Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

1065. Inmunología Aplicada

Enseñanza Experimental

Estimulación de Linfocitos Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celulary Cultivo Celular

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Material• 1 estuche de disección• 6 agujas hipodérmicas• 2 vasos de precipitado de 150 mL• 1 tubo de cultivo estéril de 15 mL • 1 micropipeta (200-1000 L)• 1 micropipeta (20-200 L)• 1 micropipeta (2-20 L)• Puntas para micropipetas estériles• 1 piseta• 1 gradilla• 1 tubo para microcentrífuga estéril• 1 microplaca para cultivo con 24 pozos• 1 cámara de Neubauer

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

• 1 jeringa estéril de 5 mL• 1 caja Petri estéril• 3 pipetas estériles de 5 mL• 2 tubos de 13x100 estériles con tapón de gasa• 10 gasas estériles

Material

NOTA. Material por equipo.NOTA. Material por equipo.

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Reactivos

• Medio RPMI sin suplementar

• Medio RPMI suplementado (piruvato, estreptomicina/penicilina, suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales, glutamina)

• Etanol al 70%

• Azul tripano al 0.04%

• Concanavalina A en concentración óptima

• Éter etílico

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Material biológico

• 1 ratón de la cepa BALB/c de 25 días de edad

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Obtención de células esplénicas

Anestesiar al ratón en una cámara con éter

Obtener el bazo quirúrgicamente y

colocarlo en la caja Petri

Perfundir gota a gota con 5 mL de medio

RPMI no suplementado

Transferir la suspensión celular al

tubo de 15 mL con tapón

Centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos (lavar 2 veces en las mismas condiciones)

Resuspender el botón celular en 5 mL de RPMI

suplementado

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Cuenta de linfocitosRealizar una dilución 1:20 de la suspensión de linfocitos con azul tripano en un tubo para

microcentrífuga

Tomar 10 L de la dilución anterior y llenar la cámara de

Neubauer

Realizar el conteo de linfocitos viables en el microscopio a un

aumento de 40X

Ajustar la suspensión de linfocitos con RPMI

suplementado a 106 cel/mL

Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas Laboratorio de Investigación en Inmunología

Cultivo celular

Llenar 3 pozos con 500 L de la suspensión de linfocitos

ajustada

Adicionar 500 L de Concanavalina-A 2.5 g/mL

LINFOCITOS ESTIMULADOS

Llenar 3 pozos con 500 L de la suspensión de linfocitos

ajustada

Adicionar 500 L de RPMI suplementado

LINFOCITOS CONTROL

Incubar la microplaca a 37°C con atmósfera de CO2 al 5%

durante 24 h

Revisar el cultivo en un microscopio invertido con

contraste de fases