Universidad de Santiago de Chile Facultad de Qumica y Biologa Licenciatura en Bioqumica Laboratorio de Bioqumica

Laboratorio N 3-4______________________________

Separacin de protenas a partir de electroforesis SDS-PAGE y determinacin de los parmetros cinticos para la reaccin catalizada por -galactosidasa

INTRODUCCINLas caractersticas tanto fsicas como qumicas de las protenas pueden ser estudiadas a partir de diferentes mtodos como la electroforesis o la actividad enzimtica. La electroforesis es una tcnica de dispersin de partculas a partir de su movilidad relativa para cada molcula en un gel, este medio puede ser de agarosa o acrilamida, al cual se le aplica un campo elctrico que se encarga de producir la migracin de las molculas en la matriz. En este prctico se utilizar un gel de acrilamida el cual es un excelente medio de soporte para separaciones de molculas pequeas, este medio se caracteriza por ser transparente, tener alta elasticidad, su porosidad puede ser controlada y puede ser compatible con una alta cantidad de compuestos qumicos. La poliacrilamida es una copolimerizacin de los compuestos, acrilamida y NN`-metilen-bis-acrilamida, los cuales determinan el tamao del poro a utilizar dependiendo de la relacin acrilamida/bis-acrilamida [1]. Observndose que a mayor porcentaje de acrilamida en funcin de bis-acrilamida el tamao del poro es menor, lo cual determina que la friccin es mayor y por ende la velocidad de migracin de las molculas es menor. El entrecruzamiento de las molculas se genera a partir de la formacin de radicales libres, para general este radical es posible utilizar dos mtodos, a partir de la utilizacin de un iniciador de radicales libres como el persulfato de amonio (APS), que es agregado con N,N,N`N`-tetrametiletilendiamina (TEMED) el cual acta como catalizador de la reaccin. Esos dos componentes en presencia del monmero, el entrecruzador y un buffer apropiado se generan los radicales libres necesarios para inducir la polimerizacin, a dems de este mtodo es posible utilizar un mtodo basado en la fotoqumica, en la que se utiliza algn compuesto que sea fotosensible que genere radicales libres al ser irradiado por luz UV[2]. Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida es posible utilizar un detergente conocido como Dodecilsulfato de sodio (SDS), esta tcnica electrofortica es conocida como SDS-PAGE, se basa en la utilizacin de dicho detergente anionico para formar complejos desnaturalizados, cargador negativamente. Esta unin genera una relacin carga/masa constante para las distintas protenas, es decir se anula su carga intrnseca, por lo que la separacin en el gel de electroforesis ser determinado solo por la masa molecular de las especies [3].La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por enzimas, pudiendo conocer as detalles del mecanismo cataltico de esa enzima, su papel en el metabolismo y cmo puede ser inhibida su actividad por drogas o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.Una enzima interacta con su sustrato en el centro cataltico de la enzima que lo reconoce y lo transforma en producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la DNA-polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente [4].Principios generales La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.La cantidad de producto formado a partir de una determinada concentracin de sustrato y de enzima vara con el tiempo. Solamente en los primeros minutos de la reaccin existe una relacin lineal entre el producto formado y el tiempo. La velocidad de la reaccin calculada a partir de los datos de esos primeros minutos, es lo que se denomina velocidad inicial (Vo) y se puede medir por la variacin de la cantidad de sustrato transformado, o la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Cuando se miden las velocidades iniciales (Vo) de una reaccin enzimtica con distintas concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y temperatura y manteniendo constante la concentracin de enzima [E], se obtiene una curva como se representa a continuacin:Figura 1.- Cintica de Michaelis-Menten

La cintica de las reacciones descritas anteriormente fue caracterizada por los investigadores Michaelis y Menten. La ecuacin de Michaelis-Menten es:

Figura2.- Ecuacin de Michaelis-Menten. La ecuacin es una descripcin cuantitativa de la relacin entre la velocidad (Vo) de una reaccin catalizada por una enzima, la concentracin de sustrato [S] y dos constantes Vmx y Km (constante de Michaelis). Las unidades de Km son, por lo tanto, unidades de concentracin, usualmente molaridad. Km puede definirse como la [S] a la que la enzima alcanza la mitad de su velocidad mxima o la [S] a la que la mitad de las molculas de enzima estn formando ES.La forma de determinar Km por el mtodo grfico definido antes, no es la usada en la prctica; rara vez se llega a medir Vmx por problemas tales como la solubilidad del sustrato a concentraciones altas. Se utiliza entonces, la transformacin de la ecuacin de Michaelis-Menten realizada por Lineweaver-Burk que consisti en tomar la inversa de cada trmino. La ecuacin queda como:Figura3.- ecuacin de doble recproco. La representacin grfica con coordenadas 1/Vo y 1/[S] es una recta. El corte de la recta con el eje de las ordenadas permite calcular Vmx y el corte con el eje de las abscisas permite calcular Km[5]. Figura 4.-Grafica de dobles recprocosLa actividad enzimtica puede ser disminuida o eliminada por la accin de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimticos. La unin de un inhibidor puede detener al sustrato de entrar al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles usualmente reaccionan con la enzima y cambian su estructura qumica. Estos inhibidores modifican los residuos esenciales de los aminocidos necesitados para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, tales como puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y enlaces inicos, y diferentes tipos de inhibiciones son producidas dependiendo en si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a los dos.Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican segn el efecto de variar la concentracin del sustrato de la enzima en el inhibidor. Inhibicin competitiva: el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato tambin se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato. Inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que al sustrato de la enzima. Sin embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato. Como resultado, el grado de la inhibicin depende solamente de la concentracin del inhibidor[6]. Objetivos Determinar el tamao molecular de una protena por electroforesis SDS-PAGE. Determinar los parmetros cinticos para la enzima Determinar los parmetros cinticos para la enzima -galactosidasa (-gal). MATERIALES Y MTODOS Electroforesis en gel SDS-PAGE Materiales- Mezcla de protenas estndar de peso molecular conocido (BM-1100), 6 mezclas de protenas, amortiguadoras de corrida, fuente de poder, cmara electrofortica, azules de Coomasie G-250, placas con gel de poliacrilamida al 12%. Preparacin gel concentrador- Esta debe poseer una concentracin de 5% acrilamida/bis-acrilamida. A la mezcla se le agreg 25L de APS y 2L de TEMED. Finalmente se carg sobre el gel separador en la cmara de electroforesis. Preparacin de muestras para anlisis electrofortico- Se prepararon 6 tubos eppendorf con 15L de muestra desconocida a las que se le agreg 15L de buffer con una concentracin al 2X, el cual contiene amortiguador Tris (pH8.3), SDS, 2--mercaptoetanol, glicerol y azul de bromofenol (5KDa). Luego fueron llevados a un termociclador por 5min a una temperatura de 95C, y finalmente se realiz un spin para homogenizar. Realizacin de la electroforesis- Se tomaron 20L de muestra tratada y se cargaron en el gel concentrador, tambin se cargaron 20L de mezcla de protenas estndar en el carril 1, y se aplic una corriente de corrida de 80V para producir el ingreso de la muestra al gel separador, y luego se cambi el voltaje aplicado a 150V, hasta que el azul de bromofenol lleg a la base del aparato de electroforesis. Finalmente se tieron las muestras con Azul de Coomasie G-250. Anlisis de parmetros cinticos de -galMateriales- Amortiguador citrato (pH 6.4), NaOH (0.05M), o-nitrofenil--galactsido (ONFG) (2.5mM), o-nitrofenol (ONF) (60mM), -galactosidasa, Fenil--D-tiogalactopiranosido(PETG)(50mM). Curva de calibracin- Se realiz una curva de calibracin para el producto de la reaccin tomando los siguientes volmenes:Tabla 1.- Volumen utilizado de ONF y de NaOHSe utilizaron 6 muestras para la realizacin de la curva de calibracin Tuboo-nitrofenol 60mM( L)NaOH 0.05M (L)

101000

2125875

3250750

4500500

5750250

610000

Luego de tomar los volmenes necesarios se procedi a tomar la absorbancia de la muestra a 420nm, y finalmente se grafic la absorbancia en funcin de la concentracin de ONF

Determinacin parmetros cinticos de -gal y efecto de PETG en la reaccin- Se prepararon 10 mezclas de reaccin las cuales contienen ONFG, Buffer citrato, PETG y enzima en diferentes concentraciones. A continuacin se presenta una tabla con los volmenes utilizados de cada componente de la mezcla. Tabla 2.-Volumenes de ONFG, Buffer, PETG y enzima utilizadosLa tabla muestra los diferentes volmenes de las 10 mezclas. tuboONFG2.5mM (L)Buffer citrato (L)PETG 50mM(L)Enzima (L)

104000100

2503500100

31003000100

41502500100

52002000100

6036535100

75031535100

810026535100

915021535100

1020016535100

Luego de preparar las 10 muestras se incubaron durante 15min a 37C y luego se tomaron 100L de cada muestra y se agregaron a 900L de NaOH 0.05M. Finalmente se tomaron 200L de la solucin y se midi la absorbancia a 420nm. RESULTADOSElectroforesis en gel de poliacrilamida Para separar la mezcla de protenas entregadas en los diferentes tubos, se realiz una electroforesis, donde se obtuvo el siguiente gel: Figura 5.- Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. La figura muestra el gel obtenido luego de realizar una electroforesis a 150V hasta que el azul de bromofenol alcanzara la base de la cmara electrofortica. Las muestras analizadas corresponden a una mezcla de protenas. El carril 1 corresponde al estndar Winkler, los carriles del 2 al 7 corresponden a las muestras problemas.

Luego de realizar la electroforesis, se procedi a determinar los pesos moleculares de las protenas ya separadas. Para esto, se midieron las distancias de migracin en el gel de las bandas de protenas en el estndar (mostrados en Tabla 3) y se graficaron en funcin del logaritmo de su peso molecular, como se observa en el siguiente grfico:

Figura N6: Relacin entre peso molecular y movilidad relativa de protenas. En el grafico se observa la relacin entre los pesos moleculares de protenas en el estndar en funcin de su peso molecular. Al trazar la recta, se obtiene la ecuacin que se presenta a continuacin: Y = -0,870X + 1,89, con un R2 = 0,964. Tabla N 3: Movilidades relativas de protenas estndar Winkler en el gelLa tabla muestra la movilidad relativa en mm de la migracin de las bandas en el estndar y sus respectivos pesos moleculares. Para B-galactosidasa no se observaron bandas en el gel.ProtenaPeso Molecular (kDa)Movilidad relativa (mm)Log Peso molecular

- galactosidasa116--

BSA66,20.15871,8209

Ovoalbmina450.23811,6532

LDH350.33331,5441

Endonucleasas de restriccin250.58731,3979

-lactoglobulina18,40.68251,2648

Lisozima14,40.8731,1584

La movilidad relativa (Rf) se calcul aplicando la siguiente formula Rf= Distancia recorrida por la protena en el gel (mm)/ distancia recorrida por el frente de migracin (mm)Luego de realizar la grfica con las protenas del estndar, y una vez conocida la ecuacin de la recta, se procedi a calcular los pesos moleculares de las bandas obtenidas en que van desde el carril 2 hasta el carril 7. Para esto se midieron las distancias de migracin de las bandas, al igual que para el estndar, y este valor se extrapol en la ecuacin de la recta, en donde se obtiene el logaritmo del peso molecular de la protena desconocida, donde luego, es posible calcular su peso molecular. Estos resultados se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 4.-: Movilidades relativas de las protenas separadas en la electroforesisLa tabla muestra la movilidad relativa de las bandas obtenidas en el gel con su respectivo peso molecular asignado de acuerdo a la ecuacin de la recta mencionada anteriormente.CarrilMovilidad relativa (mm)Peso molecular asignado (kDa)

20.158756.48

20.238148.18

20.317541.09

20.587323.94

20.714318.56

20.920612.28

30.333339.81

30.571424.71

30.698419.16

30.920612.28

40.158756.48

40.317541.09

40.587323.94

40.714318.56

40.936511.89

50.333339.81

50.571424.71

50.730217.98

60.174654.71

60.349238.57

60.650821.08

70.174654.71

70.746017.42

Curva de calibracin Al medir la absorbancia de las muestras a 420nm se obtuvieron los siguientes datos, descontando la absorbancia obtenida en el tubo uno a cada absorbancia obtenida:Tabla 5.- Datos para curva de calibracin La concentracin de ONF se consider en mol/mL para comparar con el rango lineal de literatura [7]Concentracin ONF (mol/mL)Absorbancia 420nm

0.0750.240

0.150.428

0.31.070

0.451.339

0.61.665

Luego se grafico la absorbancia obtenida en funcin de la concentracin de ONF Figura 7.- Curva de calibracin para concentracin. Se consideraron solo el rango de concentracin entre 0.02 a 0.3 mol/mL, ya que en ese rango muestra una linealidad segn bibliografa. A partir de la curva de calibracin se obtuvo la ecuacin de la recta Y=3.773X-0.081 con un R2= 0.986 utilizando solo los datos correspondientes a las concentraciones 0.075, 0.15 y 0.3 mL. Determinacin de los parmetros cinticos para -gal y anlisis del efecto de PETG en la reaccinA partir de la concentracin de producto formado y la concentracin de sustrato en la muestra es posible calcular los diferentes parmetros cinticos para -gal. A continuacin se presentan los datos obtenidos por la reaccin enzimtica:Tabla 6 Datos obtenidos a partir de la reaccin enzimticaEn la tabla se encuentran las concentraciones de sustrato las absorbancias y las respectivas concentraciones de producto formado y las velocidades de cada reaccin [ONFG]mM*Aborbancia S/[I][ONF] mM*Voabsorbancia c/[I][ONF] mM*Vo

0.0250,1820,6970,0460,1050,4950,033

0.050,3131,0440,0690,2830,9640,064

0.0750,4221,3330,0880,3261,0950,073

0.10,5261,6090,1070,3951,2610,084

*Los datos fueron considerados aplicando ciertas diluciones.Para el clculo de la concentracin de sustrato y de producto se consideraron las siguientes diluciones: 1.- Para el sustrato la muestra se encontraba a una concentracin 2.5mM y se tomo para la primera muestra un volumen de 50L que fueron llevados a un volumen final de 500L obtenindose una concentracin de 0.25mM, luego se tom 100L de la muestra y se llevaron a 1000L final obtenindose una concentracin de sustrato final de 0.025mM (mol/mL). As para cada muestra de sustrato. 2.- Para la concentracin de producto solo se consider la dilucin final, ya que solo se tomaron 100L de la formacin de producto y se llevo a 1000L obtenindose la concentracin indicada en la tabla. A partir de los datos obtenidos se procedi a graficar la velocidad de formacin de producto en funcin de la concentracin de sustrato.

Figura 8.- grafico de Vo/ [ONFG]. Se observa que la curva para la reaccin sin el inhibidor no alcanza al nivel de saturacin mientras que la reaccin con inhibidor si la alcanza. Luego para obtener los valores de Km y Vmax en la reaccin realizar la grafica de Lineweaver-Burk o de dobles recprocos obtenindose la siguiente grfica:

Figura 9.- Grfica de dobles recproco. A partir de las graficas se obtuvieron las siguientes ecuaciones de la recta. (A) reaccin sin inhibidor Y= 0.402X+5.851 con un R2=0.997. (B) reaccin con inhibidor Y= 0.615X+5.750 con un R2= 0.990.A partir de la grfica de doble reciproco es posible obtener los valores de Km a partir de la extrapolacin al corte del eje X es decir cuando el valor de 1/Vo = 0, el valor en el eje X es de -1/Km, para el caso de la reaccin con inhibidor se tiene que el valor donde corta el eje X se obtiene -1/Km siendo un coeficiente de correccin al utilizar un inhibidor representado por =1+ [I]/Ki para reacciones de tipo competitivo. Para el clculo de la Vmax es necesario conocer el punto donde se corta el eje Y, ya que cuando se tiene que 1/ [ONFG] es igual a 0 el valor de Y= 1/Vmax. Este valor es aplicado tanto para la reaccin sin inhibidor como la con inhibidor, para el caso de inhibidores de tipo competitivos.Los datos obtenidos a partir de los clculos realizados son expuestos en la siguiente tabla:Tabla 7.- Parmetros cinticos para la reaccin con y sin inhibidor.En la tabla se presentan los valores obtenidos al calcularlos a partir de la grfica de doble reciprocos.Tipo de reaccin Km(mM)Vmax (min-1)Ki (mM)

Sin inhibidor0.06870.17090

Con inhibidor0.1069*0.17390.6295

*el dato representa el valor obtenido por Km, ya que la Km en s se mantiene constante. DISCUSIN La electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida, comnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.En este caso se realiz una electroforesis en condiciones desnaturantes utilizando SDS , el cual es un detergente que se une a las cadenas polipeptdicas desnaturalizadas con una relacin de 1.4 g de SDS por g de protena, unindose aproximadamente una molcula de SDS por cada dos aminocidos de la cadena. Esta unin masiva de molculas de SDS bloquea la carga propia de la molcula de protena y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las protenas acomplejadas con SDS viajen hacia el nodo. La separacin de los complejos SDS-protena es proporcional slo a la masa de la protena pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular[8].Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son qumicamente inertes, propiedades uniformes, estables en un rango amplio de pH , temperatura y fuerza ionica , es capaz de ser preparado en forma rpida y reproducible , formando geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del poro, siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs acrilamida se use.De esta forma, el porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen (tabla 8). As, la mayora de las protenas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao[2].

Tabla N8: Rango de separacin efectivo para geles segn el % de Acrilamida para SDS-PAGELa tabla muestra los tamaos de protenas que son separadas efectivamente segn el porcentaje de acrilamida en el gel concentrador.

En el caso de este laboratorio el gel utilizado contena un 12% de acrilamida, que como se observa en la tabla N8, permite la separacin efectiva de protenas que van desde 14 a 70kDa. El estndar utilizado (Winkler) contena 7 protenas que van desde los 14,4kDa (lisozima) hasta 116kDa (-gal), por lo que esta protena no es posible visualizarla en el gel, ya que el tamao del poro le impide desplazarse en el gel separador, por lo que esta se queda en el bolsillo. De esta manera se justifica la aparicin de 6 bandas en el carril 1 (que contiene al estndar). Es posible observar en la tabla N4, que el carril 2,3 y 4 presentan bandas inferiores a la lisozima, con un peso molecular 12kDa, lo que sugiere la presencia de otra protena ms pequea que en el estndar no se encuentra, pero que, sin embargo, es posible su visualizacin, ya que su peso molecular es muy similar. En el carril 2,4 y 6, se observan tamaos de banda demasiado grandes, lo que podra explicarse porque tal protena se encuentra en una gran concentracin en esas muestras, adems como es posible observar en la figura N5 , estas bandas grandes se encuentran todas a la misma distancia.La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, dentro de los que se encuentran: - Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel: La movilidad de las protenas vara entre otras causas porque la viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas (la distancia recorrida es aproximadamente 20 % mayor en la regin central que es ms caliente). Este efecto puede atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o manteniendo temperaturas bajas durante el desarrollo de la electroforesis. La uniformidad de la temperatura a travs del gel mientras ocurre la corrida electrofortica generalmente elimina el efecto de la deformacin de las bandas en forma de sonrisa. [9]- Velocidad de la polimerizacin. Niveles de catalizadorUna polimerizacin muy rpida puede deformar las bandas, porque ocurre una contraccin no uniforme del gel, en este caso debe reducirse el TEMED y el persulfato de amonio o adicionar ferricianuro de potasio, con el objetivo de hacer ms lenta esta. El empleo de niveles bajos de catalizador provoca que la superficie del gel se torne desigual y tienda a romperse con facilidad, pero el empleo de altas concentraciones provoca que los geles tiendan a cuartearse. Este problema puede solucionarse en geles de altas concentraciones, al poner una capa de alcohol isobutlico en lugar de agua. [10] - Tiempo de corridaLa determinacin del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su correcta separacin, pero tambin se ha probado que tiempos de corrida cortos minimizan la dispersin de la muestra y el ensanchamiento de la banda. En este caso, para obtener un gel de mejor calidad se recomienda, correr el gel a mayor tiempo y a un menor voltaje. - Preparacin de las muestrasEn el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa desnaturalizacin de las protenas, para evitar la aparicin de bandas fantasmas en la electroforesis (bandas dobles por la concentracin de -Mercaptoetanol o por el tiempo de incubacin). [11]- TincinLas protenas coloreadas naturales como la mioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C, pueden ser observadas directamente en los geles, sin embargo la visualizacin de la mayora de las protenas requiere el uso de colorantes. Los colorantes orgnicos fueron los que se emplearon primero para teir protenas en los geles (ejemplo de estos bromofenol azul, azul de Coomassie, etc.). Una rpida tincin y fijacin son esenciales en el caso de las protenas pequeas para evitar su elucin.Existen diferentes tipos de tincin, entre ellos la plata que es muy sensible y tiene la caracterstica de producir generalmente coloraciones de color negro. La tincin con Coomassie puede emplearse para la determinacin de protenas cuando estas son abundantes, pero no para la determinacin de pureza de protenas trazas. Esta tincin requiere un medio cido para la generacin de la atraccin electrosttica entre las molculas del colorante y los grupos amino de las protenas. La atraccin inica es a travs de las fuerzas de Van Der Walls, que une a las protenas y al colorante formando un complejo. [12]En todo ensayo para la caracterizacin de una protena luego de su separacin se realiza comnmente el anlisis de sus caractersticas cinticas, en las cuales se determina la velocidad de formacin de producto. Para esto es necesario tomar en consideracin otros mtodos analticos como el anlisis de absorbancia de analitos en solucin. La -gal se encarga de hidrolizar los enlaces -galactosidos, esta enzima es capaz de actuar sobre sustratos sintticos cromognicos, que al ser hidrolizados general un producto coloreado. El ONFG es un sustrato sinttico para esta enzima que puede ser hidrolizado para formar ONF el cual en medio alcalino es capaz de tautomerizarse, tomando un color amarillo, es por esto que en el ensayo es necesario utilizar un medio de NaOH en la medicin de la absorbancia. La absorbancia a 420nm es directamente proporcional a su concentracin en el rango 0.02 a 0.3mM [7], es por esto que los puntos obtenidos en la recta mayores a 0.3 fueron omitidos, ya que la linealidad al considerar dichos puntos disminua de 0.986, que se obtuvo con los puntos en el rango de linealidad de bibliografa, a 0.973 que se tiene tomando todos los puntos observados. Luego de realizar la curva de calibracin se procedi a calcular la velocidad de formacin de producto en funcin de la concentracin de sustrato, como se observa en la figura 8 la muestra sigue una linealidad inicial pero no alcanza su punto de saturacin, ya que los valores de Vmax para la enzima son mucho mayores a las velocidades obtenidas de la enzima a la mayor concentracin de sustrato considerado, siendo Vmax 0.1709 y la velocidad ms alta de 1.107. En cuanto a la enzima en presencia de inhibidor se observa que la velocidad de formacin de producto disminuye en comparacin con la de la enzima sin inhibidor. Como se observa en la tabla 7 las velocidades mximas para cada reaccin son diferentes pero con una diferencia de +0.003, por lo que la diferencia puede ser despreciada, considerando que la velocidad mxima se mantiene constante con la accin del inhibidor, luego al observar los valores de Km se observa que hay un cambio considerable en los valores, ya que la Km con inhibidor aumenta por la presencia del factor que considera la concentracin de inhibidor y la constante de inhibicin, los cuales producen un aumento en el valor de la Km. Segn estos datos es posible concluir que la inhibicin que ejerce el PETG sobre la accin de -gal es de tipo competitivo, en el cual el inhibidor acta directamente sobre el sitio activo de la enzima compitiendo con el sustrato por dicho sitio de fijacin enzimtica, formando un nuevo complejo enzima-inhibidor que se encuentra en equilibrio con sus especies por separado. Por consiguiente un inhibidor de tipo competitivo acta reduciendo la concentracin de enzima libre disponible para la fijacin de sustrato. As el inhibidor no afecta el nmero de recambio de la enzima, sino que la presencia del inhibidor produce un efecto de dilucin de la concentracin de sustrato, o hace que el valor de Km parezca mayor de lo real [6], lo cual explica la figura 8 en la que se observa un aumento en la Km con el inhibidor. Es importante controlar ciertos aspectos en una reaccin enzimticas para poder sacar resultados concluyentes sobre los parmetros cinticos de las enzimas, entre estos aspectos est el pH, ya que las protenas solo son activas en un estrecho intervalo de de pH siendo para la -gal su pH optimo de 6[13], es por esto que se trabajo a un pH 6.4 aproximadamente conferido por el buffer citrato. Otro parmetro a considerar debe ser la temperatura, ya que a mayor temperatura mayor velocidad de reaccin, pero hasta cierto punto en el cual se desnatura la protena [5], es por esto que nosotros solo consideramos la temperatura corporal como temperatura optima de accin. Y finalmente para obtener resultados concluyentes de la accin de inhibidor sobre la reaccin enzimtica es necesario realizar varios ensayos con diferentes concentraciones de inhibidor y con sus respectivos duplicados o triplicados para aumentar la precisin del anlisis. CONCLUSIONES La electroforesis es un mtodo analtico que permite separar protenas y otro tipo de molculas adecuadamente, y permite calcular el peso molecular de protenas a partir de la utilizacin de un estndar. A partir de un anlisis cintico a la -gal se obtuvo que la Km es de 0.0687mM y la velocidad mxima es de 0.1709 min-1, y que la accin inhibitoria de PEGT es de tipo competitivo por los valores de Km y Vmax obtenidos, que fueron de 0.1069 y 0.1739 respectivamente.

REFERENCIAS [1] Westermeier R (2001): Electrophoresis in Practise, 3 ed. WILEY-VCH Verlag GmbH [2] Switzer R, 1999, Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods, Freeman and company, 61-77[3] Boyer R.,2000, Modern Experimental Biochemistry, Benjamin Cummings, San Francisco,113-120[4] F. Agius, O. Borsani, P. Daz, S. Gonnet et al. Bioqumica. Facultad de Agronoma., Enzimas, http://www.fagro.edu.uy/~bioquimica/docencia/basico/enzimas.pdf, 23/05/2010[5]Lehninger D., 2009, Principios de bioqumica, 5 edicin, editorial OMEGA, 194-200[6] Voet D. Voeth J., 2005, Biochemistry, Editorial OMEGA, S.A. pag 367-373.[7] Maisey K., 2010, Trabajos prcticos bioqumica, Determinacion de las propiedades cinticas de la Enzima -galactosidasa, Santiago. [8] http://www.med.ufl.edu/biochem/bch6206/DETERGENTS.pdf[9] Da Woon J, Gyoung Hoon T, Jin Wook L, et al., Detection of proteins in poliacrilamida gels using eriochrome black T rhodamina B. Anal. Biochem.1998; 263:118-120.[10] Guo Y, Li X, Fang Y. The effects of electroendosmosis in agarose electrophoresis. Electrophoresis. 1998; 19 (8-9):1311-3.[11] Schgger H, Von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis for separation of proteins in the range from 1 to 100kDa. Analytical Biochemistry 1987; 166, 368-79.[12] http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm[13] Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, et al., September 1995, A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (20): 93637