efecto del tiempo y la temperatura en la viabilidad del adn en la perfilación genética de muestras...

8/9/2019 Efecto del tiempo y la temperatura en la viabilidad del ADN en la perfilacin gentica de muestras de sangre

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arrojaron una baja amplificacin. La presente investigacin trata de igualar lascondiciones que presenta un lugar de los hechos, el tipo de muestras encontradas, conel fin de que la informacin recabada sea de utilidad para establecer cules muestrasson ms viables de ser analizadas en del laboratorio.

PALABRAS CLAVE: Viabilidad, ADN, Sangre, Temperatura, Amplificacin.

ABSTRACT

In this study has been investigated the feasibility of obtaining DNA genetic profiling ofbiological samples from male human blood subject temperature and humidity factors.The methodology consisted of a sample preparation, DNA extraction, PCRamplification of genetic marker Amelogenin and finally DNA sequencing, wedetermined the incidence of effective amplification to obtain a complete profile, partialor no sample problem. Furthermore human blood samples over eight days of exposureshowed a lower amplification. This research seeks to level the playing field having ascene, the type of samples found, so that the information gathered in this research is

very useful trying to help establish viable which samples are to be analyzed in thelaboratory.

KEY WORDS: Viability, DNA, Blood, Genetic profile, Temperature, Amplification.

INTRODUCCIN

El conocimiento ms detallado de las regiones del DNA ha permitido utilizarlo paradiferenciar a un individuo o determinar sus relaciones biolgicas de parentesco. En1985, Alec Jeffreys fue el primero en realizar estudios, obteniendo un patrn debandas parecido a un cdigo de barras que denomin huella digital del ADN o huellagentica. Los marcadores moleculares de eleccin para estas pruebas son las regionescon repeticiones tndem de nmero variable (VNTR) y las repeticiones cortas entndem (STR), los cuales poseen unidades de repeticin de 30 pb en promedio, y de 2 a5 pb, respectivamente (Rudin, 2002).

Al utilizar cualquier marcador molecular en pruebas de identidad es importanteconsiderar que el ser humano es un organismo diploide, es decir, que su materialgentico est en doble dosis, una heredada del padre y otra de la madre. Por ejemplopara un STR del cromosoma 1 con una estructura AGT AGT AGT AGT conrepeticiones, cada persona se identifica de acuerdo con el nmero de repeticiones quetenga el STR de sus dos cromosomas 1, es decir, por sus dos alelos, de manera que alobservar a un individuo con un genotipo 6/4 para ese STR, se puede inferir queforzosamente sus padres tendrn alguno de estos alelos. Al ir analizando varios

marcadores en un individuo, se va creando un cdigo conocido tambin como perfil deDNA. A la fecha, una de las tcnicas ms utilizadas para obtener perfiles de DNA es lareaccin en cadena de la polimerasa (PCR), ya que permite generar millones de copiaso amplificar los VNTR y STR a partir de cantidades mnimas de muestra.Posteriormente, el par de alelos de un individuo puede observarse con facilidadmediante diferencias en migracin al someter los productos amplificados aelectroforesis, razn por la cual la tcnica tambin se conoce como polimorfismos en lalongitud de los fragmentos amplificados o Amp-FLP. Los STR tienen una ventajaadicional debido a su tamao pequeo, ya que varios se pueden amplificar en una sola


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reaccin, conocida como PCR multiplex y analizarse en una sola electroforesis (Guzar,2001).

ste es el principio de la identificacin humana por va gentica: Si se estudiacon detalle una serie de caractersticas del ADN ser capaz identificar a una personafrente a todas las dems. No es necesario estudiar todo el ADN, igual que no esnecesario observar a una persona de cerca para diferenciarla de otra. Del mismo modoel ADN presenta una serie de caractersticas que permiten establecer con ciertarapidez una identificacin. Esto es muy til, pues si hubiera que estudiar todo el ADNel tiempo necesario y el coste hara inviable el intento. La introduccin de las tcnicasde anlisis del ADN en la criminalstica ha supuesto una verdadera revolucin porvarias razones, entre las cuales se destacan las siguientes: El ADN de cada persona esnico, y convenientemente analizado sirve para diferenciar a un ser humano de entretodos los dems. El ADN es comn en todas las clulas del cuerpo. Es posible obtenerinformacin de indicios biolgicos aunque haya pasado mucho tiempo desde elmomento en que fueron depositados, incluso muchos aos despus (Rudin, 2002).Segn Jos Adolfo Reyes Caldern (1998) se entiende como rastro a cualquier vestigioperceptible o imperceptible que dejan las personas, los animales o las cosas al cambiar

de ubicacin o al descomponerse. El rastro tiene relacin con la prueba material yconcretamente con la prueba circunstancial. El rastro en consecuencia, se relacionacircunstancialmente con el hecho, con las personas vinculadas, con el tipo, el modo, ellugar y el mvil de la accin u omisin.

Lo anterior tomando en cuenta el trabajo realizado en el lugar de los hechos o delhallazgo el cual deber llevarse a cabo de una manera correcta con la ayuda de lacriminalstica como lo refiere Jos Adolfo Reyes Caldern (2005), en su libro tituladoTratado de Criminalstica, que la Criminalstica es la ciencia aplicativa que utilizaheterogneos conocimientos, mtodos y tcnicas de investigacin de las ciencias, paraestablecer cmo, cundo, dnde, quin y en qu circunstancias acaeci un hecho o dejode acaecer.

La Criminalstica, as entendida, es una ciencia aplicada o aplicativa (ReyesCaldern, 2005) que, valindose de peritos o expertos en determinada materia, emite yplasma sus hallazgos en los, bien llamados, informes periciales a efectos de que suconcurso y conocimiento pueda coadyuvar a un mejor entendimiento de los sucesos porparte de los operadores de justicia, en procesos judiciales en general, en procesosadministrativos o, que sus hallazgos puedan ser utilizados por cualquier individuo enparticular, para cualquier asunto particular.

Cada da se les concede mayor valor a las evidencias fsicas en los procesos judiciales, lo que sumado al avance del anlisis de pruebas de los laboratorioscriminolgicos, aumenta la responsabilidad de que tienen a su cargo la persecucinpenal, ya que la escena del crimen deber hacer una minuciosa investigacin,recoleccin, embalaje, manejo y transporte de evidencias (Reyes Caldern, 1998).

Debido a la poca informacin publicada de estudios que avalen estadsticamentela viabilidad de las muestras ante factores ambientales para una perfilacin gentica,el presente proyecto pretende comprobar si los factores ambientales tales comohumedad y temperatura presentan un efecto directo que imposibilite o dificulte laaplicacin de la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglasen ingls) para la obtencin de un perfil gentico de identificacin que pueda serutilizado en una aplicacin forense. Como resultado de la aplicacin de lasmetodologas de recoleccin, extraccin de ADN, amplificacin por PCR ysecuenciacin en muestras biolgicas de sangre degradada, se pretende obtener una


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estandarizacin que permita calcular de manera indirecta si una muestra que seencuentra en un lugar de los hechos como indicio biolgico, dentro de unainvestigacin criminal es vlida y viable o no para la obtencin de un perfil genticoque pueda ser usado con fines de comparacin e identificacin humana.

El objetivo general del presente estudio fue el determinar la viabilidad del ADNcon la obtencin de un perfil gentico de muestras biolgicas de sangre humana delsexo masculino, sometidas a diferentes niveles de temperatura y tiempo.

Como objetivos especficos se tuvieron los siguientes:

Se analizaron muestras representativas de sangre que se sometieron atratamientos de temperatura y tiempo;

Se valor la amplificacin de PCR del marcador gentico Amelogenina (sexobiolgico), para la posible obtencin de un perfil gentico de las muestraspreviamente expuestas a factores ambientales, y

Se determin la Incidencia de amplificacin efectiva al obtener un perfilcompleto, parcial o nulo de la muestra problema.

Los principios de divisibilidad y transferencia de la materia interactan en lageneracin de indicios/evidencias, antes y durante el hecho criminal, la investigacinforense comienza despus del crimen, con la inspeccin ocular del lugar de los hechos yla localizacin y deteccin de evidencias e indicios, en particular de los biolgicos parael anlisis de ADN, como base de la investigacin criminal. Se debe llevar a cabo unabuena recoleccin y embalaje de cada uno de los objetos o elementos de inters parainvestigacin criminal (evidencia) que porta posibles restos biolgicos susceptibles deanlisis (indicios) al ser examinados en el laboratorio. Los restos biolgicos seencuentran en situaciones adversas cuando abandonan las condiciones controladas yestables del organismo, principalmente por las variables medio ambientales comotemperatura y humedad, a la exposicin a sustancias qumicas o de microorganismos,hongos y bacterias, ocasionando la degradacin del indicio o la inhibicin de losanlisis, circunstancias que limitan la lectura de la informacin genticatraducindose en la obtencin de resultados parciales o incluso la no obtencin deresultados (Jeffreys, 1985).

La sangre es una excelente fuente de ADN, asociada a muchos ilcitos, sinembargo el ADN contenido en el ncleo de los glbulos blancos est en una proporcinminoritaria. La relacin 400:1 de clulas rojas (sin ncleo) en relacin con las clulasblancas, coloca la sangre en el segundo nivel de fuentes de ADN o categora II entrminos de producto de ADN respecto al volumen de muestra (Jeffreys, 1985).

La importancia propia de la recoleccin de evidencia con ADN no debe serminimizada. Si la muestra de ADN est contaminada desde el principio, se obtieneinformacin ambigua que se convierte en un reto importante en la investigacin

forense, pues puede llegar a comprometer los resultados. Las muestras recolectadasdeben ser escogidas cuidadosamente para prevenir la redundancia de la evidencia enel caso (Butler, 2005).

MATERIAL Y MTODO

1. Diseo de experimento . Se establecieron los protocolos de toma y de colocacinde muestras. Se estandariz el protocolo de extraccin de ADN por resinasquelantes llamadas Chelex y con el kit comercial DNA IQ System, Resinas


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magnticas de la marca Promega. Se analizaron los factores de temperatura yhumedad.

2. Preparacin de las muestras . La muestra de sangre humana se tom porpuncin venosa en tubo vacutainer sin anticoagulante EDTA de una persona desexo biolgico masculino. Se continu con la preparacin de las muestras colocandocuatro muestras con manchas representativas de 100 l de sangre en soportes detela de algodn aproximadamente de 2 cm de ancho por 2 cm de alto, las cualesfueron sometidas a factores de temperatura y humedad. Los rangos detemperatura y humedad que se utilizaron, son basados en la bibliografa ytomando en cuenta los valores de temperatura y humedad promedio registrados en Aguascalientes. Los parmetros y los intervalos de temperatura se establecieroncomo temperatura mxima (37 C), temperatura media (temperatura ambiente) ytemperatura mnima (4 C), en cuanto a la Humedad relativa solo se tom encuenta su relacin con la temperatura media (temperatura ambiente), por periodosde exposicin de 1/ 2/ 4/ 8/ 16/ 32/ 64 das. Se realiz un muestreo de cada una delas muestras sanguneas expuestas a factores ambientales, mediante el Manualde recolecta para indicios en Gentica Forense (Penacino, 2009).

3. Extraccin del ADN . De las manchas colocadas en soportes de tela de algodn serealiz un corte de 1 cm2, el cual se resuspendio en 1000 l agua desionizada,realizando lavados para eliminar el exceso de hemoglobina y comenzar con laextraccin del material gentico, la extraccin de ADN se llev a cabo por el mtodode resinas quelantes llamadas Chelex y el kit comercial DNA IQ System Resinasmagnticas de la marca Promega.

4. Amplificacin por PCR del marcador gentico Amelogenina . Se realizaron84 amplificaciones de ADN de las muestras con manchas biolgicas de sangredegradadas, expuestas bajo las tres temperaturas o variables utilizadas (mxima,media/humedad y mnima), durante los intervalos de 1/ 2/ 4/ 8/ 16/ 32 y 64 das,utilizando el marcador gentico Amelogenina (sexo biolgico).

5. Secuenciacin de ADN. (Manual de PROMEGA, 2008) Se llev a cabo lasecuenciacin de 84 muestra con manchas biolgicas de sangre degradada, tanto enuna matriz de gel de agarosa como en gel de poliacrilamida. El protocolo utilizadopara realizar la secuenciacin de ADN en gel de agarosa se llev acabo en cuatrofases que fue la preparacin de agarosa, se coloc la agarosa en la cmara deelectroforesis y finalmente se corrieron las muestras. Por otro lado el protocoloutilizado para realizar la secuenciacin de ADN en gel de poliacrilamida se realizde igual forma en cuatro fases, la preparacin de los vidrios de electroforesis, lapreparacin del gel de poliacrilamida, el corrimiento de las muestras y el reveladode las muestras.


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RESULTADOS

Tabla No.1 . Temperaturas y Humedad Relativa del ambiente registradas en lugar del diseoexperimental.

FECHA TEMPERATURA8:00 HORAS

TEMPERATURA 14:00HORAS

TEMPERATUR A20:00 HORAS

HUMEDADRELATIVA8:00

HORAS

HUMEDADRELATIVA14:00 HORAS

HUMEDADRELATIVA20:00 HORA

24/10/2012 24.8 C 39%25/10/2012 24.8C 25.3C 33% 32%26/10/2012 25.3C 24.6C 33% 36%30/10/2012 23.1C 21.6C 33% 38%31/10/2012 22.9C 21.3C 38% 39%01/11/2013 22.9C 20.5C 33% 39%03/11/2012 19.9C 22.0C 41% 39%05/11/2012 20.5C 19.4C 40% 54%06/11/2012 20.9C 19.1C 41% 45%

07/11/2012 20.1C 18.6C 36% 41%08/11/2012 20.0C 18.9C 35% 38%10/11/2012 18.8C 21.3C 37% 35%12/11/2012 21.3C 41%13/11/2012 21.3C 19.5C 41% 48%14/11/2012 21.2C 20.1C 41% 47%15/11/2012 21.7C 20.2C 42% 47%16/11/2012 22.1C 20.7C 41% 47%17/11/2012 19.6C 21.5C 49% 43%22/11/2012 20.8C 19.5C 41% 43%23/11/2012 21.4C 19.9C 40% 46%24/11/2012 18.5C 22.1C 52% 41%

26/11/2012 19.5C 18.4C 38% 43%27/11/2012 20.1C 17.8C 42% 50%28/11/2012 19.5C 18.1C 45% 41%29/11/2012 19.2C 18.4C 42% 49%03/12/2012 20.6C 19.7C 41% 41%04/12/2013 20.5C 19.5C 31% 34%05/12/2012 20.0C 18.9C 33% 33%06/12/2012 19.7C 18.6C 33% 35%07/12/2012 19.8C 18.6C 33% 35%08/12/2012 17.5C 20.2C 35% 30%09/12/2012 18.8C 42%13/12/2012 17.8C 49%14/12/2012 18.8C 18.3C 48% 46%15/12/2012 19.5C 41%17/12/2012 19.1C 32%18/12/2012 18.5C 18.3C 29% 33%19/12/2012 18.5C 18.4C 37% 40%20/12/2013 18.4C 18.6C 30% 32%04/01/2013 16.6C 16.5C 54% 56%08/01/2013 16.7C 16.9C 60% 63%10/01/2013 16.6C 51%


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11/01/2013 18C 47%16/01/2013 16C 18%17/01/2012 14.1C 29%19/01/2013 25.9C 25C 43% 45%20/01/2013 23.2C 25.3C 49% 44%22/01/2013 26C 25.2C 31% 27%

Nota: La humedad relativa solo fue tomada como referencia para este diseo experimental.

Tabla No.2 . Resultados de extraccin de ADN por el mtodo de Chelex , de las muestras entela de algodn expuestas en los diferentes tratamientos de temperatura y de tiempo.

DA DEEXPOSICI

N

Calidad de la Extraccin por elmtodo de Chelex de muestras

expuestas aTemperatura mnima, media,

mxima Porcentaje de Extraccin1 12 MUESTRAS DE12 100%

2 10 MUESTRAS DE12 83%4 10 MUESTRAS DE12 83%8 8 MUESTRAS DE 12 66%16 6 MUESTRAS DE 12 50%32 6 MUESTRAS DE 12 50%64 6 MUESTRAS DE 12 50%

Tabla No.3 . Resultados de extraccin de ADN por el mtodo de DNA IQ System, Resinasmagnticas, de las muestras en tela de algodn expuestas en los diferentes tratamientos de

temperatura y de tiempo.

DA DEEXPOSICI

N

Calidad de la Extraccin por el

mtodo de de DNA IQ System,Resinas magnticas de muestrasexpuestas a

Temperatura mnima, media,mxima Porcentaje de Extraccin

1 12 MUESTRAS DE12 100%2 12 MUESTRAS DE12 100%4 12 MUESTRAS DE12 100%8 12 MUESTRAS DE 12 100%16 10 MUESTRAS DE 12 83%32 10 MUESTRAS DE 12 83%64 8 MUESTRAS DE 12 66%


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Tabla No.4 . Resultados de amplificacin de las muestras en tela de algodn en los diferentestratamientos de temperatura y de tiempo.+++ = Bien amplificado,++ = Medianamente

amplificado, N.A .= No Amplifico.

SOPORTECONDICIN

TEMPERATURA

MNIMA4C

TEMPERATURA

MEDIA AMBIENTE

TEMPERATURA

MXIMA3724 HORAS (1 DA)

Muestra 1 +++ +++ +++ Muestra 2 +++ +++ +++ Muestra 3 +++ +++ +++ Muestra 4 +++ +++ +++

48 HORAS (2 DAS) Muestra 1 +++ +++ +++ Muestra 2 +++ +++ +++ Muestra 3 +++ +++ +++ Muestra 4 +++ +++ +++

96 HORAS (4 DAS) Muestra 1 +++ +++ +++Muestra 2 +++ +++ ++Muestra 3 +++ +++ ++Muestra 4 +++ +++ +++

192HORAS (8 DAS) Muestra 1 +++ ++ N.AMuestra 2 +++ ++ ++Muestra 3 +++ ++ ++Muestra 4 N.A ++ ++

384 HORAS (16 DAS) Muestra 1 +++ ++ ++Muestra 2 +++ ++ ++Muestra 3 +++ ++ ++Muestra 4 +++ +++ ++

768 HORAS (32 DAS) Muestra 1 +++ ++ ++Muestra 2 +++ +++ ++Muestra 3 +++ ++ ++Muestra 4 +++ +++ N.A.

1536 HORAS (64 DAS) Muestra 1 N.A ++ N.A.Muestra 2 ++ N.A. N.A.Muestra 3 ++ N.A. ++Muestra 4 ++ ++ N.A.

Tabla No. 5. Promedio de Temperatura Ambiente y Humedad relativa registradas en ellugar del diseo experimental.

TEMPERATURA AMBIENTEPROMEDIO 20.20C

HUMEDAD RELATIVA PROMEDIO 40%


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Tablas No. 6 y 7. Porcentaje de Amplificacin relacin Das- Temperaturas. Se puedeobservar que la probabilidad de amplificar es ms alta en los tratamientos de 1/2/4 das.

DA

Muestras amplificadasTemperatura mnima, media,

mxima Porcentaje de Amplificacin

1 12 MUESTRAS DE 12 1.002 12 MUESTRAS DE 12 1.004 10 MUESTRAS DE 12 0.838 3 MUESTRAS DE 12 0.2516 5 MUESTRAS DE 12 0.4232 6 MUESTRAS DE 12 0.564 0 MUESTRAS DE 12 0

DA

Muestras amplificadasTemperatura mnima, media,

mxima Porcentaje de Amplificacin1 12 MUESTRAS DE 12 100 %2 12 MUESTRAS DE 12 100 %4 10 MUESTRAS DE 12 83 %8 3 MUESTRAS DE 12 25 %16 5 MUESTRAS DE 12 42 %32 6 MUESTRAS DE 12 50 %64 0 MUESTRAS DE 12 0 %

Grfica No. 1. Grafica que muestra la Probabilidad de Amplificacin relacin Das-Temperaturas de las muestras de sangre expuestas.


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Tabla No. 8 . Porcentajes de Buena amplificacin (+++), relacin da- temperaturaExiste una probabilidad ms alta de 0.821 de tener una buena amplificacin en muestras quese encuentran expuestas a una temperatura mnima de 4C, independientemente de los das

transcurridos excepto

Da

Temperatura

Mnima 4C

Temperatura

Media Ambiente

Temperatura

Mxima 37C1 0.143 0.143 0.1432 0.143 0.143 0.1434 0.143 0.143 0.0718 0.107 0.000 016 0.143 0.036 032 0.143 0.071 064 0 0.000 0

PorcentajeTotal 0.821 0.536 0.357

Tabla No. 9 . Porcentajes de Media amplificacin (++), relacin da- temperatura

Existe una probabilidad ms alta de 0.464 de tener una media amplificacin enmuestras que se encuentran expuestas a una temperatura mxima de 37C,independientemente de los das transcurridos.

DaTemperaturaMnima 4C

TemperaturaMedia Ambiente

TemperaturaMxima 37C

1 0.00 0.000 0.0002 0.00 0.000 0.0004 0.00 0.000 0.0718 0.00 0.107 0.10716 0.00 0.143 0.14332 0.00 0.107 0.10764 0.11 0.036 0.036

PorcentajeTotal 0.107 0.393 0.464


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CONCLUSIONES

Los mtodos de extraccin de ADN por resinas quelantes llamadas Chelex y laextraccin de ADN por el mtodo de DNA IQ System, resinas magnticas de la marcaPromega son mtodos de extraccin tiles en el procesamiento de muestras de sangredegradada. La extraccin con resinas quelantes llamadas Chelex demostr ser unmtodo de extraccin eficaz para soportes de tela de algodn con manchas de sangresometidas a diversas temperaturas como lo es a 4 C, a temperatura ambiente y a 37C, logrando amplificacines en los das de exposicin de 1/ 2/ 4/ 8 das de exposicincon un porcentaje por arriba del 66%. Se observ al secuenciar que el marcadorgentico Amelogenina (sexo biolgico) es ms fcil de visualizar su amplificacin enuna matriz de gel de poliacrilamida que en una matriz de gel de agarosa. Lasmuestras con manchas de sangre que se encuentren en una tela de algodn que seexpusieron por ms de ocho das sometidas a cualquier temperatura arrojarn unaamplificacin ms baja. Como recomendacin se resalta este tipo de trabajos para elimpulso de la investigacin, trabajos realmente que cumplen con el objeto de laciencia. Se recomienda que se repita con otras variables como lo puede ser un lugar

abierto, con otros soportes como es el suelo, paredes e incrementar el tiempo deexposicin a 6 meses. De igual forma se recomienda realizar este experimentoutilizando otros marcadores genticos (STR) adems de la Amelogenina, as comotambin la exposicin a sustancias qumicas.

REFERENCIAS

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