ELECTROFORESIS DE DIGERIDOS CON ENZIMAS DE RESTRICCION

ADRIANA MARIA GIL ZAPATA Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

ENZIMAS DE RESTRICCIN

SECUENCIAS PALINDRMICASEcoRI 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 hidroliza los enlaces fosfodister que unen las bases G y A de cada hebra, de este modo los cortes que crea son escalonados y dan lugar a la formacin de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta regin monocatenaria que resultar complementaria a las de los otros fragmentos.

Polimorfismos de longitud de Fragmentos de Restriccion (RFLPs)

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO IUna sola enzima (multimrica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia especfica de ADN, metila y restringe. Pero la restriccin no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO IILa restriccin ocurre en el sitio de reconocimiento. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en gentica molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios especficos, y as, recuperar secuencias conocidas.

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO IIIEs similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas, y rompen el DNA 25-27 bp, ms all del sitio de reconocimiento.

ENZIMAS DE RESTRICCION

Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1g de DNA en 1 hora. Se han identificado ms de 200 endonucleasas de restriccin.http://www.neb.com/nebecomm/products/category 1.asp

ENZIMAS DE RESTRICCIONLas enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I. B. Cortes Romos (Desoxinucleotidil transferasa terminal).

ENZIMAS DE RESTRICCION

EXTREMOS PEGAJOSOS O COHESIVOS

EXTREMOS ROMOS

CORTES ENZIMAS DE RESTRICCION

APLICACIONES ENZIMAS DE RESTRICCION

Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante.

APLICACIONES ENZIMAS DE RESTRICCIONDesarrollo ADN Recombinante y biotecnologia. Mecanismos de regulacin y expresin gnica. Mapeo y cartografa de genes. Diagnostico enfermedades geneticas con cambio en la secuencia de ADN. Desarrollo protenas recombinantes.

APLICACIONES DE LA GENTICA MOLECULAR

ENZIMAS DE RESTRICCIN

APLICACIONES DE LA GENTICA MOLECULARENFERMEDAD GNICA GANANCIA O PRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIN

Protocolo de Digestin con Enzimas de RestriccinPolimorfismo 1711C>T Enzima de restriccin HhaI Secuencia de Reconocimiento 5- GCG^C- 3 3- C^GCG- 5

Reactivo / Polimorfismo H20 bidestilada Buffer 10XBSA Acetylated g/l Enzima de restriccin 10 U/l 100

1711C>T (A486V)

2,825 l 1 l 0,1 l

Separaracin: Gel de agarosa al 3% Visualizacin: Bromuro de Etidio

HhaI 1 U 6 l10 l

AmplificadoVolumen final

Incubacin a 37C

4 horas

P 1711C>T ElectroforesisPolimorfismo Tamao del Amplificado (bp)Enzima de Restriccin

Genotipo

Tamao del Producto de Restriccin (bp)

TT 1711C>T 185 HhaI CC CT

185 161 / 24 161 / 24 - 185

PCR ANGIOTENSINOGENO AGTH20: Buffer: MgCl2 : dNTPs: Primers: Taq:

1 0 ul 5.0 ul 6.0 ul 4.0 ul 6.4/6.4ul 0.2 ul _________ 38 ul + 12 ul ADN.

DIGESTICON CON LA ENZIMA NcoIDescriptin Features C CATG G G GTAC C Blue/White Cloning Qualified: Promega's blue/white cloning assay provides a higher level of quality control for enzymes used in cloning applications. Restriction Enzyme Usage Information.Store at 20 C.

ProtocolStorage Conditions

Storage Buffer Source Incubatin Conditions

10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol. Nocardia corallina. Buffer D. 37 C.

A Percent Activity in 4-CORE Buffer System5075%

B75100%

C75100%

D100%

MULTI-CORE75100%

Frequency of Cutting

4

Ad-220

X1740

pUC180

M13mp180

pBR3220

Notes

For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 364059.

PROTOCOLO DIGESTION NcoIEnzima: 0,2 ul Bufffer : 0,5 ul H 20 : 4,3 ul ________ 5,0 ul + 15ul Amplificado Llevar a 37C.

ELECTROFORESIS

METODOLOGIA DE ANLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CONVENCIONALCAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAREQUIPO ABI PRISM 310

ELECTROFORESISTcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico.

La velocidad de migracin es funcin de la densidad de carga y sta a su vez es funcin de una serie de parmetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza inica, voltaje, interacciones con el soporte.

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICOCatin ( carga + ) Anin ( carga - ) Migra al polo negativo. CATODO Migra al polo positivo. ANODO

La fuerza que ejerce el campo elctrico sobre la partcula cargada, es proporcional a la carga de la partcula y al voltaje del campo elctrico aplicado. F = Q X V

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO

Otra fuerza se opone al movimiento de la partcula y es proporcional al tamao y la forma de ella y a la viscosidad del buffer. Fr = F X V Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partcula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULASCarga neta de la partcula: Efecto del pH del tampn. Cuando las partculas se colocan en un campo elctrico, estas migrarn hacia el nodo o el ctodo en funcin de la carga neta que posean y sta depende del pH de la solucin en que se encuentran.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULASTamao y Forma de la partcula: Segn el tipo de electroforesis, el tamao y la forma de la partcula pueden tener mayor o menor importancia. Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de molculas, segn el tamao, retienen las grandes y dejan pasar las ms pequeas.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULASFuerza inica del tampn: En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampn como de las partculas en solucin, por tanto cuanto ms concentrado es el tampn, mayor la proporcin de corriente que transportan, menor la migracin de las partculas y peor la separacin.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULASPotencial del campo elctrico:A mayor potencial del campo elctrico mayor velocidad de la partcula. Segn el mtodo electrofortico se elige trabajar manteniendo constante el V o A. Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de separacin, pero tambin la temperatura aparecen efectos indeseables como: desnaturalizacin de pr, evaporacin del buffer, aumento de la fuerza inica.

TIPOS DE SOPORTESEl procedimiento electrofortico se lleva a cabo sobre dos soportes::

1. Soportes No Restrictivos: Las partculas colocadas sobre ellos, se separan nicamente en funcin de su carga elctrica. Los principales soportes son: Papel Acetato de Celulosa Agarosa

TIPOS DE SOPORTES2. Soportes Restrictivos:El soporte ejerce algn tipo de resistencia al desplazamiento de las molculas de la muestra. La resistencia estar dada por el tamao del poro del soporte y por el tamao y caractersticas de las molculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son: Geles de Almidn Geles de Poliacrilamida

ELECTROFORESIS CONVENCIONALAGAROSA: Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentracin entre 0.5 2 gr %. El tamao del poro es grande y permite el paso de molculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en funcin de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificacin por densitometra.

ELECTROFORESIS CONVENCIONALPOLIACRILAMIDASe forman por polimerizacin de la acrilamida con un agente enlazante. El tamao del poro vara, segn la concentracin de la acrilamida y las molculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaos. Soporte ideal para obtener mayor y mejor nmero de separaciones electroforticas. Se puede leer por densitometra. Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

Fragmentos obtenidos de la digestin de AGT con la enzima NcoIEl fragmento del amplificado de AGT sin digerir pesa: 303 pb T: 303 pb M: 211 pb + 92pbEl polimorfismo: T174M Resultado de la electroforesis: TT 0.83, TM 0.15, MM 0.02

ELECTROFORESIS CAPILARPOLIMERO POP 4 Soporte restrictivo que permite la separacin de molculas de ADN desde un par de bases en adelante. Se deposita en un capilar de 1 mm de dimetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la seal de los fluorocromos.

ABI PRISM 310

ABI PRISM 310

FLUOROCROMOS

REALIZACION DE LA ELECTROFORESISObtencin de la Muestra Montaje de la jeringa

Montaje de la muestra

Electroforesis capilar Deteccin por el laserLectura de electroferogramas

ELECTROFEROGRAMA

MARCADOR DE PESO MOLECULAR

LADDER ALLICO

PERFIL GENTICO