1

Adriana Hernández Msc.

PCR en TIEMPO REAL

2

PCR – Reacción en cadena de Polimerasa

Mullis, Premio Nóbel química 1993

Karry Mullis, PCR 1985

PCR Tiempo Final

3

PCR – Reacción en cadena de Polimerasa

PCR Tiempo Final

4

PCR Tiempo Final

DESNATURALIZACIÓN-

separación de doble hebra de DNA en cadenas simples

-

temperatura recomendada 94ºC , durante 1 min.

ALINEAMIENTO (ANNELING)-

unión de primers en zona complementaria

-

temperatura dependerá

del Tm de los primers, alrededor de 55ºC

ELONGACIÓN -

DNA polimerasa extiende los primers en presencia de dNTPs y buffer

-

temperatura mayor actividad Taq 72ºC

REPETICIÓN CICLOS -

el número de ciclos varía entre 20-40

-

los productos se incrementan exponencialmente

5

Curva de amplificación de PCR

Fase de meseta

Fase exponencial

Fase basal

deteccción de muestras

PCR de tiempo final

PCR Tiempo Final

6

DESVENTAJAS DE PCR (Tiempo final)

• Tiempo consumido elevado:-PCR, manipulación electroforesis (armar cuba, hacer gel, cargado muestras, correr gel, teñir) analizar bandas.

• Pérdida de Precisión:-

Como no es un sistema automatizado la manipulación puede producir

errores

• Perdida de sensibilidad -

Detección : -El producto es detectado al final de la PCR, no está

directamente

relacionado con la cantidad de DNA.

• Riesgo de contaminación

• Cuantificación:-

Basada en discriminación por tamaños, no podemos determinar

concentración

7

PCR – Tiempo real

8

•

PCR en tiempo real, permite monitorear los productos amplificados durante la PCR (en cada ciclo) con fluorescencia (quimicos)

•

El incremento de señal fluoresecnte es directamente proporcional a la cantidad de amplicones producidos durante la PCR

PCR Tiempo Real

9

ALGUNAS VENTAJAS DE PCR (Tiempo final)

Detección del producto en cada ciclo de reacción (análisis de cinética de reacción).

Análisis rápidoAnálisis semi-automatizado (colecta de datos y análisis)No es necesario procesamientos luego de la amplificación (ej. Auto

radiografías o geles)Preciso, sensible, reproducibleDiscriminación de productos inespecíficos con análisis de curvas de “melt”

o desnaturalización.

10

Aplicaciones PCR - TR

• Expresión génica

• Detección de patógenos

• Diagnóstico de tumores

• Control de eficiencia a fármacos

• Diagnóstico veterinario

• Genotipado

• Epigenética

• Análisis de melting

11

MODULOS de ANÁLISIS

Cargado demuestras

1 Templado (DNA or cDNA)

2 Mix comercial

3 Mix primer/sonda

Extr

acci

ón d

el t

empl

ado

Cuan

tifi

caci

ón

PCR

12

ELECCIÓN DEL MÉTODO:

• Cantidad y peso molecular requerido de DNA• Pureza requerida• Tiempo disponible • Dinero

MÉTODO BASE:

• Homogenización y lisis de la muestra• Remoción de proteínas y contaminantes• Recuperación del DNA (pp)Ex

trac

ción

del

tem

plad

o

13

• Método de extracción orgánica x DNA-

detergente, fenol-cloroformo, isoamilalcohol(ej. DNAzol –INVITROGEN)

• Método de extracción orgánica x RNA -

isotiocianato de guanidina (lisis), fenol-cloroformo,

alcohol (ej. TRIzol –

INVITROGEN)

• Gradiente densidad CsCl (DNA calidad, Tiempo)CsCl + BrEt centrif, isopropanol, etanol

• Cromatografía de intercambio aniónico-

se usa para separar moléculas grandes (50-

100kb)

•

Absorción gel Silice (ej. DNeasy /RNeasy– QIAGEN)

-

Se usa para pequeñas cantidadesExtr

acci

ón d

el t

empl

ado

14

1.

CALIDAD DEL TEMPLADO2.

BUEN SET DE PRIMERS

3.

CONTENIDO DE SALES 4.

APROPIADA CONCENTRACION DE MgCl

5.

AJUSTES DE LA TºC ANNELING6.

CALIDAD DE CURVA ESTANDAR

7.

TIPO DE CONTROLES8.

CONCENTRACIÓN DE FLUOROFORO

O SONDA9.

CICLADO EN GRAL.

10.

DESPUES DE LA PRIMER PCR VERIFICAR EL PRODUCTO EN UN GEL

OPT

IMIZ

AC

IÓN

DE

LA

PC

R

15

Plataforma Rotor-Gene Q

161616

Ventajas del sistema. centrifugo400 RPM

>10 G

Las muestras giran constantemente •

400 RPM

No hay variabilidad entre los pocillos

Uniformidad térmica demostrada

No hay variabilidad óptica entre los tubos

Se caracteriza por una rapidez importante •

las 100 muestras son leídas en 0.15 s

La fuerza G mantiene el contenido en el fondo

•

se evitan burbujas y condensación •

no se forman pellets

1717

OPTICA RG

Cámara de reacción

PMTDetectoróptico

FUENTE LED

(diodos emisores de

luz)

Lens

Filtros -

Detección

Motor rotatorio

1818

Rotary optics 3D animation

LED light source(rotates for each channel)

rotor spins tubes at 400 rpm

lens

filter set(rotates for

each channel)

sensitive PMT (photomultiplier)

detector

1919

5 Modelos1. 2-Plex

Green/Yellow2. 2-Plex HRM

Green/Yellow + High Resolution Melt channel

3. 5-Plex

Green/Yellow/Orange/Red/Crimson4. 5-Plex HRM

Green/Yellow/Orange/Red/Crimson + High Resolution Melt channel

5. 6-Plex

Blue/Green/Yellow/Orange/Red/Crimson

Channel Excite/Detect (nm) Fluoroforos detectadosBlue 365/470

BiosearchBlue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®

350Green 470/510

FAM™, SYBR®

Green 1, Fluorescein, EvaGreen™, Alexa Fluor®

488Yellow 530/555

JOE™, VIC™, HEX™, TET™, Yakima Yellow®, Cal Flour®

Gold 540Orange 585/610

ROX™, Cy3.5®, Redmond Red®, Alexa Fluor®

568Red 625/660

Cy5®, Quasar670™, LCRed640®, Texas Red®, CAL Fluor™

Red Crimson 670/710

Quasar705™, LCRed705®, Alexa Fluor®

680HRM 460/510

SYTO®9, LC Green, LC Green™Plus+, EvaGreen™

UV

IR

NOTA: no es necesaria normalizacion ROX™

en un canal especial

20

•

Las disparidades térmicas de los sistemas de placas es una de las principales causas datos erroneos

•

Las esquinas y los bordes son las que más sufren

•

Se localizan “hotspots”

como resultado de los fallos de los sistemas Peltier

•

Productos erroneos por fallas en anneling de primers

2121

Ventiladores centrífugos llevan aire

a toda la cámara

Mecanismo Térmico

Nota: agujeros del rotor

permiten flujo aire

Encendido elementos térmicos

2222

Entrada de aire frío

Ventiladores centrífugos llevan

aire a toda la cámara

Se abren respiraderos, se expulsa aire caliente

Mecanismo descenso temperatura

Apagado elementos térmicos

Nota: agujeros del rotor

permiten flujo aire

23

OTV: Optical Temperature Verification‡

•

Utiliza unos cristales líquidos termocromáticos

•

A temperaturas específicas las propiedades quimicas de cada cristal cambian. Ésto es detectado por el Rotor-Gene

‡

Patented by Corbett Research

•

El Rotor-Gene es el único termociclador de tiempo real que ofrece un sistema para la verificación de la temperatura

24

OTRAS VENTAJAS ROTOR GENE

• No precisa una calibración rutinaria

(la puede realizar el propio usuario, no hace falta la visita de un técnico)

•

No requiere la presencia de un fluorescente de referencia

que bloquea canales y encarece el sistema (ejemplo ROX en el ABI, Stratagene

y Bio-Rad)

• No requiere una limpieza del bloque

(los tubos rotan en el aire)

• La centrifugación remueve automáticamente las burbujas

(rotor)

• Se pueden marcar los tubos

(no es posible con sistemas de 96 pocillos)

• Plataforma abierta a distintas variedades de tubos y medidas

• Es la plataforma global más abierta

2525

Formatos de tubos

PCR tubos 36 ×

0.2 mL 1.

2. PCR tubos 72 ×

0.1 mL tubes

2626

Gene-Disc™ Anillos

3. Gene-Disc™ 72 - 0.1 mL tubos - tubos orientados verticalmente (no en angulo)

4. Gene-Disc™ 100 - 30 µL pocillos - pocillos orientados verticalmente(no en angulo)

27

Principios deCUANTIFICACION

28

Bajo número de copias

(ej. ~103

copias)SEÑ

AL →

(fluo

resc

enci

a no

rmal

izad

a)

TIEMPO →(ciclos amplificados)

Bajo = alto no. copias

amplificadas pronto

Alto CT

=

bajo no. copiasamplificadas tardiamente

Umbral de detección

Ploteo de Amplificación

Alto número de copias(ej. ~108

copias)

Fase inicialNo se detecta

señal

Fase logarítmicaseñal ~ se duplica

cada ciclo

Fase platóReacción lenta y se detiene

(componentes se vuelven limitantes)

PCR final(no cuantitativa)

CT

CT = ciclo umbral

PCR Tiempo Real

29

0.1→

Ajuste al principio de la fase lineal de la fase log:

1.

Encima de fase inicial2.

Debajo del plató

Ajuste del UmbralAmplificación lineal

30

1.

ABSOLUTA (curva estándar –

resultado numérico)2.

RELATIVA (resultado comparativo con un gene referencia

o con un calibrador)

PCR Tiempo Real

TIPOS DE CUANTIFICACIÓN

31

CUANTIFICACIONCuantificación Absoluta

• Es una cuantificación apropiada por ej., para DNAgenómico, para determinaciones virales, etc

• Se utiliza una curva estándar que debeser debidamente obtenida

• Las curvas pueden provenir de producto de PCRpurificado, plásmidos recombinantes y genómicos, grandes oligos sintetizados comercialmente

32

CUANTIFICACION

Punt

o de

cor

te (c

iclo

s)

log (numero de copias)

Valor Absoluto

(Numero copias)

1. Amplificacion de una muestra desconocida

fluor

esce

ncia

ciclos

ciclos

2. Amplificacion deEstandares externos

fluor

esce

ncia

Cuantificación Absoluta

3. Generacion de una curva estandard

33

CUANTIFICACION

5,000 50,000 500,000 5,000,000 50,000,000 500,000,000

CT

Concentracion (en unidades apropiadas. Ej., copias/uL, numero copias, pgacs nucleicos, uL, etc)

Cantidadde muestra

desconocida

determinadadesde la curva

Cuantificación Absoluta

34

CUANTIFICACION

Muestra desconocida

Umbral

Nombre Punto de corte estandar Concentración

calculada QS 1 21.4 1x105 cop/µl 1.15x105 cop/µlQS 2 24.9 1x104 cop/µl 1.26x104 cop/µlQS 3 28.7 1x103 cop/µl 0.85x103 cop/µlQS 4 31.9 1x102 cop/µl 1.12x102 cop/µlQS 5 35.8 1x101 cop/µl 0.81x101 cop/µl

Muestra desconoida 26.1 6.21x103 cop/µl

Cuantificación Absoluta

35

CUANTIFICACION

LA PENDIENTE DE LA CURVA ESTANDAR

36

CUANTIFICACION

37

CUANTIFICACION

38

La eficiencia de la PCR debe ser entre 90-100% (pendiente ideal = -3.3)

CUANTIFICACION

A = 10-1/pendienteA = 10-1/-3.32 = ~ 2.0

CALCULO DE LA AMPLIFICACIONEXPONECIAL

Un cierto número de variables pueden afectar la EFICIENCIA o la AMPLIFICACIÓN EXPONECIAL: largo del amplicon, estructuras secundarias, diseño de los primers, etc.

39

CUANTIFICACION

ECUACIÓN DE LA PCR

Xn = X0 (1 + E)n

Xn

= producto de PCR luego de n ciclosX0

= numero copias inicialE = efficiencia de amplificacionn = numero de ciclos

Xn

XX00

Numero de ciclosN

úmer

o de

cop

ias

40

CUANTIFICACION

Effecto de la EficienciaEffecto de la EficienciaXn = X0 (1+E)n

Caso 1: E = 0.9 Caso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8Caso 2: E = 0.8

XXnn = 100 (1+0.9)= 100 (1+0.9)3030 XXnn = 100 (1+0.8)= 100 (1+0.8)3030

XXnn = 2.3 x 10= 2.3 x 101010 XXnn = 4.6 x 10= 4.6 x 1099

RESULTADOUna diferencia de 0.1 o del 10% de EFICIENCIA deamplificacion resulta como una diferencia de 5veces en la relación final de los productos de PCRdespués de 30 ciclos.

(E= 90%) 30 ciclos (E= 80%) 30 ciclos

41

CUANTIFICACION

Antes de aceptar los datos para la eficiencia de una curva de dilución,Se deberían de tener en cuenta ciertos criterios

* Colocar manualmente el umbral del estándar * Chequear que todas las curvas de melting estén bien.* Chequear que todas las pendientes sean paralelas en

la grafica logarítmica* Deshacerse de las muestras que atraviesan juntas el umbral

en caso de múltiples diluciones * Deshacerse de muestras en el ciclo 10 o anterior* Estar seguro de que se tienen 5 o mas puntos.* Chequear que el coeficiente de correlación sea mayor de 0.990

Por rutina si se cumplen con estos criterios el coeficiente de correlación será

del 0.998 o por encima.

CRITERIOS PARA LA CALIDAD DE LAS CURVAS DE DILUCIÓN

42

CUANTIFICACIONCuantificación Relativa

• Se analizan los cambios de expresión génica

•Es la cuantificación de nuestra muestra problemacon referencia a una muestra calibradora o estandar externo.

• Calibrador también llamado control interno, controlendógeno, suelen ser genes housekeeping.

• Los resultados se expresaran como la relación muestraproblema/muestra referencia

• Se recomienda para su uso la normalización de los mismos

43

CUANTIFICACION

EJEMPLOS DE G. HOUSEKEEPING EMPLEADOS

44

CUANTIFICACIONCuantificación Relativa

MÉTODO DE DOBLE CURVA ESTANDAR

1.

CURVA ESTANDAR DEL GEN REFERENCIA(Housekeeping) + control G. REF. + experimental G. REF.2. CURVA ESTANDAR DEL GEN DE INTERES (GOI)

+ control GOI + experimental GOI

45

CUANTIFICACIONCuantificación Relativa

Modelos sin corrección de eficiencia -

Δ Δ CT

46

Software RG-Q

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

Standard Curve Quantitation2 Standard Curves Relative QuantitationΔΔCT Relative QuantitationComparative QuantitationRelative Expression Software Tool (REST)LinReg (Assumption-Free Analysis)Melt AnalysisHigh Resolution Melt AnalysisEnd-Point AnalysisAllelic DiscriminationScatter Graph AnalysisConcentration Analysis

Standard Curve Quantitation2 Standard Curves Relative QuantitationΔΔCT Relative QuantitationComparative QuantitationRelative Expression Software Tool (REST)LinReg (Assumption-Free Analysis)Melt AnalysisHigh Resolution Melt AnalysisEnd-Point AnalysisAllelic DiscriminationScatter Graph AnalysisConcentration Analysis

57

58

59

HRM High Resolution Melt

60

FORMATOS DE DETECCIÓN QUIMICA

PCR Tiempo Real

1.

Detección inespecífica (agentes intercalantes del DNA) :

-

químicos primera gn –

Bromuro de Etidio-

químicos segunda gn –

SYBR Green I

-

químicos tercera gn - SYTO 9, Eva green, LC Green

2.

Detección específica

-

sondas fluorescentes -

FAM, TAMRA, JOE, ROX,etc.

61

SYBR Green

VENTAJAS

• El análisis solo requiere de los primers• Es económico• Permite análisis de curvas de disociación o melting

DESVENTAJAS

• Como se une a sec. Inespecíficas puede dar falsos positivos

• Es necesario hacer una curva de disociación o melting• No se pueden realizar análisis “multiplexing”

PCR Tiempo Real

62

SYBR Green -

CURVAS DE DISOCIACIÓN

• Al final de la reacción se aumenta la temperatura (ej. Desde 50ºC a 99ºC) y se estudia la disociación del SYBR Green cuando selibera de la doble hebra al ser desnaturalizada

• Dependiendo de la longuitud y de la secuencia de los ampliconesse tendrán distintas curvas de melting

• A medida que aumenta la temperatura, la fluorescencia disminuye • Tm = Temperatura de melting , 50% del DNA está

desnaturalizado

PCR Tiempo Real

63

ANÁLISIS DE LA CURVA DE MELTING

Ploteo de la derivada negativa del rango de cambio de la fluoresecencia

vs la temperatura como –dI/dT

PCR Tiempo Real

64

Incremento de la temperatura

Tm

Desnatura lización

DNA

ANÁLISIS DE LA CURVA DE MELTINGPCR Tiempo Real

65

Tecnología de saturación para HRM -LCGreen™

I, EVA Green, Syto 9

LC Green™ I

•

Estos químicos son menos tóxicos, se usan en > concentración,

•

Permite saturación en todos los sitios

•

H –

La saturación total evita la re-localización

QUMICOS INTERCALANTES

SYBR® Green I

• SYBR Green I es tóxico, por eso se usaen bajas concentaciones en la PCR

• Entonces el DNA no queda totalmente Saturado

• SG se re-localiza cuando empieza el melting

PCR Tiempo Real

66

HRM - High Resolution Melt ANÁLISIS HRM –

se basa en la caracterización de los productos de la PCR de acuerdo al comportamiento de disociación de hebras (melt)

Productos de PCR –

variaciones de secuencias = diferencias de contenido GC =

DIFERENTES PROPIEDADES DE MELTING

HRM es sensible incluso a un simple cambio de base (ej. SNP)

PCR Tiempo Real

67

• La alta intensidad y sensibilidad óptica detecta pequeños cambios de fluorescencia

•

La precisión en el control de temperatura permite que se efectúen pequeños incrementos (mayor resolución)• Variación de Temperatura entre tubos +/-

0.01°C

• Alta velocidad de captura de pequños incrementos = muchos datos puntuales

PCR Tiempo Real

Porque el RG-6000 es IDEAL para ANÁLISIS DE HRM

68

Software HRM

Resolucion 0.02 °C, recomendado 0.1 °C

los pasos son mucho más rápidos y esto es

apropiado para análisis de SNP

PCR Tiempo Real

69

Homoduplex C>T

Homocigotas se diferencian facilmente por la diferencia en las TM

s.

T

AC

G

PCR Tiempo Real

70

Heteroduplex C>T

Heterocigotas forman heteroduplexesHeterocigotas (azul) es una mezcla de 4 heteroduplex yel resultado es de gráficas más complejas

T

AC

G

++

T

A

C

G

+

T

G

C

A

PCR Tiempo Real

71

ADQUISICIÓN DE DATOS

•

Dos regiones definidas—por encima de 100% doble hebra /por debajo simple hebra basal

PCR Tiempo Real

72

•ACTN3 C-T(R577X)•10 replicates•40 cycle fast(<40 min).

SOFTWARE: NormalizaciónPCR Tiempo Real

73

Diferencia de curvas

•

Esta gráfica muestra el ploteo de cada muestra menos la curva del genotipo control

•

Calcula el porcentaje de confianza relativo a un genotipo conocido

PCR Tiempo Real

74

PCR Tiempo Real

Aplicaciones•

Genotipado SNP / Discriminacion Alelica

Identificación de Candidatos con Predisposicion GeneticaStudios de Asociación -ej. Comparacion de casos y controles, genotipo a fenotipoEstudios de Prevalencia – dentro de una población o diferentes sub poblaciones Perdidad de HeterocigosidadDNA fingerprintingBloques de Haplotipo

•

Test PredictivosEstudio de variaciones de una enfermedad dentro de una familia

•

Descubrimiento de Mutaciones /Screening/Scanning—genomicas y adquiridas

•

Identificacion Especies•

Compatibilidad HLA

•

Metilaciones Epigeneticas

75

CARGADO en

MATRIZ

•

SSC

(análisis polimorfismos conformacionales simple hebra)

•

DGGE (desnaturalización por gradiente en gel –

electroforesis)

•

DHPLC

(desnaturalización por cromatografía líquida de alta presión)

•

TGCE

(electroforesis capilar con gradiente de TºC)

• Espectroscopia de masa

• Secuenciación

DIFERENTES MÉTODOS DE EXPLORACIÓN DE MUTACIONES (Reed et al., 2007)

AMPLIFIC ACION de

DNA

•Lavado•Reacciones Enzimáticas

HRM

MUESTRA

PCR Tiempo Real

76

PCR Tiempo Real

Identificacion de especies :

M.FlavescensM.Avium Complex 2

M.Avium 26

M.UlceransM. Kanassi

M.Tuberculosis

Reporte generado

77

77

Maternal Aunt 1

Patient

Paternal Aunt

Maternal Aunt 2

1104Relationship 20 probes

SS sequencing

2 days

d e g .8 5 8 5 . 5 8 6 8 6 . 5 8 7 8 7 .5 8 8 8 8 .5 8 9 8 9 .5 9 0 9 0 . 5 9 1 9 1 . 5 9 2 9 2 .5

Nor

m. F

luor

o.

1 1 0

1 0 5

1 0 0

9 5

9 0

8 5

8 0

7 5

7 0

6 5

6 0

5 5

5 0

4 5

4 0

3 5

3 0

2 5

2 0

1 5

1 0 Patient

Maternal Aunt 1

2.5Hrs

X

X

11040401

11430403

1104

2 days

No match

04010403

Red Cross-Melbourne

Estudio de COMPATIBILIDAD - HLA

78

PCR Tiempo Real

Sister 07, 13

Patient 1303,1601

070113031601

Estudio de COMPATIBILIDAD - HLA

Brother 1303,1601

2 Brother 07,13