3.electroforesis taller

Electroforesis Dr. Héctor L. Ayala del Río AMGEN Bruce Wallace Program UPR-Humacao

Primera tarea  Derretir Agarosa

 Combinar en un matraz:  Agarosa  Solución amortiguadora 1X SB

 Derretir empleando protocolo alterno  Verter gelatina

© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa AMGEN Bruce Wallace

Electroforesis  Método utilizado para separar y

purificar macromoléculas:  Proteínas  DNA  RNA

 Principio: Separar moléculas a base de su tamaño.  Diferencias en fricción en un medio

poroso


Agarosa

  Polímero lineal de galactosa   Agente solidificante de

alimentos y medios de cultivo   Extraído de algas marinas   Puede poseer impurezas   El tamaño del poro depende

de la cantidad de agarosa y el tipo de agarosa

D-galactose 3,6-anhydro L-galactose


Matriz porosa

• Agarosa polimerizada (1×1 µm)


¿Cómo vamos a obligar al DNA a pasar a través de los poros?

Ácido deoxyribonucleico (DNA)


Nucleótidos


¿Quién llegará primero?

¿El elefante o el ratón?


¿Quién llegará primero?

¿Porqué?


Migración del DNA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=hmg&part=A1236


Animación

© 2009 Dr. Héctor L. Ayala del Río, UPR-Humacao, Programa

AMGEN Bruce Wallace

Efectos de la conformación


Migración de los fragmentos en una gel


http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/gel/

Virtual Gel Electrophoresis Additional Information on Gel Electrophoresis:


Aspectos Prácticos

Casting tray

Gel combs

Power supply

Gel tank Cover

Electrical leads

Electrophoresis Equipment


La agarosa se preparará mezclando el polvo con la solución amortiguadora

Se utilizará un matraz que sea 5 volúmenes o más respecto al volumen a derretir

Agarose

Amortiguador

Matraz


Derritiendo la agarosa

Agarosa a temperatura de salón es insoluble

Luego de hervir el matraz la Agarosa se disuelve y la solución se torna cristalina

1.  Mezclar la solución periódicamente durante el calentamiento para facilitar que los agarosa se disuelva

2.  CUIDADO: La solución de agarosa se puede sobre-calentar en el microondas y puede hervir abruptamente al moverla.


Sellar los extremos de la bandeja usando cinta adhesiva y colocar la peinilla. La peinilla no debe tocar el fondo de la bandeja. Colocar la bandeja sobre una superficie nivelada.

Preparación de la bandeja de electroforesis


Permite que la agarosa se enfrie un poco (~60ºC) y cuidadosamente vierte la solución en la bandeja. Evita que se formen burbujas al vertirla.

Virtiendo la Agarosa


Si la cantidad de agarosa fue suficiente las peinillas estarán sumergidas en la agarosa derretida.


Una vez fria, la agarosa se polimeriza formando una gelatina flexible. Su aparencia será blancuzca y menos transparente (30-45 minutos). Remueva cuidadosamente las peinillas y la cinta adhesiva.


Colocar gel con bandeja en cámara


¿Cuánto amortiguador hace falta?

 3-5 mm sobre la agarosa (~250 ml)  Muy poco

 Se seca la agarosa  En exceso

 > 10 mm mayor distorsión de las bandas  Disminución de la migración del DNA


amortiguador

Cátodo (negativo)

Ánodo (positivo)

pozos

DNA


6X Tinte de cargado: • Bromophenol Blue (color) • Glycerol (peso)

Preparación de las muestras   Para poder cargar la

muestra de DNA en los pozos es necesario:   Sea más densa que la

solución   Posea coloración que la

distinga del amortiguador

  La muestra se mezcla con tinte de cargado que posee un tinte y glicerol para aumentar la densidad de la solución


Cargado de la gel

Utilizando la micropipeta mezclamos el tinte con el DNA. Luego se toma la mezcla y se deposita en el pozo colocando la punta de la micropipeta sobre el pozo. Al descargar la muestra ésta debe caer en el pozo por la diferencia en peso. Tener cuidado de no perforar la gel


Técnica A


Técnica B

Cierra la caja de puntas!


Técnica C Estilo taco de

billar


La punta de la

micropipeta debe estar SOBRE EL POZO, NO DENTRO!!!


Pozos perforados por

la punta de micropipeta

causarán que la muestra

salga.


Coloque la tapa de caja de electroforesis conectando los cables a los polos. Conecte los polos a la fuente de energía. Asegúrese de colocar los polos correctamente. El negro (negativo) siempre tiene que estar en el lado de los pozos. Cuando encienda la corriente se deben producir burbujas en los polos dentro de la cámara de electroforesis.

Running the Gel


wells Bromophenol Blue

Cathode (-)

Anode (+)

Gel

After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA.

DNA (-)


Separación


100 200 300

1,650

1,000

500

850 650

400

12,000 bp

5,000

2,000

-

+

DNA migration

Marcador de Pesos moleculares

  Para poder determinar los tamaños de los fragmentos de la gel es necesario una referencia con valores conocidos.

  Usando el marcador podemos determinar por comparaciones los tamaños de los desconocidos.


Tinción con Bromuro de Etidio

***CUIDADO! El Bromuro de Etidio es mutagénico y tóxico. Guantes deben de ser utilizados en todo momento.

• Para detectar el DNA es necesario teñirlo con Bromuro de Etidio, un tinte que fluoresce en presencia de luz ultravioleta.


Incorporación del Bromuro de Etidio


Teñir la gelatina

• Coloca la gelatina en la bandeja de tinción con el tinte. • Tiñe la gelatina por 10-20 minutos. • Destiñe la gelatina en agua destilada por 5 minutos. • Reemplaza el agua de la bandeja de desteñir vairas veces para que la destinción sea eficiente.


Sistema de fotodocumentación


Electroforesis luego de tinción con bromuro de etidio


Electroforesis


Pozos Marcador

peso molecular

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