Enzimas en Suero I y II

1) Dr. Jos G. Castao

Objetivos

Describir y manejar los parmetros fundamentales que definen la actividadenzimtica.

Mtodos de medicin de enzimas como catalizadores y como protenas.

Principales enzimas y utilidad clnica: Transaminasas, Fosfatasas, Creatina kinasa, troponinas, amilasa, GGT y PSA

Enzimas- Catalizadores biolgicos Catalizadores

aumentan velocidad de reacciones qumicas

un catalizador no se consume y convierte varias molculas de sustrato

La concentracin final de sustratos y productos se rige por la ley de equilibrio qumico

Enzimas Mayor parte protenas,

algunas RNAs Aumenta velocidad de

106 a 1012

Condiciones de reaccin suaves

Especificidad Regulacin

Propiedades de los Enzimas Reacciones qumicas - rotura, formacin y

reordenamiento de enlaces qumicos Especificidad

Dictada por el sitio activo del enzima Algunos sitios activos permiten la entrada de varios

sustratos Cofactores

Las cadenas laterales de los aminocidos de lasprotenas tienen un pequeo repertorio de gruposactivos Necesidad de cofactores.

Cofactores: Derivados de vitaminas, metales (Fe, Ca, Mg, Mn) pueden unirse como co-substratos o estar unidos al enzima de forma covalente (grupo prosttico) y permanecer unidos al enzima en multiples ciclos catalticos

Nomenclatura de Enzimas

Oxidoreductasas (EC Clase 1) Transferencia electrones (RedOx)

Transferasas (EC Class 2) Transferencia grupos funcionales entre moleculas

Hidrolasas (EC Class 3) Rompen enlaces por entrada de H2O

Liasas (EC Class 4) Reacciones de eliminacin para formar dobles enlaces

Isomerasas (EC Class 5) Reordenamiento de enlaces intramolecularmente

Ligasas (EC Class 6) Unen dos molculas con nuevos enlaces

Base de datos de enzimashttp://www.expasy.ch/enzyme

Ejemplo ID 2.3.1.43 DE Phosphatidylcholine--sterol O-acyltransferase. AN Lecithin--cholesterol acyltransferase. AN LCAT. AN Phospholipid--cholesterol acyltransferase. CA Phosphatidylcholine + sterol = sterol ester + CA 1-acylglycerophosphocholine. CC -!- Palmitoyl, oleoyl, and linoleoyl can be transferred; a number of CC sterols, including cholesterol, can act as acceptor. CC -!- The bacterial enzyme also catalyses the reactions of EC 3.1.1.4 and CC EC 3.1.1.5. DI Norum disease; MIM:245900. DI Fish-eye disease; MIM:136120. PR PROSITE; PDOC00110; DR BRENDA; 2.3.1.43. DR EMP/PUMA; 2.3.1.43. DR WIT; 2.3.1.43. DR KYOTO UNIVERSITY LIGAND CHEMICAL DATABASE; 2.3.1.43. DR P10480, GCAT_AERHY; P53760, LCAT_CHICK; P04180, LCAT_HUMAN; DR P16301, LCAT_MOUSE; Q08758, LCAT_PAPAN; P30930, LCAT_PIG ; DR P53761, LCAT_RABIT; P18424, LCAT_RAT ; //

http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?245900http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?136120http://srs.ebi.ac.uk/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-e+[BRENDA-ECNumber:'2.3.1.43']http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?ec:2.3.1.43

Concepto de IsozimasIsozimas son dos o ms formas de un enzima

que catalizan la misma reaccin qumicapero tienen distinta secuencia primaria.

Por tanto codificada por distintos genes

FormacinFormacin de unde un complejo enzimacomplejo enzima--sustrato sustrato eses el primer el primer paso paso de la de la catlisiscatlisis

Sustrato Sustrato se se une une al al enzima enzima en elen el sitio activositio activo..

A A cantidadcantidad de de enzimaenzima fijafija, la , la velocidadvelocidad de de la la reacinreacin aumentaaumenta con la con la concentracinconcentracin de de sustratosustrato hastahasta queque se se alcanzaalcanza la la velocidadvelocidadmximamxima de la de la reaccinreaccin..

Sitio activo

Sustrato+

Enzima Complejo ES

Llave cerraduraLlave cerradura -- Emil Fischer (1890)Emil Fischer (1890)

Enzima

Sustrato

+

Complejo ES

Ajuste inducidoAjuste inducido -- Daniel E. Daniel E. Koshland JrKoshland Jr. (1958). (1958)

Velocidad de reaccin en funcin cantidad de sustrato

[[SustratoSustrato]]

Vel

ocid

ad re

acci

nV

eloc

idad

reac

cin

(V)

(V) V max

Velocidad: nmero de moles convertidos por unidad de tiempo

Concepto de VMAX y KM de una reaccin enzimtica

[[SustratoSustrato]]

Vel

ocid

ad

Vel

ocid

ad d

e de re

acci

nre

acci

n(V

)(V

)

KKMM

VVMAXMAX

VVMAXMAX22

Ensayo de actividad: Cuantaenzima est presente?

Usar: pH ptimo, temperatura ptima, etc Cantidades saturantes de sustrato y cofactores[Sustrato] = 10 x Km

[P]

Tiempo

[E] = 2x

[E] = 1x

Linearidad con el tiempo de reaccin

Vo

[E]

[S] >>>>> Km

Linearidad con la cantidad deenzima

Curvas de progreso de la reaccin enzimtica

Aparicin de producto Desaparicin de sustrato

LagV inicial

Parada

Parada

Lag

V inicial

[P] [S]

Tiempo Tiempo

Velocidad inicial se considera cuando se ha consumido < 10% del sustrato

Medicin de actividadenzimtica

LagV inicialP/t

V inicialP/t

Tiempo

[P]

Lag

ParadaMedicin mltiple y continua

Medicin 2 puntos

Parada

[P]

Tiempo

Medicin de actividadenzimtica: mtodos directos y acoplados

LDHPiruvato + NADH Lactato + NADDirecto Desaparicin de

absorbancia de NADHa 340 nm

E1 Creatina +ATP Creatina- P + ADPCKAcoplado

E2 ADP + PEP Piruvato + ATPPKDesaparicin deabsorbancia de NADHa 340 nm

E3 Piruvato + NADH Lactato + NADLDH

E2= 5X E1; E3= 10 X E1. Concentraciones saturantes de sustratos:Creatina, ATP, PEP, NADH

Medicin de enzimas como protenas Un defecto enzimtico es una disminucin en la

actividad de un enzima. Esto puede ser debido.

Tipo I: Cantidad reducida, pero la actividadespecfica* es normal

Tipo II: Cantidad es normal, pero la actividad especfica* est reducida debido a un defecto en elenzima.

*actividad especfica = actividad enzimtica (moles/min) pormg de protena

Enzimas como Protenas(Ensayo enzimtico vs. Ensayo inmunolgico)

Los enzimas se siguen ensayando por su actividad enzimtica: desaparicin de sustrato o aparicin de producto. ES UNA AMPLIFICACION BASADA EN LA REACCION ENZIMATICA.

Tcnicas inmunolgicas permiten medir la cantidad de enzima como protena (independiente de su actividad): ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - La deteccin de

cualquier enzima por medio de anticuerpos especficos contra esa protena

Western blot (Deteccin de enzimas por anticuerpos especficos) -Nos da el peso molecular y la carga (IEF) -> isozimas

RIA (radioinmunoensayo)

Western blot e Inmunoblot

Protenas se obtienen de suero ( o de clulas) , y se preparan en soluccin para cargar en los pocillos de un gel de protenas (en condiciones nativas; o desnaturalizadascon detergentes, i.e. SDS). Se corre el gel y tras la electroforesis las protenas separadas se transfieren a una membrana (nitrocelulosa, PVDF, etc). La membrana se bloquea los sitios inespecficos y se aade anticuerpos contra la protena que queramos detectar (anticuerpoprimario). Se lava el exceso de anticuerpo no unido. Se incuba la membrana con un anticuerpo anti- anticuerpo primario que lleve unido covalentemente una enzima quepermita detectar posteriormente donde se ha unido. Se revela el Iblot con los sustratos adecuados que darn lugar a la formacin de color o a la emisin de luz (quimioluminiscencia)

Western e Inmunoblot

Transferenciaa membranade NC, PVDF

Revelado conAnticuerpo secundario

Inmunoblot Revelado : quimio-luminiscencia y precipitado con color

Ag

10Ab

20AbEnzima:

LuminolLuz Placa deRayos X

Membrana

BCIP, NBT Color azul

peroxidasa

Fosfatasa alcalina

Resultados de un inmunoblot

Reaccin de Ag y anticuerpo

Enzimas en suero tiles en diagnstico clnico

carcinoma de prostataProstataProstate specific antigen(PSA)

Enfermedad hepatobiliarHgado y Rin-glutamiltranspeptidasa

Muy inespecficaVarios tejidosLDH

Infarto Miocardio, msculoCorazn, Msculo y cerebroCreatina Kinasa* (CK)

Enfermedades pancreticasGlandulas salivares, PANCREASAmilasa*Remodelacin huesoHgado, huesoFosfatasa alcalina*

Infarto Miocardio, hgado, msculo

Corazn, Hgado, msculo, rin

Aspartato transaminasa(AST)

Dao o enfermedad heptica

Hgado >> RinAlanina transaminasa(ALT)

Aplicacin clnicaFuente principalEnzima

* isozimas especficas de tejido

Transaminasas

L-Asp + -cetoglutarato Oxalacetato + L-glutamatoAST

(GOT)

Cofactor: Piridoxal fosfato

L-Ala + -cetoglutarato Piruvato + L-glutamatoALT

(GPT)

Especificidad de tejidos de AST y ALT

Heart

Liver

Sk.Mus

cleKid

ney

Pancrea

sSpl

een Lung

RBCs

0

2000

4000

6000

8000

10000Aspartato transaminasa (AST)Alanina transaminasa (ALT)* * *

**

*

*

*

Con

cent

raci

n re

lativ

a su

ero

Transaminasas

AST sube en suero: Infarto de miocardio10 a 100 X Hepatitis viral

Necrosis hepticaShock, hipoxia

AST sube en suero: Cirrosis hepticaModerado 2 X- 5X Ictericia colestsica

Metastsis hepticaEnf. Musculoesquelticas

ALT sube en sueroAfectacn hepticaen paralelo a AST

LDH: lactato deshidrogenasaLDHPiruvato + NADH Lactato + NAD

Elevacin en suero es muy inespecfica. Sube: Infarto miocardio. Insuficiencia cardaca. Anemia Megaloblastica. Hepatitis. Cncer metastasis. Traumatismos musculares. Distrofias musculares

Varias isozimas: H Heart, M Muscle. LDH X: testculo

LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1- +M4 H4Punto de aplicacin

Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb

Electroforesis de sueroIsozimas LDH

Creatina Kinasa: Creatina (FosFo)KinasaCreatina +ATP Creatina- P + ADPCK

Muy abundante en msculo esqueltico y cardaco, cerebro, estmagoPoco abundante en hgado

BB B

B

1

2

3

14q32

19q13

Cerebro

Corazn

Msculo

Isozimas: es un dmero de B y M. Combinaciones

CK isozimas actividades en diversas patologas

1.515971986Duchenne portador(hembra)

39673 10521725Distrofia muscular de Duchenne (varn)

111781338(11x)

1556Infarto miocardio hasta 24h

0.32345347Pacientes inyeccin intramuscular

2.35.9124131Pacientes hospital no cardacos

CK-2 (MB)

CK-3 (MM)

ActividadTotal

% CK-2Creatina Kinasa Actividad (Units/L)Condicin clnica

(7.8X-crnico)

(30x -temp)

(2.7x -temp)

Creatina kinasa isozimas en elInfarto de Miocardio

IM

MM

normal

MM

MB

MB

-Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb

CKMM CKMB CKBB +

95 %

5 %

Cambios en suero: Infarto de Miocardio

Das despus del infarto

Mul

tiplo

s de

l lim

ite e

stab

leci

do

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Mioglobina

Troponina cardiaca

Creatina kinasa-MB

Troponina Cardaca con angina inestable

0

1

2

5

10

20

50

Limite de decisin AMILimite superior de normalidad

Troponinas cardacas

Troponinas T e I son parte de la unidad motora del msculo y regulan la interaccin de actina con miosina.

Hay isozimas de Troponina T e Iespecficas cardacas que pueden detectarse con tcnicas inmunolgicas muysensibles.

Curvas ROC para TnT y TnI en el diagnstico de Infarto de Miocardio

Fosfatasa alcalina ALP (FA)Es una glicoprotena de 74-92 kDa

H2O + R-O-P-O- R-OH +H2PO4

OH

O-

pH >9.0

ALP

Funcin ? Aumento absorcin y excrecin

Tejidos: Hgado: Hepatocitos y Canalculos biliaresHueso: Osteoblastos (calcificacinIntestino, rin: Membrana plasmticaPlacenta

Fosfatasa alcalina: Isozimas- Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb +

Isozimas ALP1: Biliar o renal2: Heptica3: Osea4: Placentaria5: Intestinal

5 3 2

3 2

Normal

Normal

3 2Nios

3 24Embarazo

5 3 2 1Colestasis

La fosfatasa alcalina por ser una protena secretada est glicosilada

Asialoglicoproteinas son reconocidas por receptores deasialoglicoproteinas y eliminadas por la bilis heptica

Las protenas del suero y extracelulares estn glicosiladascon acido silico (cido N-acetilneuraminico) como unidadterminal. Las protenas intracelulares no estn glicosiladas

SueroTejidosFragmentos

BilisHgado

influye en la vida media: ALP intestinal minutosALP heptica 7 das

El tratamiento de suero con neuroaminidasa(elimina cido sialico) y permite diferenciar isozimas de ALP.

Neuraminidasa

+

-Ambas isozimas

ALPhgado

ALPsea

Fosfatasa alcalina en Clnica

Aumento de Actividad Total en suero: Enfermedades seas: Hiperparatiroidismo (con

deficit de Calcio), Enfermedad de Paget, Tumores seos, Osteomalacia y Raquitismo, Fracturas seas

Enfermedades hepticas: Ictericia obstructiva extraheptica. Cncer o tumor heptico. Colestasis intraheptica. Hepatitis infecciosa. Cirrosis alcoholica

Adolescentes y nios: est elevada 2 a 3 veces. Crecimiento seo

Fosfatasa alcalina en Clnica

Aumento de ALP por isozimas Isozima seo: Enfermedades seas antes mencionadas.

Infarto Pulmonar. Insuficencia renal crnica. Isozima placentario: Embarazo durante el tercer

trimestre Isozima intestinal: Alteraciones del Intestino delgado.

Individuos con grupo sanguneo B u O Isozima heptico: las antes mencionadas. Pancreatitis

aguda o crnica. Insuficiencia cardaca congestiva. Cirrosis

Isozimas no identificadas (Regan o Nagao): en diversos tumores: cancer pulmonar, mama, ovario y colon

Alfa-AmilasaHidroliza enlaces glicosdicos alfa 1-4 de almidn, glucgenoy otros polisacridos. No hidroliza celulosa (beta 1-4),ni ramificaciones alfa 1-6. Dando lugar a glucosa, maltosa etc

Ca 2+GlucosaMaltosa

NOAmilasa

Tejidos e isozimas: glndulas salivares: isozima S (S1, S2, S3).Est tambin presente en: pulmn, hueso, ovario y tiroides

pncreas: isozima P (P1, P2, P3 muy poco)cuello uterino y trompas, epitelio intestinal yeyuno

Alfa-Amilasa. Significado clnicoSe eleva en suero especialmente en la pancreatitis agudaOtras causas de elevacin en suero:

lcera perforadaoclusin intestinalapendicitis agudaRotura de Embarazo ectpicoAdenocarcinoma pulmonar, ovario o pncreas

Hay una hiperamilasemia no patolgica en el 1-2% de los individuos. Se debe a la unin de amilasa a IgG o IgA circulantes.Este complejo es demasiado grande para ser filtrado por elrin y por eso se da la hiperamilasemia. No tiene significadopatolgico

GGT: -Glutamiltransferasa(-Glutamiltranspeptidasa)

-glutamylcysteinylglycine (glu-cys-gly) Glutation-GGT transfiere el -glutamilo a otro aminocido. Es un enzimamicrosomal que se induce por consumo de alcohol, fenobarbital, etc

glu-cys-gly

glu-cys-gly

S

S

(GSSG)

glu-cys-gly

SH

(GSH)

R-O-OH R-OH

Glutationperoxidasa

A.A

glu- AA

Cys-Gly

-GGT

El enzima del sueroes de origen hepticofundamentalmente

GGT: -GlutamiltransferasaIsozimas- Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb +

4 2

4 2

Normal

Normal 3

4 2Hepatitis alcohlica 3

Elevacin de -GGT en suero:Cancer heptico primario X 10-20Metstasis heptica X10-15Cirrosis biliar primaria X10-15Hepatitis crnica activa X 7Colestasis intraheptica X6Colestasis extraheptica X 5Hepatitis alcoholica X4Vigilancia del consumo de alcohol

4 25Colestasispor drogas

5 4 2 1Cncer heptico

Fosfatasa cida ACP

H2O + R-O-P-O- R-OH +H2PO4

OH

O-

pH < 5.0

ACP

Funcin ?

Tejidos: Prostata 1000 veces superior a resto tejidosHgado: Hepatocitos y Canalculos biliaresHueso: Osteoclastos (descalcificacin)RinPlaquetas

ACP. Elevada en el cncer de prstata. Muy inespecfica.En la actualidad no se utiliza

PSA (Prostate Specific Antigen).PSA es una proteasa similar a la quimiotripsina (familia de la Kalikrena)producido por el epitelio prosttico, y muy abundante en el fludo seminal. PSA se detecta en la mayor parte de los pacientes con cncerde prstata. En el suero se encuentra formando un complejo con el inhibidor de proteasas alfa-1-antiquimiotripsina (ACT). En el cncerde prstata un alto porcentaje de PSA se encuentra unido a ACT, ms queen la hiperplasia prosttica. Se determina por tcnicas inmunolgicascon anticuerpos especficos. Sus niveles disminuyen con la desaparicin delcncer de prstata, se utiliza para el seguimiento del tratamiento.

Rango de PSA normales varan con la edad: ng/ml40 - 49 0.0 - 2.550 - 59 0.0 - 3.560 - 69 0.0 - 4.570 - 79 0.0 - 6.5

Enzimas en Suero I y IIObjetivosEnzimas- Catalizadores biolgicosPropiedades de los EnzimasNomenclatura de EnzimasBase de datos de enzimas http://www.expasy.ch/enzymeEjemploConcepto de IsozimasFormacin de un complejo enzima-sustrato es el primer paso de la catlisisSitio activoVelocidad de reaccin en funcin cantidad de sustratoConcepto de VMAX y KM de una reaccin enzimticaEnsayo de actividad: Cuanta enzima est presente?Curvas de progreso de la reaccin enzimticaMedicin de actividad enzimticaMedicin de actividad enzimtica: mtodos directos y acopladosMedicin de enzimas como protenasEnzimas como Protenas(Ensayo enzimtico vs. Ensayo inmunolgico)Western blot e InmunoblotWestern e InmunoblotInmunoblot Revelado : quimio-luminiscencia y precipitado con colorResultados de un inmunoblotEnzimas en suero tiles en diagnstico clnicoTransaminasasEspecificidad de tejidos de AST y ALTTransaminasasLDH: lactato deshidrogenasaCreatina Kinasa: Creatina (FosFo)KinasaCK isozimas actividades en diversas patologasCreatina kinasa isozimas en el Infarto de MiocardioCambios en suero: Infarto de MiocardioTroponinas cardacasCurvas ROC para TnT y TnI en el diagnstico de Infarto de MiocardioFosfatasa alcalina ALP (FA)Fosfatasa alcalina: IsozimasLa fosfatasa alcalina por ser una protena secretada est glicosiladaEl tratamiento de suero con neuroaminidasa (elimina cido sialico) y permite diferenciar isozimas de ALP.Fosfatasa alcalina en ClnicaFosfatasa alcalina en ClnicaAlfa-AmilasaAlfa-Amilasa. Significado clnicoGGT: g-Glutamiltransferasa (g-Glutamiltranspeptidasa)GGT: g-GlutamiltransferasaIsozimasFosfatasa cida ACPPSA (Prostate Specific Antigen)Theoretical enzyme values for healthy (H) and diseased (D) patientsTest Outcomes6a) Define the terms specificity and sensitivity.Receiver operator characteristic (ROC) curve for theoretical data.Clinical Correlate 1Clinical Correlate 2