Dr. Oscar Alonso Luna1

Biologia Molecular en OncologiaParte 1

Temas

• Genes, Genómica y Cáncer – Introducción

• Tecnologías que están revolucionado la genómica en el tratamiento del cáncer

¿Cual es la diferencia entre estas dos frutas?

Descubrimiento del ADN

Células y DNA• El cuerpo humano contiene

~100 trillones de células

• Cada célula contiene 23 pares de cromosomas ( = genoma)

• Los cromosomas contienen DNA

• Cada célula (excepto algunas cuantas) en un individuo contiene exactamente el mismo genomaEd Radclyffe, CSIRO

Estructura del ADN

DNA a Proteína

• El DNA en el genoma se interpreta para producir proteínas

• Los segmentos del DNA en el genoma llamados “GENES” codifican para proteínas

• Las proteínas son los productos funcionales finales en la célula.

DNA RNA Funciónproteína

Código Producto decodificado

insulin

Embrión de Erizo de mar

Embrión de ratón

Embrión de alga Fucus

Alga FucusRatónErizo de mar

Embrión humano

Genomas a Organismos

Humano (conectado)

Modificado del MCB 4a edición

Proyecto del genoma humano• 23 pares de cromosomas

• 3 x 109 pares de bases (o nucleotidos)– A, G, C & T

• Proyecto del Genoma Humano - 10 años y costó $2700 millones de dolares• ACGTGCATCTGACATTTACTG …..

Variaciones del genoma humano – Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)

• ~ 97 % del genoma entre dos individuos es idéntico.• ~ 1% de las diferencias son

variaciones de un solo nucleótido (SNPs)

• ~2% debido a otros cambios – variaciones en el número de copias, deleciones

• Entre 11-12 millones de SNPs se han identificado

DefinicionesGenética: estudio de la herencia y de alteraciones en genes; también, el estudio de un solo gene

Genómica: estudio de genes múltiples, sus funciones, evoluación y sus interacciones, actuando en conjunto

Pruebas pronósticas de los genes: refleje la probabilidad de un cáncer para repetirse o la extensión fuera del sitio primario estas pruebas determina la probabilidad que un cáncer recurrirá o se detendrá.

Pruebas Predictivas: indican la sensibilidad o la resistencia relativa a los tratamientos específicos, tales como quimioterapia o tratamiento hormonal

Estas pruebas determinan la probabilidad que un cáncer responderá a un tipo de tratamiento en particular.

Que es el Cáncer?

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Mutaciones

Modified from: M. Meyerson, S.Gabriel, G.Getz, Nature Reviews Genetics 11, 685-696

Tipo de cambio Cuenta Porcentaje

Mutaciones somáticas identificadas en COLO-829

SustitucionesCodificantes

SilenciosaMissenseTruncante

No codificantesUTRncRNAmiRNA

IntrónicasSplicingOtras

IntergénicasInserciones y deleciones pequeñas

CodificantesUTRIntrónicasIntergénicas

RearreglosPuntos de rupturaCodificantesUTRIntrónicosIntergénicos

ClasesIntracromosomales

DelecionesInversiones

DuplicacionesOtras

IntercromosomalesmiRNA, microRNA; ncRNA, RNA no codificante; UTR, región no traducida

Genética ayuda a identificar pacientes de “High Risk” para desarrollar Cáncer

– Genética es el estudio de la herencia

– Genetica se enfoca primariamente en el como se desarrolla el cáncer… BRCA1 o BRCA2

– Genética evalúa demostrar mutaciones, no enfermedades

Source: Understanding Cancer Series: Gene Testing,

National Cancer Institute

Genómica ayuda a buscar Pacientes de una Biología Tumoral Individual

Genómica Genómica es el estudio de como interactuan los genes

genes y son expresados como un todo• Genómica y los perfiles de expresión de genes son

herramientas enfocadas en el cáncer mismo y pueden ayudar a determinarCuanto agresivo es el cáncer (pronóstico)y/oCuanto es beneficioso un particular tipo de

tratamiento (predicción)

1818

La Promesa de la Genómica• Diagnóstico temprano y efectivo

– Anticipatorio, no reactive

– Predictivo y preventive

• Mayor individualización de las decisiones de tratamiento • Terapia Dirigida basada en una enfermedad individual• Mayor posibilidad de éxito en los estudios clínicos• Más “drug discovery” racional• Desarrollo de drogas más rápido

– Selección de pacientes– Respuesta de los pacientes

• Más rápido de comercializar

Entonces, Porqué es esto tan importante en el Cáncer?

Expresión Génica en el Cáncer

• Sobre-expresión génica

• Mitógenos, Factores de crecimiento.

Oncogenes

• Silencio génico durante la diferenciación, Reparación del DNA, control mitótico y apoptosis

Genes supresores de tumor o anti-oncogenes

Como se activan los oncogenes?

Secuencia codificante

Deleción o MutaciónPuntual en la secuencia

codificante

Amplificación Génica Re-arreglo Cromosómico

DNA

RNA

Proteína hiperactiva encantidades normales

Proteína normalampliamente sobre-expresada

Amplificación cercana ófusión a un gen activo

Combinaciones de oncogenes frecuentemente asociados con algunos cánceres humanos

Loci Afectado Tumor

APC, MCC, DCC, KRAS2, P53 Cáncer Colorrectal

HRAS, MYC Carcinoma cervical

MYB, MYC, EGFR, HER2, HRAS, P53, RB1, BRCA1, BCL1, HSTF1, INT2

Carcinoma mamario

JUN, MYC, MYCN, MYCL, HRAS, RB1, P53, RAF1 Carcinoma pulmonar

HRAS, P53, RAF1, INT2 Carcinoma de células escamosas

MYC, BLYM Linfoma de Burkitt

P53 (EGFR, MYC, MYCN, GLI, HER2, PDGFB, ROS, TGF alfa

Astrocitoma

ABL Leucemia mieloide crónica

Que vías metabólicas están relacionadas con el cáncer?

WNT

Cell

ECM

Growth factors (e.g. EGF, amphiregulin TGFa)

Nuclear receptors(e.g. oestrogen)

Survival factors(e.g. IGF1)

Cytokines(e.g. ILs, IFNs)

Deathfactors

(e.g. FasL)

Anti-growth factors(e.g. TGFb)

GPCR ligands

Frizzled Dishevelled

GSK-3b

APC

Tubulin

TCF

Integrins

b-Cutenin b-Cutenin:TCFE-Cadherin

CdC42 PI3K Rac

FakCas Crk

Src

Fyn

ShcNF1

RasRTK Grb2SOS

Ral MEK MAPK MAPK

MEKK

PLC

PKC Mos MKKs JNKs

ELK

Myc:Max

Max:MaxFos

JUN

Abl

7-TMR

CdC42 Rac Rho

G-Prol Ad Cycl PKA CREB

PKC NF-kB

NHR (e.g. ER)

NF-kB

P13K Akt Akka IKB

PTEN?

Stat 3.5

Stat 3.5

Stat 3.5

Bcl XL

Caspase 9

Cytochrome C

Jaks

Bad BidMitochondria

Bim, etc.Abnormalitysensor

Bcl-2

Cell Death(Apoptosis) Caspase 8

Fap

FADD

Bcl-2

Bax

ARF

p53

Mitochondria

MDM2

DNA damagesensorCell

Proliferation(cell cycle)

Changesin Gene

Expression

Cycl E:CDK2 p21

p27

E2Fs

Rb

p16

Cycl D:CDK+ p15 Smads

RTK

Cytokine R

Decoy R

Fas

SurfaceAg

TGFbR

HPVE7

Hanahan D, Weinberg RA. Cell 2000;100:57–70

Moléculas Candidatas para mutaciones causantes de cáncer (“oncogenes”=rojo)

Efectores candidatos = verde

Candidatos para blanco= amarillo

Fallas Moleculares del Tumor Primario

Genómica FuncionalLos ensayos funcionales: Permiten perturbar los diferentes elementos del sistema y ver las consecuencias funcionales.

Integración de Datos por Pruebas Moleculares

Una lista ordenada y registro de genes controladores.

…

• Haciendo uso de la gran escala de las pantallas funcionales que se están acumulando rápidamente.

• Lo mejor de ambos mundos: Integración de datos de los tumores primarios con pantallas funcionales en los datos genómicos.

Tumor Primario Análisis Genómico

Alteraciones Moleculares en la progresión del Cáncer

Normal Hi perplasia Displasia

In Situ Carcinoma

InvasorCarcinoma

- p53 - p53 - BRCA 1, 2 - BRCA 1, 2 +HER-2 +HER-2 +Cyclin-D +Cyclin-D +myc +myc

p53 BRCA1 BRCA2

Growth factor, hormone, ER deregulation?

Temas

• Genes, Genómica y Cáncer – Introducción

• Tecnologías que están revolucionado la Genómica en el tratamiento del Cáncer

Tecnologías de Biología Molecular• PCR en tiempo real

– Alta sensibilidad– Alta precision

• DxS kit (CE)• TIB MOLBIOL (CE)• COBAS (CE)

MELTING CURVESResults show GAT (G12D), GTT (G12V), AGT (G12S), and TGT (G12C) mutations at codon 12 of the K- ras

Curves represent GAT (G12D) and GTT (G12V) mutations at codon 12 of the K-ras gene.

Test usando sondas hidrolizables

Tecnologías de Secuenciación• Tecnología de secuenciación de Primera generación

• Secuenciación Sanger• Tecnología de secuenciación de Segunda generación

• Roche - 454• Illumina – GA II• SOLiD

• Tecnología de secuenciación de Tercera generación• Helicose• PacBio• Illumina = HiSeQ, MiSeq• Ion Torrent• Oxford Nanopore

Comparación de métodos

Sequencing TIB MOLBIOL

Taqman COBAS

Probe preparation identical identical identical identical

Tissue material requirement

low low medium low

Detection sensitivity(low level mutations

< 5-10%)+/- +++ +++ +++

Work flow complexity complex simple simple simple

Cost high low low high

Advantages of TIB MOLBIOL assay will allow future diagnostic application in tumor diseases with limited tumor tissue availability (e.g. lung tumors). Additionally, simple workflow requires less personnel, which will increase acceptance of diagnostic kit utilization.

Estrategias de la “Next Generation Sequencing” (NGS)

• Secuenciación de Genomas completos (WGS)– Mutaciones somaticas en tumores– Mutaciones de línea germinal y

polimorfismos• Secuenciación de exomas completos (WXS)• Secuenciación de blancos de alteraciones

accionables (ACGS)• Soporte Informático

El aparato personal genómico ha sido diseñado con propósitos de investigación, ofreciendo cargar un iPod mientras que analiza DNA. Tiene un puerto iPod en la parte superior…

La plataforma usa sensores semiconductores en paralelo para medir los iones hidrógeno producidos durante la replicación del DNA en tiempo real (pH…).

Es el primer aparato en usar este tipo de tecnología superconductora, mientras que continua el uso de fluidos integrados y micromaquinaria para traducir la información en nuestro DNA a información digital fácilmente medible.

Ion Torrent (LifeTechnologies) – lecturas de 100bp reads, barato, fácil

http://www.iontorrent.com/?s_kwcid=TC-12648-4977112303-p-652132722

Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing

First Generation Sequencing

Clinical therapeutics consultation

“Drugs for a patient, or patients for drugs.”

Manuel Hidalgo, MD

Clinical care or clinical trial

Investigación tradicional vs aplicaciones “High-throughput”

Royal Mail Stamp Issue 25 February 2003

The doctor’s perspective

"Here's my

sequence..."

The patient’s perspective

www.nanopharmacia.com