ASOCIACION UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

SEMESTRE ACADEMICO 2013-II

CURSO: BIOQUIMICA Y NUTRICION

PRACTICA Nº 1

ESPECTROFOTOMETRIA

OBJETIVOS:

• Construir una curva estándar o de calibración del Bicromato de potasio 40mg%

• Determinar la concentración de una solución de bicromato de potasio de concentración desconocida haciendo uso de la curva de calibración

• Determinar la concentración de una solución de bicromato de potasio de concentración desconocida haciendo uso del Factor de calibración

Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su estado puro, en función de la longitud de onda de la radiación lumínica y a las mediciones a una determinada longitud de onda.

* Arco iris en Marte

***

Así todos los elementos existentes poseen un espectro

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud

de onda (λ = lambda).

λ

La luz visible es sólo una pequeña parte del espectro electromagnético con longitudes de onda que van aproximadamente de 350 nanómetros hasta unos 750 nanómetros<nanómetro, nm = milmillonésimas de metro>.

Luz visible

350 nm

750 nm

GAMMA

X

U.V.

Infrarrojo

Microondas

Radio

La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda

El color de un cuerpo depende de la luz que recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el color rojo se dá cuando absorbe en casi su totalidad, todas las radiaciones menos las rojas, las cuales refleja o deja pasar dependiendo su estructura (sólida o transparente).

El color de un cuerpo depende de la luz que recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el color rojo se dá cuando absorbe en casi su totalidad, todas las radiaciones menos las rojas, las cuales refleja o deja pasar dependiendo su estructura (sólida o transparente).

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

Longitud del medio absorbente o ancho de la celda

I0

c = concentración. (número de partículas por cm3)

I

a = absortividad

Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I0

b

a

o

los fundamentos de la interrelación de la luz que se absorbe y la que se transmite

Las leyes de Lambert y Beer *

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromática (I0) pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida que la longitud del medio absorbente aumenta

I = I0e-ab

1 cm. 2 cm. 3 cm.

I0 I I0 I0I I

Ancho de la celda

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0 I0 I0I I I

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (Io) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra.

I0 I

LUZ A B S O R B I D A

Luz transmitida

De acuerdo a las características de la sustancia analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la solución

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitanciaAbsorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)

Concentración

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia

La representación gráfica correspondiente a absorbancia y transmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

Concentración

Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz de radiación electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda específicas, formando un espectro, semejante a un código de barras del objeto, con el propósito de identificar, calificar y cuantificar su energía

DISTRIBUCIÓN DE LA LUZ EN EL ESPECTROFOTÓMETRO

 

Espectrofotómetro Mecanismo Interno

¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?

Para la determinación de la concentración de un compuesto en particular se indica una longitud de onda ( )l específica a la que hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro.

La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática

Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda es común que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material .

El razonamiento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es:

A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Curva Patrón

CURVA PATRÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt

AB

S

0

R

B

A

N

C

I

A

Interpolación

Absorbancia del problema

Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:

Abs MP / Abs estándar = Conc. MP / Conc. Estándar

Conc estándar x Abs problema Conc. M P = Abs estándar

FC = Conc estándar

Abs estándar

En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de poder calibrar la absorvancia del equipo a cero

Compuesto1

(blanco)

2 3 4 5 6 7

Glucosa 0,1 mg/ml (mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Agua destilada (mL) 1.0 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Acido sulfúrico (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Tubos Absorbancia

1 0

2 0.135

3 0.253

4 0.417

5 0.658

6 0.574

7 0.768

Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

RESULTADO de la curva patrón anterior

Curva de calibración de glucosa

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3 4 5 6 7

Tubos

Abso

rban

cia

Spectronic 20 D Spectrónic 20

EXPERIMENTO:

TUBO I TUBO II TUBO III TUBO IV

Bicromato de potasio 40mg% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml

Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml

Concentración mg% 4 mg%

Absorvancia

Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a 530nm

a) Construir su curva de calibración en papel milimetradob) Medir la absorbancia de la MP que el profesor le hará entregac) Obtener el FC promedio de las soluciones estándard) Calcular la Concentración de la MP:

a) Extrapolandob) Usando el FC