obtuvo mayor producción de etanol que al emplear la levadura comercial. Las
figuras 12, 13 y 14 muestran los resultados de obtención de etanol, DNS y glucosa
para las dos metodologías de inoculación.
FIGURA 12. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol como organismo fermentador. La primera metodología de inoculación (SSF) consiste en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; la segunda metodología (S+F) consiste en inoculación a diferentes tiempos de ambos microorganismos. Resultados de la producción de etanol.
FIGURA 13. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol como organismo fermentador. La primera metodología de inoculación (SSF) consiste en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; la segunda metodología (S+F) consiste en inoculación a diferentes tiempos de ambos microorganismos. Resultados de la concentración de glucosa.
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FIGURA 14. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) en shaker bajo dos metodologías de inoculación, empleando una cepa de Saccharomyces cerevisae degradadora de fenol como organismo fermentador. La primera metodología de inoculación (SSF) consiste en la inoculación simultanea del hongo sacarificador y de la levadura fermentativa; la segunda metodología (S+F) consiste en inoculación a diferentes tiempos de ambos microorganismos. Resultados de la concentración de azucares reductores.
4.4 Rendimientos de glucosa, azucares reductores y etanol.
Para el calculo de los rendimientos de glucosa y azucares reductores, se emplearon
las concentraciones de estos azucares en la tusa de palma africana como los máximos
rendimientos posibles. Para el etanol, el rendimiento se calculo con respecto a un valor
teórico el cual se obtiene asumiendo una conversión total de los azucares en el medio
en etanol. Se calcularon los rendimientos obtenidos con ambas levaduras tanto en el
reactor como en el shaker. Para las SSF realizadas en el reactor, la tendencia es
similar para ambas levaduras fermentativas; se da un mayor rendimiento de glucosa y
azucares reductores hacia los primeros días y va disminuyendo a medida que avanza
el tiempo. Es necesario considerar que el medio inicial contenía glucosa en bajas
cantidades. Esto se observa en el mayor rendimiento que se obtiene en la primera
medición tanto de glucosa como de azucares reductores, ver figura 15. Los
rendimientos de las SSF se muestran en la figura 17. Una vez que fueron inoculadas
las levaduras se observó que el rendimiento de glucosa es casi nulo. Por otro lado el
rendimiento de los azucares reductores fue máximo cuando se empleó la levadura
degradadora de fenol bajo una metodología de inoculación simultanea.
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FIGURA 15. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el bioreactor. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos cepas de S. cerevisae. Para cada cepa, el valor presentado corresponde al promedio de las dos replicas. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados de los rendimientos de azucares reductores.
FIGURA 16. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el bioreactor. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos cepas de S. cerevisae. Para cada cepa, el valor presentado corresponde al promedio de las dos replicas. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados de los rendimientos de glucosa.
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FIGURA 17. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el bioreactor. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos cepas de S. cerevisae. Para cada cepa, el valor presentado corresponde al promedio de las dos replicas. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados del rendimiento de etanol.
FIGURA 18. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el shaker. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos metodologías de inoculación (SSF y S+F) y para los dos cepas de S. cerevisae. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados de los rendimientos de azucares reductores.
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FIGURA 19. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el shaker. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos metodologías de inoculación (SSF y S+F) y para los dos cepas de S. cerevisae. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados de los rendimientos de glucosa.
FIGURA 20. Rendimientos de las Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en el shaker. Se muestran los rendimientos de azucares reductores y de glucosa para las dos metodologías de inoculación (SSF y S+F) y para los dos cepas de S. cerevisae. La levadura 1 corresponde a la cepa de S. cerevisae de panadería, mientras que la levadura 2 es la cepa de S. cerevisae degradadora de fenol empleada en bioremediacion. Resultados de los rendimientos de glucosa.
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5 CONCLUSIONES
La producción de etanol fue máxima al emplear recipientes de vidrio para realizar la
sacarificación y fermentación simultánea (SSF). El esfuerzo cortante que ejercen las
aspas dentro del reactor puede resultar demasiado estresante para el hongo lo cual
inhibe su acción de sacarificación del sustrato, causando una reducción en el
rendimiento de etanol. Adicionalmente el tipo de microorganismo fermentador resulta
importante en la cantidad de etanol producida. Al emplear una levadura activada,
degradadora de hidrocarburos se obtiene un rendimiento de etanol significativamente
mayor que cuando se emplea la levadura comercial. Esto se puede deber a una mayor
adaptación a condiciones adversas por parte de la levadura activada, ya que se ha
seleccionado para sobrevivir y proliferar en ambientes hostiles como el petróleo.
Se requiere de estudios posteriores para la obtención de una levadura robusta, capaz
de tolerar condiciones adversas del medio y generar un mayor rendimiento de etanol
significaría en una mayor rentabilidad económica para esta tecnología emergente.
Adicionalmente se requiere establecer las condiciones óptimas de crecimiento del
hongo sacarificador, con el fin de maximizar la actividad de este y por ende la cantidad
de azúcar disponible para ser fermentado.
Los rendimientos de etanol son bajos, se obtiene poco del alcohol que se podría
obtener teóricamente a partir de la tusa de palma africana. Considerando que el
empleo de tusa de palma africana para producir etanol, es una técnica que apenas se
esta comenzando a explorar los resultados son alentadores. Sin embargo esta
tecnología ha de prosperar debe ser económicamente viable, por lo que se requiere de
mayores estudios para optimizar el proceso.
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6 RECOMENDACIONES
- Emplear levaduras mas robustas para llevar acabo la fermentación de los
azucares liberados por el hongo sacarificador. El empleo de levaduras
comerciales diseñadas específicamente para este tipo de procesos, puede
resultar en una mayor producción de etanol.
- Desarrollar metodologías que permitan cuantificar la producción diaria de
etanol. Esto permitiría determinar si el etanol detectado es aquel producido
inicialmente y permanece en el medio o por el contrario es el resultado de
producción continua. Es posible emplear técnicas como la destilación reactiva y
la descomposición catalítica del etanol producido, con el fin de determinar
cuanto etanol se produce a lo largo de las SSF.
- Desarrollar técnicas de cuantificación de azucares que sean mas confiables en
los resultados y sean mas rápidas de realizar. El empleo del kit de glucosa
resulto ser laborioso y los resultados obtenidos por este método presentaron
inconsistencias. Se recomienda estudiar la factibilidad de realizar la detección
de azucares mediante el empleo de HPLC.
- Realizar modificaciones al bioreactor con el fin de reducir el estrés generado
sobre el hongo por la agitación. Un menor número de revoluciones por minuto,
podría ayudar en este sentido.
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