Espectrofotometría, Curva de Calibración y Determinación de Proteínas por el

método de Biuret.

María José Astorga; Daniela Soto; Dayane Rivera

Fecha: 01 mayo 2012

La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución, basados en sus propiedades fisicoquímicas. Como es el caso de las propiedades de compuestos como proteínas, que absorben cierta intensidad de luz (cromóforos) en el espectro UV- visible. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución, con lo cual, a partir de ello se realiza una curva de calibración con las absorbancias medidas por el aparato a concentraciones exactamente conocidas de un tipo en un mismo volumen. Se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

Introducción

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

La determinación de proteínas se efectuara por el método de biuret, en donde las proteínas y péptidos dan positiva a esta reacción. La absorbancia que es la cantidad de luz absorbida por una solución de determinada concentración a una longitud fija, se medirá en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm; en donde el valor de la absorbancia es proporciona a la concentración de proteínas presentes en la solución. Para colocar a prueba todo lo indicado se pretende construir una curva de calibración para la determinación de proteínas plasmáticas mediante el método de biuret; además de determinar la misma en una muestra desconocida. Los resultados esperados son demostrar que las soluciones que tienen mayor concentración de proteínas sean las que tengan un valor de absorbancia mayor en comparación a las que su concentración estándar de proteínas es menor; además de obtener los niveles precisos de proteínas en solución y la concentración exacta de proteínas presentes.

Espectrofotómetro

Materiales

Espectrofotómetro ajustado a 546 nm.

Cubetas de plástico de 1,5 ml.

Material volumétrico.

Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl

Tubos de ensayo.

Muestra de suero y estándar de proteínas totales.

Reactivo Biuret.

Timer o cronometro.

Agua destilada.

Métodos

1) Rotulamos 7 tubos de ensayo y los situamos en la gradilla.

2) Preparamos los 7 tubos de ensayo tal cual se nos indico y se resumen en la tabla 1:

Tubo 1: Añadimos 50 µl de agua destilada.

Tubo 2: Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl suero normal.

Tubo 3: Añadimos 25 µl de agua destilada y 25 µl de suero patológico.

Tubo 4: Añadimos 30 µl de agua destilada y 20 µl de concentración estándar proteínas.

Tubo 5: Añadimos 20 µl de agua destilada y 30 µl de concentración estándar de

proteínas.

Tubo 6: Añadimos 10 µl de agua destilada y 40 µl de concentración

estándar de proteínas.

Tubo 7: Añadimos 50 µl de concentración estándar de proteínas.

Nota: Luego de realizado el paso anterior se les agrego a todos los tubos 2000 µl del

reactivo de biuret.

Tabla 1:

Tubo 1 Blanco

(µl)

Tubo 2 Normal

(µl)

Tubo 3 Patológico

(µl)

Tubo 4 (µl)

Tubo 5 (µl)

Tubo 6 (µl)

Tubo 7 (µl)

Agua Destilada

50 25 25 30 20 10 -------

Estándar ------- ------- ------- 20 30 40 50

Proteínas

Suero Normal

------- 25 ------- ------- ------- ------- -------

Suero patológico

------- ------- 25 ------- ------- ------- -------

Reactivo Biuret

2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

3) Mezclamos por agitación todos los tubos con sus respectivos agregados.

4) Incubamos los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

5) Leímos la absorbancia de cada uno de los tubos a 546 nm.

Resultados

1).- Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 546 nm tal como se

muestra en tabla 2:

Tabla 2:

Tubo T% Absorbancia

1 29,1 0,536

2 20,8 0,683

3 18,6 0,730

4 26,0 0,586

5 22,3 0,652

6 21,9 0,659

7 18,5 0,733

2).- Absorbancia y concentración de proteínas real de tubos 4, 5, 6 y 7

como se indica en tabla 3:

Tabla 3:

Tubo N° 4 5 6 7

Absorbancia 0,586 0,652 0,659 0,733

Concentración de proteínas

(g/dl)

0,39 (g/dl)

0,59 (g/dl)

0,78 (g/dl)

0,98 (g/dl)

Tubo N°4

40 x 20 = x 2050

= 0,39 mg/ml

Tubo N°5

40 x 30 = x 2050

= 0,59 mg/ml

Tubo N°6

40 x 40 = x 2050

= 0,78 mg/ml

Tubo N°7

40 x 50 = x 2050

= 0,98 mg/ml

3).- Calcular ∆A de los tubos 4, 5, 6 y 7 según se indica en tabla 4 para

realización de posterior grafico.

∆absorbancia: ─

Tabla 4:

Tubo ∆absorbancia (∆A)

4 0.05

5 0.116

6 0.123

7 0.197

Tubo N°4 Tubo N°5

= 0.05 = 0.116

Tubo N°6 Tubo N°7

= 0.123 = 0.197

4).- De acuerdo a los resultados obtenidos de ∆A para los

tubos 4, 5 , 6 y 7, realice grafico (grafico 1); según lo indicado en

Tabla 5:

Concentración de proteínas (eje x) vs ∆absorbancia (eje y).

Tabla 5:

Tubo [ ] de proteínas (eje x) ∆A (eje y)

4 0.39 0.05

5 0.59 0.116

6 0.78 0.123

7 0.98 0.197

Grafico 1:

0,05

0,116 0,123

0,197

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,39 0,59 0,78 0,98

∆ A

bso

rban

cia

Concentracion de Proteinas

Curva de calibración

curva de calibración

Ecuación de la recta:

Determinación de nivel de proteínas y muestras de suero a través de la ecuación de la recta con los datos conocidos de los patrones.

Siendo la ecuación de la recta: Donde: y: absorbancia. m: pendiente. x: concentración. n: coeficiente de posición. Calculo de la pendiente:

Utilizando los datos extremos medidos de absorción y concentración del patrón.

Calculo del coeficiente de variación:

Reemplazando los datos determinados de manera experimental en la ecuación de los valores extremos.

Tubo 4: Tubo 7:

Por lo tanto, la ecuación de la recta para la curva de calibración es:

Calculo de concentración de proteínas para la muestra suero normal: -Absorbancia del suero normal: 0.683

Calculo de concentración de proteínas para la muestra con el suero patológico: -Absorbancia del suero patológico: 0.730

Discusión

Al concluir este trabajo y obtener los resultados, es importante señalar que tal como

se pensaba; efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbancia-

concentración es directamente proporcional, ya que los tubos con mayor

concentración de proteínas fueron los que obtuvieron valores de absorbancia mayor.

Al realizar la curva de calibración nos muestra una representación ascendente en

cuanto a la concentración de proteínas y la variación de absorbancia de una solución,

lo que se traduce en lo antes ya señalado.

Tal como se ha realizado con anterioridad en nuestro trabajo y en trabajos anteriores

se ocupo en particular el “reactivo de biuret” a pesar de la existencia de otros para los

mismos fines, ya que nos permitió cuantificar de manera muy precisa, y obtener

resultados para la determinación de proteínas totales en solución.

Preguntas guía:

1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir?

Una curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se emplea en trabajos cuantitativos en los cuales hay que calcular la concentración del absorbente. Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. La elaboración de la curva de calibración es la fase principal al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico.

2. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no

coloradas?

No se podrá construir una curva de calibración; pero si se presentan sustancias

no coloreadas, se emplean reactivos (reactivo de Biuret) que le proporcionen

color a estas sustancias para que puedan ser estudiadas y así realizar la curva

de calibración.

3. ¿Cuál es objetivo de incluir un tubo blanco en las

determinaciones colorimétricas?

El fin de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas se debe a

comparaciones que se logran realizar; siendo este tubo una base (solución

tipo) de absorbancia que presenta esta técnica, llegando a establecer por una

diferencia el valor real de la absorbancia de la muestra y poder realizar los

cálculos pertinentes a exponer.

Las soluciones deben prepararse simultáneamente.

En fin, existe una comparación colorimétrica con la muestra tratada.

4. ¿Cuál es el fundamento del reactivo de Biuret?

Por el método de Biuret se puede determinar la presencia de proteínas totales en una mezcla. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración azulada (cambia a violeta luego en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta). Presenta un máximo de absorción a 540 nm. La intensidad de este color se mide en el espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de proteínas presentes.

5. ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante?

La Albúmina, es la proteína más abundante en el plasma (50% aprox.) se forma predominantemente en el hígado, pero también, si bien en menor cantidad, en otros tejidos. Es responsable principalmente por la presión coloido-osmótica del plasma. Otra de sus funciones consiste en el transporte de sustancias. Al unirse con las hormonas, vitaminas, bilirrubina, medicamentos, etc., las lleva por la circulación a sus órganos efectores. Sus valores normales oscilan entre 3,5 y 5 g/100 ml.

Conclusión

El método ocupado en esta oportunidad es tan efectivo como preciso para la

determinación de proteínas en solución, y además muestra pocas interferencias, es

por eso que se prefiere; este nos permitió obtener lo que se pensaba, en cuanto a que

la absorbancia es proporcional a la concentración de proteínas en una muestra, y

además mediante este método obtuvimos valores exactos de la contracción de

proteínas real en cada tubo, no siendo difícil manipular los materiales y trabajar con el

espectrofotómetro para obtener dichos resultados. Que si pensamos en ocuparlos

para fines de mayor índole como puede ser en el área de salud es primordial evitar los

posibles errores que mas que nada podrían ser de manipulación, lo cual podría

modificar los resultados.

Referencias y Bibliografía

http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf

http://adolfoneda.com/proteinas-plasmaticas/

http://www3.ucn.cl/FacultadesInstitutos/laboratorio/colorT3.htm http://www.panreac.es/spanish/practicas/p29.pdf

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm

http://www.med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/proteinas.pdf

http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-

mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE

%20PROTE%C3%8DNAS.pdf

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/steinera/part

e02/07b.htm