electroforesis
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Electroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico. ELECTROFORESIS. Cátodo. -. +. -. +. Ánodo. ELECTROFORESIS. Cátodo. q. -. Velocidad = E. f. +. -. E: gradiente de potencial. E=V/d q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH) - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ELECTROFORESIS
Electroforesis: migración de
una partícula cargada
sometida a un campo
eléctrico
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
ELECTROFORESIS
qVelocidad = E
f
E: gradiente de potencial. E=V/d
q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH)
f: coeficiente de fricción tamañoforma
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
Criterios de separación electroforética
q (carga)Velocidad = E
f (tamaño, forma)
1. Separación por tamaño
2. Separación por carga
3. Separación por tamaño y carga
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
ELECTROFORESIS
q (carga)Velocidad = E
f (tamaño, forma)
1. Muestra
2. Tampón: mantenimiento de pH y conductividad
3. Soporte
4. Equipo electroforético:• Fuente de alimentación• Cubeta de electoforesis
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
SOPORTES ELECTROFORÉTICOS
1. Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937)
En solución. Difusión, convección.
2. Electroforesis de zona
• Soportes no restrictivos• Papel, acetato de celulosa• Almidón, agar, agarosa
• Soportes restrictivos• Agarosa (ácidos nucleicos)• Poliacrilamida
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS
--
++
CátodoCátodo
ÁnodoÁnodo
++ --
Carga eléctrica de la biomoléculas
1. Ácidos nucleicos
2. Proteínas
8
Lehninger. Principios de Bioquímica
Enlace fosfodiéster
Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
RNADNA genómicoDNA viral
Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Lab-on-a-Chip: electroforesis miniaturizada y automatizada
ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))
ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))
RNADNA genómicoDNA viral
Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Criterios de separación electroforética
q (carga)Velocidad = E
f (tamaño, forma)
1. Separación por tamaño
2. Separación por carga
3. Separación por tamaño y carga
-
+
Cátodo
Ánodo
+ -
1. DNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes• Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE)
• Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol
2. RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes• Tampón: MOPS + formaldehído
• Muestra: Formamida, Azul de bromofenol
Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la calle 1.
a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA de cada banda?
b) A continuación se incubó el DNA con topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA corresponde cada banda?
c) Otra muestra se incubó durante 30 min con topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de encontrar más DNA de las formas de movilidad reducida?
Topología del DNA
Electroforesis de DNA en geles de agarosa
SSCP: single-strand conformation polymorphism
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamaño
pulsed field gel electrophoresis
• FIGE: field inversion gel electrophoresis
• TAFE: transverse alternating field electrophoresis
• RGE: rotating gel electrophoresis
• CHEF: Contour-clamped homogeneous electric field
Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA
Schizosaccharomyces pombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated
multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose
(Clontech), 10 C.
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae
chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,
1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32
samples, a maximum of 72 are possible
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE)
gel Nitrocelulosa
Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot
Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot
Electroforesis DNA
Autoradiografía
1.Transferencia a nitrocelulosa o nylon
2. Hibridación con sonda específica radiactiva
3. Lavado y autoradiografía
Southern blot: RFLP Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de
Restricción
Electroforesis DNA genómico Autoradiografía
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRISONDA
(A)
(B)
(A)(B)
Hibridación de ácidos nucleicos: Northern blot
Electroforesis RNA
Autoradiografía
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL SUERO EN ACETATO DE CELULOSA
Soporte no restictivo: Separación por carga
ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN ACETATO DE CELULOSA
Anemia falciforme:
Mutación en hemoglobina A
• Mutación GAG -> GTG
• Glu -> Val
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-
PAGE)
Soporte restrictivo: Separación por tamaño
Gel de empaquetamiento (3% PA)
Gel de separación (8-20% PA)
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-
PAGE)• Concentración de poliacrilamida
• Homogénea
• Gradiente
• Tampón de muestra
• Reductor (2-mercaptoetanol)
• No reductor
• Detección de las proteínas separadas
• Tinción (Azul Coomassie, sales de plata)
• Fluorescencia
• Inmunodetección
ISOELECTROENFOQUE
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
ELECTROFORESIS CAPILAR
Electroforesis capilar de alta resolución (HPCE)
• Soporte: capilar 7-100 cm, 20-200 micras de diámetro
• Voltaje: >500 V/cm
• Automatizada, gran resolución
• Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …
ELECTROFORESIS CAPILAR• CZE: de zona. Medio líquido, homogéneo,
capilares con carga uniforme
• CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal, metilcelulosa.
• CIEF: Isoelectroenfoque capilar.
• Isotachophoresis (ITP).
• Electrokinetic Chromatography (EKC).
• Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC.
• Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC).
• Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE).
• Capillary Electrochromatography (CEC.
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Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado
Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A
- DNA polimerasa- Nucleótidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes
ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´5´--C T T A A G C G A T T A C -3´
5´--C T T A A G C G A T T A -3´
5´--C T T A A G C G A T T -3´
5´--C T T A A G C G A T -3´
5´--C T T A A G C G A -3´
5´--C T T A A G C G -3´
5´--C T T A A G C -3´
5´--C T T A A G -3´
Detector de fluorescencialáser
Separación de los
fragmentos de DNA
marcados, mediante
electroforesis
capilar
-
+
G C G A T T A C G . . .
¿A qué fuerza centrífuga relativa equivalen, en un rotor de 10 cm de radio, las siguientes velocidades de giro?
•1.000 rpm•10.000 rpm•30.000 rpm
•100.000 rpm
CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE FUERZA CENTRÍGA RELATIVA