en zimas in movi liza das

Métodos Enzimáticos de Análisis II. Enzimas Inmovilizadas

Conocer las características de los enzimas inmovilizadas y los diferentes métodos de inmovilización.

Tener una visión general de los diferentes métodos enzimáticos de análisis que utilizan enzimas inmovilizadas

OBJETIVOS

1. Introducción

2. Métodos de Inmovilización

3. Propiedades de las enzimas inmovilizadas

4. Aplicaciones Analíticas


Introducción

Enzimas en disolución

Inmovilización de enzimas

Proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado paraobtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica

Posibilidad de reutilizar la enzima Aumento de la estabilidad del preparado

Las enzimas son solubles en medio acuoso y no pueden reutilizarse Estabilidad limitada. Preparación de disoluciones con frecuencia

Costes elevados

Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para la determinaciónde sustratos, activadores, inhibidores.

Introducción

Enzimas inmovilizados

Aplicaciones Analíticas:Diseño de biosensoresReactores enzimáticos

Aplicaciones MédicasTratamiento con

enzimas inmovilizados

Aplicaciones Industriales

Industria farmacéuticaIndustria alimentariaIndustria química

1. Introducción





Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión

Con formación de enlaces covalentesSin formación de enlaces covalentes


Inmovilización por Adsorción

Interacción física, no específica (puentes de hidrógenointeracciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.

Alumina, carbón activo, vidrioResinas cambiadoras

El método más sencillo De aplicación general Coste moderado

Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción.

UnionesReversiblesNo covalentes

Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa


Formación de un polímero altamente entrecruzadoen presencia de la enzima. Esta queda atrapada enlos poros de la matriz polimérica formada.

Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática

Se puede perder proteína lentamente

Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas De aplicación general

Gel de poliacrilamidaPolímeros conductores

Atrapamiento por microencapsulación


Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos pero no de la proteína.

Membrana polimérica obtenidaen un proceso de polimerizaciónen la interfase disolución orgánica-acuosa

Se requieren elevadas concentraciones de proteína en disolución acuosa (10 mg/L)

Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente


Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soportepero no entre las moléculas de enzima. El tipo de soporte determina la química de la inmovilización

Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivosempleados en el proceso de inmovilización.Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidorcompetitivo durante el proceso de inmovilización.

Soporte Enzima

Grupo funcional Soporte

-CONH2

-COOH

-NH2

-OH

-Si(OH)3

Poliestireno, nylon

Carboxymetilcelulosa

Poliacrilamida

Celulosa, agarosa, sephadex

Vidrio poroso

Activación para obtener grupos funcionales reactivos

Unión a través de las cadenas lateralesde los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína

-NH2 Lisina

-OH-Ph Tirosina

-COOH Aspartato Glutamato

-SH Cisteina

-OH Serina

-Nimidazol Histidina

Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido

OCH2COOHCH3OH

HClOCH2COOCH3

NH2NH2OCH2CONHNH2

OCH2CONHNH2NaNO2

HClOCH2CON3

OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA

Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida

Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida

Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque tambiénreaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.


2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido

COOH COOC+ C

N

N

R

R´

NH

NH

R

R

La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamenteenlace amida con residuos de Lisina

Activación del soporte para darun derivado acilisourea por reaccióncon carbodiimida

Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina

COOC

NH

NH

R

R

+ NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + C

NHR

O

NHR

+ H

Reacción con la enzima


3. Unión a través de enlace azo

R NH2

NaNO2

HClR N2 Cl

R N2 Cl HO Enzima R N N

HO

Enzima

+

Activación del soporte para obtener una sal de diazonio

Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina

Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina Evita entrecruzamiento enzima-enzima

Entrecruzamiento

N2N2


ICH2 CHN

O

CH2ICHN

O

(CH2)6

S OC

O(CH2)2 N

O

O

SO C (CH2)2

O

N

O

O

Formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte

Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura

Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas

Reactivos bifuncionales más utilizados

Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)

Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato

(CH2)3

CHO

CHO

Glutaraldehido

Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido

Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento

Método simple y sencillo Se verifica en condiciones de pH neutro

(CH2)3

CHO

CHONH2-ENZIMA

NH2-ENZIMA+ (CH2)3

CH

CHN- Enzima

N-Enzima

Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática se puede optar por un método de co-reticulado: entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.

1. Introducción





Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difierende las de las enzimas en disolución debido a efectos delmaterial soporte y a cambios conformacionales de la enzima

Inmovilización Efectos sobre la estabilidadEfectos en las propiedades cinéticas

1. Efectos en la Estabilidad

Estabilización conformacional de la enzima por uniones multipuntuales enzima-soporte

Mayor resistencia a desactivación térmica o química

Alteración del microentorno de la enzima

Por ejemplo mayor estabilidad en medios orgánicos sobre soportes hidrofílicos

[S1]

[S2]

0 Distancia a la Superficie del soporte

1

[S]

[S]dis.


2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas

Capa de difusiónDisolución

SK

Svv

M

max

Los valores de KM y vmax para las enzimas inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)

[S]superficie < [S]disolución

K´M suele ser mayor que KM

4 6 8 10

100

pH

%Actividadrelativa


Efectos de microentorno Cambio del pH óptimo de la enzima

Quimotripsina en disoluciónQuimotripsina/portador catiónico

Quimotripsina/portador aniónico

Sobre soportes catiónicos:[OH-]superficie>[OH-]disolución

pHsuperficie> pHdisolución

Sobre soportes aniónicos:[H+]superficie>[H+]disolución

pHsuperficie< pHdisolución

1. Introducción





Aplicaciones Analíticas

ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO

TRANSDUCTOR ELECTRÓNICA

Esquema general de un sensor químico

Un sensor es un dispositivo que responde de forma directa, continua, rápida, selectiva y reversible a los cambios de concentración de una especie química en una muestra compleja, idealmente sin tratamiento previo de la misma.Consta de un elemento de reconocimiento molecular (que produce una interacción selectiva (específica) con el analito), en contacto físico con un transductor.

SENSORES QUÍMICOS

Elementos de reconocimiento molecular empleados en el desarrollo de sensores

Reactivos inmunológicos

NucleótidosADN/ARN

EnzimasCélulasTejidos

Polímeros Molecularmente

impresos

Ligandos neutros

Cambiadores líquidos

Bioafinidad Biocatalíticos

Bióticos Abióticos

Componentes de reconocimiento molecular

Membranas sólidas

Proceso de reconocimiento selectivo

analito

Transducción Energía

Electroquímicos Ópticos Térmicos

Secuencia de procesos en la operación de un sensor químico.Se resumen los distintos tipos de transductor que pueden ser utilizados

Amperométrico Potenciométrico Conductimétrico

Respuesta-Procesamiento de datos

Piezoeléctricos(de masa)

Transductores empleados en el desarrollo de sensores

BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS ENZIMÁTICOS: Sensor de Urea

Transductor(Electrodo selectivo)

Capa de enzima inmovilizada

(NH2)2CO 2 NH3 + CO2

Ureasa

Métodos de inmovilizacióndel enzima

Estabilidad del sensor

Interferencias Tiempo de Rango de respuesta linealidad

pHControl pH(tampón dil.)

1 min 510-5-10-3 M

NH4+ K+ (Na+) 35 s 510-5-10-1 M

Encapsulación en membranas de diálisis

Inclusión en gel de poliacrilamida

Inclusión + enlace covalenteen ácido poliacrílico

Entrecruzamiento con albúmina(glutaraldehido)

10 d.

21 d.

30 d.

60 d.

SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.

Sensor de oxígeno de Clark (no enzimático)

-600 3.25

Eap./ mV i./ µA

Electrolito interno (KCl)

Ánodo de Ag/AgCl

Cátodo de Pt

Membrana dePolímero (PTFE)

Proceso catódico:O2 + 2 H+ + 2 e- H2O2

Proceso anódico:2 Ag(s) + 2 Cl-(aq) 2AgCl(s) + 2 e-

Características de respuesta

Corriente de difusión estacionaria:

i = nFA Co*

Dq

= espesor de la membrana= porosidad de la memb.q = factor de tortuosidad

Tiempo de respuesta:

test. = 2 2

(D/q)test 20 – 50 s

SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS1. Basados en el empleo de enzimas oxidasas

Enzima inmovilizada

transductor

Señal (i/ µA)

Eapl = cte

SH2 + E(FAD) E(FADH2) + S

E(FADH2) + O2 E(FAD) + H2O2

1. Medida del peróxido de hidrógeno generado

H2O2 O2 + 2 H+ + 2 e- Reacción electródica

2. Empleo de un mediador de transferencia electrónica (Med) (el O2 se sustituye por un aceptor de electrones no fisiológico)

SH2 + O2 S + H2O2

E

E ox

Ered

SH2

S

SH2

S

Sensor Disolución

Medox

Medred

e- E(FAD)

E(FADH2)

Enzima y mediador inmovilizados

SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS2. Basados en el empleo de enzimas deshidrogenasas

NADHNADH electrodoelectrodo

NADNAD++ + 2e+ 2e-- + H+ H++

++ NADNAD++SHSH22 S + S + NADHNADH + H + H++

EE

Cinética lenta

Mecanismo complejo

SelectividadSelectividad

EstabilidadEstabilidad

ReproducibilidadReproducibilidad

DIFICULTADES

EMPLEO DE MEDIADORES DE TRANSFERENCIA ELECTRÓNICA

NAD+

NADH

E

SH2

S

SH2

S

Electrodo Disolución

Medox

Medred

en zimas in movi liza das

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