PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTANDARIZADOS

MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICOS

Se elabora con el fin de mejorar las condiciones de trabajo, que sea de fácil entendimiento, facilitar la operación y asegurar el correcto funcionamiento en la preparación de los medios y brindar un servicio óptimo a quienes lo requieren.

OBJETIVO GENERAL• Establecer un documento de

apoyo que a través de procedimientos estandarizados permita prestar un servicio óptimo en el área de Preparación de Medios de cultivos Microbiológico.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Preparar medios de cultivo que cumplan los requisitos necesarios y acordes a las buenas prácticas de laboratorio implementadas en el área de Preparación de Medios.

• Mejorar las condiciones de trabajo en laboratorio para garantizar la calidad del material que se prepara en esta área.

• Controlar por medio de registros adecuados los procesos que se ejecutan en esta aérea.

• Estructura de un laboratorio de microbiología clínicaSECCIÓN I

• Área de trabajo del ambiente preparación de medios de cultivo microbiológicos

SECCIÓN II

• Medios de cultivo microbiológicosSECCIÓN III

• Descripción de los materiales y equipos más utilizados en el área de preparación de medios de cultivo microbiológicos.

SECCIÓN IV

• Control de calidad.SECCIÓN V

SECCIÓN I:ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Las áreas de trabajo son aquellas en las cuales se realizan los análisis específicos y las actividades relacionadas.

Las áreas auxiliares son las destinadas a funciones administrativas o funciones de apoyo (almacenes, salas de espera, salas de reuniones y docencia, despachos, habitaciones de descanso de personal, vestuarios, aseos o pasillos).

La diferenciación de las áreas auxiliares (sobre todo aquellas que son utilizadas o visitadas por personal no perteneciente a los laboratorios) de las de trabajo permite separar áreas de mayor riesgo de las de riesgo menor.

•SEÑALES DE ADVERTENCIA Tienen forma triangular, pictograma negro sobre fondo amarillo (el amarillo deberá cubrir como mínimo el 50% de la superficie de la señal), y bordes negros.

El Real Decreto 664/1997 establece que las actividades que supongan la manipulación de agentes biológicos se ejecutarán en zonas de trabajo con sus correspondientes niveles de contención

•SEÑALES DE PROHIBICIÓNTienen forma redonda, el pictograma es negro sobre fondo blanco, los bordes y banda transversal descendente, de izquierda a derecha, atravesando el pictograma a 45º respecto a la horizontal, serán de color rojo (este color deberá cubrir, como mínimo, el 35% de la superficie de la señal).

SEÑALES RELATIVAS A LOS

EQUIPOS DE LUCHA CONTRA

INCENDIOS

RECOMENDACIONES ESPECÍFICAS

PARA LOS LABORATORIOS DE

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Todos los aparatos destinados a

almacenamiento de reactivos deberán estar

debidamente señalizados con etiqueta de

“riesgo biológico”, “acceso restringido”,

“medidas de protección obligatorias”.

Todas las áreas de trabajo del laboratorio

de microbiología estarán debidamente

marcadas con la señal de riesgo biológico

y su nivel de contención.

Bioseguridad:

BARRERAS DE CONTENCIÓN PRIMARIA

VESTIMENTA PROTECTORA

BATA

GUANTES

MASCARILLAS

GAFAS

Bioseguridad:

BARRERAS SECUNDARIAS: EL AMBIENTE DE LABORATORIO

PAREDES

VENTANAS, PUERTAS

SUPERFICIES DE TRABAJO

GRIFOS

CIRCULACIÓN DE AIRE

FILTROS HEPA

LOGOTIPO DE RIESGO BIOLÓGICO

BIOSEGURIDAD

Técnica del personal

PROHIBIDO COMER, BEBER, FUMAR, ALMACENAR ALIMENTOS

NO PIPETEAR CON LA BOCA

BARRERAS DE PROTECCIÓN (VESTIMENTA PROTECTORA, CSB)

NO SALIR DEL LABORATORIO CON BATA, GUANTES, ETC.

EVITAR FORMACIÓN AEROSOLES (UTILIZAR MECHEROS ELÉCTRICOS,

USAR ASAS DESECHABLES, CENTRÍFUGAS DE TAPA HERMÉTICA,

ELIMINACIÓN ADECUADA DE RESIDUOS

AL FINAL, LIMPIEZA DE MESA

LAVADO DE MANOS

COMUNICAR CUALQUIER ACCIDENTE

TÉCNICA DEL PERSONAL (CONCENTRACIÓN EN EL TRABAJO PARA EVITAR, PINCHAZOS, ACCIDENTES, AEROSOLES, ETC.)

Sección II: Área de trabajo del ambiente preparación de medios de cultivo microbiológicos

Área de almacenamiento

de material, medio de cultivo

Área de desecho y lavado.

Área de esterilización.

Área de preparación de medios de

cultivo

Área de preparación de medios de cultivo

Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento (o para ambas).

Área de esterilización.

El área de esterilización, puede estar constituida por dos áreas conectadas entre sí (esterilización y lavado)

Lavar, preparar y envolver correctamente el material que se someterá a esterilización.

Seleccionar los métodos de esterilización adecuados para las diversas necesidades del laboratorio de microbiología.

Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.

Área de desecho y lavado.

especifica que el material contaminado debe esterilizarse y posteriormente lavarse usando una solución de detergente neutro o detergente enzimático, el enjuague debe ser con agua de la llave, posteriormente con agua destilada,

Área de almacenamiento de material, medio de cultivo

Se debe determinar y verificar el período de validez de los medios preparados en las condiciones de conservación especificadas. Se debe observar:

Cambio de color

La evaporación

La deshidratación

Crecimiento microbiano.

En general los medios preparados se guardan:

En heladera no más de tres meses

A temperatura ambiente no más de un mes en condiciones que impidan que su composición sea modificada.

Sección III: MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICOS

Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de

agua y sustancias que en conjunto proporcionan los

requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos

Requisitos: Nombre del medio y lista de

componentes, incluido cualquier suplemento.

Fecha de vencimiento del medio.Condiciones de almacenamiento.

Control de esterilidad.

Envases: deben estar herméticamente cerrados.

(especialmente medios deshidratados)

No deben utilizarse medios deshidratados que presenten

apelmazamiento o un cambio de color.

Deben ser preparados de acuerdo a procedimientos escritos (POE) y apropiadamente asegurándose

que la calidad de medios de cultivo sea apropiada para los

ensayos realizados.

MANEJO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El laboratorio debe registrar la fecha :

de recepción

de apertura del envase.

de caducidad

Envases: deben estar herméticamente cerrados. (especialmente medios deshidratados)

No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color.

Los medios de cultivo, deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado.

Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.

Utilizar materiales de vidrios bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.

Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

PARÁMETROS A TENER EN CUENTA PARA  OBTENER UN BUEN RESULTADO MEDIO DE CULTIVO.

Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte.

pH: El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a pH 7,6 y púrpura a pH 7,8.

Fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.

15 ml de espesor agar en placas Petri 90 mm.

Secado de placas estufa 25-55 C° (20 min.) o en flujo laminar.

Incubación: las pilas de platos < 6.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE UN MEDIO DE CULTIVO:

AGAR: utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.

EXTRACTOS: son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de órganos o tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado.

PEPTONAS: se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales. Son muy ricas en péptidos y aminoácidos.

FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma): Se añaden a los medios de cultivo porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos microorganismos exigentes.

SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisódicos y bipotásicos): se utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor.

INDICADORES DE pH: son indicadores ácido-base con el objeto de detectar variaciones de pH.

AGENTES REDUCTORES: se añaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerófilos.

AGENTES SELECTIVOS: son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en selectivo.

Clasificación

Su aspecto físico

Líquidos.

semisólidos

sólidos,

Clasificación

Por su uso:Medios selectivos

Medios enriquecimiento.

Medios diferenciales

Medios de transporte

Medios Simples:

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Extracto de carne

3.0

Cloruro de sodio

8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

•AGAR NUTRITIVO:Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

FUNDAMENTO:Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

CARACTERÍSTICAS DEL MEDIOPreparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

ALMACENAMIENTOMedio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

Medios Enriquecidos

SANGRE AGAR BASE: FUNDAMENTO:

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

Componentes ( gr/l) Preparación

Infusión de

músculo de

corazón

375.

0

Suspender 40 g del polvo en un litro

de agua destilada. Dejar reposar 5

minutos y mezclar perfectamente

hasta obtener una suspensión

homogénea. Calentar con agitación

frecuente y hervir 1 minuto. Esterilizar

20 minutos a 121°C. Enfriar a 45-50°C

agregar sangre desfibrinada al 5%.

Homogeneizar y distribuir en placas.

Peptona 10.0

Cloruro de sodio 5.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2A. PREPARACIÓN DE LA PLACA DE AGAR SANGRE: añadir en forma aséptica

un 5% de sangre estéril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a

45°C.

B. PREPARACIÓN DE AGAR CHOCOLATE: después de añadir la sangre y agitando

frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80°C por 10 minutos hasta que

adquiera un color pardo achocolatado.

Medio preparado: ámbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

MEDIOS DIFERENCIALES :

.

•AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI)

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

FUNDAMENTOEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

MEDIOS DIFERENCIALES: TSI

Medios diferenciales: TSI

A: ácido K: alcalinoCaracterísticas del medio: Medio preparado: rojoAlmacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC

MEDIOS DE TRANSPORTE:

I. STUART MEDIO DE TRANSPORTE

Medio destinado a la recolección, transporte y

preservación de muestras. Es útil para mantener

la viabilidad de gonococos y de otros

microorganismos de difícil desarrollo.

FUNDAMENTO: Medio semisólido, no nutritivo.

Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un

ambiente reducido y es útil para suprimir cambios

oxidativos en el medio de transporte, y azul de

metileno, que es el indicador de óxido reducción.

CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: ligeramente opalescente con

tonalidad azul dependiendo del grado de oxidación.

ALMACENAMIENTO

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Especificaciones

El fabricante debe especificar en cada medio:

a.- Contenido de humedad (medio deshidratado).

b.- Composición del medio.

c.- Método de preparación.

d.- Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado (en autoclave).

e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.

f.- Características de desarrollo de los microorganismos en el medio.

g.- Advertencia sobre la conservación de los medios preparados.

h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.

i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.

j.- pH del medio preparado.

k.- Fuerza de gel (si procede).

Sección IV:MATERIALES Y EQUIPOS MÁS UTILIZADOS EN EL ÁREA DE PREPARACIÓN DE MEDIOS

PLACAS PETRI AUTOCLAVE

HORNO DE ESTERILIZACIÓN BALANZA ANALÍTICA

REFRIGERADORMECHERO DE BUNSEN.

CONTROL DE CALIDAD DEL AUTOCLAVE

Para controlar la eficiencia del autoclave, recomendamos utilizar la cepa control Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus ATCC 7953.

También puede utilizarse otros controles comerciales, tales como las tiras reactivas, tapes para autoclave, cápsulas spot, etc.

De no contarse con ninguna de las anteriores, un método cualitativo consiste en colocar una cepa de Bacillus subtilis en un Tioglicolato. Incubar por 24 horas a 35ºC y posteriormente colocar el tubo durante la rutina de trabajo de la autoclave. Luego de la esterilización, se transfiere con un hisopo a un agar sangre el cual se incuba a 35ºC por 24 horas. No debe haber crecimiento en el agar sangre, si la autoclave ha trabajado adecuadamente.

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE CALIDAD QUÍMICO:

Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parámetros a evaluar, tales como:

PH, Conductividad, Olor, Color aparente, Turbidez, Alcalinidad, Dióxido de carbono, Dureza, Iones, Cationes, Metales pesados

MÉTODO:

Colocar en un vaso químico limpio :

10 ml de agua destilada a examinar

2 gotas de ácido nítrico

1 ml de Solución de NO3Ag

EVALUACIÓN:

El agua deberá continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina, indicará que la calidad es deficiente.

(Ref: manual de Técnicas Básicas OPS/OMS N° 439, pag. 58)

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICO DEL AGUA DESTILADA:

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato.

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre.

Incubar a 35.5 °C por 4 días.

Llevar un libro récord del control de calidad del agua.

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICO DEL AGUA DESTILADA:

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato.

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre.

Incubar a 35.5 °C por 4 días.

Llevar un libro récord del control de calidad del agua.

Sección V: CONTROL DE CALIDADPROTOCOLO DE CONTROL DE CALIDAD INTERNO DE MEDIOS DE CULTIVO:

Aspecto físico: nivel, volumen, color, empaque.

Control de esterilidad

Control de funcionalidad.

Calidad microbiológica : método ecometrico, cepas de referencia .ATCC.

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE ESTERILIDAD:

Se comprueba que no haya desarrollo microbiano en los medios sin inocular en las condiciones de incubación habituales.

PROCEDIMIENTO DEL CONTROL DE ESTERILIDAD

Seleccionar al azar 5 placas o tubos e incubar 24 horas a 35°c y luego 24 horas a T° ambiente. Con esto se aproxima a una muestra de 5% de los lotes de 100 o menos palcas o tubos.

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE FUNCIONALIDAD:

Consiste en comprobar la capacidad del medio de recuperar un bajo número de los microorganismos más sensibles para lo que ha sido preparado, la capacidad de inhibir un alto número de los microrganismos que deben ser inhibidos en caso de los medios selectivos y de medios diferenciales.

PROCEDIMIENTO DEL CONTROL DE FUNCIONALIDAD.

Preparación del inoculo: el inóculo varía dependiendo de la capacidad nutritiva o inhibitoria del medio a probar y determinar si las bacterias son más o menos exigentes en sus requerimientos.

Bacterias no fastidiosas: se utiliza un caldo soya tripticasa con 4 a 5 horas de incubación en fase de creciente exponencial dejar a una concentración equivalente a 0.5 Mac Farland.

Bacterias fastidiosas: se utiliza un cultivo de 18 a 24 horas de incubación en medio solido apropiado se realiza una suspensión equivalente a 0.5 Mac Farland.

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

CEPAS DE REFERENCIA .ATCC

Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas. Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domésticas o cepas control comercial (ATCC).

La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC. (Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia), por ejemplo para el agar de sal y manitol

es probado con:

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO: MICROBIOLÓGICA

CONTROL DE CALIDAD

Para el control de precisión y exactitud del Mueller Hinton Agar se usan las siguientes cepas control:

Escherichia coli.......................ATCC 25922

Staphylococcus aureus…........ATCC 25923

Pseudomonas aeruginosa........ATCC 27853

Enterococcus faecalis...............ATCC 29212

Klebsiella pneumoniae ............ATCC 700603

Para evaluar el desempeño de inhibidores de

enzimas betalactamasas en Mueller Hinton

Agar, se utiliza la cepa control:

Escherichia coli .........................ATCC 35218

Para el control de precisión y exactitud del

Mueller Hinton Sangre Agar se utiliza la cepa

control:

Streptococcus pneumoniae .......ATCC 49619

CONTROL DE ESTERILIDAD : Medio sin inocular resultado medio sin cambios

Sección V: CONTROL DE CALIDAD

MÉTODO ECOMETRICO

Técnica simple que permite recuperar, comparar y cuantificar el crecimiento de microrganismos con cargas de UFC definidas en los diferentes medios de cultivo.

Con esta prueba se evalúa la selectividad y productividad de medios de cultivo.

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO: MICROBIOLÓGICA

Si hay crecimiento en las cinco

estrías de los cuatro cuadrantes y

la estría central, el índice de

crecimiento tiene un valor de 5.

Figura 2. Prueba Ecométrica de agar xilosa lisina desoxicolato, se sembraron tres cepas que crecen en el

medio de cultivo (S. typhimurium, S. enteritidis y C. freundii) y tres cepas que son inhibidas (S. aureus, S.

epidermidis y B. subtilis).

 

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

(a) Rajadura del plato o envase.

(b) Rajadura en la superficie del medio.

(c) Variaciones en el volumen del medio.

(d) Hemólisis.

(e) Cristales en el medio.

(f) Presencia de burbujas.

(g) Presencia de coágulos.

(h) Cambio de color normal.

(i) Contaminación.

(j) Falla en la inhibición de microorganismos saprófitos.

FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO:

VALOR DE PH INCORRECTO: Medir el Ph por encima de los 25°C. Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50°C. Solución incompleta del medio. Mala calidad del agua. Recipiente mal lavado o con residuos químicos. Mala conservación del medio deshidratado o vencido.

TURBIDÉZ O PRECIPITACIÓN Mala calidad del agua. Sobrecalentamiento. Ph incorrecto. Solución incompleta.

OSCURECIMIENTO Sobrecalentamiento. Solución incompleta. Alteración del Ph.

GEL BLANDO 

Bajo porcentaje de agar en el medio. Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos. Sobrecalentamiento. Mala homogenización del medio. Exceso de agua.

CRECIMIENTO BACTERIANO POBRE Exceso de calentamiento. Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente. Alteración en el Ph.

SECCION VI: DOCUMENTACION - INFORME DE CONTROL DE CALIDAD

El informe como mínimo debe contener:

Nombre del medio de cultivo evaluado

Número de lote de medio evaluado

Fecha de realización del análisis

Cepa usada (género y especie del microorganismo, y clave)

Medio de referencia usado para evaluar la productividad

Los resultados de productividad, selectividad, promoción de crecimiento

Prueba ecométrica

Porciento de recuperación bacteriana

Prueba de esterilidad y pH.

“

”

GRACIAS POR SU ATENCION