Fundamentales en la composición de la atmósfera actual y en el ciclo global

del carbono

Las Algas: Recordemos su Importancia evolutiva,

ecológica y biotecnológica

Cyanobacteria fueron responsables de transformar la atmósfera original de

la tierra en una atmósfera oxigénica.

A partir de una Cyanobacteria, por endosimbiosis, se originaron y

diversificaron los distintos grupos de algas.

Un ancestro perteneciente a Chlorophyta llevó al origen de las Embriophyta

y de esa manera se logró la conquista y diversificación de las plantas en el

ambiente terrestre.

Importancia evolutiva, ecológica y biotecnológica

Forman comunidades claves en los diversos ecosistemas, por ej:

Fitoplancton: mantenimiento de cadenas tróficas en

ríos lagos, lagunas, océanos.

Perifiton: sustento de fauna de protozoos y

microinvertebrados

Bosques de macroalgas marinas (Chlorophyta,

Rhodophyta, Phaeophyta): hábitats que permiten

elevada diversidad animal (refugio, alimentación,

desove y cría).

Siendo sólo el 1 % de la biomasa fotosintetizadora del planeta, son

responsables de:

60 % del oxígeno respirable,

50 % del total de la producción primaria del planeta (E

y C reducido para mantener el mundo animal)

sostener el 70 % de la biomasa mundial,

Son excelentes Organismos Modelo para investigación (estructura

de flagelo, fotosíntesis, desarrollo celular).

Importancia evolutiva, ecológica y biotecnológica

Aplicación científica y tecnológica:

Producción de distintos metabolitos de valor para el desarrollo de

programas biotecnológicos relacionados con acuicultura, industria

farmacéutica, cosmética, alimenticia, combustibles (ej Chlorella,

Dunaliella y Haematococcus)

Macroalgas como alimento (Japón, China y Corea).

Biomonitores de condiciones ambientales, particularmente de

condiciones de contaminación.

Macroalgas son fuente de ficocoloides (alginato: Phaeophyta, agar y

carragenano: Rhodophyta), espesantes en industria farmacéutica,

cosmética, alimenticia, etc (dentífricos, jabones, shampooes,

helados, postres, cremas, etc).

Los cultivos de algas constituyen una herramienta importantísima

y casi indispensable para diversos estudios, permitiendo por ej:

Resolver delimitaciones taxonómicas en diferentes grupos,

Conocer y entender el ciclo de vida de muchas especies.

Conocer y entender los casos de polimorfismo,

Estudiar la resistencia a antibióticos y efectos de distintos

tóxicos

Comprender la citología, genética y mutaciones

Estudiar y encontrar aplicaciones: fijación de N2; inducción e

inhibición de crecimiento; vitaminas, pigmentos, ácidos grasos,

etc., evaluación de calidad de aguas e impacto ambiental

No cabe duda de la importancia de los estudios científicos sobre algas y

de las acciones que lleven a la conservación de su biodiversidad.

La importancia del uso de cultivos llevó a lo largo de

los años a un mejoramiento de las técnicas y al

desarrollo y establecimiento de colecciones de

cultivos.

Las colecciones son fuente de estándares biológicos,

indispensables para muchos estudios taxonómicos,

fisiológicos, ecotoxicológicos y de exploración o

búsqueda de productos químicos útiles o nuevas

aplicaciones.

El desarrollo de colecciones se ha logrado

principalmente con una gran diversidad de microalgas

Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

Famintzin (1871, Rusia): el iniciador. Fisiólogo vegetal

que hizo crecer algas verdes en una solución mineral

diseñada por Knop (en 1965) para plantas vasculares.

Beijerink (Holanda): 1º en aislar Chlorella,

Scenedesmus y presuntamente obtener cultivos

axénicos en 1890 (muy cuestionado).

Miquel (1890, 1898, Francia): aisló diatomeas y

estableció el método de aislamiento con micropipeta.

Además desarrolló 2 soluciones minerales para

enriquecer el agua de mar.

Chodat (1900, Suiza): durante más de 30 años estableció

una colección de más de 300 especies en cultivos puros.

Kuster (1908): 1º en aislar dinoflagelados y Jacobsen

(1910): 1º aisló Volvocales

Allen (1910, UK): padre de la maricultura algal. 1º que

desarrolló cultivos de microalgas marinas como

alimento animal y sentó las bases para el cultivo de

macroalgas

Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

Pringsheim (1912, Alemania): medio bifásico tierra-

agua. 1º en obtener un cultivo axénico de Cyanophyta.

Construyó grandes colecciones (Universidad en Praga

y las famosa CCAP y SAG).

Mainx (1930, Praga) centrifugación y uso de fototaxis

para aislamiento.

En 1949: impulso de la criobiología (glicerol como

protector de espermatozoides) y comienzan los

intentos de mantenimiento de algas en N2 líquido.

Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

CCAP (UK): algas y protozoos (+ 2500 cepas)

UTEX (EEUU): Univ. Texas (3000 cepas)

SAG (Alemania): Univ. Göttingen (+ 2400 cepas)

NCMA (antes CCMP, EEUU): fitoplancton marino (+ 2500 cepas)

ACOI (Portugal): Univ. Coimbra (+ 2000 cepas)

ASIB (Austria): Inst Botánica Insbruck (+ 2000 cepas)

RCC (Francia): Colec cultivos de Roscoff (+ 1300 cepas)

UHCC (Finlandia): Cyanobacteria Univ Helsinski (aprox 1000 cepas)

ATCC (EEUU): Colec americana de cultivos tipo

NIES (Japón): cultivos microbianos Inst Nac de Estudios Ambientales (+ 2500

cepas)

PCC (Francia): cultivos de Cyanobacteria Inst Pasteur (+ 800 cepas)

CSIRO (Australia): Collection of living microalgae (aprox 800 cepas)

Algunas de las Colecciones internacionales de mayor

envergadura

Conservar ex situ y mantener la diversidad

morfológica, fisiológica y genética de las algas

Objetivo de las Colecciones de cultivo

Valor fundamental: constituyen una fuente de

estándares biológicos para distintos estudios

El potencial uso de cultivos para estudios científicos,

determina que su mantenimiento garantice una

correcta preservación de sus propiedades fisiológicas

y bioquímicas.

El desarrollo y crecimiento de las colecciones apuntó

al establecimiento de una metodología de trabajo con

una rutina precisa de preservación, mantenimiento,

almacenamiento y control.

Proveen cultivos que son difíciles o imposibles de re-aislar

(especies tipo de descripciones originales, especies de ambientes

extremos, etc)

Proveen un depósito de biodiversidad bien caracterizada para

investigación y/o explotación: fuente de resursos biotecnológicos

Son fuente irremplazable de cultivos derivados de material de

descripciones e identificaciones originales de especies, necesarias

para estudios taxonómicos y filogenéticos

Proveen una base informática sobre cultivos e investigaciones

relacionadas con ellos

Importancia de las colecciones de cultivos de algas

Las colecciones de cultivo internacionales almacenan un número

significativo de cepas de la región o de otras regiones

Método de mantenimiento más común: rutina de subcultivo seriado

(mantener poblaciones saludables y representativas en morfología y

genética).

Métodos de mantenimiento

Desventajas del método de subcultivo:

Es trabajoso e insume mucho tiempo

Limita la capacidad de mantener un gran número de cepas (personal

especializado y exclusivo)

Existe riesgo de contaminación bacteriana

Existe riesgo de errores de etiquetado o contaminación cruzada

Puede haber cambios morfológicos o fisiológicos con respecto a la

población nativa. Hay evidencia en distintas microalgas

La estabilidad fenotípica y genética de los cultivos es de

importancia crítica, no sólo para preservar biodiversidad

representativa, sino para la preservación de recursos estables para

estudios científicos y para explotación biotecnológica.

Criopreservación como técnica alternativa para el mantenimiento de

cultivos algales.

Almacenar el organismo a T° ultra-baja (debajo de -130º C), siguiendo un

protocolo de congelamiento y aclimatación con un crioprotector, de

manera tal que sea capaz de sobrevivir luego del descongelamiento.

En teoría permite mantener algas indefinidamente en un estado

metabólicamente inactivo, y evita o disminuye los riesgos asociados al

mantenimiento por subcultivo seriado.

Da estabilidad contra cambios genéticos debidos a

la presión de selección de las condiciones de

cultivo o debidos a la deriva génica

Protege las cepas de contaminación microbiana,

errores de manipulación, errores de etiquetado,

fallas mecánicas de los equipos de cultivo

Necesita un espacio de almacenamiento mínimo

(volúmenes de cripreservación de 1-2 ml)

Ventajas del método de

criopreservación

Inversión inicial para entrenamiento y equipo especializado

Necesidad de un resguardo de equipos de alta confiabilidad

Aporte regular de N2 líq y freezer de Tº ultra-baja (- 150º C)

Se necesitan 2 a 3 semanas para obtener un volumen adecuado de

cultivo en activo crecimiento a partir de los viales congelados

Desventajas del método de criopreservación

No puede aplicarse a todas las algas (sin éxito en Dino, Crypto, Synuro

y Rhaphidophyta).

Distintos protocolos de congelamiento influyen en la calidad del

material preservado y puede llevar a mutaciones

Riesgo de selección de subpoblaciones resistentes y de alteraciones

genéticas. Puede inducir estrés vía formación de cristales intracelulares,

shock osmótico y/o toxicidad del crioprotector (PVP, glicerol, DMSO,

MeOH). Ej: Muller et al. (2007) diferencias genómicas luego de

criopreservación en 14 de 28 cepas de Chlorophyta.

Discutir e impulsar investigaciones relacionadas con los problemas

asociados a las colecciones de cultivos.

Proyecto COBRA (Conservación de recursos biotecnológicos y

científicos europeos en microalgas y cianobacterias)

Objetivos principales: Aplicar criopreservación a especies “reacias”

Monitorear por técnicas moleculares la ocurrencia de cambios en

cultivos post-descongelamiento

Testear los protocolos de congelamiento y establecer pautas de

validación y control de calidad

Lineamientos establecidos: Se recomienda evitar el uso de protocolos de congelamiento subóptimos

(menor número de pasos, crioprotectores menos confiables)

Se establecieron los niveles mínimos aceptables de viabilidad post

descongelado en un 10 a 60 %

Pero se recomiendan viabilidades mayores al 60 % como estándares, ya

que ello, junto con el congelar grandes poblaciones, minimiza el riesgo de

seleccionar variantes genéticamente tolerantes al congelamiento.

CCAP (UK): algas y protozoos (+ 2500 cepas)

UTEX (EEUU): Univ. Texas (3000 cepas)

SAG (Alemania): Univ. Göttingen (+ 2400 cepas)

NCMA (EEUU): fitoplancton marino (+ 2500 cepas)

ACOI (Portugal): Univ Coimbra (+ 2000 cepas)

ASIB (Austria): Inst Botánica Insbruck (+ 2000 cepas)

RCC (Francia): Colec cultivos de Roscoff (+ 1300 cepas)

UHCC (Finlandia): Cyanobacteria Univ Helsinski (aprox 1000 cepas)

ATCC (EEUU): Colec americana de cultivos tipo

NIES (Japón): cultivos microbianos Inst Nac de Estudios Ambientales (+

2500 cepas)

PCC (Francia): Cyanobacteria Inst Pasteur (+ 800 cepas)

CSIRO (Australia): Collection of living microalgae (aprox 800 cepas)

Colec Cultivos Univ. Leningrado (Rusia): (aprox 700 cepas)

Aumento del número de cepas criopreservadas dentro del proyecto COBRA:

1500 cepas nuevas del 2002 al 2005.

Algunas iniciativas de desarrollo de cultivos de algas Colección de cultivos del Laboratorio de Microalgas de la Facultad

de Ciencias Naturales Sede Trelelew – Chubut (Univ. Nacional de la

Patagonia San Juan Bosco) (Prof. Isabel Albarracín).

Cultivos en nuestro país

Colección de cultivos de microalgas del Laboratorio de Ficología

(DBBE, FCE-N, UBA) (Dr. Vélez)

Cultivos de cepas marinas y de agua dulce del Lab. Estudios

Básicos y Biotecnológicos en Algas y Hongos y Lab. Ficología y

Micología, Dto. Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad

Nacional del Sur, Bahía Blanca (Dra. Leonardi y Dr. Cáceres)

Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Cs. Exactas de la Universidad

Nacional de La Plata, laboratorio dirigido por la Dra. Gianuzzi y el Dr. Andrinolo,

Cultivos de Euglenophyta y microalgas verdes de agua dulce,

incluyendo Volvocales (Lab. Protistas, DBBE, FCE-N, UBA) (Dres.

Conforti, Solari, Juárez)

Trabajo Práctico:

Técnicas de Cultivo de

Microalgas

• Muchos estudios necesitarán desarrollar cultivos de microalgas a escala de laboratorio.

• Normalmente se busca optimizar su crecimiento (estudio de requerimientos de la especie utilizada).

• El tipo de estudio a realizar condiciona el medio de cultivo a utilizar y el tipo de cultivo a desarrollar.

• El primer paso para el desarrollo de cultivos es el aislamiento

• DE ESO NOS OCUPAREMOS EN EL TP

Técnicas de cultivos en microalgas

Técnicas de cultivos en microalgas M

ed

ios d

e c

ultiv

o Minerales definidos

Macronutrientes (Mg, Ca, K, Na, S, N, P, C)

Micronutrientes (Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Co, Vn)

Quelante (EDTA, ác. Nitrilotriacético)

Sistema Buffer ( (Tris, Hepes, KH2PO4 - K2HPO4)

Provisión de CO2

Minerales definidos con

agregado de

compuestos orgánicos

No definidos Con extracto de levadura, peptona o medio tierra agua

(tiamina, cianocobalamina, biotina,

glucosa, acetato)

Se utilizan líquidos o sólidos (agar 1,5-2%), esterilizados

SW tindalizado (Tierra-agua) (Prinsgheim): Buen crecimiento

de filamentosas (Zygnematales), Volvocales (más CaC03-y B12),

Euglenoideos (más arveja ó cebada, B12).

SW autoclavado (Tierra-agua): mismos grupos anteriores y

permite el crecimiento de Oedogoniales.

BBM (Bold's basal medium): medio mineral para algas sin

requerimientos especiales; de uso generalizado principalmente para

cultivos axénicos. Crecen muy bien las Chlorococcales.

BBMSW: BBM + sobrenadante de tierra-agua: Indicado para

algas de agua dulce en general. Bueno para Chlorococcales y microalgas

de suelo. También algunas diatomeas

MEDIOS DE CULTIVO DE USO GENERALlZADO

JM (Jaworsky's medium): medio mineral con 3 vitaminas (B12,

tiamina, biotina).Buno para Desmideáceas, algunas Volvocales y

Diatomeas (agregar Na2Si03).

Medios minerales con fuente orgánica de carbono

(acetato de Na ó glucosa): buenos para aumentar el rendimiento de

biomasa de muchas Chlorococcales. Solo para cepas axénicas.

Medios minerales con componentes orgánicos (peptona y

extracto de levadura): bueno para el crecimiento de Euglenoideos. Solo

para cepas axénicas.

MEDIOS DE CULTIVO DE USO GENERALlZADO

Autoclavado (calor húmedo): 20 min. A 121ºC y 1,5

atm de presión)

Tindalizado (calor húmedo a 100ºC y presión normal):

1 hora 3 días seguidos

Filtración: membranas de 0,22 mm de poro

Radiación: sólo para material plástico (gama, UVC)

Óxido de etileno: material de plástico descartable

Estufa (calor seco): 2 horas a 170-180ºC. Sólo

material de vidrio

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Métodos de aislamiento

Irradiación UV

Tratamiento con antibióticos (penicilina,

cloranfenicol, NO estreptomicina)

Tratamiento con detergente de alto peso

molecular

PURIFICACIÓN A AXENICIDAD

Cultivos en lote (batch): una o más especies suspendidas en un medio

acuoso. Obtención de grandes cantidades de material (Crecimiento,

bioquímica, fisiológicos,dinámica de fitoplancton y bioensayos).

Cultivos sincrónicos: Todas las células en igual estado fisiológico

dividiéndose simultáneamente. Inducción por ciclos L -O, cambios de Tº,

niveles de nutrientes, o selección de tamaño. (÷ celular, ciclo reproductivo, vías

metabólicas).

Cultivos continuos: Siempre en el mismo punto de la curva, rinde altas

cantidades de material homogéneo por períodos largos. (máx. producción

de biomasa o de metabolitos, estudios a largo plazo de respuesta de los

cultivos a cambios ambientales rigurosamente establecidos (luz, Tº, pH,

niveles de nutrientes, acción de inhibidores y sust. tóxicas). Puede

lograrse por renovación periódica del medio de cultivo y cosecha periódica

de células.

TIPOS DE CULTIVOS EN MEDIO LíQUIDO A ESCALA DE LABORATORIO

Importante: mantener agitación, principalmente en cocoides