Manuel Talón

Genómicadecítricos (Citrus genomics')

Centro de Genomica, InstitutoValenciano de InvestigacionesAgrarias (IVIA),

Apartado Oficial,46113 Moncada (Valencia).

Email: talon_man € gva.es

Esta sesión del congreso nos ofrecióel plato fuerte del mismo y una informa-ción crucial por la que en los años veni-deros se recordará este evento, ni más ni

menos que la secuenciación del genomade los cítricos. Sin duda la investigaciónen cítricos cambiará a partir de este mo-mento, a raíz de la información que ofre-ce la secuencia del genoma de los agriosy de las facilidades con las que contaránlos científicos del campo citrícola.

Las presentaciones orales relaciona-das con el genoma de los cítricos, quefueron 7, exploraron nuevas áreas de es-tudio y herramientas tecnologías y bioló-gicas que mejorarán sin duda todos loscamposdela citricultura desde el cultivopropio de los cítricos hasta la disciplinasde la Biología y de la Fisiología o de lasaplicaciones relacionadas con la mejorade las especies cultivadas, la generaciónde nuevas variedades o las técnicas bio-tecnológicas de protección vegetal. Traslas presentaciones directamente relacio-nadas con la dilucidación de las secuen-cias de DNA de los genomas de loscítri-cos, se abordaron por este orden, temá-ticas centradas en la generación delmapa genético de los cítricos, precisopara orientar y guiar el anclaje de las se-cuencias en los cromosomasy en la pro-pia citogenética de los cromosomas delos cítricos. En la presentación siguientese mostró un análisis de identificación degenes relacionados con la partenocarpiamediante un estudio del transcriptoma delos tejidos de las flores, y por ultimo en la

presentación oral final se expuso la utili-dad de un vector viral para realizar estu-dios de funcionalidad génica.

Las presentaciones en formato deposter (15 en total) se dividieron portemáticas afines y relacionadas dentrodel concepto general de genómica. Así,se presentaron dos estudios relaciona-dos con la expresión génica en tallos delimón y en cítricos afectados por el malseco y por la cancrosis. La caracteriza-ción funcional de genes relacionados conestreses abióticos y con el desarrollo decaracterísticas de maduración fue objetode las tres presentaciones posteriores.La poliploidia, la floración y la juvenilidadfueron motivo de otras tres charlas. Lasesión continuó con dos estudios parale-los sobre la identificación de proteínasrelacionadas con el metabolismo prima-rio y con el estado redox. El estudio delorigen de los cítricos mediante al análisisde ESTs y la secuenciación de genomasocuparon las dos charlas siguientes.Estas presentaciones fueron seguidaspor tres exposiciones sobre la obtenciónde marcadores, la utilidad de la Biologíade Sistemas y minería de datos para laidentificación de genes de interés y, porúltimo sobre las posibilidades de genoti-par variedades de cítricos mediante fu-sión de alta resolución.

Comunicaciones orales

La exposición inicial, que fue la expo-sición estrella, se realizó a cargo delConsorcio Internacional de Genómicade Cítricos, formado por centros deinvestigación de USA, Francia, ltalia,Brasil y España, representada por elIVIA. En ella se presentó el genoma delos cítricos dilucidado en una variante dela Clementina de Nules que ha servidocomo genoma de referencia para el restode secuenciaciones de genomas que sepresentaron en las charlas subsiguien-tes. También se ofreció la secuencia delgenoma dela naranja dulce y se realizóun análisis comparativo de genomas decítricos que ha permitido descubrir el ori-

gen de las variedades cultivadas decítri-cos (Figura 1). Así, la domesticación de

los cítricos se produjo mediante crucesde dos variedades ancestrales, Citrusreticulata, que seria el contribuidor mayorde las mandarinas actuales y Citrus ma-xima, que era muy semejante al pumeloactual. Con esta información se concluyóque el naranjo amargo es un híbridodirecto de estos pumelos y mandarinasancestrales, mientras que la naranjadulce es un producto de un mestizajemas complejo en el que los dos parenta-les poseían mezclas genómicas de man-darinas y pumelos ancestrales. El estudiotambién permitió dilucidar el origen denuestra clementina, que resultó ser uncruce directo del mandarino común y dela naranja dulce.

La segunda exposición corrió a cargode representantes del Centro de Genó-mica del IVIA, que en nombre delConsorcio español CITRUSEQ, informóde la secuenciación del genoma de 150variedades de cítricos representativas eimportantes para la citricultura española,estudió que permitirá un desarrollo consi-derable de nuevas herramientas de traba-jo y de tecnologías con un amplio abanicode posibilidades. El Consorcio CITRU-SEQ, en un esfuerzo conjunto desarrolla-do por instituciones púbicas y empresasprivadas ha generado un portal web quepermite la búsqueda y comparación entrelas secuencias de aproximadamente 8millones de variantes de genes encontra-dos y entre 45 mil millones de pares debases. Los análisis iniciales sugieren quela información almacenada puede ayudara desentrañar los aspectos fundamenta-les de interés biológico y evolutivo, comoel origen de los cítricos, el mecanismo degeneración de variedades espontáneas,la identificación de puntos calientes derecombinación, y los efectos de las muta-ciones inducidas. Desde el punto de vistacomercial esta información es crucialpara la autentificación y para la mejoray obtención de variedades y para identi-ficar genes de interés agronómico rele-vante.

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Continuando con esta línea, la si-guiente exposición abordó la secuencia-ción en Japón del genoma de 11 varie-dades de cítricos, mayoritariamente sat-sumas, con la idea de obtener variantesgénicas para su posterior uso en mejorade variedades. Shimizu y col. reportanque tanto el número de variantes, asícomo la proporción de ellas tanto homoci-góticas como heterocigóticas fueron bas-tante diferentes entre las variedades.

El equipo proveniente de Wuhan(China) se centró en la secuenciacióndel genoma de la naranja dulce, unaaportación prácticamente idéntica a lapresentada por el consorcio internacionalque ofreció el genoma de la clementina.El resto de la exposición de Xu y cols.,sorprendió a todos los presentes, puesaunque no constaba en su comunicaciónescrita ni en el título de la ponencia, con-tinuaron con el estudio sobre el origen dela naranja dulce, que a todas luces era untrabajo idéntico en concepción y desarro-llo y por tanto paralelo al presentadoanteriormente por el consorcio interna-cional. Sin embargo, pronto quedo claroque las conclusiones del estudio erandistintas, ya que la propuesta china con-templaba un origen en el que uno de losparentales era híbrido de pumelo pormandarina mientras que el otro era unamandarina.

Tras estas 4 presentaciones de altovoltaje, se presentaron los resultados deuna amplia colaboración que implicaba alos numerosos grupos de investigaciónpertenecientes a varios países que gene-raron el mapa genético de Citrus clemen-tina, que entre otros desarrollos sirvió alconsorcio internacional para establecerun marco genético sobre el que asentaren los cromosomas las lecturas de lassecuencias con objeto de desentrañar lasecuencia del genoma haploide de cle-mentina. El mapa genético tambiéncorroboró el origen de la clementina ylos puntos de recombinación de lavariedad haploide utilizada en lassecuenciación del genoma de la cle-mentina.

La siguiente charla, expuesta porinvestigadores brasileños (Silva y cols.),abundó en la citogenética de los cro-mosomas de cítricos y propuso la bús-queda de una nomenclatura unificadorabasada en la evolución de los distintos

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Figura 1. Origen filogenético de las principales especies cultivadas de cítricos.

Población ancestral dePumelos (C. máxima)

Población ancestral deMandarinas (C. reticulata)

T ] ña”PO Ayl

1 ¡ Me Xx 7: 1 -0-6 :

Población tradicional de! ó Mandarinas

AmargoPumelo l 0-6

0Ácido l; Hibrido MandarinaMandarina

LS 1 pe [ zi Común |

“ APumelo “a r 4Chandler % ii

cariotipos. En este trabajo se utilizarondiversos tipos de marcadores para iden-tificar cada uno de los pares de cromo-somas y poder construir mapas citoge-néticos de varias especies de cítricos.Mientras que al aparecer, los cromoso-mas 1, 4 y 8 se han conservado de unaforma relativa, el cromosoma 3 es espe-cialmente variable, lo que sugiere reajus-tes estructurales adicionales tales comoinversiones.

Las dos últimas exposiciones estu-vieron dedicadas a los análisis de identi-ficación y de funcionalidad génica.La pri-mera de ellas, presentada por un grupoitaliano se centró en el estudio de la basegenética de la autoincompatibilidad delos cítricos. El análisis comparativo deltranscriptoma floral de dos genotipos declementina condujo a la identificación deun conjunto de genes candidatos relacio-nados con la autoincompatibilidad. Losgenes identificados, al parecer, son total-mente desconocidos porque no mues-tran homología con genesdeotras espe-cies de plantas. Algunos de estos genesmuestran un incremento de su expresiónen concomitancia con la detención de laelongación del tubo polínico.

LA” 777

77“aMandarina

Clementina

La exposición oral final corrió a cargode un grupo español (Agúero y cols.) queexplicó la utilidad de un nuevo vectorviral basado en el genoma de un virusque ataca a los cítricos para estudiar lafunción desconocida de un determinadogen. El método parece ser altamenteefectivo pues los ensayos generados congenes que controlan la síntesis de carote-noides o de la fotosíntesis o incluso genespromotores de la floración mostraron quela infección con el virus provoca un cam-bio en la expresión de los transgenes quese manifestaba durante al menos dosaños en las plantas infectadas.

Comunicaciones en panel

Las comunicaciones en forma de pos-ter se iniciaron con un estudio clásicosobre la expresión génica diferencial entreplantas de limón afectadas de dos proble-mas principales, la destructiva enferme-dad conocida como “Mal Secco” causa-da por el hongo Phoma tracheiphila y eldaño por frío causados por bajas tempe-raturas. El análisis de las secuencias dife-renciales reveló homología con genespre-viamente identificados que participan enlos mecanismos de defensa contraestrés biótico y abiótico. En la siguiente

comunicación, que versó sobre la can-crosis de los cítricos (Xanthomonasaxonopodis pv. Citri), se reportó que de untotal de 14 accesiones testadas se encon-tró que una variedad de cidro chino(Citrus medica) mostró resistencia com-pleta y activa a esta enfermedad. El estu-dio comparativo de los perfiles de trans-cripción de muestras sensibles y resisten-tes reveló que el número de las secuen-cias reguladas en las muestras resisten-tes era mayor. Además, en el estudio sehan identificado más de 20 genes queestaban involucrados en la vía de la inte-racción planta-patógeno.

La siguiente comunicación se centróen la caracterización funcional de genesasociados con dos rasgos de importan-cia agronómica en los cítricos, como laresistencia a la sequía y el color de lafruta. Este grupo ha estado usando lasherramientas de la genómica, biologíamolecular, y la tecnología del ADNrecombinante para alcanzar este fin.Algunos de sus resultados incluyen laidentificación de miembros de las fami-lias de factores de transcripción implica-dos en la respuesta de estrés hídrico, lacaracterización de acuaporinas involu-cradas en la deshidratación, la descrip-ción de un mecanismo alternativo deregulación de la biosíntesis de hormonasen relación con la tolerancia al estrésabiótico, la caracterización de dos nue-vos genes que controlan la síntesis debetacarotenos y la identificación de va-rías formas de los genes involucrado enla biosíntesis de licopeno. La exposiciónsiguiente versó sobre la posibilidad dedeterminados genesde interactuar en latolerancia o resistencia al frio. El tra-bajo muestra que estos genes aumentansignificativamente su expresión cuandola disminución de la temperatura llega almenos a 5 * C. El máximo nivel de expre-sión se observó en las plantas tolerantesal frío de naranja trifoliada, seguido dekumquat (Fortunella crassifolia), pomelo(Citrus grandis), naranja dulce (Citrussinensis) y por último el limón (Citruslimon). El estudio prosigue con una des-cripción estructural de estos genes endondese señalan las diferencias y simili-tudes que pueden ayudar a explicar susefectos sobre la resistencia a las bajastemperaturas. Esta presentación se com-plementó con una exposición sobre otrotipo de genes, de relativa importancia enlos cítricos que contribuyen quizá al

desarrollo de la planta. Estas proteínasque son ricas en prolina representan unaclase de proteínas de la pared celular.Los estudios de expresión mostraron quela transcripción de estos genesse reali-zaba preferentemente en hojas. Unasecuencia de su promotor fue clonada ysu actividad se ensayó mediante el usode un gen indicador GUS bajo su control.El promotor dirigió la expresión en hojasy cotiledones de plantas de Arabidopsisthaliana. Las plantas RNAi mostraron unfenotipo relacionado con el retraso en elcrecimiento. Mediante microscopía elec-trónica se reveló que el bloqueo de laexpresión también reducía el número ytamaño de los granos de almidón en loscloroplastos, lo que indica que estos ge-nes pueden estar implicados en el desa-rrollo y el metabolismo de hidratos decarbono delas hojas.

La comunicación siguiente (Niñoles ycols.) cambió el registro de estudio alcentrarse en los efectos de la poliploidía,que ha sido reconocida como una fuerzaimportante en la evolución de las plantascon flores, porque a menudo resulta ennuevos fenotipos que no están presentesen sus progenitores diploides. El gruporeporta que en trabajos anteriores segeneraron clementinas sintéticas condiferentes niveles de ploidía, específica-mente líneas haploides, dihaploides yautotetraploides. Curiosamente, las líne-as dihaploides no fueron capaces de for-mar flores, mientras que las líneashaploides, diploides y líneas autote-traploides si. Mediante el uso de un enfo-que de microarrays, se realizó un análi-sis exhaustivo de divergencia y en parti-cular se han explorado nuevos patronesde expresión de genes relacionados conla capacidad de florecer. Se encontrarondiferencias en la expresión en el tejido dela corteza de los cuatro linajes y a raíz delos distintos análisis se seleccionaron 16genes supuestamente implicados en lasdiferencias encontradas en las flores.También relacionada con la floración, lasiguiente presentación (Muñoz-Fambue-na y cols.), describió un trabajo cuyoobjetivo fue determinar la relación entrela expresión de los genes de la flora-ción y el tipo de brotación. Para estefin, se utilizaron brotes de la mandarina'Moncada' y tras el análisis se concluyóque los resultados indican que las inflo-rescencias con hojas y sin hojas mues-tran expresión diferencial de determina-

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dos genes dela floración. Así, existe unaausencia de relación entre el número deflores por inflorescencia y la expresiónrelativa de los genes dela floración. Porotra parte, los diferentes niveles deexpresión de otros tipos de genes, comolos genes homeóticos florales parecenestar relacionados con la aparición dediferentes tipos de brotacioneso inflores-cencias. El siguiente panel (Castillo ycols.) versó sobre el acortamiento de lafase juvenil en plantas de Arabidopsisobtenidas mediante la expresión ectópicade factores de transcripción cítricos. Enlos cítricos, la juvenilidad es un períodolargo (5-20 años, dependiendo de lavariedad) durante el cual la iniciación flo-ral no ocurre incluso bajo condicionesambientales que normalmente son induc-tivas. En este trabajo se han identificadovarios factores de transcripción diferen-cialmente expresados en las fases juve-niles y adultas. Algunos de ellos son ge-nes que participan en los procesos dedesarrollo, mientras que otros mostraronuna alta similitud de secuencia parcialrestringida a dominios específicos. Segeneraron plantas transgénicas deArabidopsis que sobreexpresan estosTFS y se determinaron diversas caracte-rísticas morfológicas como el número dehojas, tricomas, el tiempo de floración yla morfología de las hojas y las silicuas.Algunas plantas mostraron un acorta-miento de la fase juvenil, lo que indicaque estos genes están probablementeinvolucrados en la determinación de latransición de la fase reproductiva.

Tras estas exposiciones se presenta-ron dos trabajos paralelos (Muñoz-Fambuenay cols.) centrados en la expre-sión diferencial de proteínas relaciona-das con el metabolismo primario y con elestado redox en hojas de la mandarina'Moncada' con carga de frutos diferente.En relación con el estudio sobre el meta-bolismo primario, las muestras fueronrecolectadas en noviembre, las proteínasextraídas y se seleccionaron 33 “spots”de los cuales, la mayoría se asociaron almetabolismo de hidratos de carbono y lafotosíntesis, y un número menor al ciclode Krebs. La identificación de las proteí-nas se llevó a cabo por MALDI-MS o LC-MS-MS. Según estos resultados, elmetabolismo primario parece ser másactivo en las hojas de arboles con pocacarga, lo que sugiere que la carga de fru-tos inhibe el metabolismo primario en la

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variedad 'Moncada'. El otro estudio pre-teómico se centró en el estado redox decítricos y en la respuesta al estrés rela-cionado con la carga de fruta. Así, deacuerdo con los resultados obtenidos, engeneral, en las muestras de árboles enlos años de escasa carga, las proteínascon actividad oxidorreductasa son lasmayormente reguladas, mientras que enlas muestras de los arboles con carga loson las proteínas relacionadas con lasrespuesta al estrés y a la actividad óxido-reductasa. Por lo tanto, los autores con-cluyeron que el estado redox es diferen-te para los dos tipos de árboles.

En la siguiente exposición (Zhong ycols.) se analizaron las secuencias deEST de cítricos para abordar los orígenesde Citrus sinensis, Citrus clementina y C.

poonensis. Esta aproximación es parale-la a la empleada por el Consorcio Inter-nacional de cítricos, que presentó susresultados en la parte de las presentacio-nes orales, excepto que en este caso seaborda el estudio en base a las secuen-cias de ESTs mientras que el Consorciotrabajó con las secuencias genómicas.Dos enfoques distintos, la comparaciónentre haplotipos y el análisis filogenéticose utilizaron para estudiar 359 loci dife-renciales de genes de cítricos. Se de-mostró que las tres especies, C. sinensis,C. clementina y C. poonensis son a lolargo de todo su genoma heterocigotos.De la inferencia del análisis de datos se

deriva que C. clementina proviene de uncruce entre una mandarina y C. sinensis,y la mandarina se confirmó que era C.deliciosa, mediante el genotipado de 25SNPs representativos. A su vez, C.sinensis debió originarse por al menostres cruces, [(pomelo mandarina x) x

pomelo o toronja x (x pomelo mandarina)]x mandarina. Se discutió la evolución y ladomesticación de los cítricos y el signifi-cado del alto nivel de polimorfismosencontrado. Estos resultados son básica-mente idénticos a los presentados porelConsorcio Internacional y difieren de lapresentación oral que realizó el grupochino sobre el origen de la Naranja dulceque atribuye la presencia de pummelo auno sólo de los parentales de la naranja.

El siguiente panel (Chung y cols.)reportó sobre la secuenciación genómicay el análisis comparativo de Citrus platy-mamma (Byungkyool), una especie decítricos nativos en Jeju Island (Corea delSur) en una aproximación similar a laspresentaciones orales que reportan lasecuenciación de grupos numerosos degenomas.

En el trabajo siguiente, Ohta y cols.,reportan que han desarrollado un méto-do directo de genotipado para cítricosrápido y rentable basado en la PCR.Estemétodo consta de dos pasos: (1) unapunción de una hoja y (2) la inmersión dela aguja en una mezcla de PCR o una

SINTOMATOLOGÍA(eeeEsasE

RIESGOS CLIMÁTICOS EN CÍTRICOS.SINTOMATOLOGÍA Y EVOLUCIÓN DE DAÑOS.

Miguel Ángel Torres Ramírez. 103 págs. 131 fotografías color. (2010).

CONTENIDO: Introducción. | — Riesgo de helada. II — Consideraciones al cuantificar las pér-didas ocasionadas porel riesgo de helada. III — Riesgo de granizo.IV — Consideraciones al cuantificar las pérdidas ocasionadas porel riesgo de granizo. V —

Riesgo de viento. VI — Consideraciones al cuantificar las pérdidas ocasionadas porel riesgode viento. VII — Riesgo de viento seco-cálido. VII — Consideraciones al cuantificar las pérdi-das ocasionadas porel riesgo de viento cálido. IX — Riesgo de inundación, lluvia torrencial ylluvia persistente. X — Consideraciones para la cuantificación de los riesgos de inundación,lluvia torrencial y lluvia persistente. XI — Aforo de cítricos. XII — Identificación práctica de espe-cies por sus hojas. XIII — Protocolo de identificación práctica de variedades de cítricos.Anexo|. Índice de fotografías. Bibliografía

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Finalmente los dos paneles presenta-dos por Silva y cols., y Distefano y cols.,presentaron dos estudios sobre la utili-dad de la minería de datos y la biologíade sistemas para la identificación degenes clave implicados en la calidad delos cítricos y sobre el uso de la fusión dealta resolución (HRM) para el genotipadode los cítricos. En el primer trabajo, seutilizaron algoritmos específicos paraidentificar los módulos y nodos centralesdentro de las distintas bibliotecas de cítri-cos con la idea de utilizar los resultadoscomo guía para seleccionar genes espe-cíficos de cítricos para nuevos estudiosfuncionales como la expresión génica ola transformación de plantas. En la últimapresentación, por primera vez se aplicóla HRM al análisis de los cítricos paradetectar la presencia de SNPs o polimor-fismos. Los resultados sugieren que estees un método eficiente, rentable y preci-so a la hora de detectar variaciones en lasecuencia.

Agradecimientos

El trabajo del autor incluido en esteartículo ha sido subvencionado por elConsorcio Cltruseg y por el Ministerio deCiencia e Innovación mediante los pro-yectos PSE-0600002009-8 e IPT-010000

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