dykhuizen, lactose lysis in e coli, 1978

7/30/2019 Dykhuizen, Lactose Lysis in E Coli, 1978

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J o u R N A L O F B A C T E I O L O G Y , S e p t . 1 9 7 8 , p . 8 7 6 - 8 8 20 0 2 1 - 9 1 9 3 / 7 8 / 0 1 3 5 - 0 8 7 6 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t K ) 1 9 7 8 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 1 3 5 , N o . 3

P r i n t e d i n U . S . A .

T r a n s p o r t b y t h e L a c t o s e P e r n e a s e o f E s c h e r i c h i a c o l i a s t h eB a s i s o f L a c t o s e K i l l i n gDANIEL DYKHUIZEN* AND DANIEL HARTL

D e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , P u r d u e U n i v e r s i t y , W e s t L a f a y e t t e , I n d i a n a 4 7 9 0 7R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 0 A p r i l 1 9 7 8

L a c t o s e k i l l i n g i s a p e c u l i a r p h e n o m e n o n i n w h i c h 8 0 t o 9 8 % o f t h e E s c h e r i c h i ac o l i c e l l s t a k e n f r o m a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t d i e w h e n p l a t e d o n s t a n d a r dl a c t o s e m i n i m a l m e d i a . T h i s u n i q u e f o r m o f s u i c i d e i s c a u s e d b y t h e a c t i o n o f t h el a c t o s e p e r n e a s e . S i n c e u p t a k e o f e i t h e r l a c t o s e o r g a l a c t o s e b y t h e l a c t o s ep e r m e a s e c a u s e s d e a t h , t h e a c t i o n o f r a p i d t r a n s p o r t a c r o s s t h e m e m b r a n e mustb e t h e c a u s e o f t h e p h e n o m e n o n . A l t e r n a t i v e c a u s e s o f l a c t o s e k i l l i n g , s u c h a sa c c u m u l a t i o n o f t o x i c m e t a b o l i c i n t e r m e d i a t e s o r a c t i o n o f t h e 8 ) - g a l a c t o s i d a s e ,h a v e b e e n e l i m i n a t e d . I t i s p r o p o s e d t h a t r a p i d u p t a k e o f s u g a r s b y t h e l a c t o s ep e r m e a s e d i s r u p t s m e m b r a n e f u n c t i o n , p e r h a p s c a u s i n g c o l l a p s e o f t h e m e m b r a n ep o t e n t i a l .E n v i r o n m e n t a l r e s o u r c e s i n n a t u r e c o m m o n l yv a r y b e t w e e n s h o r t a g e a n d e x c e s s . T h u s , o n ee x p e c t s o r g a n i s m t o h a v e b e c o m e w e l l a d a p t e d

t o f l u c t u a t i o n s i n t h e i r n u t r i e n t s u p p l y . I n m o s tc a s e s , o r g a n m i s m a r e i n d e e d a d a p t e d t o s h o r t -t e r m f l u c t u a t i o n s i n n u t r i e n t s u p p l y . W i t h r e -s p e c t t o f l u c t u a t i o n s i n t h e amount o f l a c t o s e ,h o w e v e r , E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s a r e a n y t h i n g b u ta d a p t e d . I n d e e d , w h e n E . c o l i c e l l s t h a t h a v eb e e n g r o w i n g o n a l i m i t e d s u p p l y o f l a c t o s e i n ac h e m o s t a t a r e p r o v i d e d w i t h e x c e s s l a c t o s e , t h e ys t o p g r o w i n g ( 1 3 ) . I f t h e s e sa me c e l l s a r e p r o -v i d e d w i t h e x c e s s g l u c o s e o r m a l t o s e , t h e y c o n -t i n u e t o g r o w . T r i v i a l e x p l a n a t i o n s o f t h e p h e -n o m e n o n , w h i c h h a s b e e n c a l l e d l a c t o s e k i l l i n g ,s u c h a s t h o s e b a s e d o n c h a n g e s i n m e d i a pH o ri o n i c s t r e n g t h , h a v e b e e n e l i m i n a t e d ( 2 4 ) . Wet h e r e f o r e d e c i d e d t o e x a m i n e t h e p h y s i o l o g i c a lb a s i s o f t h e l a c t o s e e f f e c t .S u b s t r a t e - a c c e l e r a t e d d e a t h ( 3 , 4 , 1 8 , 1 9 , 2 2 ,2 3 ) i s a p h e n o m e n o n s i m i l a r t o l a c t o s e k i l l i n g . I ti s i n d u c e d e x p e r i m e n t a l l y b y g r o w i n g A e r o b a c -t e r a e r o g e n e s i n e n e r g y - l i m i t e d c h e m o s t a t s ,w a s h i n g t h e c e l l s , a n d t h e n s t a r v i n g t h e m i nb u f f e r e i t h e r w i t h o r w i t h o u t t h e e n e r g y s o u r c e .( T h e c e l l s a r e u n a b l e t o g r o w b e c a u s e t h e b u f f e rl a c k s m a g n e s i u m , n i t r o g e n , a n d o t h e r f a c t o r s . )U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , c e l L s d i e f a s t e r i n t h ep r e s e n c e o f t h e e n e r g y s o u r c e t o w h i c h t h e yw e r e a d a p t e d t h a n t h e y d o i n i t s a b s e n c e , w i t hg l y c e r o l a n d l a c t o s e b e i n g p a r t i c u l a r l y e f f e c t i v ei n a c c e l e r a t i n g d e a t h .F o r b o t h l a c t o s e k i l l i n g a n d l a c t o s e - a c c e l e r -a t e d d e a t h , t h e c e l l s w e r e g r o w n i n c h e m o s t a t sw h e r e l a c t o s e i s l i m i t i n g g r o w t h . Th e c e l l s p h y s -i o l o g i c a l l y b e s t a d a p t e d t o t h e s e c h e m o s t a t sm u s t b e t h o s e c e l l s w h i c h h a v e t u r n e d o f f a n y

r e g u l a t o r y s y s t e m t h a t m o d u l a t e s t h e e n t r y a n du s e o f l a c t o s e . When t h e s e c e l l s a r e g i v e n e x c e s sl a c t o s e , a n e x c e s s i v e a n d u n r e g u l a t e d u p t a k ea n d m e t a b o l i s m o f l a c t o s e m u s t r e s u l t , l e a d i n gt o t h e l e t h a l e f f e c t s . We a r e i n t e r e s t e d i n f i n d i n gt h e c a u s e o f t h e l e t h a l i t y .U n r e g u l a t e d g l y c e r o l m e t a b o l i s m i s a l s o l e t h a li n E . c o l i ( 8 ) . When b o t h r e p r e s s i o n a n d f e e d -b a c k i n h i b i t i o n o f g l y c e r o l k i n a s e a r e e l i m i n a t e db y m u t a t i o n , m e t a b o l i s m o f g l y c e r o l i s t o x i c .M e t h y l - g l y o x a l , p r o d u c e d f r o m g l y c e r o l i n t h e s eu n r e g u l a t e d c e l l s , c a u s e s t h i s t o x i c i t y . A n o t h e rt o x i c c e l l u l a r i n t e r m e d i a t e t h a t c o u l d c a u s e l a c -t o s e k i l l i n g i s U D P - g a l a c t o s e . E x p e r i m e n t s s h o wt h a t a c c u m u l a t i o n o f n e i t h e r o f t h e s e m e t a b o l i ci n t e r m e d i a t e s c o u l d a c c o u n t f o r l a c t o s e k i l l i n g .A f t e r c o n s i d e r a b l e d a t a w e r e c o l l e c t e d o n t h ep h e n o m e n o l o g y o f l a c t o s e k i l l i n g , i t w a s c o n -c l u d e d t h a t t h e e n t r y o f l a c t o s e v i a t h e l a c Yp e r m e a s e i s t h e c a u s e o f l a c t o s e k i l l i n g . T h i sh y p o t h e s i s w a s c o n f i r m e d b y a f i n a l e x p e r i m e n t .We s h o w e d t h a t a s t r a i n l a c k i n g , B - g a l a c t o s i d a s eb u t w i t h a c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d l a c t o s e p e r -m e a s e i s a l s o k i l l e d b y l a c t o s e .MATERIALS AND MEIHODS

S t a n d a r d t e c h n i q u e s f o r t h e h a n d l i n g a n d g e n e t i cm a n i p u l a t i o n o f E . c o l i w e r e u s e d ( e . g . , 1 6 ) . M e d i a a n dc h e m o s t a t a p p a r a t u s h a v e b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( 7 ) .S t r a i n s o f E . c o l i K - 1 2 u s e d w e r e : ( i ) DD323 r p s L( D y k h u i z e n a n d D a v i e s , u n p u b l i s h e d d a t a ) . ( i i ) C 2 4 9r p s L h i s A ( b i o - g a l ) ( 6 ) . ( i i i ) DD539 H f r Cl a c r z a w Y r e b g R A + , a d e r i v a t i v e o f A2 o f H a l l a n dH a r t l ( 1 0 ) s e l e c t e d f o r g r o w t h o n l a c t o s e w i t h o u ta d d e d i s o p r o p y l - 1 - t h i o - , B - g a l a c t o s i d e ( I P T G ) . e b g Rc o d e s f o r t h e r e p r e s s o r ( 1 0 ) . ( i v ) DD552 r p s L h i s , ag a l ' b i o + d e r i v a t i v e o f C 2 4 9 o b t a i n e d b y P 1 t r a n s d u c -8 7 6


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LACTOSE KILLING 8 7 7t i o n . ( v ) L i n 1 phoA8 r e I A l t o n A 2 2 T 2 ' o b t a i n e d fromB . B a c h m a n n ( 8 ) . ( v i ) L i n 2 9 2 p h o A 8 r e l A l t o n A 2 2T 2 ' m g r 2 , a m e t h y l - g l y o x a l - r e s i s t a n t d e r i v a t i v e o f Lin1 , o b t a i n e d f r o m B . B a c h m a n n ( 8 ) . ( v i i ) DD654l a c Z j w 4 6 r p s L . ( v i i i ) DD655 l a c + r p s L , a l a c + d e r i v -a t i v e o f DD654 o b t a i n e d b y P 1 t r a n s d u c t i o n . ( i x )CSH66 A l a c t h i ( X c I 8 5 7 S 7 p l a c 5 I Z + Y ) ( 1 4 ) . ( x ) W 3 1 0 2g a l K 2 , o b t a i n e d f r o m B . B a c h m a n n .E n z y m e a s s a ys f o r f l - g a l a c t o s i d a s e were p e r f o r m e da c c o r d i n g t o P a r d e e e t a l . ( 1 7 ) ; a s s a ys f o r g a l a c t o k i n a s ewere p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o H e i n r i c h a n d H o w a r d( 1 1 ) . A s s a y s f o r f - g a l a c t o s i d e p e rm e a s e we re t h e sameas t h o s e f o r 1 6 - g a l a c t o s i d a s e e x c e p t t h a t i n t a c t r a t h e rt h a n t o l u e n i z e d c e l l s were u s e d , s i n c e t h e amount o f, 8 - g a l a c t o s i d e p erme a s e l i m i t s t h e r a t e o f s u b s t r a t eh y d r o l y s i s i n i n t a c t c e l l s ( 2 1 ) .A s s a y s f o r t h e amount o f l a c t o s e k i l l i n g were per-f o r m e d b y sampling from t h e c h e m o s t a t o v e r f l o w ond a y s 6 , 7 , a n d 8 a f t e r t h e c h e m o s t a t s were i n o c u l a t e d .T h e s e s a m p l e s were d i l u t e d a p p r o p r i a t e l y a n d p l a t e don s i x p l a t e s e a c h o f m a l t o s e , m e l i b i o s e , g a l a c t o s e , a n dl a c t o s e m i n i m a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h r e q u i r e dn u t r i e n t s . S i n c e m i c r o s c o p i c c e l l c o u n t s s h o w e d t h a tv i r t u a l l y a l l ( 9 5 t o 9 9 % ) o f t h e c e l l s s u r v i v e d on m a l -t o s e , t h e amount o f l a c t o s e k i l l i n g was m e a s u r e d a st h e r e d u c t i o n i n s u r v i v a l w h e n p l a t e d on o t h e r sugarsa s c o m p a r e d t o s u r v i v a l on m a l t o s e . S a m p l i n g t h ec h e m o s t a t s on d a y s 6 , 7 , a n d 8 r e p r e s e n t s o u r e m p i r i -c a l l y d e t e r m i n e d o p t i m u m p r o c e d u r e . L a c t o s e c o n s t i -t u t i v e m u t a n t s are r a p i d l y s e l e c t e d i n l a c t o s e - l i m i t e dc h e m o s t a t s , r e a c h i n g very h i g h f r e q u e n c i e s a f t e r d a y3 or 4 ( D y k h u i z e n a n d D a v i e s , u n p u b l i s h e d d a t a ) . O n ew i s h e s t o s a m p l e a f t e r t h i s r a d i c a l c h a n g e h a s t a k e np l a c e b u t b e f o r e o t h e r u n r e l a t e d e v o l u t i o n a r y c h a n g e sh a v e o c c u r r e d i n t h e c h e m o s t a t s .I n some e x p e r i m e n t s , s u c h as t h e o n e t o d e t e r m i n ew h e t h e r c e l l s ca n b e r e v i v e d a f t e r i n c u b a t i o n i n l a c -t o s e , a s e r i e s o f 1 0 - m m - d i a m e t e r t e s t t u b e s were u s e d .S a m p l e s were d i l u t e d 1 0 - f o l d i n t o t h e g r o w t h m e d i a ,a n d 0 . 5 - m l s a m p l e s were d i s p e n s e d i n t o t h e t u b e s .W i t h c e l l d e n s i t i e s a s t h e y a re i n o u r c h e m o s t a t s , t h i sp r o c e d u r e l e a d s t o l e s s t h a n a 5 0 % c h a n c e t h a t a g i v e nt u b e w i l l c o n t a i n o n e or more c e l l s . A f t e r 2 d a y s o fi n c u b a t i o n o f t h e c o n t r o l ( b r o t h - c o n t a i n i n g ) t u b e s a t3 7 0 C , t h e p r o p o r t i o n o f t u b e s w i t h no g r o w t h wasa s s u m e d t o e q u a l t h e n u l l t e r m o f a P o i s s o n d i s t r i b u -t i o n ; f r o m t h i s , t h e n u m b e r o f v i a b l e c e l l s per m i l l i l i t e ri n t h e o r i g i n a l s a m p l e was e s t i m a t e d , a n d t h e p e r c e n t -age o f k i l l i n g was t h e r e b y c a l c u l a t e d f r o m p r o p o r t i o no f e x p er i m e n t a l t u b e s i n w h i c h no c e l l g r o w t h oc-c u r r e d .A d i f f e r e n t p r o c e d u r e was d e v i s e d t o a s s a y t h el a c t o s e k i l l i n g i n t h e l a c Z d e l e t i o n s t r a i n ( D D 6 5 4 )b e c a u s e t h e s u r v i v o r s w i l l n o t grow on l a c t o s e m i n i m a lm e d i u m . The d i l u t e d c e l l s p l u s 2 . 5 m l o f s o f t agar( 0 . 2 % l a c t o s e + 0 . 5 % agar i n D a v i s s a l t s ) was p o u r e do n t o l a c t o s e m i n i m a l medium p l a t e s ( 0 . 2 % l a c t o s e +1 . 4 % ag ar i n D a v i s s a l t s ) . T h e s e p l a t e s were i n c u b a t e df o r 2 d a y s a n d t h e n o v e r l a i d w i t h 5 m l o f s o f t agarc o n t a i n i n g 1% m a l t o s e . A f t e r 2 d a y s , t h e v i s i b l e c o l o -n i e s were c o u n t e d as t h e s u r v i v i n g c e l l s . No morec o l o n i e s a p p e a r e d w i t h 6 d a y s o f a d d i t i o n a l i n c u b a t i o n .To as s ay f o r l a c t o s e c o n s t i t u t i v i t y , c e l l s were t r a n s -f e r r e d f r o m c o l o n i e s g r o w i n g on t h e m a l t o s e m i n i m a lmedium p l a t e s o n t o TTY p l a t e s ( 1 2 ) w i t h s t e r i l e t o o t h -

p i c k s . T h e TTY p l a t e s w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t . T h en e x t m o r n i n g a d r op o f t o l u e ne w a s p u t o n e a c h c o l o n y .A f t e r 1 5 m i n , t h e t o l u e n e w a s e v a p o r a t e d w i t h f o r c e da i r , a n d a d r o p o f o - n i t r o p h e n y l - 1 8 - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e( 0 . 4 m g / m l ) w a s p u t o n e a c h c o l o n y . The c o n s t i t u t i v ec o l o n i e s t ur n e d d a r k y e l l o w , t h e r e g u l a t e d o n e s r e -m a i n e d w h i t e . I t w a s n o t p o s s i b l e t o a s s a y s t r a i nDD654 d i r e c t l y f o r c o n s t i t u t i v i t y , s i n c e i t c o n t a i n e d n o, B - g a l a c t o s i d a s e . T h e f o l l o w i n g g e n e t i c m a n i p u l a t i o nw a s d o n e s o t h i s s t r a i n c o u l d b e a s s a y e d . A X p l a cl y s a t e w a s m a d e f r o m C S H 6 6 . T h e s e p h a g e w e r e c r o s s -s t r e a k e d o n M a c C o n k e y - l a c t o s e p l a t e s ( 1 6 ) a g a i n s tc u l t u r e s g r o w n f r om s i n g l e c e l l s o f DD654 t a k e n f r o mt h e c h em os t a t . C e l l s t h a t w e r e p h e n o t y p i c a l l y L a c 'w e r e p i c k e d f r o m t h e i n t e r s e c t i o n o f t h e s t r e a k s . I f ac e l l c a r r y i n g t h e p h a g e i s s t i l l r e p r e s s i b l e , t h e r e p r e s s o rf r o m t h e c e l l w i l l r e p r e s s t h e , B - g a l a c t o s i d a s e g e n ec a r r i e d b y t h e p h a g e . I f t h e c e l l i s c o n s t i t u t i v e , t h e , -g a l a c t o s i d a s e c a r r i e d b y t h e p h a g e w i l l n o t b e r e -p r e s s e d . T h u s t h e a s s a y f o r c o n s t i t u t i v i t y u s i n g o -n i t r o p h e n y l - , - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e c a n a l s o b e u s e do n l y s o g e n i c c e l l s f r o m s t r a i n D D 6 5 4 .

RESULTSThe p he no m en ol o gy o f l a c t o s e k i l l i n g .When E . c o l i w e r e g r o w n f o r 6 t o 8 d a y s i n al a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t ( 0 . 0 2 % l a c t o s e ) , 8 0 t o9 8 % o f t h e c e l l s w e r e k i l l e d when p l a t e d o nl a c t o s e m i n i m a l medium ( 0 . 2 % l a c t o s e ) . S t r a i nd i f f e r e n c e s e x p l a i n much o f t h e v a r i a b i l i t y i n t h ep e r c e n t a g e o f l a c t o s e k i l l i n g . F o r e x a m p l e , t h e

k i l l i n g r a t e o f DD552 was a b o u t 8 5 % , w h e r e a st h e k i l l i n g r a t e o f W3102 w a s 9 8 % . T h e s e s t r a i n sa r e a l s o d i f f e r e n t i n t h e a m o u n t o f , B - g a l a c t o s i d -a s e i n t h e c e l l s . DD552 c u l t u r e s c o n t a i n e d a b o u t6 0 % o f t h e a c t i v i t y f o u n d i n W 3 1 0 2 . A s o m e w h a tl a r g e r p e r c e n t a g e o f t h e c e l l s s u r v i v e d i f c a s e i na m i n o a c i d s w e r e i n c l u d e d i n t h e p l a t e s , a n dv a r i o u s c u l t u r i n g a n d h a n d l i n g p r o c e d u r e s h a da m i n o r e f f e c t o n s u r v i v a l r a t e . E . c o l i c e l l sg r o w n i n c h e m o s t a t s l i m i t e d f o r g l u c o s e , m a l -t o s e , o r g a l a c t o s e e x h i b i t e d n o s u c h k i l l i n g p h e -nomenon w h e n p l a t e d o n t h e i r r e s p e c t i v e s u g a r so r o n l a c t o s e . I n d e e d , l a c t o s e k i l l i n g w a s p r o -v o k e d b y l a c t o s e i t s e l f . When E . c o l i c e l L s g r o w ni n a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t w e r e p l a t e d o nm a l t o s e m i n i m a l m e d i u m , n o k i l l i n g o c c u r r e d .M o r e o v e r , c e l l s t h a t h a d g r o w n o v e r n i g h t o nm a l t o s e p l a t e s c o u l d b e t r a n s f e r r e d t o l a c t o s ep l a t e s w i t h o u t a n y m o r t a l i t y . T h i s r e s u l t s u g -g e s t s t h a t t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t o r i n l a c t o s ek i l l i n g i s t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e a t t a i n e d b y c e l l si n t h e c h e m o s t a t , a l t h o u g h g e n e t i c c h a n g e sm i g h t a l s o i n f l u e n c e t h e p h e n o m e n o n . Th e i m -p o r t a n c e o f t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e i s c o n f i r m e db y t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t . C e l l s f r o m a l a c -t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t w e r e g r o w n f o r 2 h i ng l u c o s e m i n i m a l m e d i u m , a t w h i c h t i m e t h e c e l l sh a d u n d e r g o n e s l i g h t l y more t h a n o n e d i v i s i o n .When t h e s e c e l l s w e r e t h e n p l a t e d on l a c t o s e

V O L . 1 3 5 , 1 9 7 8


3/7

8 7 8 DYKHUIZEN AND HARTLm i n i m a l medium, l a c t o s e k i l l i n g was no l o n g e ro b s e r v e d . T h u s , a f t e r o n e g e n e r a t i o n o f g r o w t hon g l u c o s e , t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e o f t h e c e l l swas s u f f i c i e n t l y a l t e r e d t o p r e v e n t l a c t o s e kil ling.T h i s s u g g e s t s t h a t t h e n o r m a l b a l a n c e a n d i n -t e r a c t i o n o f t h e p a t h w a y s i n v o l v e d i n l a c t o s ec a t a b o l i s m s o m e h o w b e c o m e d i s t o r t e d b yg r o w t h i n a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t .I n a r e l a t e d e x p e r i m e n t , f o u r s e t s o f 7 2 t e s tt u b e s e a c h were i n o c u l a t e d w i t h s u c h a d i l u t i o no f a c h e m o s t a t c u l t u r e t h a t t h e mean n u m b e r o fc e l l s pe r i n o c u l u m was l e s s t h a n 1 . O n e c o n t r o ls e t o f t u b e s ( A ) c o n t a i n e d 1 m l e a c h o f g l u c o s en u t r i e n t b r o t h ; a s e c o n d s e t ( B ) c o n t a i n e d 1 m le a c h o f n u t r i e n t b r o t h p l u s 0 . 5 m l o f 0 . 2 % l a c t o s em i n i m a l m e d i u m ; a t h i r d s e t ( C ) c o n t a i n e d 1 m le a c h o f g l u c o s e n u t r i e n t b r o t h , t o w h i c h wasa d d e d 0 . 5 m l o f 0 . 2 % l a c t o s e minimal medium 1 0m i n a f t e r i n o c u l a t i o n ; a f o u r t h s e t o f t u b e s ( D )c o n t a i n e d l a c t o s e minimal medium a n d s e r v e da s a n o t h e r c o n t r o l . Th e n u m b e r o f t u b e s i ngroup A p r o d u c i n g g r o w t h was t h a t e x p e c t e d ont h e h y p o t h e s i s o f no k i l l i n g . R e l a t i v e t o t h e s e ,s u r v i v a l i n c o n t r o l s e t D was 1 5 % . C o n s e q u e n t l y ,t h e killing i s n o t m e d i a t e d t h r o u g h medium e f -f e c t s , b e c a u s e s i n g l e c e l l s i n t h e t u b e s w i t h 0 . 5m l o f l a c t o s e m i n i m a l medium d i e d : s e t s B a n dC b o t h h a d 3 7 % s u r v i v a l r e l a t i v e t o c o n t r o l A .T h u s , g r o w t h i n r i c h medium o f f e r s s o m e, b u tn o t m u c h , p r o t e c t i o n a g a i n s t l a c t o s e k i l l i n g . T h i ss u g g e s t s t h a t a n u t r i t i o n a l or energy s h o r t a g e i sn o t t h e cause o f t h e k i l l i n g .T h e q u e s t i o n w h e t h e r l a c t o s e a c t u a l l y k i l l st h e c e l l s ca n b e a p p r o a c h e d b y f i n d i n g o u tw h e t h e r c e l L s e x p o s e d t o l a c t o s e ca n b e r e v i v e db y t h e a d d i t i o n o f r i c h m e d i u m , s i n c e more c e l l ss u r v i v e expo sure t o l a c t o s e i n a r i c h mediumt h a n i n m i n i m a l m e d i u m . A c c o r d i n g l y , a s a m p l ef r o m a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t was d i l u t e d a sa b o v e i n t o v a r i o u s m e d i a a n d a d d e d t o a s e r i e so f s m a l l t e s t t u b e s . T a b l e 1 s h o w s t h e number o ft u b e s ( o u t o f 7 2 ) s h o w i n g g r o w t h a f t e r 2 d a y s onm a l t o s e m i n i m a l m e d i u m , l a c t o s e m i n i m a l m e -d i u m , or a b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( D a v i s s a l t s ) .A s s h o w n i n t h e T a b l e , 3 7 / 7 2 or 5 2 % o f t h em a l t o s e - c o n t a i n i n g t u b e s c o n t a i n e d v i a b l e c e l l s ,w h i c h c o r r e s p o n d s t o a mean n u m b e r o f c e l l sper i n o c u l u m o f 0 . 7 3 . O n l y 8 o f 7 2 t u b e s s h o w e dg r o w t h i n l a c t o s e m i n i m a l m e d i u m , so t h e meann u m b e r o f s u r v i v i n g c e l l s per i n o c u l u m i s 0 . 1 2 .T h i s g i v e s a r a t e o f l a c t o s e k i l l i n g o f 0 . 6 1 / 0 . 7 3 or8 4 % . I n s a l t s a l o n e , o f course, t h e r e was nog r o w t h . To d e t e r m i n e w h e t h e r c e l l s e x p o s e d t ol a c t o s e f o r 2 d a y s c o u l d b e r e v i v e d , 1 m l o f Lb r o t h was a d d e d t o e a c h t u b e , a n d t h e n u m b e ro f a d d i t i o n a l c u l t u r e s t h a t grew were r e c o r d e d .A s s h o w n i n T a b l e 1 , no a d d i t i o n a l t u b e s con-taming m a l t o s e showed g r o w t h , w h e r e a s v i r -t u a l l y a l l o f t h e c e l l s m a i n t a i n e d i n s a l t s s u r v i v e d

J . B A C T E R I O L .TABLE 1 . R e v i v a l o f c u l t u r e s e x p o s e d t o l a c t o s e

M e d i u m N o . o f c u l t u r A d d i t i o n a l c u l -s h o w i n g g r o w t h t u r e sM a l t o s e 3 7 0L a c t o s e 8 0L a c t o s e 8 o bS a l t s 0 3 6

N u m b e r o f c u l t u r e s ( o u t o f 7 2 ) t h a t e x h i b i t e dg r o w t h o n t h e v a r i o u s m e d i a s h o w n , a n d t h e a d d i t i o n a ln u m b e r o f c u l t u r e s t h a t g r e w a f t e r 1 m l o f L b r o t h w a sa d d e d a t 4 8 h . C e l l s m a i n t a i n e d f o r 4 8 h i n l a c t o s em i n i m a l m e d i u m c a n n o t b e r e v i v e d w i t h L b r o t h .b T h e r e m a i n i n g 6 4 t u b e s w e r e i n d i v i d u a l l y s p r e a do n t o L p l a t e s .a n d g r e w i n t h e p r e s e n c e o f b r o t h . A s i n d i c a t e di n t h e t h i r d r o w o f T a b l e 1 , n o a d d i t i o n a l g r o w t hw a s o b s e r v e d when a n i d e n t i c a l s e t o f l a c t o s ec u l t u r e s w e r e p l a t e d i n d i v i d u a l l y o n L b r o t hp l a t e s c o n t a i n i n g g l u c o s e t o d i l u t e o u t t h e l a c -t o s e . We c o n c l u d e t h a t 2 d a y s i n l a c t o s e m i n i m a lmedium c a u s e s c e l l d e a t h .T h e r e i s a s t r o n g p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e nt h e a m o u n t o f f - g a l a c t o s i d a s e p e r c e l l a n d t h er a t e o f l a c t o s e - a c c e l e r a t e d d e a t h i n K l e b s i e l l aa e r o g e n e s ( 4 ) . T h i s i s a l s o t r u e f o r l a c t o s e k i l l i n g( f o r e v i d e n c e s e e T a b l e 2 ) . S i n c e t h e a m o u n t o fl a c t o s e p e r m e a s e i s s t r o n g l y c o r r e l a t e d w i t h t h ea m o u n t o f , B - g a l a c t o s i d a s e ( t h e y a r e c o o r d i n a t e l yc o n t r o l l e d ) , t h e r e i s a l s o a s t r o n g c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e a m o u n t o f l a c t o s e p e r m e a s e a n dt h e a m o u n t o f l a c t o s e k i l l i n g .W i l d - t y p e E . c o l i i n a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o -s t a t u s u a l l y b e c o m e s c o n s t i t u t i v e f o r t h e l a co p e r o n a f t e r 3 o r 4 d a y s , o w i n g t o t h e s e l e c t i v ea d v a n t a g e o f c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n s ( D y k h u i z e na n d D a v i e s , u n p u b l i s h e d d a t a ) . B e f o r e t h e c o n -s t i t u t i v e m u t a n t t a k e s o v e r , t h e amount o f , B -g a l a c t o s i d a s e i s l o w ( 2 . 9 u n i t s ) a n d t h e r e i s n ok i l l i n g . A f t e r t h e c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n t a k e so v e r , t h e a m o u n t o f , - g a l a c t o s i d a s e i s h i g h ( 7 . 5t o 1 2 u n i t s ) a n d t h e r a t e o f k i l l i n g i s h i g h ( 8 0 t o9 8 % ) . I f a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m os t a t w a s i n o c u -l a t e d w i t h a l a c t o s e - c o n s t i t u t i v e s t r a i n i n s t e a do f a l a c + s t r a i n , h i g h k i l l i n g r a t e s ( 7 0 % ) w e r es e e n 1 d a y a f t e r i n o c u l a t i o n . By d a y s 6 t o 8 , t h ea v e r a g e k i l l i n g r a t e f o r t h i s s t r a i n w a s 9 3 % .G r o w t h o f E . c o l i i n m e l i b i o s e - l i m i t e d c h e m -o s t a t s l e d t o l a c t o s e k i l l i n g ( T a b l e 2 ) . T h i s i sb e c a u s e l a c c o n s t i t u t i v e s a r e s e l e c t e d i n s u c hc h e m o s t a t s b e c a u s e m e l i b i o s e , a n a - g a l a c t o s i d e ,i s t r a n s p o r t e d i n t o t h e c e l l b y t h e l a c t o s e p e r -m e a s e ( 1 2 ) . I n d e e d , t h e r a t e o f l a c t o s e k i l l i n gp a r a l l e l s t h e i n c r e a s e o f l a c c o n s t i t u t i v e s i n t h ec h e m o s t a t , a s s h o w n i n F i g . 1 . T h a t t h e c o r r e -l a t i o n i s c a u s a l i s i n d i c a t e d b y t h e f a c t t h a t , o nd a y 7 , 8 4 % o f t h e c h e m o s t a t c e l l s w e r e l a c c o n -s t i t u t i v e s , b u t o n l y 7 5 % o f t h e s u r v i v o r s o n l a c -t o s e p l a t e s w e r e .


4/7

LACTOSE KILLING 8 7 9T A B L z 2 . A m o u n t o f k i l l i n g o f v a r i o u s s t r a i n s o n l a c t o s e , g a l a c t o , a n d m e l i b i o s e m i n i m a l m e d i a a s af u n c t i o n o f t h e d e g r e e o f i n d u c t i o n o f t h e l a c t o s e a n d g a l a c t o s e o p e r o n s

U n i t s o f e n z y m e % K i f l i n g o n bS t r a i n z C h e m o s t a t m e d i u m p G a l a c t o s i d - G a a c t o k i - L a c t s e G a l a c t o s e M e l i b i o s e

m n n a s eDD323 G a l a c t o s e 0 0 . 1 2 0 0 1C 2 4 9 L a c t o s e 3 . 4 0 4 0C 2 4 9 G l u c o s e + I P T G 4 . 7 0 3 7 4DD323 G a l a c t o s e + IPTG 5 . 4 0 . 1 1 , 4 9 9 3DD323 G l u c o s e + I P T G 5 . 7 0 . 0 2 5 2 2 0 4DD323 M e l i b i o s e 5 . 9 c 0 . 0 8 6 0 d 8 6DD552 L a c t o s e 7 . 9 0 . 0 8 8 6 3 3 d 8DD323 L a c t o s e 9 . 3 8 2 3 6 d 1 3DD671 G l u c o s e + I P T G 1 3 . 8 9 8 8DD539 L a c t o s e 0 . 0 2 0 . 0 4 4 3 1 4 3aDD323 a n d DD552 a r e w i l d t y p e f o r t h e l a c a n d g a l o p e r o n s ; DD539 i s I a c i F Z 7 w e Y r e b g A + R ; C 2 4 9c a r r i e s a d e l e t i o n o f t h e g a l o p e r o n .b P e r c e n t a g e o f I l l i n g w a s c a l c u l a t e d a s 1 m i n u s t h e p e r c e n t a g e o f s u r v i v a l , w h e r e p e r c e n t a g e o f s u r v i v a l i se x p r e s s e d r e l a t i v e t o s u r v i v a l o n m a l t o s e m i n i m a l m e d i u m . S u r v i v a l o n m a l t o s e m i n i m a l m e d i u m w a s v i r t u a l l y1 0 0 % .' T h e a c t i v i t y i n c r e a s e d f r o m 5 . 0 u n i t s o n d a y 6 t o 6 . 8 o n d a y 8 ; t h e n u m b e r i n t h e t a b l e i s t h e a v e r a g e .d T h e p e r c e n t a g e o f I l l i n g i n c r e a s e d f r o m d a y 6 t o d a y 8 ; t h e n u m b e r s i n t h e t a b l e a r e a v e r a g e s .

K 0 0

7 5 _

i 5 02 5 _

6 7Day

8

F I G . 1 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n d e g r e e o f l a c t o s ek i l i n g and proportion o f c o n s t t i t l a c c e U s i n am e l i b i o s e - l i n t e d c h e m o s t a t . ( 0 ) P e r c e n t a g e o f c e U sk i l l e d w h e n p l a t e d on l a c t o s e m i n i m a l m e d i u m ; ( 0 )p e r c e n t a g e o f c e U s i n t h e c h e m o s t a t that a re c o n s t i -t u t i v e f o r t h e l a c t o s e operon.

A r e t h e survivors o f l a c t o s e kiling g e n e t i c a l l yr e s i s t a n t t o t h e p h e n o m e n o n ? T h i s was t e s t e db y examining two i s o l a t e s t h a t had s u r v i v e d al e v e l o f 8 8 % l a c t o s e k.iling. B o t h s t a i n s werec o n s t i t u t i v e f o r l a c , a n d when grown i n l a c t o s e -l i m i t e d c h e m o s t a t s p r o d u c e d t h e same amounto f l a c t o s e ki l l i n g a s f o u n d i n c o n t r o l s . T h u s ,s u r v i v a l s e e m s t o b e a p h y s i o l o g i c a l p h e n o m e -non, a l t h o u g h we c a n n o t e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l -i t y t h a t t h e r e s i s t a n t i s o l a t e s were g e n e t i c a l l yr e i s t a n t a t t h e o u t s e t b u t u n d e r w e n t r e p l a c e -ment b y s e n s i t i v e r e v e r t a n t s u n d e r s e l e c t i o n i nt h e c h e m o s t a t .M e t h y l - g l y o x a l . S i n c e m e t h y l - g l y o x a l as m a l l d i f f u s i b l e m o l e c u l e , h a s b e e n f o u n d i n t h e

m e d i a o f m u t a n t c e l l s ( L i n 1 ) f e d g l y c e r o L c e l l sf r o m a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t w e r e e x p o s e dt o l a c t o s e f o r 2 h t o s e e i f a n y t o x i c c o m p o u n dc o u l d b e f o u n d i n t h e m e d i a . We f o u n d n o e v i -d e n c e o f a n y s u c h c o m p o u n d . We t h e n made am o r e d i r e c t t e s t o f t h e h y p o t h e s i s t h a t m e t h y l -g l y o x a l c a u i s e d l a c t o s e k i l i n g . S t r a i n s L i n 1 a n dL i n 2 9 2 , w h i c h a r e d i f f e r e n t o n l y i n t h a t t h el a t t e r s t r a i n i s r e s i s t a n t t o 5 0 t o 7 5 nM m e t h y l -g l y o x a L w e r e g r o w n i n l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o -s t a t s . Th e k i l l i n g r a t e s f o r L i n 1 w e r e 9 4 % o nl a c t o s e a n d 9 4 % o n m e t h y l - g l y o x a l ; w h e r e a s , t h ek i l l i n g r a t e s f o r L i n 2 9 2 w e r e 9 3 % o n l a c t o s e a n d3 0 % o n m e t h y l - g l y o x a l . T h u s , w h i l e t h e s t r a i n sr e t a i n t h e i r d i f f e r e n t s e n s i t i v i t i e s t o m e t h y l -g l y o x a l , t h e t w o s t r a i n s a r e e q u a l l y s e n s i t i v e t ol a c t o s e . T h i s s h o w s m e t h y l - g l y o x a l i s n o t t h ec a u s e o f l a c t o s e k i l l i n g .

U D P - g a l a c t o e . N e x t we c o n s i d e r e d t h e h y -p o t h e s i s t h a t t h e m e t a b o l i s m o f g a l a c t o s e i s t h ec a u s e o f l a c t o s e k i l l i n g . A p r i m e s u s p e c t f o r t h ek i l l i n g w o u l d t h e n b e U D P - g a l a c t o s e , a h i g h l yt o x i c i n t e r m e d i a t e f o r m e d i n g a l a c t o s e m e t a b o -l i s m . C e l l s d e f e c t i v e i n g a l E , t h e g e n e c o d i n g f o rt h e e n z y m e w h o s e s u b s t r a t e i s U D P - g a l a c t o s e ,d i e i n t h e p r e s e n c e o f g a l a c t o s e d u e t o a c c u m u -l a t i o n o f U D P - g a l a c t o s e . H o w e v e r , c e l l s g r o w ni n g a l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t s s u r v i v e whenp l a t e d o n g a l a c t o s e . I f U D P - g a l a c t o s e o r a n yo t h e r m e t a b o l i t e o f g a l a c t o s e i s i n v o l v e d i n l a c -t o s e k i l l i n g , t h i s m u s t b e d u e t o a n i n t e r a c t i o nb e t w e e n t h e l a c t o s e a n d g a l a c t o s e o p e r o n s . T h i si n t e r a c t i o n c a n b e a s s e s s e d b y e x a m i n i n g t h ec o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e a m o u n t o f l a c t o s e k i l l i n ga n d t h e d e g r e e o f i n d uc t i on o f t h e l a c t o s e a n dg a l a c t o s e o p e r o n s .

V O L . 1 3 5 , 1 9 7 8


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880 DYKHUIZEN AND HARTLI n d u c t i o n o f t h e l a c t o s e a n d g a l a c t o s e operon s

ca n b e u n c o u p l e d b y u s i n g c o m b i n a t i o n s o f i s o -p r o p y l - , - D - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ( I P T G ) ( ag r a t u i t o u s i n d u c e r o f t h e l a c t o s e o p ero n w h i c hi s e f f e c t i v e a t c o n c e n t r a t i o n s g i v i n g o n l y m i n i m a li n d u c t i o n o f t h e g a l a c t o s e o p e r o n ) , g a l a c t o s ei t s e l f , w h i c h i n d u c e s t h e g a l a c t o s e operon b u tn o t t h e l a c t o s e operon, a n d g l u c o s e , w h i c hs t r o n g l y represses t h e g a l a c t o s e operon. T a b l e 2s h o w s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l e v e l s o f i n d u c -t i o n o f t h e l a c t o s e a n d g a l a c t o s e operons a n d t h eamount o f l a c t o s e k i l l i n g . Th e amount o f k i l l i n gp a r a l l e l s t h e i n d u c t i o n o f t h e l a c t o s e operon b u ti s u n r e l a t e d t o t h e l e v e l o f i n d u c t i o n o f t h eg a l a c t o s e operon.A f u r t h e r e x p e r i m e n t was d o n e t o s h o w t h a tU D P - g a l a c t o s e c o u l d n o t cause l a c t o s e k i l l i n g .S t r a i n W 3 1 0 2 , w h i c h c a r r i e s a p o i n t m u t a t i o n o fgalK, t h e gene w h i c h c o d e s f o r t h e f i r s t e n z y m ei n t h e g a l a c t o s e c a t a b o l i s m p a t h w a y , was t e s t e df o r l a c t o s e k i l l i n g a n d f o u n d t o b e very s e n s i t i v et o l a c t o s e , e v e n t h o u g h no U D P - g a l a c t o s e c o u l db e p r o d u c e d .Galacts. T u r n i n g now t o g a l a c t o s e i t s e l f ast h e p o t e n t i a l b a s i s o f l a c t o s e k i l l i n g , i t m i g h t b ea r g u e d t h a t t h e g r e a t e r t h e a c t i v i t y o f t h e l a c t o s eoperon, t h e g r e a t e r t h e i n t r a c e l l u l a r a c c u m u l a -t i o n o f g a l a c t o s e . T h i s p o s t u l a t e d o v e r l o a d o fg a l a c t o s e c o u l d cause t h e s o r t o f c o r r e l a t i o ns h o w n i n F i g . 1 .T h e r e are t w o reas ons f o r e x c l u d i n g g a l a c t o s ea s t h e cause o f l a c t o s e k i l l i n g . F i r s t , a s shown i nT a b l e 2 , we d i d n o t f i n d t h e n e g a t i v e c o r r e l a t i o ne x p e c t e d b e t w e e n t h e a c t i v i t y o f g a l a c t o s e k i -n a s e a n d amount o f l a c t o s e k i l l i n g . Were i n t r a -c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n o f g a l a c t o s e r e s p o n s i b l ef o r k i l l i n g , a n e g a t i v e c o r r e l a t i o n w o u l d certaiyb e e x p e c t e d , as l o w e r l e v e l s o f i n d uc t i on o f t h eg a l a c t o s e operon w o u l d l e a d t o h i g h e r a cc u m u -l a t e d l e v e l s o f g a l a c t o s e .A s e c o n d reason f o r e x c l u d i n g g a l a c t o s e ac-c u m u l a t i o n a s t h e cause o f l a c t o s e killing d e r i v e df r o m s t u d i e s o f s t r a i n D D 5 3 9 . T h i s s t r a i n c a r r i e da d e l e t i o n o f l a c Z b u t i t c o n s t i t u t i v e l y p r o d u c e sa n o t h e r f l - g a l a c t o s i d a s e f r o m t h e e b g A + g e n e .Th e a c t i v i t y o f t h i s , 8 - g a l a c t o s i d a s e i s o n l y a b o u t1 % o f t h a t o f t h e l a c Z gene p r o d u c t ( 1 0 ) . I ns t r a i n D D 5 3 9 , w h i c h p r o d u c e s t h e l a c t o s e p e r -mease c o n s t i t u t i v e l y , o n e e x p e c t s an a c c u m u l a -t i o n o f l a c t o s e b u t n o t a n a c c u m u l a t i o n o f g a l a c -t o s e . H e n c e , i n t h e g a l a c t o s e a c c u m u l a t i o n h y -p o t h e s i s , l i t t l e o r no l a c t o s e k i l l i n g i s e x p e c t e d .Th e o b s e r v e d a mo un t o f k i l l i n g was, h o w e v e r ,4 3 % . T h i s r e s u l t a l s o s h o w s t h a t l a c t o s e k i l l i n gi s n o t d e p e n d e n t ont h e a c t i v i t y o f t h e l a c Z gene.L a c t o s e . Th e a c c u m u l a t i o n o f l a c t o s e c o u l dn o t b e t h e cau s e o f l a c t o s e ki l l i n g b e c a u s e , B -g a l a c t o s i d a s e i s so much more a c t i v e t h a n t h ep er m e a s e t h a t very l i t t l e l a c t o s e w i l l a c c u m u l a t e

J . BACERIOL.w i t h i n t h e c e l l . Th e amount o f l a c t o s e killing i ns t r a i n DD539 a l s o serves t o eliminate l a c t o s ei t s e l f as t h e cause o f l a c t o s e kil ling. O w i n g t o i t sl o w l e v e l o f , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y , t h i s s t r a i ns h o u l d a c c u m u l a t e more l a c t o s e t h a n t h e w i l d -t y p e s t r a i n s ( D D 3 2 3 ) a n d t h u s e x h i b i t h i g h e rl e v e l s o f l a c t o s e k i l l i n g t h a n t h e s e . T h e a c t u a ll e v e l o f l a c t o s e k i l l i n g i s c o n s i d e r a b l y l e s s t h a ni n t h e s e w i l d - t y p e s t r a i n s .Th e u p t a k e o f l a c t o s e . T a k e n t o g e t h e r , t h ef o r e g o i n g r e s u l t s eliminate m e t h y l - g l y o x a l ,U D P - g a l a c t o s e , galactose a c c u m u l a t i o n , a n dl a c t o s e accumu l ation a s p o s s i b l e c a u s e s o f l a c -t o s e killing. T h a t l e a v e s e n t r y o f l a c t o s e i n t o t h ec e l l s t o b e c o n s i d e r e d , a n d we now p r o v i d e e v i -d e n c e t h a t l a c t o s e p e r m e a t i o n i s i n d e e d t h ecause o f t h e p h e n o m e n o n . I f a s t r a i n w h i c h h a sa d e l e t e d , B - g a l a c t o s i d a s e s h o w s l a c t o s e k i l l i n g ,t h e n n o s t e p or p r o d u c t i n t h e c a t a b o l i s m o fl a c t o s e ca n b e t h e cau s e o f l a c t o s e killing, l e a v i n go n l y e n t r y o r u p t a k e a s i t s b a s i s . T h i s i d e a wast e s t e d u s i n g s t r a i n D D 6 5 4 . I n t h i s s t r a i n o n l y ap o r t i o n o f t h e , 6 - g a l a c t o s i d a s e g e n e i s d e l e t e d .T h e r e s t o f t h e l a c t o s e o p e r o n i s l e f t i n t a c t .S t r a i n s DD664 a n d D D 6 5 5 , t h e l a c + c o n t r o l ,were grown i n m e l i b i o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t s a n dt e s t e d on d a y 8 a f t e r i n o c u l a t i o n ( T a b l e 3 ) .DD654 s h o w e d n e a r l y 5 0 % k i l l i n g . T h i s c a n n o tb e b e c a u s e t h e c e l l s were u n a b l e t o grow f o r 2d a y s . When c e l l s were p l a t e d on agar w i t h o u ta n y s u g a r , i n c u b a t e d f o r 2 d a y s , a n d t h e n grown,t h e r e was o n l y 5% k i l l i n g . T h e l o w e r p e r c e n t a g eo f l a c t o s e k i l l i n g i n t h e d e l e t i o n t h a n t h e c o n t r o li s e x p l a i n e d b y t h e l o w e r p e r c e n t a g e o f c o n s t i -t u t i v e s i n t h e f o r n e r c u l t u r e t h a n t h e l a t t e r ( s e eF i g . 1 ) .G a l a c t o s e d e l e t i o n . S t r a i n C 2 4 9 , w h i c h car-r i e s a d e l e t i o n o f t h e w h o l e g a l a c t o s e oper on,d o e s n o t e x h i b i t l a c t o s e k i l l n g w h e n grown i n al a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t . I n c i d e n t a l l y , t h ee q u i l i b r i u m c e l l d e n s i t i e s o f C 2 4 9 are o n l y o n e -h a l f t h e d e n s i t i e s o f w i l d t y p e on t h e samec o n c e n t r a t i o n o f l a c t o s e , s i n c e C 2 4 9 i s u n a b l e t ou s e t h e g a l a c t o s e h a l f o f l a c t o s e . T h e l a c k o fk i l l i n g i n C 2 4 9 i s expable. T h e a mo un t o f /-g a l a c t o s i d a s e i n t h e s e c e l l s i s l o w t h a t l i t t l eki l l i n g i s e x p e c t e d ( T a b l e 2 ) . Th e C 2 4 9 c e l l s ,w h i c h h a d grown i n l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t sf o r 8 d a y s , were c h e c k e d f o r l a c t o s e c o n s t i t u t i v eT A B L E 3 . Amount o f k i l l i n g o n v a r i o u s s u g a r s i n a, 9 - g a l a c t o s i d a s e d e k t i o n s t r a i n ( D D 6 5 4 ) a n d a l a c +c o n t r o l ( D D 6 5 5 )

% K i l l i n g o nStrain ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ %o n -s t r a i n L a c t o s e G a l a c - M e l i b i - No s t i t u t i v etoLeteugar

DD664 4 7 4 4 2 5 6 2DD666 8 7 4 3 1 2 1 4 9 2


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LACTOSE KILLING 8 8 1m u t a t i o n s . O u t o f t h e 4 0 0 t e s t e d , n o c o n s t i t u t i v e sw e r e f o u n d . T h e l a c t o s e o p e r o n i n s t r a i n C 2 4 9 i sn o r m a l b e c a u s e s t r a i n D D 5 5 2 , w h i c h i s a g a l +b i o + t r a n s d u c t a n t o f C 2 4 9 , b e c a m e l a c t o s e c o n -s t i t u t i v e a n d s h o w e d n o r m a l a m o u n t s o f l a c t o s ek i l l i n g i n l a c t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t s . A l s o , t h eg a l a c t o s e d e l e t i o n i s n o t b l o c k i n g l a c t o s e k i l l i n gb e c a u s e C 2 4 9 , g r o w n i n g l u c o s e p l u s I P T G ,s h o w e d n o r m a l k i l l i n g ( T a b l e 2 ) . C o n s e q u e n t l y ,t h e p r e s e n c e o f t h e u n u s a b l e g a l a c t o s e s e e m s t ob l o c k t h e s e l e c t i o n o f c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n s .T h i s c o u l d b e b e c a u s e t h e u s e l e s s g a l a c t o s e i nt h e c e l l i s h a r m f u l a n d a b a l a n c e m u s t b er e a c h e d b e t w e e n l a c t o s e u p t a k e a n d g a l a c t o s ed i s p o s a l .O n e c h e m o s t a t c u l t u r e o f C 2 4 9 s u p p o r t e d t h eh y p o t h e s i s t h a t e n t r y o f l a c t o s e i s t h e c a u s e o fl a c t o s e k i l l i n g . T h i s c u l t u r e w a s g r o w n i n l a c t o s e -l i m i t e d m e d i u m , g a v e n o l a c t o s e k i l l i n g ( t h e r a t i oo f t h e n u m b e r o f c e l l s o n l a c t o s e p l a t e s t o t h en u m b e r o n m a l t o s e p l a t e s w a s 1 . 0 3 ) , a n d s h o w e da l e v e l o f , - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y ( 3 . 9 u n i t s ) f o rw h i c h 1 5 % k i l l i n g w a s e x p e c t e d . I t w a s f o u n dt h a t t h e a c t i v i t y o f t h e l a c t o s e p e r m e a s e o f c e l L sf r o m t h i s c h e m o s t a t w a s o n e - h a l f t h a t o f c e l L sf r o m t h e C 2 4 9 s t o c k c u l t u r e o r f r o m o t h e r c h e m -o s t a t s , w h e r e a s t h e a c t i v i t y o f f - g a l a c t o s i d a s e i na l l t h e s e c e l l s w a s t h e s a m e when g r o w n i ns h a k e r c u l t u r e w i t h I P T G . T h u s a g e n e t i cc h a n g e w h i c h l o w e r s t h e a m o u n t o f l a c t o s e p e r -m e a s e p r o t e c t s a g a i n s t l a c t o s e k i l l i n g .

DISCUSSIONT h e p h e n o m e n o n o f l a c t o s e k i l l i n g s e e m s t ob e u n i q u e . E . c o l i c e l l s g r o w n i n c h e m o s t a t sl i m i t e d f o r o t h e r s u g a r s e x h i b i t n o s i m i l a r s e n -s i t i v i t y . H o w e v e r , s i n c e n o t a l l s u g a r s w e r et e s t e d , g l y c e r o l o r s o m e o t h e r s u g a r m ay p r o d u c ea s i m i l a r s e n s i t i v i t y .I n t h i s p a p e r we h a v e e l i m i n a t e d t h e p o s s i b i l -i t y t h a n a n y c a t a b o l i c p r o d u c t o f l a c t o s e c a u s e sl a c t o s e k i l l i n g . Th e t h i o g a l a c t o s i d e t r a n s a c e t y -

l a s e , t h e l a c A e n z y m e , c a n n o t b e t h e c a u s e o fl a c t o s e k i l l i n g b e c a u s e t h i s t r a n s a c e t y l a s e w i l ln o t a c c e p t l a c t o s e a s a s u b s t r a t e ( 1 ) . Th e f i -g a l a c t o s i d a s e c a n n o t b e t h e c a us e o f l a c t o s e k i l l -i n g , b e c a us e l a c Z c e l l s s t i l l s h o w l a c t o s e k i l l i n g .T h e p r e s e n c e o f l a c t o s e i n t h e c e l l i s n o t t h ec a u s e o f t h e k i l l i n g , b e c a u s e c e l l s g r o w n i n l a c -t o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t s d i e o n g a l a c t o s e . Wep r o p o s e t h a t t h e t r a n s p o r t o f l a c t o s e a c r o s s t h ec e l l membrane i s t h e b a s i s o f l a c t o s e k i l l i n g .T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t h a t t h e m i s f i n c t i o n i s a ts i t e I o f t h e l a c t o s e p e r m e a s e . Th e l a c t o s e p e r -m e a s e ( t h e s o - c a l l e d M p r o t e i n f r o m t h e l a c Yg e n e ) i s a l a r g e p r o t e i n o f a b o u t 3 0 , 0 0 0 m o l e c u l a rw e i g h t ( 9 ) . T h e r e a p p e a r t o b e t w o p r i n c i p a ls i t e s o f u p t a k e , s i t e I , w h i c h t a k e s u p l a c t o s e a n dg a l a c t o s e , a n d s i t e I I , w h i c h t a k e s u p t h e a -

g a l a c t o s i d e , m e l i b i o s e ( 1 5 ) . I f s i t e I w e r e i n v o l v e di n l a c t o s e k i l l i n g b u t s i t e I I w e r e n o t , t h e n o n ew o u l d e x p e c t c o n s i d e r a b l e g a l a c t o s e k i l l i n gw h e n e v e r g a l a c t o s e i s p r i m a r i l y t r a n s p o r t e d b yt h e l a c t o s e p e r m e a s e , b u t n o t much m e l i b i o s ek i l l i n g . T h i s i s w h a t w a s s e e n ( T a b l e s 2 a n d 3 ) .Th e r a t e o f m e l i b i o s e k i l l i n g was g e n e r a l l y l o w ,o n t h e o r d e r o f 1 / 5 t o 1 / 1 0 t h e r a t e o f l a c t o s ek i l l i n g . On t h e o t h e r h a n d , t h e amount o f g a l a c -t o s e k i l l i n g c a n b e s u b s t a n t i a l , u p t o 1 / 2 t h e r a t eo f l a c t o s e k i l l i n g . T h e r e i s , h o w e v e r , no g a l a c t o s ek i l l i n g i n t h e a b s e n c e o f i n d u c t i o n o f t h e l a co p e r o n .O u r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f l a c -t o s e k i l l i n g i s a t v a r i a n c e w i t h t h a t o f H o r u i c h ie t a l . ( 1 3 ) . T h e y c o n c l u d e d t h a t t h e a c t i v i t y o f, - g a l a c t o s i d a s e was a p r i m e f a c t o r i n t h e k i l l i n gb e c a u s e I P T G , a n o n - m e t a b o l i z a b l e , B - g a l a c t o -s i d e , w h i c h i s t r a n s p o r t e d b y s i t e I o f t h e l a c t o s ep e r m e a s e , d i d n o t s t o p g r o w t h . T h e y g r e w t h e i rh y p e r - i n d u c e d c e l l s o n s o d i u m l a c t a t e i n s h a k e rc u l t u r e a n d f o u n d t h a t a d d i t i o n o f l a c t o s es t o p p e d g r o w t h , w h e r e a s a d d i t i o n o f t h e sa mea m o u n t o f IPTG o n l y s l o w e d t h e g r o w t h r a t e b y2 0 % . B u t v o n H o f s t e n ( 2 4 ) , wh o f o u n d t h a t c u l -t u r e s o f l a c t o s e c o n s t i t u t i v e m u t a n t s g r o w i n g onl a c t a t e w e r e n o t s e n s i t i v e t o l a c t o s e , f o u n d t h a ta d d i t i o n o f l a c t o s e s t o p p e d g r o w t h o f l a c t o s e -c o n s t i t u t i v e c e l l s g r o w i n g on s u c c i n a t e w h i l e a d -d i t i o n o f g a l a c t o s e o n l y s l o w e d d o w n t h e g r o w t hr a t e o f t h e c u l t u r e . Th e p e r c e n t a g e o f d e c r e a s eo f t h e g r o w t h r a t e i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n ga m o u n t s o f g a l a c t o s e . T h u s , w h i l e t h e r e s u l t o fH o r u i c h i e t a l . ( 1 3 ) i s d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t i nt e r m s o f t h e r e s u l t s o f t h e e x p e r i m e n t s o f t h i sp a p e r , i t s e e m s t h a t IPTG w i l l b e h a v e l i k e g a -l a c t o s e i n t h a t i t w i l l g i v e a m o u n t s o f k i l l i n g l e s st h a n l a c t o s e b u t s t i l l i f i c a n t .A l t h o u g h o u r r e s u l t s s h o w t h a t l a c t o s e - s e n s i -t i v e c e l L s m a i n t a i n e d i n l a c t o s e f o r 2 d a y s c a n n o tb e r e v i v e d , d e a t h i s b y no me a n s i n s t a n t a n e o u s .v o n H o f s t e n ( 2 4 ) a n d H o r u i c h i e t a l . ( 1 3 ) h a v es h o w n t h a t s u c h c e l l s c a n b e r e v i v e d f o r u p t o 6h a n d t h a t d u r i n g t h i s t i m e a c o n s i d e r a b l eamount o f U V - a b s o r b i n g m a t e r i a l i s e x c r e t e df r o m t h e c e l l s . I n d e e d , a n u m b e r o f f a c t o r s c a na l t e r t h e amount o r t i m i n g o f l a c t o s e - i n d u c e dd e a t h . C a l c o t t e t a l . ( 2 ) h a v e f o u n d t h a t m a g -n e s i u m i o n s ( 1 m M) o r t h e o p h y l l i n ( 0 . 5 m M ) ,w h i c h p r e v e n t s b r e a k d o w n o f c y c l i c A M P ,g r e a t l y d e c r e a s e t h e r a t e o f l a c t o s e k i l l i n g a s s o -c i a t e d w i t h s u b s t r a t e - a c c e l e r a t e d d e a t h i n A .a e r o g e n e s . C e l L s s t a r v e d i n l a c t o s e medium seemt o e x t r u d e c y c l i c AMP i n t o t h e medium event h o u g h t h e i n t e r n a l c o n c e n t r a t i o n o f c y c l i c AMPi s l o w a n d t h e c e l l s a r e p r o d u c i n g c y c l i c AMP.H o w e v e r , t h i s a l s o h a p p e n s when g l u c o s e i sa d d e d t o s t a r v e d c e l l s g r o w n o n g l u c o s e ( 2 0 ) a n dt h e r e i s n o s i m i l a r k i l i n g w i t h g l u c o s e . H i g h

V O L . 1 3 5 , 1 9 7 8


7/7

8 8 2 DYKHUIZEN AND HARThe x t e r n a l c o n c e n t r a t i o n s o f c y c l i c AMP ( 5 m M)c a n r e t a r d l a c t o s e - a c c e l e r a t e d d e a t h ( 2 ) . T h em e c h a n i s m o f t h e e f f e c t o f c y c l i c AMP i s n o tk n o w n , b u t i t m ay b e d u e t o a r e g u l a t o r y e f f e c to n t h e l a c t o s e p e r m e a s e .

U n t i l l a c t o s e k i l l i n g i s b e t t e r u n d e r s t o o d , a n ye x p l a n a t i o n o f t h e p h y s i o l o g i c a l m e c h a n i s m w i l lb e s p e c u l a t i v e . H o w e v e r , we w i l l p r o p o s e a p o s -s i b l e m e c h a n i s m , w h i c h i s t h a t t h e r a p i d u p t a k eo f s u g a r s c a u s e s c o l l a p s e o f t h e m e m b r a n e p o -t e n t i a l . L a c t o s e u p t a k e i s d r i v e n b y a p r o t o ng r a d i e n t , a n d p a s s i v e a c c u m u l a t i o n o f w e a ka c i d s r e f l e c t s t h e p r e s e n c e o f t h i s g r a d i e n t ( 1 4 ) .K a b a c k ( 1 4 ) r e p o r t s t h a t w h e n l a c t o s e i s a d d e dt o m e m b r a n e v e s i c l e s 5 0 % o f t h e a c c u m u l a t e da c e t a t e i s r e l e a s e d e v e n t h o u g h t h e r e i s a 6 0 %i n h i b i t i o n o f t h e l a c t o s e p e r m e a s e i n t h i s s y s t e m .T h i s i m p l i e s t h a t t h e u p t a k e o f l a c t o s e c a n r a p -i d l y d e p l e t e t h e p r o t o n g r a d i e n t . C o n s e q u e n t l y ,r a p i d a c c u m u l a t i o n o f l a c t o s e i n f u l l y i n d u c e dc e l l s f r o m t h e c h e m o s t a t t h a t a r e p h y s i o l o g i c a l l ya d a p t e d t o l o w s u g a r l e v e l s c o u l d c o l l a p s e t h ep r o t o n g r a d i e n t a n d p r e v e n t a n y r e e s t a b l i s h -ment o f t h e g r a d i e n t .

ACKNOWLEDGMENTSO u r t h a n k s t o S u s a n N y e f o r t e c h n i c a l h e l p a n d t o a n o n y -mous r e v i e w e r s f o r s u g g e s t i o n s w h i c h c o n s i d e r a b l y i m p r o v e dt h i s p a p e r .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e g r a n tG M - 2 1 6 2 3 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a lS c i e n c e s . D . H . i s t h e r e c i p i e n t o f P u b l i c H e a l t h S e r v i c e R e -s e a r c h C a r e e r A w a r d G M - 0 0 0 2 3 0 1 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t eo f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s .

LITERATURE CITED1 . A n d r e w s , K . J . , a n d E . C . C . L i n . 1 9 7 6 . T h i o g a l a c t o s i d et r a n a c e t y l a s e o f t h e l a c t o s e o p e r o n a s a n e n z y m e f o rd e t o x i f i c a t i o n . J . B a c t e r i o l . 1 2 8 : 5 1 0 - 5 1 3 .2 . C a l c o t t , P . H . , W. M o n t a g u e , and J . R . P o s t g a t e . 1 9 7 2 .T h e l e v e l s o f c y c l i c AM P d u r i n g s u b s t r a t e - a c c e l e r a t e dd e a t h . J . G e n . M i c r o b i o l . 7 3 : 1 9 7 - 2 0 0 .3 . C a l c o t t , P . H . , and J . R . P o s t g a t e . 1 9 7 2 . S u b s t r a t e -a c c e l e r a t e d d e a t h i n K i e b s i e U a a e r o g e n e s . J . G e n . M i -c r o b i o l . 7 0 : 1 1 5 - 1 2 2 .4 . C a l c o t t , P . H . , and J . R . P o s t g a t e . 1 9 7 4 . T h e e f f e c t s o f, B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y a n d c y c l i c AMP o n l a c t o s e - a c -c e l e r a t e d d e a t h . J . G e n . M i c r o b i o l . 8 5 : 8 6 - 9 0 .5 . C e c h i n i , G . , a n d A . L K o c h . 1 9 7 5 . E f f e c t o f u n c o u p l e r so n d o w n h i l l f t - g a l a c t o s i d e t r a n s p o r t i n e n e r g y d e p l e t e dc e l l s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 2 3 : 1 8 7 - 1 9 5 .6 . C l e a r y , P . P . , A . C a m p b e l l , and R . C h a n g . 1 9 7 2 . Lo -c a t i o n o f p r o m o t e r a n d o p e r a t o r s i t e s i n t h e b i o t i n g e n ec l u s t e r . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 6 9 : 2 2 1 9 - 2 2 2 3 .7 . D y k h u i z e n , D . 1 9 7 8 . S e l e c t i o n f o r t r y p t o p h a n a u x o t r o p h s

o f E s c h e r i c h i a c o l i i n g l u c o s e - l i m i t e d c h e m o s t a t s a s at e s t o f t h e e n e r g y c o n s e r v a t i o n h y p o t h e s i s o f e v o l u t i o n .E v o l u t i o n 3 2 : 1 2 5 - 1 5 0 .8 . F r e e d b e r g , W. B . , W. S . K i s t l e r , and E . C . C . Ln1 9 7 1 . L A t h a l s y n t h e s i s o f m e t h y l - g l y o x a l b y E s w h e r i c h i ac o h d u r i n g u n r e g u l a t e d g l y c e r o l m e t a b o l i s m J . B a c t e -r i o l . 1 0 8 : 1 3 7 - 1 4 4 .9 . G u t h r i e , P . , and A . B . P a r d e e . 1 9 6 9 . D i s c u s s i o n i n as y m p o s i u m o n m e m b r a n e p r o t e i n s . J . G e n . P h y s i o l .5 4 : 9 3 6 .1 0 . H a l l , B . G . , a n d D . L H a r t L 1 9 7 4 . R e g u l a t i o n o f n e w l ye v o l v e d e n z y m e s . I . S e l e c t i o n o f a n o v e l l a c t a s e r e g u -l a t e d b y l a c t o s e i n E s c h e r i c h i a c o l i . G e n e t i c s7 6 : 3 9 1 - 4 0 0 .1 1 . H e i n r i c h , M . R . , a n d S . M . H o w a r d . 1 9 6 6 . G a l a c t o k i -n a s e . M e t h o d s E n z y m o l . 9 : 4 0 7 - 4 1 2 .1 2 . Hohung, M L , and M . S c h w a r t z . 1 9 7 1 . M u t a t i o n s a l l o w -i n g g r o w t h o n m a l t os e o f E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 s t r a i n sw i t h a d e l e t e d malT g e n e . M o l . G e n . G e n e t .1 1 2 : 1 1 7 - 1 3 2 .1 3 . H o r u i c h i , T . , J . T o m i z a w a , a n d A . N o v i c k . 1 9 6 2 . I s o -l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f b a c t e r i a c a p a b l e o f h i g h r a t e so f , - g a l a c t o s i d a s e s y n t h e s i s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a5 5 : 1 5 2 - 1 6 3 .1 4 . K a b a c k , H . R . 1 9 7 7 . M o l e c u l a r b i o l o g y a n d e n e r g e t i c s o fm e m b r a n e t r a n p o r t , p . 5 9 8 - 6 2 5 . I n G . S i m e n z a a n d E .C a r a f o l i ( e d . ) , B i o c h e m i s t r y o f m e m b r a n e t a n s p o r t ;F . E . B . S . S y m p o s i u m n o . 4 2 . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n .1 5 . K e n n e d y , E . P . 1 9 7 0 . T h e l a c t o s e p e r m e a s e s y s t e m o fE s c h e r i c h i a c o l i , p . 4 9 - 9 2 . I n J . R . B e c k w i t h a n d D .Z i p s e r ( e d . ) , T h e l a c t o s e o p e r o n . C o l d S p r i n g H a r b o rL a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .1 6 . M i l l e r , J . H . 1 9 7 4 . E x p e r i m e n t s i n m o l e c u l a r g e n e t i c s ,2 n d e d . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n gH a r b o r , N . Y .1 7 . P a r d e e , A . B . , F . J a c o b , a n d J . M o n o d . 1 9 5 9 . Th eg e n e t i c c o n t r o l a n d c y t o p l a s m i c e x p r e a i o n o f i n d u c i b i l -i t y i n t h e s y n t h e s i s o f , B - g a l a c t o s i d a s e b y E . c o l i . J . M o l .B i o l . 1 : 1 6 5 - 1 7 8 .1 8 . P o a t g a t e , J . R . , a n d J . R . H u n t e r . 1 9 6 2 . T h e s u r v i v a l o fs t a r v e d b a c t e r i a . J . G e n . M i c r o b i o l . 2 9 : 2 3 3 - 2 6 3 .1 9 . P o e g a t e , J . R . , and J . R . H u n t e r . 1 9 6 4 . A c c e l e r a t e dd e a t h o f A e r o b a c t e r a e r o g e n e s s t a r v e d i n t h e p r e s e n c eo f g r o w t h - l i m i t i n g s u b s t r a t e s . J . G e n . M i c r o b i o l .3 4 : 4 5 9 - 4 7 3 .2 0 . R i c k e n b e r g , H . V . 1 9 7 4 . C y c l i c AMP i n p r o k a r y o t e s .A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 2 8 : 3 5 3 - 3 6 9 .2 1 . R i c k e n b e r g , H . V . , G . N . C o h e n , G . B u t t i n , a n m d J .M o n o d . 1 9 5 6 . L a g a l a c t o s i d e p e r m e a s e d ' E s c h e r i c h i ac o l i . A n n . I n s t . P a s t e u r 9 1 : 8 2 9 8 5 7 .2 2 . S t r a n g e , R . E . , a n d F . A . D a r k . 1 9 6 6 . S u b s t r a t e - a c c e l -e r a t e d d e a t h o f A e r o b a c t e r a e r o g e n e s . J . G e n . M i c r o -b i o l . 3 9 : 2 1 5 - 2 2 8 .2 3 . S t r a n g e , R . E . , a n d J . R . H u n t e r . 1 9 6 6 . S u b s t r a t e - a c -c e l e r a t e d d e a t h o f n i t r o g e n - l i m i t e d b a c t e r i a . J . G e n .M i c r o b i o l . 4 4 : 2 5 5 - 2 6 2 .2 4 . vo n H o f s t e n , B . 1 9 6 1 . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f g a l a c t o -s i d e s o n t h e g r o w t h o f E s c h e r i c h i a c o & l . B i o c h i m . B i o -p h y s . A c t a 4 8 : 1 6 4 - 1 7 1 .2 5 . Z w a i g , N . , and E . D i e g u e z . 1 9 7 0 . B a c t e r i a l p r o d u c to b t a i n e d f r o m a m u t a n t o f E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 4 0 : 1 4 1 5 - 1 4 2 2 .

J . B A C T E R I O L .

dykhuizen, lactose lysis in e coli, 1978

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