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Métodos de determinación del virus del papiloma
humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix
Beatriz Bellosillo Servicio de Anatomía Patológica
Hospital del Mar, Barcelona
Virus del Papiloma Humano- HPV
– El virus del Papiloma pertenece a
un grupo diverso de virus DNA
– infectan a piel y a membranas
mucosas de humanos y una
variedad de animales
– cerca de 150 tipos de papilomavirus
afectan a humanos
– 40 de ellos se localizan en el tracto
ano-genital, y pueden ser:
• alto riesgo
• bajo riesgo
•El HPV se infecta por transmisión sexual, un 80% de las
mujeres podrían haber sido infectadas por al menos un
tipo de HPV antes de cumplir los 50 años
•A menudo no se observan síntomas, especialmente en el
caso de HPV de alto riesgo
•Mayoría de las infecciones de HPV son transitorias y
asintomáticas y se solucionan sin tratamiento. El 91/%
puede revertirse en dos años
•Otras permanecen en estado latente durante largos
periodos
•La mujeres con riesgo de cancer de cérvix son aquellas
en las que persiste la infección de un HPV de alto riesgo
(HR)
Virus del Papiloma Humano- HPV
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación de señal
Amplificación de ácidos nucleicos
Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot
PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación de señal
Amplificación de ácidos nucleicos
Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot
Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV
PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de ácidos nucleicos
Hibridación + Amplificación de señal
Amplificación de ácidos nucleicos
Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot
PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®
Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV
Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV
Hybrid Capture®2 (hc2)
Formación de hídridos DNA-RNA
DNA de HPV
Unión de sondas de RNA que hibridan con DNA de HPV
Unión de Ac que reconocen los híbridos DNA- RNA
Unión de Ac secundario
Emisión de luz
Test Cervista™ HPV HR
Resumen del Flujo de trabajo
Botón celular Extracción Agencourt
Incubación Leer & Analizar
Preparación de la Reacción
MAGNET
Alícuota 2ml de muestra desde el Vial
Cervista®HPV
Clasificación de ensayos para determinación de HPV
Hibridación de ácidos nucleicos
Amplificación de señal
Amplificación de ácidos nucleicos
Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot
Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV
PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®
La reacción en cadena de la polimerasa
• Amplificación de secuencias específicas de DNA
• Diseño de dos oligonucleótidos “primers”
complementarios a los extremos del fragmento
a amplificar y que actúan como cebadores de la
reacción
1- Desnaturalización
94ºC-96ºC
2- Hibridación
55ºC-70ºC
3- Extensión
72ºC
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Original DNA target region
Thermal cycle Thermal cycle Thermal cycle
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean
1.07 billones de copias del ADN de interés
Detección de HPV mediante PCR
tubo
microarray
CLART® HPV2
FLOWCHIP®
cobas® 4800
cobas x 480
Equipo para la extracción de ácidos nucléicos
cobas z 480
PCR en tiempo real
Configuración
cobas® 4800
Kit multiplex cualitativo en un único tubo para la detección simultánea de14 genotipos de alto riesgo e identificación de los tipos 16 & 18 de HPV con ß-globina como control interno
4 canales de detección para medir los diferentes objetivos
– Canal 1 = panel AR HPV l (12 de 14 tipos de alto riesgo
– Canal 2 = HPV genotipo 16
– Canal 3 = HPV genotipo 18
– Canal 4 = beta-globin
Diferentes tipos de muestra
– PreservCyt
– cobas® PCR media
HR 16 18 Cont
Ch1 Ch2 Ch3 Ch4
HR
GT
18
HPV
GT
16
GT
18
High
Risk
Panel
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68
APTIMA®HPV Assay
HPV assay
Targeted HPV
genotypes
Detection technology
DNA/RNA,
target HPV
gene
Controls Certificates
Hybrid Capture 2
13 HR Sandwich capture
molecular
DNA,
whole
genome
Batch control for
process
FDA, IVD, CE
Cervista 14 HR Signal amplification DNA,
whole
genome
Sample by sample
Reaction HIST2H2BE
for sample sufficiency
FDA, IVD, CE
CLART
13 HR + 22 LR Polymerase chain
reaction/
DNA, L1
Sample by sample
hCFTR microarray
gene for
sample sufficiency
IVD, CE
Flow CHIP 18 HR + 18 LR PCR + dot blot DNA Sample by sample
housekeeping gene
for sample sufficiency
IVD, CE
Cobas
14 HR Real-time polymerase
chain
DNA, L1
Sample by sample
reaction b-globin for
sample
sufficiency
FDA, IVD, CE
APTIMA
14 HR MMLV reverse
transcriptase and T7
RNA polymerase
mediated amplification
RNA,
E6/E7
Spiked control for
sample process
validity
FDA, IVD, CE
5064 muestras- 33.2% positivas con ≥ 1 técnica (41% positivas con los 4 ensayos). Menos concordancia en : Mujeres mayores (>30 años): 30% vs 49%
Muestras cribado primario (29%) vs muestras de seguimiento (38%) Citología normal (22%) vs mujeres con citología anormal (68%)
Rebolj et al, PLOS One, January 2014
Elección de los ensayos de detección de HPV – requisitos a considerar
- Sensibilidad clínica adecuada
- Controles internos (evitar falsos negativos)
- Procesamiento de elevado número de muestras
- Automatizable
- Tiempos de respuesta adecuados
- Genotipado – no es imprescindible en estos momentos
Servei de Patologia
Francesc Alameda Belén Lloveras
Mercè Muset Sergi Serrano