REPUBLICA BOLIVARIAlVA DE VENEZUEL,A UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE AGRONOMIA DPVISIÓN DE ESTUDIOS P

PROGRAMA DE PRODUCCION ANIMAL

CdkPAGIDAD DE DESAWOLLO DE OVOGITOS BOVINOS CMOPmiFEEaVDtX OBTENIDOS A PARTIR DE IPEMBMS MESTIZAS.

Trabajo de Grado para optar al Título de Ríagister Scientiarum en Producción Animal.

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Rea l ido pof : 2fibl,:G2 &&';2 " ' ' . , . , . .

. * I , , : . ' . t . .

Lic. Franci*?. Bá ez chntntn :ras. , . , ? . ' ! ' ' . . . . . . , , . . . . . , . ,,.; . ~ , 5~ 1 > . , , . C.l. 14'356 421

Tutor: Dra. PaPricia C. Vil1 amedianil M.

1 i " ; , : .:: -' " . , 3' ., . . I C.]. J O 446 255

Maracaibo, julio 2009.

r I - 1 , i O Q . , IPAC~IP . .~D 011.: ~ I E S A R R O L ~ , O DE O ~ ~ ~ I C I - I - ~ I I S U O I ~ ~ O S C'laiáPo:aab:sEgi$ .$DOS 8:37'E\ID?iS r,-iii-ñart ntE ai3.:hisiaPrtj\s hJiE:;-I-a; ,Y; Trabajo de Grado. 1 :t Liiii\ci.\idntl ilcl 7iilia. Facii1iqii tlz t2gi-niil>iiiiri. Mai-acaibo, V~:iie.e.cI,~, 3009. 91 p.

211 este ~i.irli;ijo los espcr-iiiientos tiieroii coiid~ici(los para evaluar el clecto de la viti-iticacibii en paj~icla csiiracla (OPS), iitilizaiido ctileriglicol y sacarosa conio crioprotectores, ;vbn la sobi-evi\:ciicia iiioifológica, progresión iiici6tica y desarrollo eiiibrionario de ovoc,itos boviiics ohtciiitlos dc \latas incstizas. Para cllo o\/ociios bovinos iiind~irndos in \>;ti-c? fije-oii vitrificatloi en OI'S. O\ acitos soizctitlos al iiiisino proioiolo si11 viti.iticar f~icion iiiilizados coiiict coiitri l . I< i~ i !OS ovocitvs licscos y i-ecii.11 descoiigelados iiie vaioi-otln la sobi-cvivencia ovocit;ii-i;~ a t r a ~ + s d: I r i

evaluaci6ii iiiorl*ol6gica y coi.i.ohorada coi1 la liiicicíii vital con iod~:i.o de pi-opidio (IP). Uiia \le/ dcscoiigclutlos, los ovocitos f~icrvri sclcccioiindos, rcciindridos y ciiltivados i ~ ? ~ i t r o . Los ovocito< clc iiiiibos gi.111x)s espci~iiiicntalcs liici-o11 tcfiitlos i t l tolo pi11.a c\~alii;ii la inndiiiaciO i i~iicleai y ;is i ~;~ic~r;:ciciii cspci-iiiiiiicn. Se vrilorii In insn (le di\.isiOii ciiibr-ioiiarin y dcsai-i-ollo ciiihrion;ii-io li;;si I los S tl dc. ciiltivo i t ~ i~ i t t . o . l.:] iiiayoi tasa tlc sobi.e\;i\~ciiciri iiioifolrígica st, ciicoiiti.~i cii 1 0 ; o\.ocitos li.escos eii riiiibas teciiicns tlc \.aloi-ncióii. Los ovocito:; qiie piescliiiaioii e l iii:iyoi por~ccii~ri~jc clc tIc~eiiei~;icii)ii cc~ri.cspoiidi6 ril 2ri1p0 \~ii~~iI¡c:~c!~ sicii~lo e \ ~ ~ ~ I ~ i r i t l i ~ s l>:i.jo el ci i(e~.io th:

. - \ ~ ; i l ~ i i - ; ! i . i ( ' ) i ~ ~ i i n l , ol)sci-\s:i~iilvsc i i i i r i clil-ci-ciiciri csi;i~lislic;iiiicii~c .igiiilic;iti\,n (1).-:!).05 coi 1,: \~~iloiricitiii iiiorli)l6gicn y cl gi.iipo (le o \ , o c i t ~ s I ~ I ~ C S C I : S . 1-ii 1:15;1 tlc I i i ;~~I i~~~;~ci i ) i i dc1 griipo COI! isc!I lile tlc í)S,S5'!,;1, dilii-iciitlo clc In ;ilc¿iii/.ntla cri el gi'iil)~ tic u\ociios viii.iliicaclos (53.4'16: ~ : l ; . : ) 5 ) . 0 1 1 O0.02'~1~'l Iirc cl poi~ccii~:i~jc clc Ikc~~~icl:~ciOii rilc;~ii/:~cIo 130r el yi.irpo coii~i.oI~ :l ciial (liI:ri(j cicl yl.iipo 1 i t ~ ~ i l ~ c ; i ~ l o ( S . 1 I'',,i: 13.:.().05). 1:l ~ I ~ o ~ ~ ~ c o I o ( I c \ i (~ . i ¡ i~~:!~, i ( ' ) i~ cori 01's iitiIi~:~.lo cii c51c ~ , \ t i ~ ~ l i o ~

. . ~ ~ \ ~ i l l ] 7 l ~ ~ ~ l l l ~ ~ ; l ~ ! 1 ; ) c:l~7;lci~l;l~l tlL! 'lc~;li~l~ollo ,!c lo, 0 \ O ~ ~ l b O ¡ l % , , \ l i l í i ~ c~-ioj3l~cscl~\;l~lo>; lll:li!tl .;l(Io i i ~ . . O 1 1 i c l 1 c l \ 1 r i 1 1 i / : 1 . 1 1 1 C 1 1 1 1 1 i C : l l . 1 5 : tic L c l l ? l ; c i , ! ! , . i ,

. . . , ( 1 1 . ~ i...1(:11 ,.ii:l.~i./iil~:ii.i:i.

Báez, Conheras, Francisco José. DEáíELOPMENT CAPABILPTY 8 F CR.YOPRE SER VE 9 BOVJNE OOCYTES OBTATNED FROM CROSSBRED FEMALES. Ida Univeisida:! ce ! Zulia. Faculty of Agronomy. blaracaibo, Venezuela, 2009. 81 p.

This research was carry out For evaluating vitifiication effect on Qpen Pulle11 !itraws [OF:) ;):y.

using ethyleneglycol and sucrose as crioprotectants on morphologic survivai, :neiotic progress and enibryonic development of bovine oocytes fiom crossing cows. Here, bov ne oocytc:~ in vit.-c niatiired were vitrified in OPS. In both, fiesh and earlier thaw oocytes were tested thr ir o< cytz survivsl through morphologic assessinent and veriiied with vital staining prop dium iod de. iifr:: tliawing, oocyies were selected, fertilized and in vitro ctiltured. Experiment:J ooc1.tes ve-c stained il7 roto with orcein-acetic for evaluating nuclear maturation and spermatic penetraticn rate. Also, einbryonic division, quality and developnient to 8 d of in vitro cultiire was cvalu,itej. Oocytes thst sliowed the highest percentage of degeneration were froiii vitrified gro ip bcin5, assessed according to vital staining test, observing a statistically significant d fference 'p <T1,O 5 ) \\.itli tlie iiiorpliologicnl asscssincnt of vitritled oocytes aiid tlie fresh groiip. Tlie iiiatiii. itioii ra-e of tlie control group \\,as 68.85%, differing it íi-oni tliat achieved in the groiip of vitritie'l oocyt($s (53.4%, p <0.05). The fertili7ation rate achieved for the control groiip wis 69,02(6, ~,\!iic!i diffcred froiii the vitrified groiip (8.1 1%, P c0.05). The vitrificatiori OPS's pr~tocol iis id i l i t l i i \ :.cseascii coiiipi-oiiiiscd tlie de\ elopiiicnt capacity of boviiie cryopi-eses\ ed cocytcs i11 i\ir! c

iniitiiscd froiii crossl~red cnws by fiiidiiig rediiced rate of fcrtilizatioii nrlcl of absencc cii~l- 1 1 -, \ 111 c di\ isioii.

RESUME? ;

AL3STRAC:T

INDICE I>E CONTENIDO

LISTA DE TABLAS

LISTA DE FIGURAS

FUNDAMENTACI~N TEÓMICA 1. Criopreservación de ovocitos. 1.1. Principios Básicos en criobiologia. 1.2. Crioprotectores. 1.3. Técnicas de criopreservación. 1.4. Aplicación de la criopreservación de ovocitos. 1.5. Alteraciones causadas por la criopreservación.

2. Bases Fisiológicas de la Maduración Ovocitaria. 2.1. Ovogénesis. 2.2. Maduración in vitro. 3. Fecundación de los ovocitos. 3.1. Bases Fisiológicas. 3.2. Fecuiidación ir? vitro. 3.3. Valoración de la Fecundacicn i i 7 vitro. 3.4. Anoi-iialías de la Fecundación ; I I vitro. 4. Uesai-rol lo Embrionario. 4.1. Priincros estadios dcl Dcsariollo cn~brionniio. 4.2. ('\i!iivo i i ~ viti-o Je Eii~l~rionct;. 4.3. Valor.;icirjn be1 desarroilo y viabiiitir:d :inbrion:aria

METODOLOG~ A 1. Obtención y se!ección de ovocitos. L . Maduración in vitro de los ovocito. 3. Preparación de las pajuelas estiradas. 4. Vitrificacióii de los ovocitos. 5. Fecundación in vitro. 6. Cultivo in vilro de embriones. 7. Valoración de los resultados. 7.1. Sobrevivencia ovocitaria. 7.2. Progresión meiótica. 7.3. Evaluacióii de la fecundación in vitro. 7.4. 'Evaluacibn de la tasa de división y desarrollo embrionario.

RESUL'f ADOS l . Evaluaci8n de la sobrcvivencia morfológica dc ovocitos bov:nos

vitrificados madurados in vitro, 2. E-~aluación cle la progresión nieiótica de ovocitos bovinos

vitrificados. 3. Eval~aciiaii de la fecundación in vilr-o de ovocitos bovincls frescos y

vitn'ficados. 4. EvaliiaciO~i de la tasa de divisi611 y desarrollo einbrionario. 5 . Evaluación dc la calidad embrionaria.

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

LISTA DE TABLAS

Página 3 a

Tabla 1. Factores asociados con la qnopreservaciófi que contribuyen 2.1 .

daño y muerte celular en sistemas biológicos: 2ti

Tabla 2. Sobrevivencia morfológica de ovocitos bovinos vitrificados. 54

Tabla 3. Progresión meiótica de ovocitos bovinos vitrificados. 5 ~ 1

Tabla 4. Tasa de fecundación in vitro de ovocitos bovinos vitrificados. 5 ' .

Tabla 5. Número y calidad de blastómeras de embriones PIV. 5:

LISTA DE FIGURAS

~ i ~ L r a 1. Sobreviveiicia rnoifoiógica de ovocitos bovinos vitrificados. 5 7

Figura 2. Progresión meiótica de ovocitos bovinos. 5 ; ;

Figura 3. Valoración de la fecundación. 5:<

Figura 4. División y desarrollo embrionario. 5 ' )

Figura 5. Evaluación de la calidad embrionaria. 51)

I:n las últimas décadas se han realizado considerables esfuerzos en poner s. punto los

procadimientos de maduración (De Wit y Kmip, 2001), fecundación (Sagirkaya y col., 2007) y

c:ultivo in vitro (MN-FIV-CIV) para la producción itz vitro (PW) de embriones bov nos (Pere ira

y col., 2005). La aplicación a gran escala de estas biotecnologías reproductivas pued~: replpreser tar

.Jna mejora notable de los recursos ganaderos al permitir obtener animales cori mejcres

'raracterísticas de importancia económica resolviendo de manera importante el problema dt la

disponibilidad de alimentos, la conseevación y salvaguarda de la variabilidad genética de

especies en peligro de extinción y a su vez aprovechar y hacer uso de los animales de alto ~íi lor

genético mediante la conservación de gametos.

Los ovocitos recuperados de ovarios recogidos en matadero se han convertido e l una fbtnte

ampliamente usada para las biotecnologías repivductivas entre ¡as que se incluyen la producc ión

in vitro de embriones, el clonaje y la transgenia, que ha su vez permiten disponer cle material

gentStico, sobre todo de animales nativos o criollos. El establecimiento de programas de BIL de

emktriones bovinos tiene un gran potencial como método para obtener un elevado niimeri: de

embriones en el mismo estadio de desarrollo, tanto para su utilización comercial c3nio estuilios

científicos (Sirard y col., 2006).

El clesamllo e implementación de los programas de P N de embriones, clonaje y la transgenia,

ha astimulado significativamente la criopreservación de gametos en especial la dle ovac itos

mamíferos (Shaw y col., 2000) entrando a formar parte de estos programas por el

establecimiento y mantenimiento de bancos de germoplasma (Vieira y col., 2002). Hoy día,

existe un gran interds, ante la posibilidad de obtener blastocistos a partir de ovoc:itos

criopreservados, convirtiéndose esta en una prioridad, que a su vez hace posible la evaluaci jn y

disefio de protocolos de criopreservación cada vez más eficientes (Agca, 2000; Jvla~ssip, 2303;

Stachowiak y col., 2008).

Det~afortunadarnente, los protocolos desarrollados para una especie en concreto son usualt~~ente

muy difíciles de adaptar a otra, debido a las diferencias en el tamaño del ovocito y' SU

serisibilidad al enfriamiento y a los crioprotectores. El factor más crítico para la criopreservz.ción

de ovocitos es su compleja organización subcelular, lo que ocasiona dafios a nivel df: los

elementos del citoesqueleto, la placa metafásica y la integridad de los microtúbulos (Shaw y col.,

2000). Es por ello que la criopreservación de ovocitos bovinos continúa siendo un desalío. a

pesar de los progresos significativos alcanzados recientemente (Vieira y col., 2002).

La capacidad de desarrollo de los ovocitos que han sido congelados, medida ;amo el r úmero ;le

embriones viables en relación con el número de ovocitos congelados, se mantiene bija

comparada con la obtenida a partir de ovocitos fiescos (Albarracín y col., 2005). Estos Iesulladx

no se limitan a la técnica de criopreservación per se, sino también a las condiciones o pasos

previos a esta, como lo son el origen, estadio de desarrollo y MIV de los ovocitos :os criales

pueden afectar su desempeño. Men y col. (2002), confirma que los protocc1o:j de mduritcion

pueden afectar el coiilpoi-tairiieiito de Los ovocitos frente a la criopreservacioi~

Con el propósito de superar los efectos de los diversos pasos involucrados eii I~DS pmt~colr~s de

congelación-descongelación sobre la estructura del ovocito, cuyas consecuencias direct 3s son Las

bajas tasas de fecundación, la alteraciones del huso meiótico y la placa irietafásica (Vajta y

Kuwayama, 2006), se ha planteado la vitrificación como uno de los métodos más prorletedora:~

para solucionar los problemas que conlleva el criopreservar este fipo de célula (Massip, 2003).

Aun así, en la actualidad, se han vitrificado ovocitos de varias especies animales, rata (Clicn y

col., 2004), cerda (Men y col., 2005; Fu y col., 2009), búfalo (Wani y (:o]., 200~-), yegLa

(Maclellan y col., 2002), cabra (Beging y col., 2003), oveja (Al-aghbari y Menino, 2002; Dattena

y col., 2004;), vaca (Otoi y col., 1995; Matsumoto y col., 2001; Mavrides y h!oi~ol, 2002; h4ei1,

y col., 2002; Rodríguez, 2004; Diez y col., 2005; Albarracín y col., 2005; Malirides 11 Morral,

2005; Vieira gr col., 2006) y humano (Boiso, 2001; Tan, 2004; Chen y col., 2004).

La principal estrategia de la vitrificación es pasar por el rango de temperatura critic i. lo más

rápido posible para así disminuir el riesgo de daiio celular y llevar a la célula hasta la

temperatura de -196 "C (Albarracín y col., 2005), se basa en la rápida en una mezcla de

criopmtectores utilizados a altas concentraciones, que a bajas temperaturas aumcmtan sa

viscosidad formando vidrio, sin la formación de hielo. La consecuencia negativa de esti técnica

radica en el incremento de las posibilidades de lesionar las células debido al ch~que osmjtico y a

la toxicidad de los crioprotectot-s. Sin embargo, se ha intentado disminuir estos efectos

negativos, con el uso de crioprotectores menos tóxicos o la combtnación de ~;ri,oprotectore>, l,i

iitiliz,ación de esto S por etapas o la implementación de soluciones co~icentradas preenfhat las

(Vajla, 2000).

.En este sentido. la selección de los crio~rotectores juega Parte fundaniental en e: éxito de la

criopreservación. En el presente trabajo se utilizó el etilenglicol (EC) como l:rioprote< tor

penetrante de bajo peso molecular, a una concentración de 1,8 y 7hI. El EG es el ;riogrotec tor

mas ampiiamente utiiizado para ia vitrificación de embriones y ovccitos debic'o a su iaja

toxicidad celular v su rá~ ida difusión a través de la membrana ~1asmátic;a. Se utiliaj la sacarxa

como crioprotector no penetrante, a wla ccncentración de 0,2 M y 0,6 hl Diferentes estudios nan

demostrado que el EG junto con la glucosa, la fructosa, la trealosa o 1;t lactosa son capace: de

encs.psuiar ai ovocito o embribn previniendo la cristaiizacion mtraceiular ciurante ia

desc.ongelación v actuando como tam~ón al reducir el choaue osmótico aue Podria resultar dz la

dilución del crioprotector. También se ha observado que la adición de i:izúcares a 111s medio!: de

criopreservación favorece la estabilidad de la membrana plasmática durante e proceso de

vitrificacion y ciescoiigelacioii (Lieberiilaiiii y coi., 2üüZj.

Mucho de los avances aue se han obtenido con la criovreservación de c~vocitos señalím un éxito

limitado. Los protocolos clásicos de congelación han sido substituidos por los mtitodos más

recientes de vitrificación, incluyendo entre estos varias modificaciones., tales como \itrifica:ióri

en pajueias estiradas (open puiled straw -0PS-) (Vieira y col., 2002; Vajta y Kuwr~y;~ma, 2C06),

aue ha isermitido aumentar la velocidad de los cambios de tem~eratura. lo aue afiece cic:rtas

ventajas para la congelación, conio lo son: la disnlinución de la concentrsckm de los

cnclprotectores, y además el paso más rápido por la zona de temperatura crítica, lo q.ue pro~iuce

meiios daños por enfriamiento (Silva y Berland, 2004). Sin embargo, los ovocitos mamíieros

siguen siendo uno de los células niás dificiles oara criooreservar (Diez v col.. 2005). Desour:~ ulz

la c:nopreservación los ovocitos se encuentran comprometidos para el continuar sil desar :o110

normal (Men y col., 2003;). El estadío meiotico en que se encuentran los ovocitos irifli.iiye sot re la

capacidad de estos para sobrevivir al proceso de vitrificación (Rodiíguez, 200.1) y sobie su

car~acidad de desarrollarse desoués de la FN (Coticchio .J col.. 2005).

Esio isuede ser emlicado Dor el daño nuclear (Men v col.. 2003). aue incluve la dt~scrganiziición

del huso meiótico y otras alteraciones observadas en ovocitos vitrificados (Albmacín y col..

2005). Los ovocitos vitrificados luego de hIIV son más aptos para continuar su d~:sarrollo Iiiego

del proceso de criopreservación al mostrar un citoesqueleto más flexible, lo q le puede ser r.na

razón para que estos sean menos susceptibles al daño crioinducido que los c~voci;os

criopresenrados en estadio de vesicula germina1 (VG) (Wodíguez y col., 2004; Báez y col ,2008)

Para definir la importancia de la contribución de los ovocitos bovinos criopre:;ervados jobn: l a

calidad de embriones PW, es itnportante primero, definir claramente los diferentes 1:anibio:

fisiológicos que el ovocito puede sufrir (Gardner y col., 2007;r, lo que torisecuentementc,

determinará su viabilidad después del proceso de co~gelación y descongelación i7i'avin y Ai .3~ .

2007). Es abundante la literatura concerniente a la calidad de los embriones bovinos, obt,:nidc.s s.

partir de ovocitos criopresen.ados. La influencia de la calidad de lo:; ovocitos s ~ b r e el dt sar:(::llc

potencial ha sido reconocida en vacas más que en otras especies (Sirard y col., 2OCi6).

Estudios previos en nuestro laboratorio, con ovocitos bovinos vitnficados inmsiiiroc J

madurados in vitro, recomiendan evaluar la capacidad de desarrollo de los >voc,to:;

criopreservados madurados in i9itro luego de la fecundación in vitro hasta el estadio dt:

blastocistos. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, el objetivc general de +:st~:

trabajo fue determinar el efecto de la vitrificación en pajuela estirada (open ptnrled stiaw -0PS- I

sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos de hembras mestii:as Para ello st:

plantearon los siguientes objetivos específicos:

Evaluar la sobrevivencia morfológica de ovocitos bovinos vitrificados maduratios in i.itr.o.

Analizar los efectos del proceso de vitrificación sobre la tasa de maduración in 1litr.c; di:

ovocitos bovinos median te anhlisis ci togenético.

Analizar los efectos del proceso de vitrificación de ovocitos bovinos madurzdc~s in viiro sclbrc:

la tasa de fecundación.

Estudiar los efectos del proceso de vitrificación de ovocitos sobre la calidad de er~bnc~ne;

bovinos producidos i~ vitm mediante el conteo del níamero de blastomeras.

El objetivo esencial de la criobiología es el mantenimiento de la viabilidad y fbncionalidad

celular considerándose la supervivencia celular a la congelación como el producto cle numerc sos

efectos que interaccionan entre sí (Vila, 1984). Al conservar células a teinperahiras

extremadamente bajas (-196 "e) es posible detener por completo la actividad enzimática, la

respiración celular, el metabolismo, el crecimiento, la multiplicación, etc., es decir, es poslble

mantener las células durante un largo periodo de tiempo sin afectar su viabilidad (Schneid1:r y

Mzmr, 1984). No obstante, la mayoría de las células mamíferas mueren cuando se expont:n a

bajas temperaturas, a menos que previamente hayan sido expuestas a una solución que las proteja

y a rangos de enfriamiento y calentamiento específicos (revisado por Shaw y col., 2000).

La criopreservación de material biológico tiene lugar usualmente en soluciones acuosas, con

diferentes solutos presentes. Las propiedades fisicoquímicas que rigen los evento:; a los cuales

esti. sometida la solución durante la congelación deriva de la concentración disuelta eri ella O:all,

1992). Según Macfarlane (1987), cuando los líquidos de una solución acuosa son sonietidos a la

congelación, uno de sus componentes presenta la formación de una fase cristalina, mientras que

el resto permanece en forma sólida con apariencia de vidrio, sin la fimnación dr cristale; de

hielo.

La formación de este vidno puede ser vista como una de las propiedades intrínsecas cle todo:; los

Iíqiiidos incluyendo el agua y las soluciones acuosas, que al ser sometidas a un alto grad~) de

congelación, evitan fuertemente la formación de la fase cristalina. En soluciont:~ acuosa; de

algunos líquidos moleculares, como el etilenglicol (EG), la formación de vidno t:s usualrente

observada a concentraciones superiores a 40% p/p. Esta composicióri corresponde a aqu~:llos

cornpuestos, en los cuales el punto de congelación de la solución ha sido lo s~ficientemenee

disminuida (Macfarlane, 1987). Cuando el crioprotector (336) alcanza una cierta ccinc:entración a

bajas temperaturas, la viscosidad es suficientemente alta para impedir la crisi.alización (e11

función de la velocidad de enfnamiento) (Rall, 1987). La formación de hielo aparece sc~lamenie

ctiando las concentraciones de los compuestos que conforman la solución son lo suficieritemenie

bajas (Macfarlane, 1987) o cuando son sometidas a temperaturas de congelación cue: oscilan

alrededor de -1 50°C como sucede con EG (Bronshteyn y Steponkus., 1995).

Los efectos de las bajas temperaturas y la formación de hielo en los sisteinas biológicos son los

a:gectos de mayor importancia para la supervivencia de los organismos que son sonietidos a a

ciiopreservación El principal factor biofisico de destrucción durante el proceso (le

ciiopreservación es la formaci6n de hielo intracelular que puede ser evitado por una adecuac'a

d~:shitlratación de la célula, por eso se reduce el agua intracelular, pudiendo limitar 21 daño d=l

p roceso de criopreservación (Fabbri y col., 2000).

El daio en las células sometidas a temperaturas bajo cero, parece ser debido principalmente a

d,3s ftictores fisicoquímicos: la concentración de solutos que acompaña la formación del hielo y

la aparición de los cristales de hielo en el interior celular. La incidencia de la lesiín, en estos

casos, depende de diversos parámetros y espacialmente de la permeabilidad de la iriembraiia

c:lular, que determina notablemente la probabilidad de nucleación intrac:elular y también de la

ri:lacibn superílcie/volumen celular (Marin, 2003).

C'uanilo una célula es en£iiada entre -5 y -15°C se da la formación de hielo en el medio

extracelular. Desde entonces, los cristales de hielo son incapaces de cruzar la niembraia

plasniática, por lo que se evita la nucleación de hielo intracelular. El citoplasma se sobreenfiía

(yenrianece en estado líquido alcanzando aún temperaturas por debajo de si. punto ie

cristalización) y por definición presenta un alto potencial químico y, a consecuencia, el agua ie

ciertc modo sale a la solución externa congelada (Fabbri, 2000).

61i e1 enfriamiento es lo suficientemente lento, la célula va perdiendo agua de manera que se

i ncrementa la concentración intracelular de solutos y el potencial químico del agua intracelu ar

se equilibra con el agua extracelular. Así la célula se deshidrata pero no se pi-oduce la

c:ristalización intracelular. Si el enhamiento es rápido, la célula no consigue perder agua

sufic ente para conseguir el equilibrio y se produce un sobreenfnamiento que conduce a la

17

cristalización del agua intracelular. El tamaño de los cristales de hielo dependerá de ' a -velocidad

de enfriamiento. A más velocidad, los cristales son más pequeños Fabbri, 2000) Tanto una

excesiva deshidratación celular, como la formación del hielo intracelular son causas (te muerte

celu1;tr durante la congelación. Ambas situaciones depende de la permeabilidad de 1,1 rnembr~na

plasnlática al agua (Marin, 2003).

Según Fabbri (2000), otros de los sucesos críticos en los procesos de criopresenación, es la

ciescongelación. El problema que puede surgir durante este proceso es la recristalizac!ón cor la

jormación de hielo intracelular, que puede reducir la sobrevivencia de los ovocitos congelados.

Si una pequeña cantidad de agua intracelular está presente cuando el ovocito es smiesgido en

ilitrógeno líquido, pequeños cristales de hielo pueden formarse. Bajo estas circunsirancias la

Formación de hielo intracelular es más probable que ocurra si la descongelación es lerita, puc sto

que permite la formación de cristales de hielo a medida que aumenta el daño al ovocito.

Brorishteyn y Steponkus (1 995) establecen que, durante la descongelación los crist;lles aparecen

con una velocidad proporcional al movimiento de las moléculas (le agua. La movilidad

incrementa con el aumento de la temperatura, entonces la cantidad de hielo que se 63nna duriuite

la descongelación puede ser mucho mayor que la formada durante la congelación

Consecuentemente, el daño crioinducido a la célula está en función de la cantidad de hielo

fomiado, en conclusión el grado o proporción de deterioro durante la descongelacióri puede ser

maq or que el que ocurre durante la congelación

Fabbri (2000) propone que el proceso de descongelación debe ser muy rápido, para así penaitir

una muy rápida dispersión de los cristales de hielo a nivel intracelular; dcnc!e el t ielo

exti.acelular se derrita y difunda por la membrana en estado líquido hidratando el ovouito.

Asliwoo-Smith y col., (1988; citado por Boiso, 2001) observaron que un cambio en la fonia o

defi~rmación de los ovocitos ocurre como resultado del contacto con el frente del hielo, y quc: ese

contacto podría ser responsable de la formación de un punto débil a través de la cual se lisaría el

ovc~cito al descongelarlo.

Los agentes crioprotectores son esenciales para la criopresewación de casi todos los sistemas

biológicos. Estos aditivos aunque no permiten 100% de supervivencia después de la c:origelacion

y descongelación, pueden prevenir muchos de los daños causados por la congela~:icn (Fahy,

1986).

E l papel de los agentes crioprotectores además de que presentan una adecuada v(:lclcidad 'le

enfriamiento, mejoran la viabilidad celular alterando el comportamiento fisico-químico de las

s~~luciones acuosas en ¡as cuales tiene lugar la criepresenración. Son sustancias miiy

hidro:;olubles y de baja citotoxicidad. Para los procedimientos de criopresewación (le ovocitcls,

la coricentración del crioprotector es muy importante, usualmente se encuentra alrededor de 1,5

A l , muchas veces superior que cualquier otro componente del medio, permitiendo la enitrada c el

agentz crioprotector por ósmosis; por lo que es de gran importancia establecer el tiempo le

expos.ición del ovocito a Ia solución crioprotectora, lo cual depende de las características de la

permeabilidad y composición de la membrana, el volumen de la célula, la tempc:ra,tura y la

diferencia de la presión osmótica entre los dos lados de la membrana. Un tiemp3 (adecua~io

permitiría una deshidratación favorable de la célula, y un tiempo inadecuado la dañaría y

alteraria el pH intracelular así como el desarrollo potencial del cigoto (Fabbri et al, 2006).

Los crioprotectores pueden clasificarse en dos grupos de acuerdo a la permeabilidad a través le

l i i m2mbrana celular: agentes penetrantes y no penetrantes Los agentes penetrantes son

sustancias de bajo peso molecular y por ello permeables a través de la membrana, quí: proteger a

1;t célula de las lesiones producidas por la congelación a velocidad lenta (Fabbn y col., 2000).

E:llos reducen el punto de congelación de la solución, previenen la exposición del ovocito a

concentraciones altas de electrolitos extra e intracelulares debido a su sustitución p;ucial por el

agua. Los más utilizados en Ia congelación de ovocitos son: 1,2-Propanodi<il (PROII),

dimeiilsulfóxido (DMSO), etilenglicol (EG), glicerol entre otros (Rall y col., 1992).

1'0s agentes crioprotectores no penetrantes son sustancias de alto peso molecul;ir, que s>n

efectivas cuando se utilizan velocidades altas de congelación. A pesar de que no peletran en la

célulii, ejercen su acción crioprotectora promoviendo una rápida deshidratación celulai y suelvn

19

IIsarse asociados a los agentes penetrantes; ellos incrementan la concentración dc: 1'3s solctos

l:xtre.celulares generando un gradiente osmótico a través de la membrana celular, con la (lue

,atraen agua fuera de la célula deshidratándola. Los más utilizados son: sacarcsa, g l u c c ~ ~ ,

dextrosa, polietilenglicol (PEG), Ficoll y lipoproteínas (Fabbri et al, 2000).

En general, los crioprotectores son sustancias muy hidrosolubles que además de contribuir . I la

deshidratación celular por efectos osmóticos, actúan modificando el comportarrieiito físico-

quíniico de las soluciones acuosas. Modifican la estructura de las moléculas de agua, por una

partt: rompiendo uniones de hidrógeno y por otra, ligándose a ellas. Al actuar, en esta última

característica, se impide la formación de hielo contribuyendo a favorecer la vi tnficac ión,

especialmente, a partir de ciertas temperaturas (Marin, 2003). En este trabajo se uti1i::ará

etilenglicol (EG) como agente crioprotector penetrante, debido a su alta permeabilidad i la

membrana y su baja citotoxicidad; como crioprotector no penetrante se utilizará 1;t sacaros;l, el

cual contribuye a regular la concentración intracelular del EG durante la vitrificacicin y remi eve

efectivamente el EG del citoplasma del ovocito durante la descongelación (Cha et al, 2000).

1.3. Técnicas de ciiopmseivacibn

En las tres últimas décadas, la criopreservación de embriones y ovocitos ha sido una herramirnta

útil para interrumpir y controlar el ciclo reproductivo (Rall, 1992). Sin embargo, en contraste cori

el r:ipido desarrollo de procedimientos en las décadas de los ochenta y iioventa del siglo pasado,

los adelantos nuevos con profundas consecuencias prácticas se han alcanzado sólo recientemente

(Vajta y Kuwayama, 2006). La mayoría de las investigaciones y aplicacioiie:; han sido

concentradas en tres especies: ratón, ganado bovino y humanos. La criopreservación en gaiiado

bovino es un componente integral para la transferencia de embriones y es usado para transp~rtar

críels genéticamente superiores internacionalmente (Rall, 1992). El procedi1nit:nto d: la

criopreservación involucra una exposición inicial de las células a los agentes c:ioprotect)res,

congelación a bajas temperaturas, almacenamiento, descongelación, y finalmente: la dilucijn y

renioción de los agentes crioprotectores, volviendo a un ambiente fisiológico que le permita el

des.arrollo a la célula criopreservada. Durante la congelación, las céliilas cambian su voliimen

debido a las diferentes presiones osmóticas existentes entre las soluciones intracelulares y

extracelulares. Estos cambios en el volumen celular afectan varios parámetros c.e impofimcia

para !a sobrevivencia del ovocito, incluyendo la integridad de la membrana p1asmát:ca y de sus

organ elos (Agca, 2000).

E:l primer protocolo efectivo para la criopreservación de células de mamíferos fue e5itableci;io

hace 60 años y desde entonces se han hecho progresos considerables (Shaw et al, 2000). Se han

r1:alizado varios estudios comparando diversos métodos de criopreservación, los ci:d(:s se han

clasificado de acuerdo a la velocidad de enfriamiento y descongelación, entre estos tenemos.

congelación lenta csnvenciond (Rall, 1992), congelación Lenta4escongelació~ii rápicia,

congelación ultrarápida y la vibificaciún la cual fue propuesta por Luyet en 1937 y aplicado =n

1ii actualidad exitosamente (-41 Hasani y col., 1987).

Todos estos métodos requieren un control del volumen osmotico de las células a presenar

durante cada paso del proceso (Rall. 1992) y tienen como principios básicos proteger a la céli la

de la congelación, la formación de hielo intracelular, la deshidratación y los efectos tóxicos

(Shavv et al, 2000). Según Rall (1992) el procedimiento de la congelación conven:ic~nal ler ta

tiene tres características principales: (1) la adición de concentraciones de 1-2 M de glicerol u oi ro

cnopi-otector a la suspensión celular; (2) el control de la temperatura de almacenaniiento de la

suspensión durante la congelación; (3) una sene de cambios en el volumen osmotico de las

cilulas durante el proceso de criopreservación.

En los protocolos de congelación lenta, la adición del crioprotector suele hacerse p o ~ pasos, y el

descenso de la temperatura se realiza lentamente, en un congelador programable. E1 objeti./o

principal de este tipo de criopreservación es el de controlar la velocidad de enfriamierito de id

forma que a medida que descienda la temperatura se produzca la penetración del crioprotector al

iriterior de la célula produciéndose un equilibrio osmótico y disminuyendo la probabilidad lie

formación de hielo intracelular; la tasa de enfnamiento para esta técnica es de 0.2 a 0.3

"(-/minuto (revisado por Albarracín, 2005). La descongelación lenta se lleva a ca2o tambilin

rriediznte el uso del congelador programable, mientras que la descongelación rápidz cie hace a

te:mpe.ratura ambiente o en un baño de agua a 30°C, para evitar la recristalización (h4artino y

col., 1995).

2 1

En caso de la congelación lenta, se lleva a cabo colocando a la célula en una solución llue

~sontc:nga una concentración de 10-1 1% de crioprotector. En el caso de los p-otocolos de

congelación rápida se utilizan soluciones con altas concentraciones de solutos (crio~~rotector~ S y

azúcares). En esas soluciones las células están lo suficientemente deshidratadas y permeablc S a

los agentes crioprotectores tolerando la inmersión directa dentro del nitrógeno Iíqiiido o en los

vapores de nitrógeno. Un número de soluciones son formuladas para que solidijíquen sir la

formación de cristales de hielo. Esas son las llamadas soluciones vitrificadoras (Shaw y sol.,

2OOCl).

La congelación ultrarápida fue originalmente descrita para la congelación de enibriones, por

Troiinson (1986). Esta implica la rápida deshidratación de los ovocitos, utilizimdo altas

concentraciones de crioprotector, usualmente DMSO y sacarosa, seguida de inmersión en

nitrclgeno líquido Este tipo de congelación evita los daños debidos a la formación ie hielo i itra

y extracelular, pero puede ocumr toxicidad por el crioprotector y daño osmótico, lo ~ x a l puede

evit;isse en el momento de la elección del crioprotector y su concentración, y en la e!ección del

prot~~colo (Wlu et al, 2001). Las tasas de congelación conseguidas con esta técnica (1 lOCO a

14000 "Clminuto) disminuyen drásticamente el daño por enfriamiento, permitiendo iisar

soluciones crioprotectoras menos concentradas y acortar el tiempo de exposición clel ovocit 1 al

crio]?rotector (Martino, 1 996).

Los protocolos de congelación rápida se dividen en dos subcategorías dependiendo (le si er iste

(congelación rápida o ultrarrápida) o no (vitrificación) formación de hielo en la soliición dur,uite

la c~mgelación. Si bien la diferenciación entre congelación ultrarrápida y vitrific;lción no :stá

bien establecido, se debería utilizar el término vitrificación solo para aqiiellas técnicas en las que

no !;e forman cristales de hielo durante la congelación y descongelación, ni iiitracelula- ni

extracelular. Por el contrario, si se forman aunque sólo sean trazas de hielo durante estos

proc:esos, el término correcto debería ser congelación ultrarrápida (Shaw y col., 2000).

La vitrificación fue empleada por primera vez en 1985 por Rall, para la crioprt:servacióii de

erntlriones de ratón. Este método se basa en la congelación rápida en un#i mezcla de

crioprotectores utilizados en muy altas concentraciones, que a bajas temperaturas aiimentai su

viscosidad formando un vidrio, sin formación de hielo. Es decir, implica la solidi~ficaciói~ de

sc~luciunes a bajas temperaturas sin la formación de cristales de hielo, debido al incremento de ¡a

viscosidad de la solución y a las altas velocidades de congelación y clescongelacióii (Vajta,

1094) Además la vitrificación no requiere de equipos sofisticados como los utilizados en otr is

técnicas (congelación lenta), y el tiempo requerido es mucho menor (Boiso, 2001). 1.a

v trificación presenta numerosas ventajas como la total eliminación de la formación de hielo o la

dismii~ución del daño causado por el enfnamiento, puesto que atraviesa el rango de ienlperatura

de +15 a -15 "C (considerada la zona de letalidad) a velocidades de enfriamiento niuy rápidas

(Ivíartino y col., 1996; Isachenko y col., 1998).

La ccmsecuencia negativa de esta estrategia radica en el incremento de las probat~ilidades je

1i:sioi;lar las células debido al choque osmótico y a la toxicidad de los crioprotc:ctores. Sin

embargo, se han aplicado diferentes protocolos para intentar disminuir estos efecto; negativos,

como el uso de crioprotectores menos tóxicos o la combinación de crioprotectores, 1;i utilizaci jn

de scluciones preenfhadas (revisado por Vajta, 2000) y la utilización de criopro.:ectores yor

etapas (stepwise) (Otoi y col., 1995; Mtango y col., 2001). Para conseguir que la ~elocidad de

enfriamiento sea lo suficientemente rápida para evitar la formación de cristales (de hielo, es

imprí:scindible que el volumen a vitrificar sea lo más pequeño posible.

Cuando las células son sumergidas en nitrógeno líquido (N2L) éste se calienta p o ~ eli conta;to

con la célula, produciéndose una gran capa de calor que rodea a la célula, aislando 'a muestr,l y

evitando así, el intercambio térmico en la muestra y el N2L. Dicho proceso provoca la

disminución de la velocidad de enhamiento de la célula. Para prevenir esta dismiiiución er: la

velocidad de enfnamiento, la muestra a vitrificar deberá estar contenida en el meiioi volunien

posit)le para así tener una mayor superficie de contacto con el N2L (r1:visado poi PJbarrac ín,

:!005).

Las tdiferentes técnicas de vitrificación utilizan una gran variedad de soportes para minimiza. el

tolumen a vitnficar, entre estas se pueden mencionar a las pajuelas open pulled strsiws (O1 >S)

~(Otoi y col., 1995; Hurtt y col., 2000; hfen y col., 2003; Diez y col., 1005; Albairacín y cul.,

2003; Mucci y col., 2006, Morató y col., 2008), las pajuelas closed pulled straws (CP!;) (Chen y

col., 2001), los crioviales (Rodríguez y col., 2004; Nedambale y col., 2006; Báez J . col., 2008),

glas:; micropipette (GMP) (Cho y col., 2002), el nylon inesh (hIatsumoto y col., 2001) hand-

pu1lt:d glass micropipette (Vieira y col., 2006) cryoloop (Mavrides y hIorroll, 2002, B/davridfs y

2 3

hlorroll, 2005), flexipet denuding pipettes (Morató y col., 2008a). Con la técnica de OPS se

logra una tasa de enfriamiento de aproximadamente 20000 "C/miniito (Vajta, 2000). ,a

vitrificación con la técnica de OPS ha demostrado ser una de las inás eficiente:; para la

criopreservación de ovocitos bovinos, Albarracín y col., (2005), Men y col., (2002.) .y Vajt: y

col., (1998; citado por Albarracín) obtuvieron un 2.5%, 8.37% y 25% de blastocis os

respectivamente.

1.A. Aplicaciones de la crloprewa~ación de ovocitos

l~íucl~os de los mejoramientos revolucionarios en producción animal en las tres últinizts décajjas

:;on .itribuibles al desarrollo y aplicación de técnicas de reproducción asistida (inseminación

iirtificial, transferencia y producción in vitro de embriones) (Rall, 1992). En la dtc:da de los

'80, a medida que se han desarrollando las tecnologías de manipulación in vvtro de la

reproducción tales como la maduración, fecundación y cultivo de gametos y cigotos de

mamíferos, tomaba importancia el significado de las técnicas de cnopreservación de ovocitos ya

que las mismas proveen la posibilidad de preservar las fuentes de alto valor genético por

periodos de tiempo manteniendo su viabilidad, lo que sería de gran ayuda tanto en los progranas

de selección para la producción animal clásica, como en la implantación de biotecriologías t des

como el clonaje y la transgenia, así como también la obtención de embriones a partir cle heml~ras

en etapas no reproductivas (Villamediana, 1998), a demás de conservar la variabilidad genética

meciiante el almacenamiento de material genético de animales amenazados de extirición (Se;;ura

y Montes 2001).

Los beneficios de la criopreservación de ovocitos y embriones se centra en su kabtilidad 3ara

detener todos los procesos biológicos colocando a la célula en un estado de qu1esct:ncia (Ilail,

1992). Sin embargo, uno de los retos más grandes para los criobiólogos ha siclo desarrollar

méiodos de criopreservación eficientes, repetibles y fiables para ovocitos de aniniales

dornésticos y humanos. En muchas especies ya se han obtenido animales vivos después (le la

transferencia a hembras receptoras de los embriones producidos in vitro. Auncue ya se han

obtenido nacimientos a partir de ovocitos criopreservados, el potencial de desarrollo dt: los

mismos ha sido muy bajo (Martino y col., 1996a).

Todos los adelantos en el área de la criopreservación de ovocitos son de gran iniportanciz y

aplicabilidad en el campo de la reproducción humana debido a los temas legal=s, éticos y

religiosos asociados con la criopreservación de embriones (Fabbri y col., 2000). 3s7ra técn ca

también podría ser útil para aquellas mujeres que están recibiendo radio o quimioterapia para el

tratamiento de varios tipos de cáncer.

lL5. iilteracioiices causadas por la sriopreseavación

'Todos los ovocitos y embriones sufren considerables daños morfológicos y funcionales duraite

la criopreservación. El grado de lesión depende de factores que incluyen d tamaño y fcrrma dc la

c:élula, permeabilidad de la membrana, la calidad y sensibilidad del ovocito y del eml)ribn. Totlos

c:stos factores pueden ser altamente variables dependiendo de la especie, estadio de desarrollo y

origen (in vivo o in vitro). Sin embargo, en los ovocitos y embriones, en ocasiones, sorprende la

habilidad para reparar estos daños completa o parcialmente, y en los mejores citsos, pjra

continuar su desarrollo normal (Vajta y Kuwayama, 20061. Fabbri et al (2000) concluyeron que

la tasa de sobrevivencia de los ovocitos después de la criopreservación es depend ente de tina

c:omt)inación de varios factores incluyendo la morfología del ovocito, factores bio 3siicos y iel

])roci:dimiento utilizado para la criopreservación.

!$e ha demostrado que la exposición de ovocitos en metafase 11 a crioprotectorc:~ o a bajas

iemperaturas (Pickenng y col., 19901, puede causar la despolimenzación de los microlirbulos ((ue

c:onfirman el huso con la consecuente dispersión de cromosomas y el riesgo de aneuploidías en

<:1 enibnón resultante (Kola et al, 1988, citado por Boiso y Martí, 1997). Además un aumento en

la fr1:cuencia de no extrusión del segundo corpúsculo polar, después de la cnopreservacijn;

podrla dar lugar a embriones poliploides (Carroll, y col., 1989; citado por Boiso y Miuti, 1997 I.

131 origen de las anomalías cromosómicas y de una citoquinesis anormal luego de la

c:riopreservación sena la disrupción de la estructura del citoesqueleto (Fabbri y col., 20CO).

I3iversos estudios utilizando ovocitos en metafase II han demostrado que la tasa de sobirevivencia

del ovocito después de la criopreservación podria ser afectada por factores morfc~lógicoi; y

iisiológicos. Entre los más importantes se encuentra las características del ovocito tal comc la

inadiirez, la calidad y el tamaño.

25

Para evitar estos problemas asociados a la congelación de ovocitos en meiafsse 11, las

investigaciones se han encaminado hacia la congelación de los ovocitos inmaduros eii el estidío

de vesícula germinal, en el cual rio está presente el huso meiótico. El hecho de que el ovocito en

proi'ase 1 tenga los cromosomas localizados dentro de la membrana nuclear, presurniblemen .e le

conferiría protección contra un daño crioinducido.

Así. Al Hasani y col., en 1995 (citado por Fabbn y col., 1998), usando microscopia electróriica,

deniostró una reducción en el número de gránulos corticales en ovtxitos desclmgelado:; de

hunianos y ratones. En contraste, Fabbn, 2000, estudiando la criopreservación dl: ovocito; de

ratones y de humanos usando 1,2-propanodiol y su efecto sobre la configuraciói~ del Iiuso

meiotico, encontraron una abundancia de gránulos corticales en el citoplasma.

A pesar de todos estos cambios que ocurren a nivel celular y nuclear, Van Blerkom y Davis

(1 994) estudiando las consecuencias citogenéticas, celulares y en el desarrollo debido zi la

cnopreservación en ovocitos de ratones y humanos, demostraron que en ovocit~~s de ratones

inmaduros la estructura y organización citoplasmática son progresivamente restaui-aclas des1)ués

de la descongelación, reanudándose la meiosis normalmente, siendo rnuchos de ;:sos ovoc:itos

cap,lces de desarrollarse hasta blastocistos, a diferencia de los ovocitos humanos corigelados en

metafase II, los cuales detienen su desarrollo durante el estadio temprano d;: la división

exhibiendo un patrón anormal de citoquinesis.

Mimtras Men y col., 2003, manifiestan que la criopreservación causa una propor:ióti

sigfi~ificativa de ovocitos bovinos, que sufren degeneración, posterior a su cultivo, lo que gelera

en algunos de ellos condensación y fragmentación citoplasmática; sugiriend~ ademá; la

degeneración de estos vía apoptosis. Estudios recientes, concluyen que el proceso de

vitnficación afecta la tasa de sobrevivencia morfológica de ovocitos bovinos maduiados in vitro,

encontrándose la menor tasa en ovocitos en ausencia de células del cumidus (Rodrígut:~, 200.i).

TablaL 1. Factores asociados con la criopreservación que contribuyen al daño y muerie i;elular zn los si:;temas biológicos. -- lr -7

! SISTEMA TIPO DE aaRo

Todo Formación de hielo intracelular y extracelular, apoptc si:;, toxicidad, metabolismo general

cuerpo polar).

Apoptosis

Ir Citoesqueleto

I

Microtúbulos disueltos.

Ir ~roteínas/enzirnas 1 Deshidratación, pérdida de sus hlciones - 1 1 Ir Ultraestructura I

Grhulos corticales, zona pelúcida -1 ( Zonapelúcida 1 Endurecimiento, fracturas I~ L I - _Al

'Tomiido de Shaw y col., 2000.

i!. Baises fisiológicas de la niaduración ovocitaria:

La ovogénesis puede dividirse en tres etapas principales: diferenciación, crc:cimiento y

inadilración del gameto femenino. _Al inicio de la vida fetal las células germinales ximordiales

inigran hacia las crestas genitales, donde se produce una intensa actividad mitótica dando co no

i,esultado un gran número de oogonias. En mamíferos, la mitosis de las células gi:rrninales se

completa generalmente antes del nacimiento. Una vez que es completada la 1)rc)liferac ón

initótica, las ovogonias entran en meiosis. Estas células germinales se bloquean en el diplottno

de la profase de la primera división meiotica, para comenzar la etapa de síntesis pri:rn.eiótica de

IDNI,, diferenciándose los ovocitos en ovocitos primarios. Estos ovocitc)~, junto coq las cél~las

que Las rodean, se desplazan a una posición más cortical en el ovario, lo que resulta en la

"ormación de un folículo primordial (Van den Hurlc y col., 1997).

'5n la mayoría de las especies de mamíferos, casi todos los foliculos primordiales se fomian

jurante la vida fetal. A medida que este folículo adquiere una capa ciiboidal de c:élulas dc la

,yanulosa, pasa a ser un folículo primario. En el bovino, el folículo primario consiste en un

ovo8:ito con un diámetro de 30-40 um rodeado de un número variable de células de la granu osa

(Va? den Hurk y col., 1997).

La actividad proliferativa de las células de la granulosa resulta en la formación de ima mu1tic:apa

de c;élulas alrededor del ovocito. Los folículos con más de una capa de células de la granulosa

son llamados folículos secundarios (Thibault y col., 1987). La formacióii de gránulos corticdes y

el desarrollo de las uniones gap entre el ovocito y las células de la granulosa tiencm lugar en el

folículo secundario.

Durante la etapa de crecimiento temprano del folículo secundario, una cubierta glicoproteica, la

zona pelúcida (ZP), se forma entre el ovocito en crecimiento y la capa más interna de células de

la :;ranulosa. Esta zona tiene como función intervenir durante la interacción ir icial entie el

espermatozoide y el ovocito y protege al embrión en el desarrollo previo a la irnidzintacióii. El

crec:imiento del ovocito desde el folículo primordial hasta alcanztir el estad2 de ovocito

conlpletamente maduro, involucra un incremento en el número de organelos junto con una

difkrenciación nuclear (Van den Hurk y col., 1997).

En el momento del nacimiento, los ovocitos se encuentran detenidos en el dictioteiio Durar te la

etapa pre-puberal se producirá crecimiento folicular, pero dado que los niveles de g,or~adotro inas

aún son bajos, el crecimiento será incompleto y los ovocitos que lo inicien entrarán en atresia

(Shaw y col., 2000). La maduración meiotica del ovocito es iniciada en folículos de difertmtes

ta~~iaños en distintos mamíferos. En ratones, los ovocitos removidos de los folículos mtrales

peclueños son capaces de seguir la maduración; en bovinos y porcinos los ovocitos maduran solo

cuando el folículo alcanza un tamaño medio, mientras que en el humano el ovocito es cap;iz de

madurar solo cuando este cerca de terminar el crecimiento folicular (Szollosi, 1993).

A lo largo de la vida reproductiva, cohortes de ovocitos comenzar& a crecer dentro d: los

follculos y adquirir "competencia meiotica" es decir, capacidad para reiniciar la me osis,

evento que precederá a la ovulación. Los folículos primordiales entrarán en fase de crecimiento

de forma progresiva. Esta fase de crecimiento dentro del folículo se caracteriza por una intensa

actividad de síntesis y almacenamiento de productos (RNA y proteínas) que después le la

fecundación servirán para sustentar el desarrollo embrionario (Gougeon y cd . , 1994). El

a,lmac:enamiento de moléculas se acompaña de un aumento en la complejidad de la c~rganización

citoplasmática: abundantes mitocondrias, ribosomas, aparato de Golgi (que intervitme en la

elaboración de los gránulos corticales y de la zona pelúcida), aparición de los gránulos cortica es

4 migración de los mismos desde la periferia del Golgi hacia las proximidades de 1.1 rnembrana

plasniática, y síntesis de la zona pelúcida (Wassarman y Litscher, 1996).

111 ovocito es transcripcional y traduccionalmente muy activa La actividad tra1a:ripcioiial

<jlecac:rá con el reinicio de la meiosis, sin embargo la actividad traduccional c0ntin~ar.i hasta el

final del proceso meiótico. Los ovocitos son células de 20-50 um en diámetro en wi folíci!lo

primordial. La majror parte del WNA presente en el ovocito se sintetiza y acumu14i durante el

~er iodo de su crecimiento, para ser utilizado en la síntesis de proteínas necesaias para la

rladuración meiótica del ovocito, la fecundación y el desarrollo embrionario te nprano. La

calidad del ovocito resultante dependerá de la madurez del citoplasma, que se prel~ai-a para la

fecundación y el desarrollo embrionario, en paralelo con Ea maduración nuclear (b assamiam y

I,itsclier, 1996).

La primera evidencia de la competencia citoplasmática, es cuando el ovocito se detierie para la

fwe cie preparación (RNA y síntesis de proteínas). Una serie de cambios ocurre cer~xno a la

descarga de la hormona luteinizante (LH), en el que se muestra ima re-distribución de c~rganelos

(initocondrias y gránulos corticales). El segundo aspecto de la maduración que e:; ii~cluidc a

nienud~ en el proceso de maduración citoplasmática es la acumulación de moléculas específicas

con 11s que se prepara el ovocitos para los eventos post-fecundación (Sirard y col., 2006).

Una vez adquirida la competencia meiótica, es decir, la acumulación de RNA y proteínas

específicas, comienza en el folículo y el ovocito un conjunto de fenómenos en respiiesta a la

descarga de LH. La maduración nuclear implica la ruptura de la envoltura nuclear que rodea a la

vesíciila germinal y la progresión de la profase T. La finalización de la primera division meiótic a,

estadio de telofase 1, se caracteriza por la extmsión del primer corpúsculo polar. Terminada la

primera división el huso se reorganiza, y al entrar en la segunda división meióticí~ el ovocito

pasa a ser un ovocito secundario (Gordon, 1994). El ovocito se detiene en metafase II (13s

cromosomas ordenados en la placa metafásica unidos al huso meióhco) en espera de la

fi:cundación.

2 '>

Para que el ovocito llegue hasta el estadio de metafase II, debe ser sonletido a vario:; puntos de

control o checkpoint. Los checkpoints están generalmente encargados de controlal- los proc~sos

biocluímicos que representan un importante mecanismo en la progresión del ciclo ce:lular c Imo

es t:l de retrasar el ciclo celular y asegurar la finalización en cada fase del ciclo antes ce la

iniciación de la próxima fase, en los que se han identificado una serie de genes in ~olucrados eti

estos procesos. Existen checkpoints responsables del tamaño de la célula, replicacijn y dañc del

DNA (Trounson y col., 2001).

La madurez del ovocito es alcanzada en el estadio de metafase IT de la divició11 meiatica,

mo:;trando el primer cuerpo polar en el espacio perivitelino y los croniosomas m.eg;lados t:n el

huso meiotico (Fabbri et al, 2000,). Con el reinicio de la meiosis se prc~duce una reorganización

de inicrotúbulos formados por polímeros de tubulina. Al comienzo la tubulina se localiza t:n el

cori;ex del ovocito, adyacente a la región perinuclear de la vesícula germinal (VG). A medid2 que

el iiúcleo se desestructura y que la cromatina comienza a condensarse en crorlosomas, van

apareciendo focos de tubulina polimerizada asociados a los cromosomas (Pickering y col., 1 S 90).

A partir de estos focos durante el estadío de Metafase 1 se originará una estructura rriicrotut~ular

en forma de barril, el huso meiótico y un par de ásteres. El huso es un haz de niicrotúbulos y

proteínas asociadas con simetría bilateral, que queda dividido en dos mitades op~estas po- los

cromosomas en metafase. Un áster es un conjunto de microtúbulos dispuestos eii formt de

estrella en cada polo del huso. En cada mitad del huso un solo centrosoma (que es t:l centro de

organización de rnicrotúbulos primarios en muchas células en interfase) en el polo organiza tres

juegos distintos de microtúbulos. Uno de éstos conjuntos los microtúbulos de astrales;, forman el

ástt:r, estos microtúbulos se irradian hacia afuera de los centrosoma, hacia la corteza celular,

donde ayudan a ubica el aparato meiótico y después colaboran con la determinacióii tiel plano de

división en la citocinesis.

Los; otros dos juegos de microtúbulos componen el huso. Los microtúbulos de los cinietocoros se

unen a los cromosomas en sitios especializados. Los microtúbulos polares no interiictúan co i los

cromosomas, sino que se superponen con los microtúbulos polares del polo opuc*sto (Lodish y

col ,2005). Un huso íntegro y ordenado es esencial para el desarrollo de embriones eilploides. El

huso ss una estructura lábil extremadamente sensible a los cambios de temperatura (Pickering y

ct3l., 1 990).

C'omc~ se sabe durante la foliculogenesis el ovocito está rodeado por una gruesa cap 1 de células

de la granulosa que responden a la acción de las gonadotropinas. La acción de la hormo~a

folículo estimulante (FSH) es esencial durante el desarrollo folicular. La interelacion entre las

células de la granulosa y el ovocito primario son de importancia en el proceso de inaduracK n.

L a s células de la granulosa se diferencian en el folículo antral en células de la pared folicu ar

(organizadas como un epitelio pseudoestratificado) y células del conlplejo cumulils-corona

(Szollosi, 1993).

Con la llegada de la pubertad, el pico preovulatorio de gonadotropinas (LH) inducirá eri aquellos

cvocitos que hayan adquirido competencia meiotica el reinicio de la ineiosis a tiavés de m

nlecanismo complejo que parece ser multifactorial. La acción de la LW traducida en la ruptura de

1 a vesícula germinal se ejercería de una forma indirecta, mediada por las celulas de a granulc sa

ya que no se han detectado receptores para LW en el ovocito (Dekel y col., 1981).

No está claro cual es el detonante del proceso de maduración. Se ha observado que una kez

adquirida la competencia meióticn, si el ovocito es extraído del ambiente folicular y colocado en

rnedio de cultivo, reemprende espontáneamente la meiosis, sin que haya ocumdo la descarga de

I,H (Edwards, 1965). Este hecho sugiere la existencia de un factor inhibidor de la nieiosis en el

rnedio folicular El folículo produciría una o varias sustancias que se ha denominad12 "inhibi(.or

rneiotico ovocitario" (OMI) que se transmitiría a través de las células del comple.10 cumuliis-

cororia al ovocito (Thibault y col, 1987). Se han identificado dos moléculas eii el líquido

foliciilar que podrían jugar un papel en la detención meiotica: el AA4Pc y las purinas, qiie in vi ir0

inhiben el reinicio de la meiosis. Se ha comprobado que altos niveles de c y F urinas en el

rnedio de cultivo previenen la rotura de la membrana nuclear (GVBD) del ovocito. 51 ovocito y

las colulas del cumulus están unidos mediante uniones gap, sugiriendo que las céliilas de la

graniilosa controlan la G W D vía las células del cumulus (Dekel y col., 1981).

3 1

La maduración nuclear es un proceso indispensable en la maduración del ovocito. Pero ella sola

no asegura al ovocito la competencia para el desarrollo. También son necesarios can~bios e1 las

céliilas del cumulus, zona pelúcida, membrana plasmática y citoplasma pala lograr una

fecundación normal (Plachot y col., 1989). Los complejos cumulus-ovocito litjerados de su

aml~iente folicular e incubados en un medio de cultivo adecuado, son capaces dt: completzr la

maduración nuclear in vitro, de manera semejante a los eventos que ocurren in vivo, lo que

quixe decir, que la fase final de maduración de los ovocitos de varias especies puedt, ser

reproducida in vitro.

2.2 Maduración in vi&@:

En la década de los 80' fueron desarrolladas las tecnologías de manipulación in vit-o, tales cDmo

maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV) de gametos femeninos y cliltivo in litro

(CIV) de embriones, así como también fue reconocido el significado de la técnic:~ de

criopreservación de ovocitos (Cha y col., 2000). El objetivo de los sistemas de ~na~duraciin in

vitro es conseguir en el laboratorio que el ovocito siga los mismos cambios que sufre in vivo

dur.mte el periodo preovulatorio. Por ejemplo, Edwards (1965) demostró la capacidad dts los

ovocitos humanos para madurar in vitro cuando son aislados de los folículos y culti~rados e 1 un

medio apropiado. Es posible recuperar del ovario ovocitos en profase I que ya han c:ornpletaco su

crec:imiento, madurarlos y fecundarlos in vitro (Sirard y col., 2006).

Los ovocitos utilizados para la NJJV pueden ser obtenidos a partir de hembras vivas cl a part r de

ovarios de hembras sacrificadas en mataderos. El uso de ovarios recogidos ale hembras

sacrificadas en matadero como fuente de ovocitos para la MIV-FIV permite la producciói de

emt~riones a gran escala que pueden ser usados en el desarrollo de nuevas tecnologías.

Las principales técnicas utilizadas para la obtención de ovocitos son:

a) Ida disección de los folículos (Staigmiller y Moor, 1984), la cual permite identifica los

fo1íl;ulos no atrésicos. Diversos estudios han demostrado que el diámetro blicular está

relacionado con la capacidad del ovocito de madurar, ser fecundado y desarrollarse in vitro.

Yarig y col., (1998) en su estudio sobre el control de la maduración de ovocitos de vaca, sui,iere

que la tasa de maduración, división y desarrollo embrionario son signifícativamen -e menores eii

los ovocitos provenientes de foliculos pequeños (>2 mm) que los provenientes de folículos

medianos (2-5 mm) y grandes (5-8 mm).

bi La aspiración de los folículos, es el método más utilizado por la rapidez del proce'dimien o

atlemirs que permite seleccionar los folículos de determinado tamaño (Gortlon , 1994).

c) Las técnicas de recogida en masa, como el "slicing" (Sus y Ivladison, 1983), la cual ha sido :a

e:;cogi!da para este trabajo, permiten obtener un gran número de ovocitos por ovaiio, pero al

pi-ovei~ir de folículos de diversos tamaños y grados de atresia poseen u n l a calidad muy variable

(Edartino et al, 1995), por lo que se hace necesaria una selección estricta de los ovocia~s.

d ) La técnica ultrasonido-dirigida avanzada para la recogida de ovocitos (OPU) en ganados, fiie

u-tilizruía como herramienta para estudiar la dinámica folicular y computar c-mcidad (le

repetición y la previsibilidad de ondas foliculares. La técnica de OPU también se ha aplicado con

éxito al búfdo donde fue utilizada para sincronizar ondas foliculares o para quitar el folículo

d82miriante antes de comenzar el tratamiento superovulatorio. Además de SU USO práctico, OFU

ofieca un sistema excelente para estudiar la maduración del ovocito in v i v ~ o in vitro de ovocit3s

rc:cogidos bajo varias condiciones fisiológicas (Yang, et el al, 1998).

Los ovarios recogidos en matadero contienen folículos de diferente diámetro que presentan en su

iiitenor ovocitos de variado tamaño. En la práctica, se utilizan ovocitos provznientes de

folículos de 1 - 8 mm de diámetro para la producción rutinaria de embriones (Yang y ccd., 199;:).

La apariencia de los folículos también puede ser útil a la hora de seleccionar los o.voleitos rrás

viablí:~ para la MIV. Entre las características a tomar en cuenta están la apariencia translúcida

uniforme y una evidente vascularización. En cambio, los folículos atrésicos seih. los que

Fresenten una apariencia opaca, grisácea y poca vascularización (IvIoor y co1.,1978, citado ror

Gordon, 1994).

IJna buena selección de los ovocitos que se pondrán a madurar es fundamental para a abtención

cle buenos resultados en la maduración, fecundación y desarrollo embrionario. La selección se

basa rn criterios morfológicos, en función del tamaño del ovocito, el aspecto compacto, el maj or

riúmero de capas de células del cumulus y el aspecto homogéneo del citoplasma (01.01 y col.,

1 995)

33

Por otra parte, es importante tomar en cuenta los medios de cultivo en los que se Ilevari a cabo la

inadi~ración in vitro, como también las condiciones del cultivo. Por lo general, los inedios de

cu1ti.v.o utilizados para la maduración in vitro con muy diversos y comprenden desde :;olucio les

fisiológicas simples hasta medios complejos que contienen vitaminas, aminoácidos, punna:,, y

(3tro:;. Los medios más ampliamente utilizados son medios complejos como Hans F10 J el

M1 99 (Hawk y Wall, 1994).

En cuanto a las condiciones del cultivo se tiene:

- El pH: Debe oscilar entre 7,2 y 7,4, y el medio debe ser isotónico con los fluidos natur des

de los tejidos (Gordon, 1994).

- L:i atmósfera: La atmósfera gaseosa existente en el incubador es importante par:. el

funcionamiento fisiológico normal de las células y para mantener coristante el pH del medio,

generalmente se utiliza 5% @O2 en aire saturado de humedad (Bavister, 199:s; citado por

Villamediana, 1998).

- La temperatura: Se debe mantener igual o aproximada a la temperatura corporal fisiológici de

la especie a la que pertenecen los ovocitos (Gordon, 1994).

- La suplementación del medio: El suero fetal bovino es la fuente proteica más iinportantes en

los estudios sobre MIV en bovinos. La adición de suero al medio de maduración previer e el

endurecimiento de la zona pelúcida y aumenta la capacidad de los ovocitos para ser fecmdacos y

desarrollarse (Eppig y Schroeder, 1986). Los efectos beneficiosos del suero en la 'Mn/ p-lede

actuar vía cumulus o directamente en el ovocito. Además de fuente de macromoléc:ulas, el suero

también puede contener gonadotropinas (FSHLH), estradiol y un gran número (le factores de

crecimiento, los cuales pueden tener un papel importante en la regulación de la madur:.ción

ovc~citana.

Según Trounson (1992) la presencia de FSWLH en el medio de cultivo es nr:cesaria tomo

intermediaria de esteroides y factores de crecimiento. Sin embargo, suplementar ¿ti med,o de

maduración con FSM no incrementa la habilidad de los ovocitos para alcanzar ei estad o de

metafase U, pero si aumenta la capacidad del complejo cumulus- ovocito parra producir

progesterona y testosterona en cultivo. En cuanto a los esteroides, el estradiol juega un ~apel

importante en el desarrollo folicular, sensibiliza las células de la granulosa y estim~la 1::

proliferación y diferenciación de dichas células.

- Presencia de las células del cumulus: Según Trounson (1992) la presencia de estas células es

ct uizás el principal factor para poder completar satisfactoriamente tanto la maduración nuc1t:ar

comc la citoplasmática. Su importancia radica en la conocida impermed~ilidad de l , a membrana

clel c~vocito a varios metabolitos de bajo peso molecular (colina, inositol). La rosperación

rnetal~ólica entre el ovocito y las células del cumulus cumple un papel importanti: durante la

maduración.

I3n ciianto a la valoración de la MIV, la maduración del ovocito es evaluada a granie:; rasgo 3 a

través del grado de expansión y la mucificación de las céiulas del cuniulus (Osborn y Mox,

1985; citado por Gordon, 1994). La técnica utilizada normalmente para evaluar la maduración

nuclear incluye la fijación del s\7ocito denudado en etanol: ácido acético (3 .l) por al menos 24 h

jr su 13osterior tinción. Moor y Trounson (1977, citado por Gordon, 1994) sugieren que irna forna

para evaluar la normalidad de la maduración debetia ser la evaluación de la ~~piicidad de

clesarrollo de los embriones derivados de o\~ocitos /FIV hasta el estadio de blastc cito.

I,a MiIV del o\7ocito incluye cambios bien definidos en las células del cúmulus que lo rodean. En

rnucElos programas de FIV, la maduración del ovocito es evaluada por el grado de expansión J. la

rnucificación de las celulas del cúmulus, lo que no descarta que los ovccitos esén

c,ompletarnente maduros ni que el ovocito este listo para sobrellevar la fecundacióii cle manera

correcta (Osbom y Moor, 1985. citado por Gordon 1994). Estos autores también apiuiian que la

expansión de las células del cúmulus puede O C U ~ ~ independientemente de la matiui-ación (le1

ovoc ~to

Ilespués de la MIY del ovocito, éste está rodeado de un cúmulus expandido, hay cambios en <as

climensiones del espacio periviteliiio, se da extrusión del primer cuerpo polar (CP) a dicho

e.spac:io y se establece la segunda placa metafásica (Gordon, 2904). La técnica ust da

riomalmente para evaluar la maduracióii nuclear incluye la fijación del ovocito denudado en

etanol: ácido acético (3:l) por lo menos 24h y luego la tinción con lacmoid 1% en itna solución

cle acido acético al 45% (revisado por Villamediana, 1998). Moor y ñroimson (1977, citado I:or

(hrdon, 1994) sugieren que una forma para evaluar la normalidad de la maduraciór debería :;er

la evaluación de la capacidad de desarrollo de los embriones derivados de ovocitos W / F W

hasta el estadío de blastocito.

3. Bcecundación de Pos ovocitos

La fecundación es el proceso por el medio del cual se produce un embrión a partir de un gaineto

mz;culino y femenino. Se puede definir como los cambios que tienen lugar en el ovoc:ito después

de la interacción espermatozoide-ovocito que dan lugar a la unión de los conjunto:; haploidt:~ de

cromosomas matemos y patemos. Para que este proceso se lleve con éxito, deben oc.urrir v:lrios

eventos: (i) la penetración del espermatozoide a las células del cumulus; (ii) iiiteracciór del

espermatozoide con la Z P ; (iii) fusión espermatoide-ovocito; (iv) activación del ovocito (v)

asociación de los cromosomas patemos al huso de la primera división celular (Placlioí, 2000:.

3.1., Bases fisiológicas

Lo:; espermatozoides de mamíferos procedentes del eyaculado deben pasar un tiempo en el ti acto

genital para poder fecundar al ovocito. Austin (1992) propuso el termino capricitación para

definir los cambios bioquímicos y fisiológicos que se desarrollan en el espermatozoide dui ante

este tiempo y que lo conducen a adquirir la capacidad para fecundar Pavister, 200:!).

La capacitación parece ser un proceso reversible que implica una serie de cambios intracelu ares

y alteraciones bioquímicas de la membrana plasmática del espermatozoide. Los princil~ales

eventos de la capacitación ocurren a nivel de la membrana plasmática del espermatozoide sabre

todo a nivel de la cabeza. Se ha descrito la eliminación gradual y/o alteiación de las

glucoproteínas periféricas, la reordenación de proteínas integrales, la pérdida de colesterol ' 1 los

canibios en la distribución y composición de ciertos fosfolípidos de membrann. Se pierden

también los antígenos de membrana, básicamente en la cabeza del espermatozoide pero también

en la cola; se trata de glucoproteínas ubicadas en la parte externa de la membrana plasmátic;~. Se

observa un aumento en la actividad de adenilciclasa y una disminiición de fcsfi~dieste .asa,

aunientándose los niveles intracelulares de aMPc el cual participa directamente eii la

capacitación del espermatozoide. A su vez, el aumento del AMPc activa las proteinquinasa, las

cuales altera la estructura de las membranas del espermatozoide mediante fosfonlación de sus

proteínas dando lugar a cambios en sus propiedades fisiológicas (citado por Yanagi machi, 1994)

,";e ha observado que los espermatozoides exhiben un metabolismo energético mas activo

tlespiiés de ser incubados en el tracto genital femenino o en sus fluidos i~ociados. 140 obs ta te,

c~ste incremento en el consumo de oxígeno parece estar relacionado con los sustratos e1iergétic.o~

presentes en el medio de capacitación en sí. También se producen camt~ios en las

c.onct:ntraciones intracelulares de iones. La relación sodiolpotasio se mantiene, intrementando

los niveles de ~ a " . En los espermatozoides precapacitados se mantienes unas balas

s:oncentraciones de caz', gracias a una ATPasa ea"- dependiente que bombea este ion al

exterior (revisado por Villlamedima, 1998).

Se ha indicado que la capacitación no es sitio-específica, ya que quizás en todas las ,partes clel

tracto genital femenino se puede llevar a cabo la capacitación del espermatozoide. Además, el

hecho de que ésta pueda ocurrir en una gran variedad de medios artificiaies sin c:otitribución

s~lguria de la hembra, sugiere la naturaleza espontánea de la capacitación (Uanagimac'li, 1994).

I,a fecundación es un proceso complicado que involucra muchas moléculas. En mamíferos, el

c~vocito está envuelto por dos capas sustanciales, el cúmuius y la zona pelúcida (Kaki y Kuiio,

21004) El cúmulus suele estar expendido y posee una matriz formada principalmente por ácido

kiialurónico. No obstante, la hiaiuronidasa presente en el interior del acrosoma no 2s necesaria

para que el espermatozoide penetre las células del cúmulus, ya que se ha observadc. que esta

envoltura es atravesada por los espermatozoides capacitados que mantiene su acroion~a intac:to

(Croi:et, 1991 ; citado por Izquierdo, 1996). El mecanismo más importante para la per etración ~iel

cum~~lus parece ser la fuerza mecánica del espermatozoide y se ha comprobado que la

peneiración del cumulus no es especie-específica (Umagimacki, 1994).

Cuando el espermatozoide llega a la zona pelúcida, éstos se adhieren a ella y sufren la reacción

acrosómica, es decir, la fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosóniica extenia.

Este hecho es indispensable para que el espermatozoide pueda penetrar la zona pelúcida y entrar

en contacto con la membrana plasmática del ovocito (Kaki y Kudo, 2004). Después de penetrar

la zona pelúcida, la cabeza del espermatozoide cruza el espacio perivitelino y contacta con la

rnemmana plasmática del ovocito. Cuando el espermatozoide contacta con la rnembrzna

plasnlática del ovocito lo hace a nivel del segmento ecuatorial, el cual, durante la reacción

acrosómica, ha adquirido la capacidad de fusionarse con el citoplasma del 13\mcito. La

2 -, -1 1

interacción de las membranas plasmáticas del espermatozoide y del ovocito coniprende p3r lo

menos dos pasos distintos, la unión y la fusión (Crozet, 1993).

El primer paso, la unión lleva a las membranas a un contacto molecul ar. Aunque 1 a imión puede

ociirnr en cualquier punto de la superficie de la membrana plasmática del ovocito la fusiór rara

veí: ocurre en el área sobre la placa metafásica Esta región de la membrana del ovocito p trece

características distintas: no presenta microvillis, no tiene gránulos corticales (McLeskey y col..

1908, citado por Villamediana, 1998). La unión puede involucrar cualquier región (te la

membrana espermática incluyendo la membrana acrosomal interna, sugiriendo cjue esta inicr

put:de estar mediada por interacciones celulares no específicas (Yanagiinachi, 1994 ).

El segundo paso, la fusión, tiene requerimientos más estrictos en comparación con la unióii. La

fusión sólo ocurre en dominios celulares específicos y también requiere una temperatura, F H, y

coridiciones iónicas precisas. Por mucho tiempo se han hecho esfuerzos considerables para

encontrar las moléculas involucradas en la fusión ovocito-espermatozoide. Estudios pioneros en

el que usan el mAbs (antígeno espermático) para inhibir la fecundación, sugieren que esta

molécula, está directamente relacionada con el proceso de fusión Estudios recientes han

permitido identificación de los receptores de para el espermatozoide en la membnuia plasmábca

del ovocito, entre las cuales están, las integrinas, CD9 (proteína transmembrana). Entr: las

moléculas espermáticas involucradas en la interacción espermatozoide-ovocito se han

identificado la fertilin P, cyretestin (revisado por Kaki y Kudo, 2004), DE, M29 y ;M:17 (revisado

por Villamediana, 1998).

Tr2.s la penetración del espermatozoide se producen una serie de acontecimientos que permitrn el

normal desarrollo del ovocito fecundado La activación del ovocito provocada por la fusiór con

el c:spermatozoide, está acompañada de una serie de eventos bioquímicos y morfológicos. !;e ha

observado que tras la activación se produce un cambio en el potencial trasmembranario y una

movilización masiva del Ca '+ intracelular. La activación del ovocito se inicia coii la libenrción

masiva de las reservas de caz+ del retículo endoplasmático liso al citoplasma. Esta liben ción

tierie lugar a manera de ola comenzando cerca del sitio de unión con el espermatoz>ide.

extendiéndose a través de todo el ovocito (Crozet, 1993)

El reltículo endoplasmático es el principal resemrio de caz+ intraceiular, siendo c:omún la

liberación de ea2 ' inducida por el inositol tnfosfato (IP3) (Crozet, 1993). El TI'3 inicia la

liberación de c a 2 en los ovocitos de muchas especies mamíferas. Hay evidencias dt: que 11s

ovocitos tienen la maquinaria necesaria para provocar la liberación de ea'!' mediante un recept~r

de la proteína 6 que activa fosfolipasas, produciendo P 3 . No se ha caracterizado ningún receptx

espennático en la membrana plasrnática del ovocito que pudiera traducir la señal a uiio de 13s

sistenias de segundo mensajero. La principal hipótesis alternativa de cómo el espt:rniatozoile

dispara la liberación de calcio, sugiere que el espermatozoide libera un factor activ,tdor que se

difunde en el interior del citoplasma después de la fusión espermatozoide-ovocito (Villamediar a,

1 996).

E 1 aumento de ea" intracelular provoca el inicio de los eventos que ocurren durante la

a~tivación del ovocito, que incluyen la exocitosis de los gránulos corticales y 12: salida cel

bloqueo meiótico que permite al ovocito completar la segunda división meiótica (Vlrarig y ccl.,

2008). Los gránulos corticales poseen enzimas hidrolíticas, principalmente proteasas y

peroxidasas, capaces de modificar la zona pelúcida. Tras la fusión de la membi-aria de 13s

gránulos con el citoplasma se produce la descarga de estas enzimas en el espacio perivite1i:io

(;izqui.erdo, 1996) y que inducen la reacción de zona; que consiste en una modificz~cibn de las

carac1;eristicas químicas y fisicas de la zona pelúcida, que da lugar al endurecimierito de su

estructura y una modificación de los receptores para que los espermatozoides que incluye la

hidróiisis enzimática de ZP3. Todos estos cambios previenen una fecundación poliespérmi~a

(revisado por Crozet, 1993).

La fecundación in vitm produce una mayor proporción de ovocitos polipenetrado; que en la

ft:cundación in vivo. La penetración poliespérmica de la zona pelúcida después de la i'ecundacilin

iii vitro de ovocitos madurados in vivo o in vitro se relaciona con anomalías en la 'ibaración y

dispe-sión del contenido de los gránulos corticales; podria ser que la no dispersión del conteni io

de los gránulos resulta de un retraso en la migración periférica de los gráriulos cortic:iles durar te

la maduración in vitro, mientras que la falta de dispersión del contenido es inherente al ambier te

existente durante la fecundación in vitro (Hytiel y col., 1989, citado por Villamediana, 1998).

Durante la activación del ovocito este reemprende la meiosis continiiando con ia anafasr: U,

telofase 11 y finalmente dividiéndose asimétricamente en dos células de distinto tarnañc : el

ovocito fecundado y el segundo corpúsculo polar (Crozet, 1993).

3.2. Fecundación in viitrn

En 1944 se reportó el primer nacimiento después de la FIV de ovocitos de ratón crtopreserv idos

en NL2. Subsecuentemente, un éxito relativo ha sido reportado para la criopr~:se~rvaciÓii de

ovocitos, tanto en ratón como para otras especies en las que destacan gatos, conejos, c e r d ~ s

vacas (Ambrosini y col., 2006). Es evidente que fallos durante el proceso de rnadui.ación in .litro

o durante la capacitación de los espermatozoides darán lugar al fracaso (le la FIV. No obstanie, la

procedencia de los ovocitos, la concentración de los espermatozoides, el tiempo (le interacción

de los gametos, el medio utilizado, las condiciones de cultivo y la siiplementación del medio

pueden inferir significativamente en el éxito de la FIV y en el subsiguierite desar.0110

ernl~rionario (Chenoweth, 2007).

En la metodología de preparación de los espermatozoides se ha de tener en cuenta la efectikidad

del sistema de capacitación utilizado controlando así la poliespermia. Por otro l;do, el mxho

dorante de los espermatozoides es un factor importante, ya que se ha observado quc los

espermatozoides de distintos machos no difiere tan solo en la capacidad de fecundar ovoctti)~ in

vitro, sino que también ejerce una influencia sobre las tasas de fecundación y desar-0110

emlononario. Estas diferencias podrían deberse a variaciones tanto en la edad de los rnachos a la

cornposición del plasma seminal, como a la relación entre el volumen y c:I número de

espematozoides del eyaculado (Fukui y col., 1998). Las diferencias en los resultados de FIV

entre distintos machos pueden acentuarse debido a condiciones subóptims,~ durantv la

capacitación y la fecundación in vitro.

Una vez obtenido el eyaculado, tanto de semen fresco como en el congelado, deben lavars: los

espermatozoides, en el primer caso para eliminar el plasma seminal que contiene sustancia:; que

est;~bilizan la membrana plasmática del espermatozoide e impiden su capacitaci~jn y posierior

reacción acrosómica (First y Parrish, 198'7) y en el caso del semen congeladc además para

elimiiiar los cnoprotectores utilizados. En la bibliografia, numerosas t é c n i c ~ ~ lian sitio

propuestas para lavar el semen y concentrar la fracción de espermatozoides móviles. La más

convencional y utilizada es la técnica del swip-up, pero también han sido utili.mios o t r ~

niétotios como la centrihgación en gradientes de BSA o Percoll, o la separación mediar te

colunmas de lana de vidrio o de sephadex (Cesan y col., 2006).

E l método más comúnmente utilizado para la capacitación de los espermatozoicles es la

iiicubación con heparina. La hepanna parece ser un agente capacitante fisiológico, ya que se

encuentra en las vías genitales femeninas después de la ovulación y la membrana plasinatica de

los espermatozoides de rumiantes presenta receptores para ella (Millar y Ax, 1990, citado por

L~quierdo, 1996). Pamsh y col., (1998; citado por Bavister, 2002) demostraron que, e1 bovino, la

heparina es un potente activador de los cambios que se producen durante la capacitacion a ni~rel

de la membrana plasmática y establecieron una correlación entre los niveles de pen6:tr:ición y la

concentración de heparina utilizada en el medio de capacitación.

1,a heparina actúa sobre los espermatozoides durante la capacitación :y antes de la reacci~n

acrosómica. Esta sustancia, tras unirse a los espermatozoides, estimularía la perdida (le antígenos

c,e la. membrana plasmática y facilitaria tanto la reorganización de ia membrana como la

adcanilización del pH intracelular gr la entrada de ea" hacia el interior de la célula, permitiendo

a l espermatozoide responder a la lisofosfatidilcolina, a las glucoproteínas de la zona ?eiúcida ' 1 a

otros activadores de la reacción acrosómica (revisado por Izquierdo, 1996). Después de

seleccionar los espermatozoides más móviles mediante algunas de las t é c n i c , ~ descn:as

anteriormente, muchos laboratorios utilizan dgún agente químico para estimular y mantener

dicha. motilidad. La cafeína (Nedambale y col., 2006) y la mezcla de penicilamina, hipotaunn,~ y

c,pinefrina (PHE) son los más empleados (Gordon, 1994).

En la etapa de inseminación in vitro las concentraciones de espermatozoides uti1ii:aclas var: an

entre 0,50x10~ y 5x10~ esp/ml (Horvath y Siedel, 2006) o hasta de lxlo7 (Nedanbale et ai,

;!006a). El uso de estas concentraciones de espermatozoides tiene una influencia sigilificativa en

la proporción de ovocitos que se unen con los espermatozoides, se segmentan y alcanzan el

estado de blastocisto (Ward y col., 2002). En condiciones in vivo, la fecundación dt:l ovocito

ocun e cuando la relación espermatozoide:ovocito es cercana a 1 : 1 (Hunter, 1 993, citado 1)or

Frei, 2004), en contraste con la situación in vitro, donde la concentración de espennatozotdes

utilizada permite obtener una relación de 10.000:l (Ward y col., 2002). Los ovociios incub:idos

con una alta concentración de espermatozoides en un volumen relativamente reducido de ml:dio

de Lecundación, están expuestos a la acción de las enzimas hidrolíticas liberadas por los

espermatozoides muertos, lo que puede tener un efecto pe judicial en su potencial des.zrrollo, por

lo que la duración de co-cultivo de los gametos no debería de sobrepasar el tienipo necesario

para que se produzca la máxima penetración (revisado por Gordon, 1994).

En bovinos, a medida que aumentan las horas de co-cultivo de los gametos tambit:n aumen a la

poliespermia ya que a las 16 horas hay una poliespermia del 3% versus los expuesios por 1 lora

(1%) (Gianaroli y col., 1996; citado por Frei, 2004), Se ha establecido que la -eclucción del

tienipo de co-cultivo de los gametos favorece la obtención de embriones de mejor calidad

(Icochhar y col., 2003). Al reducir el tiempo de co-cultivo de 20 a 5 horas se lograría una

disrninución en los porcentajes de segmentación de un 85% a un 20% respectivamente: (Sum,mtri

y col., 1997). En bovinos, al reducir el tiempo de co-cultivo de los gametos disminuyen las lasas

de tlesarrollo, pero se obtienen embriones de mejor calidad (Kochhar y col., 2003). El co-cu tivo

de los gametos bovinos por 10 horas genera una mayor efectividad en las tasas de se.gmentacióii

coniparado con tiempos de 5 y 1 hora, además mejora la eficiencia en la produccióri de

bla;tocistos (Ward y col., 2002).

El medio y los protocolos utilizados para la producción de embriones son difi:rentes dl: un

laboratorio a otro y son la principal fuente de la variación de los programas de FT\I (Nedam bale

y col., 2006a). Los medios de fecundación in vitro han sido formu1;idos con el propósit~ de

favorecer las condiciones para la capacitación espermática y la fecundación de 10s ovo:itos

maciurados (Nedambale y col., 2006). Los medios empleados en esta etapa suelen b,asarse c:n la

coníposición del plasma sanguíneo (Hank's , TCM 199) o simplemente son variante:; de mt dios

salinos (TALP, DM, krebs-Ringer). En los rumiantes los medios de capacitación y ikcundzción

mái; utilizados son el medio Tyrode Modificado, TALP, utilizado en bovinos por Lima y col ,

(2006), Sagirkaya y col., (2007), Pereira y col., (2005), Vieira y col., (2002) y el BO (Brackett y

Pliphant (citado por Nedambale y col., 2006), descrita para la capacitación de es])eimatozoides

de conejo y modificado por diversos autores para adecuado las condicione:; de distintas

i:species, en bovino: Nedambale y col., 2006; Fonseca y col., 2002, siendo entonces denomini~do

inedio definido modificado (mDM).

33. 'Valoraci6n de la fecundación in viCPo

],a gestación y el nacimiento de un individuo es el parámetro ideal para establecer 121 eficacia del

sisteina de fecundación empleado. No obstante, llevar a cabo este sistema de avaluacLón

c:oml)orta unos costes superiores, ya que es necesario mantener en perfectas cond ciones a las

Iiembras receptoras y, dependiendo de la especie utilizada, se ha de esperara demaiiiado tienipo

para obtener resultados. Además, en los embriones cultivados in vitro, el proceso puc:dt: no lle%ar

ii ténnino debido a un fallo durante el desarrollo in vitro o durante la gestación. Por t:sta razo~ies

también suele utilizarse parámetros indirectos de evaluación de la viabilidad, como la

observación de 2 corpúsculos polares, la segmentación normal y desarrollo del ovocito

inserninado y del estado del material nuclear mediante tinciones especificas (Vanllac:le y c ~ l . ,

:!006).

,2 diferencia de lo observado en ovocitos de muchas especies (ratón, humano), e l iumianies,

tlebitio a la presencia de vesículas lipídicas y otros pigmentos, los pronúcleos no so 1 visibles en

inicroscopio óptico de contraste de fases, amenos que se utilicen tinciones especiales; y se

requiere de una fijación prolongada (por lo menos 24 h) y observar en detalle el estalus nuclezr y

otras características del ovocito (Asada y Fukui, 2000).

11.4. Anomalías de la feciindació~i ~ P E vidP.0

],as anomalías más comunes para la FD/' con la asincronía en el desarrollo de los prcmiicleos J la

penetración del ovocito por más de u i ~ espermatozoide, es decir, la poliespermia (Hyttel y cl)l.,

998). La asincronía en el desarrollo de los pronúcleos normalmente suele ser debitla a un error

t:n la formación y/o crecimiento del pronúcleo masculino. Según Pjaz y Hunter (198'9; citado ]>or

Izquierdo, 1996) la incapacidad del ovocito para formar el pronúcleo masculino .uede ser

causada por la ausencia del MPGF (factor de crecimiento del pronúcleo niasculino), debido a iina

inadiiración citoplasmática deficiente, o la omisión de la LH del niedio utilizado para la

fecuridación.La penetración poliespermática durante la fecundación in vitro ie ovocitos

madurados tanto in vivo como in vitro, parece ser debida a un fallo en la exocitosis d: los

gránulos corticales. La poliespermia se ha asociado con la fecundación de ovocitos tanto

inmaduros, debido a la incorrecta exocitosis del contenido de dicho grhailllos, c:omo

sot)remadurados, por una disminución de la efectividad de los encimas corhcales sobre la zona

pelúcida (Izquierdo, 1996).

La partenogénesis se define como la producción de un embrión, con o sin desarrollcl final tle un

inc'ivtduo adulto, a partir de un gameto femenino y sin ninguna contribución del gameto

femenino. Los estados tempranos de partenogénesis pueden ser inducidos artificialinente o por

ociimr espontáneamente en una amplia variedad mamíferos (Gordon, 1994). La polil;inia,,

anomalía producida por el fallo en la extrusión del primer o segundo corpúsculo polar o For la

frasmentación del pronúcleo femenino que da como resultado un cigc~to con un ;;nipo ext-a de

crclmosomas femeninos. La poliginia también parece estar relacionada con la fi:ciuidacii n de

ovocitos tanto inmaduros como sobremadurados (Bedford, 1982, citado por Izquierdo, 1996 1.

La formación de ovocitos con un solo pronucleo es el resultado de los procesos d: fecundación

Análisis citogenéticos han demostrado que cerca del 50% de los casos, los ovocitoi son

haploides, sugiriendo un origen partenogenético. Los ovocitos con un solo pronu:leo puede ser

también el resultado del desarrollo asincrónico del pronucleo (coi1 un segurido proniicleo

apareciendo pocas horas después), en casos muy raros se da la fusióii de pronuc:leos (Plachot,

2000).

Poi- otro lado, la aparición de cigotos trinucleares puede tener su origen digénico o di~hndrico. En

el caso digénico, el set de cromosomas extra es de origen materno y es el ri:siiltado (le la

fecundación de un ovocito diploide (no hubo reducción de su carga cromos6mica) pcr un

espermatozoide normal (haploide). Contrariamente, el set de cromosomas extra, en el caso del

diándrico, es de origen paterno, resultado de la fecundación polispérmic:a (Plachot, 2000).

4.1. Primeros estadios del desarrollo embrionario

Ilurante los primeros estadios de desarrollo embrionario, ocurren cambios fundamentales que

son cruciales para el desarrollo normal. Estos cambios incluyen la combinación de los genon as

paternos, activación del genoma embrionxio, alteración en la vías generadoras de energía, y en

algunas especies, la activación de mecanismos homeostáticos intracelulares y la re~~rganización

ciel citoplasma y organelos (Bavister, 2000). En mamíferos, la primera división m~tótica (el

inicio del estado de 2 células) separa al cigoto en 2 células denominadas blastóineras, de

a.pro,:imadamente el mismo tamaño y que tienen lugar entre las 1 1 y 20 horas post-iiiseminación

respectivamente de la especie.

I,a segunda división (inicio de las 4 células) es algo asincrónica, lo que resulta en la cxi:stencia de

im estadio de 3célulaspor un corto periodo de una o dos horas aproximadamente. La diiración de

este t:stadio difiere de la especie estudiada. A partir de la tercera división (inicio del estadio d~ : 8

c:élul,as), las divisiones son iguales, cortas, con breves fases G y dominadas por las ibses S y M,

€:S decir, que cada mitosis está seguida inmediatamente por la síntesis de DNA en las d'os células

hijas: sin poderse detectar fases en pausa (Barnes y Eyeston, 1990). Estas divisiones tienen 1u::ar

tie uia forma irregular de acuerdo a la dirección del plano de la divmión presetierite. En el

translrurso de estas primeras etapas, las células formadas son esféricas, están unidas mediante

puentes citoplasmáticos y cada vez son de menor tamaño, ya que no se produce un incrtmento en

e1 vc~lumen total del embrión. Del estadio de 8 células en el ratón, 14-32 en La vaca, las

tilastbmeras se aplanan unas contra otras debido al poco espacio disponible dentro (le la ZP cue

las envuelve. Como consecuencia, los límites de las células se hacen menos n'3torios y el

(:onts~cto entre las membranas plasmáticas se incrementa lo que favorece el estable~ci!niiento de

iiniories. Este proceso denominado compactación, tiene lugar en el estadio de 32 t:élulas en la

vaca (Bavister, 2000).

131 el estadio de 32 células en el ratón in vivo y a las 80-100 células en la vaca, se i:mpiez~ a

1)omI)ear ~ a ' a través de las membranas celulares hacia los espacios intracelulares del interior

del embrión, el agua sigue al ~ a + como resultado del gradiente de presión osmbtiia que se

prodilce Los espacios intracelulares del intenor del embrión se agrandan formando una s ~ l a

caviclad, el blastocele, lo que resulta en la formación de una vesícula cavitada, el b1astoi:isto. Este

r:s el momento del desarrollo en el que por primera vez se diferencian dos tipos celulares

tlistiritos. En la superficie del embrión se forman célulgs epiteliales, que sí: deri\.an

4 5

preferencialmente de las células polares y que son capaces de transportar líquido activam:nte:

son las células que constituirán el trofoectodermo. En el interior, un 2;rupo de células forria la

masa celular interna (MCI), que se deriva de las células no polares (Gordon, 1994).

Después de formado el blastocele, éste aumenta su tamaño rápidamente hasta que el eml~rión

parece una esfera vacía, el blastocisto expandido. Tras la expansión, los blastocistos c:closior~an y

escapan de la ZP para poder implantarse en el útero (Dckman, 1969, citado por Izquii:rdo, 1')96).

La salida del blastocisto parece suceder por el aumeiito del tamaño, la disminuciór del grosor de

la ;TP y por la acción de enzimas líticos producidos por el embrión y por el ú t e r ~ . Este último

solo parece tener una función de apoyo al proceso, ya que in vivo los blastocistos :ori capac :S de

eclosionar sin la acción de las mencionadas enzimas del ambiente uterino (Hyttel y col., 200 1).

Lo; RNAm y las proteínas utilizadas durante las primeras fases del desarrollo del embnór han

sido sintetizados previamente en el ovocito durante su fase de crecimiento, por lo qiie el control

de esta etapa es realizado por el material de origen materno. Posteriormente se produ1;e la

activación del genoma embrionario, que pasará a controlar el desarrollo del embiión (Banies y

Eyi:ston, 1990). El momento en el cual se produce el paso del control por parte de las molé :ulas

de origen materno al de moléculas transcntas a partir del genoma emt>rionario es distinto :ntre

las especie. Así, en el bovino se ha observado que la transición se produce en los ~:stadios d: 4 y

8 células (Bavister, 2000).

El cultivo in vitm de embriones constituye una de las últimas etapas en el proceso de Pnr. Durante esta etapa los embriones son transferidos de un medio a otro con el f i i i de

prclporcionales las mejores condiciones para su crecimiento y desarrollo. El objetivo es proveer

las condiciones que favorezcan la división celular, la formación del blastocel(: y el ncrmal

desarrollo del embrión desde de estadio de cigoto hasta blastocisto (Urdaneta, 2005). El

desarrollo in vztro de embriones ha supuesto una fuente constante de dificultad, particularniente

en los embriones producidos por /FIV. Es dificil determinar si el desarrollo deficiente de los

embriones es debido directamente a las condiciones de cultivo subóptimas o si es 1:1 resultatlo de

una reducción de la competencia para el desarrollo de los ovocitos m;idurados y fecundad~s In

.&o, ya que parece ser que existen factores moleculares, celulares y10 genéticos, intnnsico$, al

ovocitos y10 embrión, que poseenan un papel mucho más significativo en la detenniilación del

poteiicial de desarrollo que las condiciones de cultivo (Lonergan y col., 2006). En mucias

i;ituaciones, una reducción en la competencia para el desarrollo y10 condiciones subóptimas de

c:ulti.~o se combinan para producir un retraso en los embriones, anormalidades en el desarro111 y

ima tieducción de la viabilidad.

Los Factores críticos para la supervivencia de los embriones bovinos soii varios y entre ellos se

i:ncuentran: La temperatura y luminosidad: la temperatura de incubación de los entbiiones t stá

deteirninada por la temperatura fisiológica del animal. En bovinos se Iia observatlo un maior

iiúm~:ro de blastocistos en un intervalo de 37 y 39 "C y un aumento por encima de 39 'C,

~;oml>romete el desarrollo de los embriones (revisado por Sugimaya y col., 2003). La c:xposición

(ie los embriones a la luz en forma repetida o durante vanos espacios de tiempo y mis .aún en luz

~~ltravioleta, afectan de negativamente a todas las etapas de desarrollo de los embriones debido a

: a pr~~ducción de radicales superóxido (revisado por Nakayama y col., 1994).

.4tmósfera gaseosa: Las atmósferas gaseosas más utilizadas en los laboratorios de FIN par: el

i;ultivo de embriones de bovinos son: 5% de COZ en aire saturado de humedad (Balasubramanian

:J Wio, 2007), 5% de C02, 5% 02, 90% N L (Lim y col., 2007). El metabolismo ernbrion~rio

iambién parece estar influido por la tensión de 0 2 , éste puede generar la formación de especies

:-eactivas de oxígeno (ROS) durante el cultivo de embriones, manifestando sus efectos

tiirectamente en el daño del DWA, la peroxidación de lípidos y la modificación ~xidativa de

11rote:ínas (Van Soon y col., 2002). El pH y la presión osmótica: Un tampón muy utiiizado en los

inedios de cultivo es el HEPES, son muchos los laboratorios que lo emplean (Sagirlcaya y csl.,

:!OO'i), la incorporación de éste compuesto mejora la calidad tamponadora en varios medios,

i;omo en el medio sintético de fluido oviductal (SOF) y en ocasiones el MEPES puede ser

susti tuido por el bicarbonato sódico.

:Los :;ubstanciales mejoramientos de los medios de cultivo de embriones fueron registra,dos en las

dos iiltimas décadas basándolos en la formulación de la concentración idOnea de ion'zs y catio ies

y sustratos metabólicos necesarios para el desarrollo de embriones preimplantacional es (Gilch rist

Thompson., 2007). La habilidad de los embriones para desarrollarse en un medio en paríici.lar

no es necesariamente un indicativo de la preferencia de1 ambiente, en cambio, puetle ser

sil~plemente el reflejo de su habilidad para tolerar condiciones artificiales. Aunq~e los

embriones bovinos pueden ser cultivados in vitro en un medio simple bajo condiciornes defi aidac,

la suplementación con suero o BSA han demostrado ejercer un ei'ecto benef ciloso solxe el

desarrollo embrionario. Embriones en ausencia de proteínas exhiben diferencias vn su acti vidatl

ml:tabólica, una baja capacidad de desarrollo y bajo número de cklulas, comparada ccn 10:s

embriones cultivados en presencia de proteína (Duque y col., 2003; Lirn y col., 20 17).

4.3. Valoración del desarrollo y viabilidad embi.ionaiia

La literatura concerniente a la calidad de los embriones bovinos cada vez es inás abundante

(Sirard y col., 2006). Típicamente, los embriones PIV poseen un citoplasma más oscuro y nienoi

densidad como consecuencia de un alto contenido de Iípidss, una zona pelúcida más frágil:

diferencias en el metabolismo y una alta incidencia en las alteraciones; c r o m o s ó ~ i c ~ ~ , así ;omc

diferencias a nivel ultraestructural que explicarían las características anterionneiite nombradas

(Lonergan y col.,, 2006). Muy fieciientemente, el éxito del sistema de cultivo suc:le ser mi:dido

en función de la tasa de división (Skoukir y col.,, 1997), del número de embrione:; que alclnzan

el estadio de blastocistos (Mucci y col.,, 2006), ya que esta fase representa el primzr indit.ador

visible de la divergencia en el desarrollo de dos líneas celulares distintas, el trofocrct~~dermc y la

kKII (Cesari y col.,, 2006). La apoptosis, es otro indicador de la calidad de los emix-iones que

puede ser detectado durante el penodo preimplantaciond (Vandaele y col., 2006) con esp:cid

ateilción a los embriones producidos in vitio (Warzyck y col., 2007).

Los embriones PIV presentan una viabilidad reducida, las tasas de preñez zegaida de la

transferencia son generalmente bajas, existen altas pérdidas fetdes, muchas ztnormalidades

congénitas, el fenómeno llamado sindrome del becerro gigante, entre otros. Las cítusas de t:stos

trastornos aún permanecen sin descifrarse, pero entre las diferencias más estudiadas están una

alta frecuencia de mixoploidías, células poliploides entre las células diploides de Icvs blastoc stos

protiucidos in vitro (72-96%) comparado con los blastocistos producidos in wvo (25%),

anomalías detectadas mediante análisis con hibridación in siha fluorescente (FISH) (dakobs:n y

col. , 2006).

1. Obtención y seleccióii de los ovocitos:

Se rc:cogieron ovarios de vacas sacrificadas en matadero comercial y transportados al laboraiorio

en PBS + gentamicina (50 mg/L) a 35-37°C en recipientes isotérmicos. Una vez en 31 iaboratorio,

los ovarios fueron lavados tres veces con PBS + gentamicina (50 mglL) a 35-37"C. Los

complejos cumulus-ovocito (COC's) fueron recuperados mediante la técnica de slicing, que

consiste en cortar sucesivamente la superficie del ovario con una hoja de bisturí en una placa de

petri conteniendo medio TCM-199 (M2520, Sigma) suplementado con 2.2 m g / d IVaHCB:, 50

mgA, gentamicina (G1397, Sigma) y 11 . l mg/L de heparina (H9399, Sigma), li~erhndosc: así

ovoc:itos provenientes de folículos de cualquier tamaño. Fueron seleccionaclos, bajo un

microscopio estereoscópico aquellos COC's con mayor tamaño, al menos una capíi complets de

céluias del cumulus compacto y citoplasma homogéneo.

El rnedio de maduración fue el 'TCrvI-199 (M7528, Sigma) suplementado con 275 mgh, de

piru~iato sódico (815990, Fluka), 50 mg/l de gentamicina (G1397, Sigma), 146 nig/L d(: L-

glut:tmina (G-15 120, Sigma), lOps/mL de Folltropin-V@, 1 pdmL de 17P-estradiol y 107; de

suero fetal bovino (FBS). Los COC's fueron cultivados en grupos de 12 en microg.otas de 50 pl

de rnedio cubiertas con aceite mineral (M8410, Sigma) durante 24 horas a 31$.5"C en una

atrnijsfera con 5% COZ en aire saturado de humedad (Marquant y col., 1989).

3. Pi-epamsacióia de las Pajuelas Es6radas (OPS):

La preparación de las pajuelas para la vitrificación de los ovocitos, se realizó pol- el protocolo

propuesto por Hurtt et al. (2000), con algunas modificaciones. Se utilizaron pajuela!; firancesas de

0.25 m1 (utilizadas para inseminación artificial). El tercio ~entral de la pajuela fiie apoyatlo y

caleiitado por 30 segundos sobre la esquina de una platina térmica a 90°C, hasta qui: se

reblandezca el plástico. Una vez logrado esto, ambos extremos fueron halados eri un p.ano

hori;contal hasta lograr que la porción central del diámetro intemo y extemo se redujeron a la

mitad de la medida original, y consecuentemente la disminución del gi.osor de la ])ased. Lu :go se

coitaron las pajuelas en las secciones más delgadas con un bisturí, para ser esteri1i;:aclas utilizanao

luz; ultravioleta.

4. 'VitAficación de los ovocitosi

Los ovocitos con al menos una capa completa de células del cumulus y citoplasma homogéneo

fueron vitrificados siguiendo un protocolo sencillo, el propuesto por Asada y col.. (2002), col

ciertas modificaciones. Los ovocitos seleccionados fueron expuestos a la solución vitrificatlora 1

(20% de FBS + 1,8 M de Etilenglicol + 0,2 M de sacarosa en PBS) por 5 minutos y luego

traisferirlos a la solución vitrifícadora 2 (20% de FBS + 7 M de Etilenglicol + 0,6 h[ de sac:aros,li

en PBS) por 1 minuto, para posteriormente ser cargados en las pajuelas estiradas, :;uinergiétldoias

directamente en nitrógeno líquido JN2L). Después de un penodo de al menos dos días en IJ2L 1,i

descongelación se realizó sumergiendo la punta de la pajuela tlirectament? en solucióii

desvitrificadora 1 (0,23 M de sacarosa en PBS y 10% de FBS) exponiendo los o~ocitos por

miriutos, y luego expuestos a la solución desvitrificadora 2 (0,12 h1 de sacarosa en P13S y 10% di:

FBS) por 2,5 minutos. Finalmente los ovocitos fueron lavados con PBS + 10% di: I'BS an es dt:

ser transferidos al medio de maduración, momento en el cual se valoró 1 i sobrevienciii

morfológica.

5. E'ecundación in vi&@:

Los COC's madurados fueron lavados dos veces en el medio TL-Semen, para luego ser

trasladados en grupos de 25 a placas con gotas de 100 pL de medio TL-%VF (supler~eiltado c >n 6

mpmL de BSA, libre de ácidos grasos, Sigma A6003, 30pgímL de heparina (H3119, Sigmii) y

PHI3, cubiertas con aceite mineral. Para la selección de los espermatozoides se utilizó semen

congelado de toros de probada fertilidad. Una vez descongeladas las pajuelas ( a 37"C 7 30

segirndos) se centrifugaron a 500 xg durante 5 minutos en medio TL-Semen, se descartj el

sobrenadante y el pellet de espermatozoides fué lavado nuevamente centrifugado t:n medio TL-

Senien a 500 xg por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y se determinó la c:oricentra~:ión

espt:rmática con una cámara de Neubauer para luego ser diluidos t:n medio 1'L-TVF hasta

alcanzar una concentración de 10 xio4 espermatozoides por microgota de T L - m . Los gam:tos

5 1

impermeable a la membrana y generalmente excluyente de las células vivas, por 11, que es iisadc

coinúnmente para la identificación de células muertas y/o membrana celular alte-ala (Lec3eur.

2002). Se consideraron como viables aquellos ovocitos que no pudieron ser peneeados For el

iocluro de propidio. Mientras que en los ovocitos donde el IP logró penetrar y/o teñir el matenai

nuclear fueron considerados como degenerados con membrana celular alterada (Figuras 1 c, d).

Para evaluar la progresión meiótica, los ovocitos fueron denudados de sus célulss del curiulus

mediante agitación mecánica y fijados en una mezcla de rnetanol-ácido acético en i~roporción 3 1

durante al menos 48 horas a 4°C Luego se procedió a teñirlos con aceto-or2eina al 1.1'4

evaluando la maduración nuclear en un micrcsscopio de contraste de fases (Olympus, CX3 1 ,

ELrA) (400X), clasificándolos según el estadio meiótico alcanzado en: maduros (NíII+Tel3I) o

inrnaduros (anafase 1, metafase H, condensación cromosórnica y VG) (Figuras 2 a, 11, c). A ~ L ellos

ovocitos que no pudieron ser incluidos en ninguno de los grupos mterionner te nomb .ados

fueron clasificados como degenerados (Figura 2 d, e, f ) .

7.3. Evaluación de la Lecundaciáin in vt'bo:

La penetración de los ovocitos, tras 18 horas de cultivo con los espeimatozoide:, fue valorada

mediante la recogida de una muestra de ovocitos de todas las gotas de fecundacióii, estos fi eron

fija,dos del mismo modo que la muestra correspondiente a la maduración. Los o~ocitos trss ser

teñidos con aceto-orceína, fueron considerados penetrados cuando se observó al nierios una coja

de espermatozoide en su citoplasma, estos a su vez, fueron clasificados según iM;utino iit al.

(1 996), como:

a.- Normlmnte Fecundados (2PN+C): cuando en el citoplasma de los cigotos se obsen,en 2

prcaúcleos, uno femenino y otro masculino, y una cola de espermatozoide, o bien, unla cabe. !a de

espermatozoide descondensadose acompañada de su cola y de un pronúcleo femen no.

b.- AsimcrBmicos: en este grupo, los ovocitos son penetrados solamente por un espermatoz~ide,

pero se observa alguna alteración o retraso marcado en la formación de los proiiúcleos, c.omo

catpeza del espermatozoide no descondensada.

c.- Activados: ovocitos en estadio de telofase II.

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RESULTADOS

Uri total de 1690 ovocitos fueron incluidos en este estudio. De los 935 ovocitos niaduracos ir;

vitro correspondientes al grupo control, 935 fueron analizados, y distnbuidos: 133 sí:leccio~iado:~

para el estudio de la sobrevivencia morfológica, 228 para progresión meiótica, 156 para 1 ; ~ tas ,

de fecundación y 418 para cultivo in vitro. Mientras que, 765 ovocitos selec:cionados par:,

congelar, 702 fueron recuperados, alcanzando una tasa de recuperación clel 91 98O6

C~ratrocientos noventa ovocitos sobrevivieron ai proceso de congeli~ción-descoigelación, qut:

posteriormente fueron asignados, 1 9 1 para análisis de progresión meiótica, 1 1 1 llevad( 1s dt:

fecundación y 198 a cultivo in vifro

1.- Evaluación de la sobrevik~encia mom9slógica de ovscitos bovinos viti.i"rad~s nna<$ui.ado!r ire vi&@.

Se evaluaron un total de 308 ovocitos. En la tabla 2 se muestran las tasas de sobrevivencia (ie 101;

ovocitos bovinos en los dos grupos experimentaies sobre el proceso de congeleción.

descongelación. Al realizar la valoración morfo1ógica rutinaria bajo microscopio i:stereoscclpico.

la tasa de 017ocitos degenerados en el grupo control no resultó ser estadísticamente diferente de la

observada en el grupo de ovocitos vitnficados mediante la técnica de OPS (:!,O vs. 8 5996,

respectivamente).

La anomalía mayormente observada, fue la presencia de ovocitos con citop1asma contraída. Erl

relación a la tasa de sobrevivencia ovocitaria valorada utilizando la trnción vital con ioduro dt:

propidio, si se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los evocito%;

vitrificados y los ovocitos control (p<O,OS). La mayor tasa de sobrevivencia inclrfológica se

encontró en los ovocitos frescos en ambas técnicas de valoración. Los ovocitos que preser taror

el mayor porcentaje de degeneración correspondió al grupo vitnficado siendo eviiluados b ijo e '

criterio de valoración vital, observándose una diferencia estadísticamente signific:ativa (p<0,05 i

con la valoración morfológica y el grupo de ovocitos frescos.

. , UC t'Z?.:l --.. Cf.- - di.-: , p:>z'v2_l' f,;.'-.-,:- .Ci...lt:':--;r 1 c I--T<~;.~rL.'~l ? l l cy--T;;,7 c<~:;+:.,?! fi-.: d.: L

- . - ,- - . ?. &?,?j:<. cs!l +zl : ~ i ~ ~ r ~ ~ ~ :!,: !Ll 2!-?,:--..:;jz ;-1 ;;j F-:.,;P~ .~-.;pr:~p~ - ~ j ~ ~ ~ ; ~ c ~ ~ , - 1 2 ~ (jJz i?); pc

d i-<7 12,).

LQ5 ~ ~ . ~ r z e ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ s dtZ E-~'n,.:t u..---- .<- Fl!z;r, -. .. 1 . ; : ~ -. . U -,c u p-:,:.l ->5: ; .c< .2:4;c&; , - .2f-7; . 8;f $;<. ,9L;.7.; L -.....----.-.A..--... -...-- - _ Ir: 5:;:

,xj=l:;.,:>c - ,---.~n<-..,,-,,,-. ---r= - 1 A - - . - A - L . , l p q 7 L.1 ;y:,-:--?- T::!? j c r';: ~.:-.:.:-,Tr;*~i> c~-r+7..T..-,,?i3 ,:;? 21 .7,.,<;>5 , - - : 3 : 32] , , 2 j ?5l3 " < - - A - - - - . . - -. a. Y - - - - -

L-t7T ;;~ .>??, -$:-. ?:a?. ; .=;.,-. :-.- S; 'y.- ;f-;.~.-.<; . . .; (?<c*<)-;,: .?,m, - ..-. - s. L A - .. .- .. - L. . . . - . .. . : .-.: c. - ~ . - . \ L ~ , )

j,: fi I-! .; 6 ; =-~- . ,-:+...,. >-:~;l:;, > L ; ~ + r - C"&.L "

! 7 >7.7/, ,- . ,~d ' 'T).

3. !Evaluación de la fecundación irs vibo de ovocitos bovinos fsescos y vitrificados.

Trescientos ochenta y cinco ovocitos fueron asignados para el análisis de tasa dt: fecundazión,

sieiido analizables un total de 367. Los resultados de la FW se muestran en la tab a 4. El rr ayor

porcentaje de fecundación se observó en el grupo de ovocitos frescos, correspondientes al grupo

control, el cual resultó ser de 69,02%. Al analizar el porcentaje de ovocitos fecundad~x de forma

normal (2PN+C; Figura 3 a), se observaron diferencias estadísticamente significativas entr: los

dos grupos estudiados, siendo mayor en el grupo control, con un 57,1% y el menor porcenta e de

fecimdación para los ovocitos vitrificados (0.9%; y<0,05).

Entre las anomalías de fecundación observadas, los ovocitos con más de dos pronúc:leos, sólc~ fue

observada en el grupo control (Figura 3 b), mientras que para el grupo de asincrón LCCIS (Figi ra 3

c) co se observaron diferencias estadísticamente significativas en ambos tratamientos:. La mayor

tasa de ovocitos activados (Telofase II; Figura 3 d) fue observada en los ovocitos vitrificados,

obtcmiendo un 5,4%, siendo estadísticamente diferente @<0,05) con respecto al grupc de

ovocitos control (O$%).

Tabla 4. Tasa de fecundación in viíro de ovocitos bovinos vitrificados.

7 Ivocitos Penetrados ~ v o c i t o s k & l

p I T i q OBS T*m87- (9; ?9)a -1 Tx

ex

i N) " 6 . . valores en la misma columna con diferentes superíndices difieren significativamente (p<0,05).

Total Ovoc. Eval.: Total de ovocitos evaluados, 2PWK: 2 pronúcleos más cola, >2PN: más de 2 ~~roiiúcleos, AS: asinc-ónicos, TeloiI: telofase 11, Total Ovcc. l'.: Total de ovocitos penetrados.

En cuanto a los ovocitos no penetrados, se observaron diferencias estadísticamente significativas

para los clasificados como maduros (P<0,05), luego del análisis citogenético, con Ln porcen aje

Total 0 ~ 0 ~ .

Eval.

156

Penetriidc s VA>

(3$;6Ib -1 2PN+C

(Yo)

89 (57,1)a

:>2PN

(%)

7 (4,s)

AS

(%)

1 1 (7.1)

1 1

Telo 11 Total ! Ovoc. P.

(%) , (%) I

1 1 08 (0,61b (69,02)a

. . 3 3 4 ) ' , , , - t . : - ,-!e J.;,)'^ : 3 3

- 1 - 2 2 r ..- 2- - ' . % - A . .. -3. l.. :::!.,>:: 1 3f

, . . . . d.: :".-_-.-.c f~Z~?:.-;:.-p':.3 r,.-, k::;l.,.. A;.-. - . .-:c. {>,y: d?f cT'-~z< i;? . - - .y- - - . J - . . . - - . - - . - -. - - - - - - .i - L . - - - - - l".-.'-: u .. .l...

1 . ,-a <,S!. :T!s::iti~7?s" c> m3y;J. t,;zz .-!,; > I , ? . ~ : ~ - . ~ ~ , ~ ~ ,j.~-.~:>~~~~~.~s f.-> ,. ..---- ;+<.:.;?' .-.l - - > > - . > - .:r - ?c.--- 2 - ~ ----.- $ 3 j' Y.!-. ?,?!?E

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, - r . f~ ~ 1 1 e! ,::T:.Y,-~ P ; : : . ~ I . - : ! i , > . - & .. . . . .

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(9 EG. t-:.:C c : 5 ~ ~ > - - 7 L- - - - - J

57

enibriones cultivados por 8 d el número de blhstómeras células normales y con1 meml~rana

alterada resultó más alto (p<0,05) que el conteo para los embriones con 7 días de c lltivo.

Tabla 5. Número y calidad de blastómeras de embriones PIV.

No. No. de células No. células Días de Embriones Total con membrana positivas al 11' cultivo Teñidos No. Células normal

4 17 107,7 * 8,8 103,64 * gb 4,05 * 2,3b

( %) a*b: valores en la misma columna con diferentes superíndices difieren significativamente (p<0,05).

Figura 1. Sobrevivencia morfológica de ovocitos vitrificados: clasificados comcl bptimos: a (50X) y c (200X). Degenerados: b) citoplasma contraído (50X), d) ovocito coi1 inembr,ina alterada (200X).

Figura 2. Progresión meiótica de ovocitos bovinos (400X): (a) CCII, (b) TeloI, (c) MII-CP. Ovocitos bovinos degenerados: (d) MI (400X), e) y f) Material nuclear degeneiaclo (40CX y 200X, respectivamente).

Figiira 3. Valoración de fecundación (400X): ovocitos penetrados: (a) 2PN, (b) 3PN, (c) 1 Pb , d) Telofase 11 + cabeza espermatozoide (señalado con la flecha).

Figura 4. División y desarrollo embrionario (50X): Grupo control: (a) Embrioneij bovinos de varios estadios de 1, 2 y 4 células (48hpi), (c) Blastocistos bovinos (7 días de cultivo). Grlpo vitrificado: (b) ovocitos con 48hpi, (d) Ovocitos con 7 días de cultivo.

Figura 5. Evaluación de la calidad embrionaria (7 días de cultivo) (1000X). Grupcb control: (a) Blastocisto con células normales (azules), b) blastocisto con células alteradas (roja, seiñalada 3or La flecha).

6 1

Iluraiite la criopreservacióii, el o\*ocito experiineiita bruscos canibios cle voliiinen debido a la

tliferencia de presión osiiiótica eiitrc las soluciones iiitra y extraceIular, lo q ~ e causa 1111

transporte rápido de agua a traves de la aiieinbraiia plasiiiitica. Estos cai~ibios en el ~oluiiieii le1

ovocito afectan la integridad del citoplasina. de sus organelos y estructuras subcelulares. L'na

i.espiiesta osiiiOtica ha sido fa\oi.ecida en o~~oci tos eii M11 de varias especies, Iiir.luyeiido los

'3ovi los, con lo que se evita la excesiva turgencia o hinchazón por parte del ovocito curante los

lasos de congelación o descongeiacidii (Aiiibrosini y col., 2006). Nonii:iliiiente un: vez quc los

~woc itos son desvitrilic;id(>s y equil ibi'üdc!s, son evaluados bajo inic;.oscopio rstei.eosc6~ ico

coiisideráridose que han s~brevi\,itio :i1 proceso de vitrificación aquellos que iio p;-esentan lisis

celiilar, coi1 iiiia nieiiibirn;i celulai' iiitacta p citoplasiiia Iioiiiogeneo. I,os ovcicito:; cjiie iio sor1

iiicliiidos en la descripcióri :interior soii clasificados conio de~eiierados jOtoi y col., 1 VC)5).

l3asidos eii la valoración 1iiorfolí)gicn. eii el presente trab.jo 96,99% dc los ovocitos i'rescos y e;

91 .~30,/0 de los vitrificados liieron coiisiderndvs coino sobrevivientes, afii-iiiaiido que el nikfodo

de vitrificncióii OPS no caiisó L I I M tlegei~eracióii inajor a la observatia tras la iiiatluracicí i ii?

~ ) i f , . ~ ~ . FII el trab-jo de Meii y col. (20031, vitriticando ovocitos bovinos iiiaduiados ir2 7.iir.o

~isaiido OPS, obtuvieroii uiia tasa de sobre\ iveticia de 94%. En el estudio realizado por Lu la 1:

col. (2001), tanibién eiicoiiti'aron t<ihas de sobrevi\en<:ia iiiorfológica siinilarei e n o\'o~:ito<

bo~iiios vitriticados por OPS a la:, O y 22 11 de MIV (7 1 , X y 72,6%, rcspecti\/anie itt.). Enti 2 uii

47-0/,5°/, fuei-oii las tasas encontradas por Hou y col., !2005), en las que vitriticaron uvo:itos

ho\ inos WIlV con OPS.

Poi otro lado, Mavi-ides y Morroll (30021, \íitriiicaroii ovocitos de la iliisiila espec-ie eiiipleiiidc.

la técnica ctc vitrit?cacióii denoniiiiada cr*ilotoop, encontrando uiia tasa de sokreuiveiicia de

90,5»/0. Rccieiiteiiiente, Xiiii y coi., (3007). 21.al~1aroii el efecto de la \rtriticaci<ín :o11 el iiii todc

de niicrogotíi (MG) sobre el poteiicial de iiiad~ii-ación de ovocitos bo\/;iios, riiconiiaron tas is ar

sot)revivencia entre 60,O y 8490. Bogliolo y col., (200?) utilizando el inisiiio criterio de

valoración iiioi.lblógica, vitrilicaroii o\ocitos o\iiios ~itili7ando rl:j30tcr(u eii un vo iiinsn iiiíiiiii1t

esttiicial (MEV), eiicoii~rwiido 78,'7% cle sobre\~ivenciii eri los ovocitos 1 iti.ificnclos :oli ePl~ilí :, del

cu!iiulus y 74,5%, corrcspondieiite a ios ovocitos vitriticados sin células del cuinulii:, sil

e~i~ioiitrar diferencias estndísticaiiieiite si_gniticati\as (p<O,OI) entre estos.

Morató y col. (20081, ~itritlcaron ovocitos bovinos de hembras adulta:; y prepíiberes, inedi3iitt.

O$!$ y cryotops, reportando tasas de sobrevivencia morfológica entre 82.4 y 97,20/;, sin ino itrar

diferencias significativas. Wodríguez y col. (2004), vitriticaron ovocitos bovinos ~na.duradcs ir*

vi!,.,, con y sin células de! cuin~ilus, en crioviales, observaron que la mayor tasa de i;ot)revive icia

morfológica (85,54'?/0) en los ovocitos vitrificados con células del cuinulus. obsertando

diferencias estadísticamente significativa (p<0,01) entre el porcenta,je de sobrzvivencia de

ovo~:itos vitrilicados con y sin células del cuinulus (61,14%). La anomalía niayorml:nte

observada fue la presencia de o\.ociios con citoplasma contraído, similar a las erccntrada: en

este trabajo, sugiriendo que las celiilas del ciiin~ilus ejercen un efecto prctector sobrt: los ovocitos

bovinos MIV, diirante el proceso dc ci-iopreservacióai.

Sin jinbargo, Dhali y col. (2000), Hou y col. (20051, Checura y Siedel (2007), proponen qii: la

reiiiioci6n parcial de las células del cumiilus permite la penetración de los crioprotectores :on

más rapidez, durante el periodo cle equilibrio o en la tiilución, sin llegar a conipi-ometei la

,obr~:vivencin del ovocito. Zhang y col. (2009), vitriticaroil ovocitos o\linos MIV, 2 tiavés di: la

t&ciiica de supei-ticie sOlida (SSV, Ditinyes y col., 2000), si11 encontrar tlifereiitias

~:stacli~ticaincnte signiticativas entrc las tasas de scbrevivencia cn ovocito:; parcial y

r:oinl~letaiiiente denudados de las cilulas del cuiiiiilus (84,h y 82,8%, respeetivainent:). Pellict r y

col. 1.1988), hacen notar que la acci6i-i mecánica de pipeteo repetido, ejercida sobre 103 ovocitos

para su den~idación, puede alterar potencialmente al ovocito reduciendo su sohreviveiicia l u c go

tiel proceso de coiigelacibn-desco~igeIaciÓn. Hurtt y col. (?000), propone que la reinocián de las

chélulls del cumuliis es otra de las c:iracterística qiie puede ser consideradas como uria alteración

inorfbIÓgica, ya qiie en ovocitos bitriticados es ilii~cho 1116s fácil su remocióii al conip,irarla con

E 1 grlipo de ovocitos frescos, indicando que la iiiiión ovocito-cumuliis están alterad? s/ilañada., o

~oiiipio~i~etidas.

E;ii ci:alqiiier disciisióii acerca de la zvnluación de la sobi-evivencia del ovocito, se debe enfati; ar

que 1 , i norrnalidad no puede ser coiitii.iiiada por medio de una evaluacion inortológica. Men y

col. (2003) y Rogliolo y col. (2009). sugicren que una forma inás abjetiva de ebaluar la

viabilidad uvocitaria despiiés de la ~iitrificación, debe ser cleterininada sobre la integridad de la

nieint)raiia, a trnvis de una tincioii vital coi1 1F. Kaidi y col. ( 1 9991, iriiciaii los trabajos le

7

sol~revivencin riioifolBgica eii eii~brioiies ciiopreservados, evaiiiaiido la integridac dc inem iraiiii

con IP.

En el presente estudio, al corroborar la valoración de la sobrevivencia ovocitaria mediar te la

tinrión vital con IP, se obsevva clarmente que e1 choque termico la afecta r~eg;atiaramefita.

Cuando los ovocitos fueron Gtrificados en pajueltzs estiradas, in tasa de sobrevivencia Ii1eg3 del

choque témico, difirió del Gipo control, dependientemente de la tkcnica utilizlida pai.a

valoración, siendo mayor la proporción de ovocitos clasificados como degenerados con la ti~iciórr

vátiil con IP, que cuando se iitilizó el microscopio estereoscbpico. Coincidiendo cor Ics

resultados del presente trabajo, Nen y col. (2003) empleando la niisina tecnica de valor¿ ción

vital con IP, reportaron una tasa del 92% (1751187) de sobrevivencia. Hurtt y 601. (2000) p Ir su

parte, encontraron tasas de sobrevivencia en svocitoc bovinos MIV del grupo cont -01 de ian 70%

y del 50% en ovocitos vitrificados con OPS, sin obsewar diferencias esiadístlcaireimte

sigiiificativais.

El einpleo de otro flitorocromo, acetato de fluoresceina (FDA, Slii y col. 20061, ha r ido repsr tado

para la evaluación de la sobrevivencia de ovocitos de animales de interés zoclte;nico. Este

flucaocromo revela la integridad de la membrana y la actividad esterasa a nivel di:l citop1a:;rna.

Los o\/ocitos con alta intensidad de fluorescencia verde son considerados altanletite vialks,

mientras que los que muestran poca intensidad de fluorescencia o sin emisión absoluta son

clasificados de poca calidad o muertos, respectivamente. b4agnus y wol. (2009) a~sloraroi el

coi-rportciiriiento de ovocitos bovinos y encontraron que el 80% eiiiiti6 una alta intensidatl de

fluorescencia (utilizando FDA), después de MIV.

Fu y col, (2009) ritrificaron dsvcicitos de cerdo MIV ~iiediante la tgicnica de OPS, eiicontrandc

difei-encias estadísticamente significativas en las tasas de sobrea ivencia en ovocitos sin vitrificar,

ovoc:itos vitrit?cados y vitri.ficados ti-atados con Taxol, uii estabilizador del citoesqueleto ( I O )Y&,

54,55% y 60,67%; P<0,05, respec:ti\lamente), lo que indica que los ovocitos prt~tr;ttados :on

Taxo1 rcsisten niejor a la vitrificación, ejerciendo u11 efecto positivo sobre la sotrevivencia y

posterior potencial de desarrollo de o\ ocitos. Recienteniente, Slacliowial: y col. (2008), coingaró

los iiiveles de daño al DNA, iisai-ido el Conjet Asscy, en ovocitos bovifios vitriflcí~dos en h16 ,

DPS y en pajuelas de 0,25 I ~ L , afir:iiaiido que la mayor tasa de degeneración al DN,! ( 15,4% 1 se

observó en los ovocitos vitrificados en pajuelas de 0,25 mL, sin encontrar diferencias

sigriificativas entre los otros tratamientos.

La valoración de la sobrevivencia ovocitaria bajo microscopio estereoscópico resulta ser una

metodología bastante sencilla y muy fácil de incluir en la rutina del laboratorio. Sui embargo, la

tinción vital con JP ofrece una evaluación de la sobrevivencia mhs objetiva, tampoco irivolucia la

pérclida de la muestra de ovocitos (Men y col., 2003) pero se requiere tener a disposicióii la

microscopia de fluorescencia.

Todos los ovocitos y embriones sufren modificaciones considerables y daiíos funcio iaies dun mte

la ciiopresemación pero la persistencia del dafio ocasionado, que no es detectado a través d: la

evaluación de la sobrevivencia morfológica, puede continuar hasta el desarrollo eml~rionario que

depende de la especie, el estadio de maduración y el origen ovocitario (Pereira y Marqiies,

2008).

El desarrollo de iiuevas estrategias para reducir de nianeras diversas el estres asociado cor la

criopreservacion es fi~ndamental para lograr una mejor compreiisión de los pnncip des canil: ios

i-esponsables de las bajas tasas de sobrevivencia tras la descongelación. Varias estraregias se Iian

propuesto para minimizar el dafío ocasionado por la vitrificación como la reducción tanto del

volumen de crioprotector como del tamaño del contenedor y la suplemeiita.ción ton

:nacromoléculas como la albúmina (Siedel, 2006; Horvath y Siedel, 2006) o polímeros sintéti1:os

c:omo ficoll (Hou y col. 2005), polivinilalcohol (Asada y col. 2002), polivinilpirrolido?a,

liolietilenglicol y dextran (Orief y col. 2005). Estos compuestos aumentan la viscosidad de la

!;oluc:ión y reducen su toxicidad al disminuir la concentración requerida del cricprotector o

incluso la de estabilizadores del citoesqueleto como la Gitocalasina B o Taxol, durante la

vitrificación, lo que podría mejorar las tasas de sobrevivencia y posterior desarrollo embrionario

(le ovocitos y embriones (Pereim y Marques, 2008; Morató y col. 2008; Fu y col. 2009:r.

!;e sabe que el estadio de MI1 es el óptimo al evaluar el proceso de madiiración in vitro. Este se

cla por completado cuando se observa el mayor porcentaje de ovocitos en MI1 y Telol (Fhodríguez

y col. 2004). En este estudio, el grupo control (ovocitos sin vitrificar), la tasa de maciuración fue

0 5

3t. 68,850/0. El aiiilisis citogeii6tico realizado por Sosnowski y col. ( 19961, revel6 1.1ue el "7.3C$

dtb los o\ ocirns R/I IV, pi.oveiiien tes de ovai.ios recuperados de iiiatadcro, se eiicc iit rriron en bl J l

(44, l 'YO) y Tclol (3.2%). Resultado,i siiiiilares f~ieron obtenidos en otras experiencias: 77i4 Huri t

y C O I , 2000). 74,5?/0 (Park y col. 2005). 61,3°/o (Bicz y col., 2008). hlagiiiissoi- y col. (:'@CX,,

\aloraron Is tasa dc maduracioii de ovocitos bovinos a ias 24 /:oras de ciilli~o i~ v i f r í ,

encontrando ~ i i l 75% ron MI1 y 5,iS':l;) ile o\ocitos degenerados, siini1ai.e~ a los reportados e l est,:

ti-: bajo.

1,n niad~iraciUii in vi\.() de ovocitos cla COIIICI 1-csblitado 1111 porcsntaje allo de blasto:istos 1iie;o tic,

la FIV al coiiipararla con la iiiaduración i)? vltro, sugirieiido que las condiciones il virro i i SO¡:

1s suficientemente adecuadas para un desarrollo óptimo (Van de Leeinput y col , 1996; citadc

por Izadyar y col., 1998). Existen autores que sugieren que estos porcentajes .i~aiiien!arian

cotisiderablemei~te si se pone especial oteiicibiñ al periodo inicial, la \41V (Culei* y col., L:OOO,

Nagai, 2001; Men y col., 3C02; Dode y Adona, 2001; Park y col., 2005; Schoevers y col., 'i 065;

Sagirkrrya y col,, 2007; Baias~~braiiianiani y 1X110, 2007). Según S~ilton-Macfro\val1 y col.,

(2005), proponeil que se deben iriiciar 6.1 disefío de inedios iiiievos, pere sin desciiidar la ater ci6n

en 1.1 animal donador, la morfología del ovocito y las condiciones de maduracion Q.la:gi, 20(,1).

La supleinentacibn del medio de MIV con laihibidores de fostodiester;isas (PDE), responszbles

del incremento de los niveles de AMPG (iiiiportante en la regulación de la inadurazion), put.den

llegar a aumentar los porcentajes de blastocistos hasta un 53%, en ovocitos bovincs. Mejor ?ún,

Ba iiicsrporación al mcdio de MIV de factores secretados por el ovocito (OSFs), de los cual(s el

factor de difer~iicjación de crecimieiito S (GDF9) y la proteína morfol;éiiica de ttjitlo Qse< 15

(RblP t 5 ) , inejoran su potencial de desarrollo, auinentado hasta un 50 y 58%, respc tivamentc:, la

proc'ucción de blastocistos PIV e incluso la calidad de los -nismos (Gilchrist y cal., 2009). I:sto

sugizre que los estudios deben estar enfucados al entendiiniento del factor det~iiaiite dt- la

capacidad de desarrollo del ovocilo, qiie hace referencia a los cambios bi(>qliímico:; y

moli:culares, que lo capacitan para niadurar, ser fecundado y llegar exitosainente hasta cl estadio

je b;astocisto.

La gi.ogresión iiieiótica, es otro factor a considerar al iiiomento de valorar los efectos d r l proc :so

tle vitrificaci611 sobre la capacidad de desarrollo del ovociio. En el presente trabajo, e l proceso de

vitrificación, redujo significativamente de la tasa de maduración de los ovocitos vii.rificados por

OP!i (53,4%) aumentando la proporción de ovocitos degenerados, al ser comparados coii el

grupo control (68,85%; P<0,05). Coincidiendo con los resultados de este trabajo, ''airsini y col.

(200'7), compararon protocolos de vitrificación en ovocitos de rata en VGBD, obteniendo ana

tasa de maduración de 5'7,12% en el grupo vitrificado con un protocolo sencillo dc equilibr o e

inclidsión a las soluciones vitrificadoras, significativamente menor (P<O,O5) a la o3tt:nida eii el

grupo vitrificado por varios pasos (68,43 %), y el control (84,4%), indicando que e 1 tratamit nto

de 1'3s ovocitos en este estadio, con un protocolo sencillo, responden mejor a los efectos dl: la

vitrificación. Tharasanit y col. (2006), vitrificaron ovocitos equinos MIV, encontrzinclo un 46%

en A411 (MIV), y 58% en el grupo sin vitrificar (P<0,05), indicando que en una mezcla de E S y

DMSO, los ovocitos equinos MIV son más resistentes a la vitrificación por OPS.

Cetin y Bastan (2006), estudiaron el efecto del EC y DMSO sobre la progresión nrieiótica de

ovoc:itos bovinos inmaduros vitrificados en pajuelas de 0,25 mL, encontrando uii 34% de

ovo<:itos en MI1 para el grupo vitrificado con EG; 14,9% para DMSO; 20,'7% para la mezcla de

los dos CPA y un '79,6% correspondiente al grupo control. Concluyendo que lo:; ovoc tos

bovinos inmaduros podrían ser vitrificados en pajuelas, usando como crioprotc ctor el IIG.

Coni.rario a los resultados previos de este laboratorio, Rodríguez y col. (2004), estiidiandc el

rfecio de la vitrificación (crioviales) sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos M X ,

obtuvieron tasas de maduración de 36,9% en el grupo vitrificado y 52,75% para el gi-upo conti~ol,

sin diferencias estadísticamente significativas. Igualmente, Báez y col. (2008), alcanzaron iina

i.asa de ovocitos maduros del 61,36% y en los vitrificados, 52,85%. Ambos estudios proponer la

T~ritrilicación de ovocitos MIV.

1% el estudio realizado por HuPtt y col. (2000), encontraron una tasa de maduración en ovocitos

I>ovuios del grupo control del 77% y '70% en el grupo vitrificado con OPS. Morató j 1 col. (2008)

valoraron la proporción de ovocitos bovinos en MII, encontrando diferencias eshlísticameiite

significativas (P<0,05) entre los grupos de vitrificados en OPS, elyoloops y el contra1 (78,8%;

:78,85i/0 y 93,9%, respectivamente).

La pi-obabilidad de éxito de la vitrificación depende principalmente de tres factores: viscosidad

de la muestra, tasa de congelación y descongelación y volumen de la muestra. Urio de ;os

ixob1eiii:is iiiác, coiiiiines asociados coi1 la vitriticac:óil, es la coi!centraciont~s altas (le lo<

crioprotectorcs, suiiiaclo a csto el tienipo y la ~emperat~ira de e~posicií'n de los :rioprotc.c ior.UC,

qiie piiede provocar ei daiio cie 111 ct.liila a tra\ es de i i i i efecto trjxico o clioqiit. osiiiéi ico ("Y i \ i i i í

A ~ i v , 2007). Magiiiisson y col. i 20OX) , afiriiiai~ que los ovocitos boi inos ~iiaduiados i i ~ ~;?rc; J

virriticados picrclen progresi\aiiieiite sil tolerancia a concentraciuiirs altas ,le E(; e n lal

solucioiics \itriticadorris, rcducieiido su capacidad (le desarrollo despties dcl proceo d::

co1igelaci~ii/dcsco1ige1aciO11 al scr coi1iprir:idas coi1 el gi..ipo control.

Lc.s protocolos de vitriticacií~ii cd)ii OPS propiiestos por Gtoi y col. ( i 9')5), Luna y col. (2001 )

M1:n y col. (2002; 2003). Asada y ccil. (2002). Hou y col (20051, Diel. y col. ('2005 ); Checiiri ;

Sit:clel (2007). para ovociros bovinos MEV. resultaroii iio ser perjudiciales, cualid) :,e inclt ye el

pr,.eqiiilibrio a bajas coiicentraciones del crioprotector (EG y DMSO, al 10%) a teinpei atu -¿i

air;hicnie, por \arios se~iiiidos y Iiiego la cxposicióii dc iiasta 5 niinutos cc la soliicic'r~

v i t -iticridc)i.n. 1-3 des\ itriticacicíii .e I l e ~ a a cabo. eupoiiicndo lo5 ovociios priiiiero 1 iiiia siil1ici61:

coii sacarosa O,5M por 5 ininiitc,s y luego a uiia seg~iiida qiie conticiie iina coiict.ntracii ii c e

0,35M por 2.5 inii~utos. ('ha y COI. (2000). at?riiian que cl corto periodo dc espo;icióri ii-cite a

10s crioprotcctor~'~ yuetlc alik iar los danos se\ eros en repiiesta a las altas coiicenti aciones de \:,S

sc~l~iciones \, Btriticadoras.

L o $ oiloeito\ recuperados dc la ~itriiicacióri cliic presentan una aparieiic a intacta, nJ son gartiiitín

de presentrir iina inoriblogía iilaltcracla o ser coinpetente para el desarrollo. En efe-tu, presentan

drifios (a veces no percepiibles). cluc piiedeii ser iniiy sirtiles o crítico; a ~ i i \e l dt: 11 meciiiic;i

celiilar, ca~isaiido fallas diiraiite la lkciiiidación o en etapas posteriores (Coticcliio y 1:01., 2C U4).

Sor1 inuchos los probleiiias que han sido asociados con el pioceso de congeiacioii-

dest:ongelacicíii de ovociios iniiiadiiros y madurados 112 iyilt,,o, entie los que da:stricriii: la

clesoi-ganización de niicroiúbiilos y croinosoiiias, la altt.raciOii en la ;listrili~iciói~ de gráii rlos

corticales, el incremento de Iri polispermiu, el endureciiniento de la ZP por la exocitvsis

prei-iatilra de los gianulos coi-ticales (Morató y col., 2OC8), iinpidiendo la entrada del

cspcr'niato~oiclc al o\/ocito (revisado por Meii y col., 2002), fenóineno cliie se :e re le.iaclo eri las

bajas tasas de ikcundacici~~ cn o\ oc~tos criopi-esen ados (Aiiibrosini y col ,3006).

En este trabajo la tasa de fecundación a las 18 hpi, fue de 69,02% para el grupo de ovocitos sin

vitrilicar, significativamente mayor (P<0,05) al porcentaje obtenido en el grupo virij7cado 1,or

DPS (8,11%). Tasas superiores fueron obtenidos por Martino y col. (1996a), que eñicontrai.on

una tasa de penetración del 87% en ovocitos sin vitrificar y del 60 y 62% en ovocitcls boviiios

xiopreservados en gradillas de cobre para microscopía electrónica y en pajuelas (le 0 2 5 niL,

respc:ctivamente, usando EG y sacarosa en las soluciones vitrificadoras.

En el trabajo de Btoi y col. (1995), reportan una tasa de 86,6% de ovocitos bovinos penetratlos

del grupo control y un 63% del grupo de ovocitos criopreservados en estadio de MII con E(i y

sacarosa con pajuelas de 0,25 mL con un protocolo de congelación ultrarrápida. En 1997, Otí'i y

col., valoraron el efecto de la criopreservación lenta sobre la capacidad de desarrolle de ovocitos

bovinos MIV, empleando el 1,2propanodiol como único crioprotector, encontraron 42,4% de

ovocitos penetrados y un 86,9% en los ovocitos fkescos.

Un 63% de ovocitos bovinos M N criopreservados (pajuelas de 0 2 5 mL) y FIV, fue-on

clasificados como penetrados por Asada y Fukui (2000), contra un 89% correspondientes a los

controles (Pc0.01). Resultados similares fueron obtenidos por Hochi y col. (2001), encontraiido

entn: un 58 y 77% de ovocitos bovinos MIV sometidos a distintas velc~cidades de congelación

lenta, en donde emplearon EG (7,5M) y sacarosa (1,OM) en pipetas de vidrio cstiradas. En

ovocitos ovinos vitrificados con BPS, usando EG, DMSB y ficoll, fue reportado un 443% de

penetrados y un 60% de los ovocitos correspondientes al grupo control (Tian y col., :!007).

Hasta la fecha, el intento de desarrollar protocolos de criopreservación de ovocitos inamíferos

estáii basados primordialmente sobre aproximaciones empíricas. Las características de

pernieabilidad y sensibilidad ante el shock osmótico son parámetros esenciale; de gran

importancia para el disefio y aceptabilidad de protocolos de criopreservación espc:cificos Fara

ovoc:itos mamíferos (Ssngsasen y col., 2002). Aunque la información sobre lo!; parámeiros

biofiisicos requiere optimización previa de los protocolos de criopreservación que se 'ian

comenzado a sumarse (Park y col., 2005; Gardner y col., 2007). Estos parámetros inicluyen: la

pemieabiiidad al agua (Lp) y a los crioprotectores (Pepa) de la membrana plasmática. la

teml~eratura dependiente de esta permeabilidad, la probabilidad de formacion de h elo

intrs~celular, el tiempo de exposición o de equilibrio de los crioprotectores (Agca y col., 200: ) y

6Q

mis recientemente el Incremento del calcio hkxelular (Caí), inducida por los zriopratec:tore?;

(Gwdfper y col., 2007).

El crioprotector más com usado eii los protocolos de crioprmewación es el EG, ~ o r s w

efcxto tóxico reducido, su difusion rápida y el equilibrio a través de la ZP y la mm3rana

pla~smática ( M e f y col., 2005). E aii y col. (20061, reportaron que (el DMSO y el EG pueden

causar un incremento del Cai. El EG, ai parecer, provoca una entrada de calcio a @aves de la

membrana plasmática, proveniente del calcio suspendido m el medio, tr-endo corno

coiisecuencia el endurecimiento de la ZP, pareciendo la raz6n inás eomún que e:rglicaria las

bajas tasas de fecundación en los ovocitos crio-eservados. Por lo que recomienhn la

vieificación de ovocitos en inedios libres de calcio, a1 reducir el endwccimiento e irm+;re~nen to de

las tasas de fecundación y posterior desawollo exnbrioiiario (Jain y Painlson, 2006).

Diversos autores Iian demostrado que fa aplicación de las distintas técnicas de cno~resmi:ci6n

entre las que se incluye la vitrificación, causan una desorganización severa de las p acas

merafiisicas después de la congelación (Clren y col., 2001). La presencia de la plz:ca inetnf isica

en los ovocitos madurados hace de éstos un tipo celular muy difícil de criopreservar. Esta

estructura posee microtúbulos polimerizados íntimamente relacionados con los cromosomas

condensados (Albarracin y col., 2005). Morató y col. (2008a), obsenwon en ovclcibos bo.c inos

vitrificados con OPS, la desorganización parcial y descondensación de los crornosomas y la

aparición de anoinalías en la conformación del huso meiótico. La desorganizaci6n o ausenciil del

huso meiótico, provocar aneuploidías, poligloídías o siinplemente fallas durante 1 1 tlespués del

proceso de fecundación (Eroglu y col., 1998). El daño directo al huso o los microtúbulos pcdría

provocar la formación de micronúcleos con cromosornas dispersos. Si el huso tneiotico esta

aust:nte, ocurre un fallo en la extn~sión del segundo corpúsculo polar, y propicia 121 aparició 1 de

polipliodías (ko y col., 2888).

Yavin y Asav (20071, consideran que la exposición de los ovocitos al proceso de desvitrificac:ión

es cieteminante para su potencial de desarrollo, especialmente para alcanzar s rnantenei. su

capacidad fecundante. Estos investigadores afirman que el tiempo de exposición de 10s ovocitos

deskitrificados, aún en contacto con la soluci6n \,itrificadora, ocasiona d a h s irreversibles pc r la

formación de cristales de hielo y el efecto tóxico del crioprotector, comprometiendo I;t viabilidicd

ovocitaria, que se hará notoria con las bajas tasas de fecundación. Diversos estudio:; utilizantlo

ovocitos en metafase 11 han demostrado que la tasa de fecundación de ovocitos después de la

criopi~servación podría ser afectada por factores morfológicos y fisiológicos (Otoi y col., 1995;

hilartino y col., 1996; Hochi y col., 2001; Cetin y Bastan, 2006; Siedel, 2006; Jain y col., 2006;

'I'ian y col., 2007; Fujino y col., 2008; Dhali y col., 2009). La característica más connún es la

rdptura de la membrana plasmática, indicando una deshidratación celular importanle lo q le

ocasiona una contracción citoplasmática, típico de ovocitos potencialmente corriprometidas

(Hyttel y col., 2000; Zhang y col., 2009).

I,a valoración de la tasa de fecundación in vitro, la valoración citoplasmática (alguiia anomaiía

lrisib [e, contracción o ennegrecimiento) de los presuntos cigotos y la tasa división las 413 hpi, S 3n

considerados criterios de ssbrevivencia (Martino y col., 1996a; Otoi y col., 1997; Mcn y cc l.,

;!002; Asada y col., 2002; Zhang y col., 2009) para analizar el efecto del proceso de

cxiopreservación sobre el potencial de desarrollo del ovocito. Estos hallazgos indican que algún

(lafío o alteración a nivel de membrana y una desorganización del citoplasma extensiva pueden

ocurrir durante el proceso de criopxservación, en especial durante la etapa de des~ritiificacion,

por I ~ D que pueden interferir negativamente en la fecundación y posterior desarrollo zrribriona-io

(Otoi y col., 1995). Las fallas en la fecundación también pueden ser debido a cambios en la í;P,

impidiendo la entrada del espematozoide (Otoi y col., 1995; Hyttel y col., 2000; Mor;ito y col.,

:!OOSa; Mo y col., 2008; Zhang y col., 2009). Los resultados obtenidos en c:ste estutlio

tlemiiestran que el proceso de vitrificación empleando la técnica de CPS, rediijo

c:onsiderablemente el potencial de desarrollo de los ovocitos bovinos MIV.

La capacidad de división celular es la prueba más evidente del potencial y dc: la caliclad

intrínseca del ovocito, que puede ocurrir en ausencia de la fecundación, por un simple estím 110

de activación. Cuando la división no llega a ocurrir, puede ser consecuencia de la disfiinción ,,or

parte: del espermatozoide que falla en su fianción de activación del ovocito o que el este no po ;ee

la hsrbilidad o la competencia para llevar con éxito la primera división celular. La e ulaiiuación de

cienlos de ovocitos que no muestran división después a las 36 hpi indica que la mayoría no fue

fecundado y sólo una pequefia proporción mostró una descondensación incl3rripleta del

espermatozoide o pronucleos asincrónicos. Esta situación indica que una pequefia proporción de

Bus o\/ocitos obteiiidos de ovarío~ pi.ovenientes de inatadcro son coiny)elentes par3 tlesencrdeivr

l o s procesos siicesivos liiego de la fecundación y pi-iiiiera divisí611 celiilai- (Sirard 11 col., 20(16).

Men y col. (2003), obsei-varo11 elice r i I tercer día del ~ i ~ l t i ~ o de ovocitos bo~i i io>~ vitrilicade.;

(CIPS) y FIV, el 79 y 76% de 10s o\ociios clasificados ron citoplasrnn tiagineritaSo coritrnídc,

i-e;pectivaiiiente, adeinás preseniaroii fraginentación del TINA (niedi~~nte la prueba de TLNEL ,

Tt.i.~ninal decxyiiiicleotidil transfern\e dUTP Niclc nnd lobeliiig, siglas en inglés). iuYr.ireiles y coi.

(2004), reporta11 que en ciiibriones bo\'inos PlV, la I'ragiiicntación nuc?ear aparcce di:spiii.s Jc la';

96' lipi, tienipo e11 el que coiiiien7a a hacerse ec ideiite.

Eii este trabajo, a las 48 Iipi el griipo coiitrol alcanrí, iiiia tasa dc división c.1-iibrioiiaiia

62,61'!/0, siendo siinilar a la cncc)nti-ada cii otros trabajos (Diez y col., 2005; Mko col,, 2005;

M m t ó y col., 2008; C'~)i-i-ea j/ col., 2!)C8; klagniissoii y i d . , 2008) siiostraii(lo iiiia \t-iit¿ij(i

ieL;pecto al grupo de vitrilicacios donde no se observó di\ isi6n. Varios autores liar reportad2 q1.11.

la tkcnica dc viti-iticacióii iisando OI'S, Iia sido c~ i to sa ii1 ser iinplcincntada cii o~oci tos hciiiit,

iii;idiirados il? i~ili'o, iiio\ti-ando ~inii tasa cic división eiiibrionai-ia clcl 19% par? /\satla coi

(2002), con EG (40%) + ~~ca i -osa (O.GM) + PVA ( I %). iin 50.33 - 6 I,13% eii el tn b¿ijo de hfcn 1,

col. (2002), ~itili7ando iina iiie7cla de E(i (20%) t 1)MSO (20%) + sacarosa (;_),5M) 211 I ;

soi~ici6ii vitrit?cacloi-:i. Magiiiissoii > col. (3008), repoi-tal-o11 eiiti-e 1111 '7-19,3n/~ al :iiiplear 13(3 a

30 y 5 pg/~iil, de citoc~lasina B. Mientras que Hoii y col. (2005), encontraron 1111 1 tasa del 53'Yt

e011 una iiiezcla de EG (2094) t I>hlSO (30Y0) f licol? (300 g/iiiL) - sacarosa t 0,SM). Par si

parte, Morató y col. (20081, eiico~its;~ron LIII porcentaje cie 3 1,5?/0 coi1 el eiiipleu de EG (3004) A

DbISO (20%) + taxol (lnibl), cstc iiltiiiio f~ i c cl iiiiico de los meiicioiiados q.ic no pi-odi!;cl

cii~brioiics :i partir dc ovocitos boa iiios viti-ilicados, c l resto encontraron tasas de produceion tlc

bllistocistos entsc el 5 y 23Y".

i\~l¿gnunsson y col. (2008). alirniaii que el éxito rel;itivo qui~lís se Jeba a la zdi;icín, e l !;ic

soluciones vitriticadoras. de sitocnlaciiia 11 (C'II). La C'I3 cs un agente inhibidor d ~ : I,i sintecis de

ii~i~:rotilaiiieiilos qiic interr.uinpe I;i polimeri;.acióii de actiiia, pi-ebine la citoquinesi; sin afec ai- 'a

cariocluinesis. Adeiiiás estabili~a el Iiuso 111eiOtico y podría inejorar la ~esisteiicia < e los ovccitcts

en cstridio dc VG ante los daiios ocasionados por la criopreservaci6,i (Thcorod~rop~is y col.,

1803; citado por Magiius~oii y col., 2008). Igiialiiieiite, la citocalacina B (C'13) p ~ ~ e d e coiii~:i-\:;r

12s uiiiones gap entre las células de cumulus y el ovocito, requeridos para coordinar la

competencia meiótica y de importancia vital para el desamllo embrionario subsecuente (Ali y

col., 2004).

Los c~vocitos recuperados de ovarios recogidos en matadero se han corivertido en uria fuente

ampliamente usada para las biotecnologías reproductivas entre las que se incluyen arlernhs de la

producción in vipo de embriones, el clonaje y la transgenia. El establecimiento de programas #le

P IV cle embriones bovinos tiene un gran potencial como método para obtener un número eleva1 io

de enibriones en el mismo estadio de desarrollo, tanto para su utilización comercial como para

estudios básicos (Loneran y Fair, 2008). Con la aplicación de estas biotec:nologÍas reproductivas

como la PTV de embriones bovinos puede lograrse una mejora notable de los recursos g;anader~s

al permitir obtener animales con mejores características de importancia económica re!jolvien lo

cle manera importante el problema de disponibilidad de alimentos de alta calidad auinentando la

pobls~ción de vientres bovinos lecheros, la conservación y salvaguarda de la variabilidad

genéi.ica, permitiendo aprovechar y hacer uso de los mejores animales reproductores mediante la

c,onst:rvación de gametos.

14 pesar de haber superado muchas de las dificultades que se presentaron en sus inicios. y

inuctios laboratorios han sido capaces de producir eficientemente embriones ipz vitro (Meirelle ; y

col., 2004), estos presentan un desarrollo y calidad más bajos que los obtenidos in t ivo. Exisi en

inuclios factores que pueden interferir en el desarrollo normal del embrión, como lo son las

condiciones de cultivo, que se traduce en la detención de la división embrionaria y el bloqueo tiel

c:uarto o quinto ciclo celular (Warzych y col., 2007). Esta falla está directamente relacionada con

la competencia para el desarrollo de los embriones en estadio de blastocisto, y no está limitada a

10s bovinos sino también persiste en humanos (Chenoweth, 2007).

'Típicamente, los embriones PIV poseen un citoplasma más oscuro y una densidad nenor cono

vonsecuencia del alto contenido de Iápidos, una ZP más fi-hgil, un número menor de bl;istómei as,

diferencias en el metabolismo y una alta incidencia en las alteraciones crornosómitas,

características que han sido reportadas con las tinciones especiales (Lonergan y col., 2006). C ida

vez es más frecuente el uso de tinciones diferenciales para deteminar la ca idad de los

blasi.ocistos, con la tinción y cuantificación del número de blastómeras. trofoectodenno y h[Cl

CONCLUSIONES

Los ovocitos bovinos madurados in vitro criopreservados, conservan su morhlogia tras el

prolyeso de vitrificación en OPS, valorados tanto con la evaluación rriorfológica cotivenci mal

conio con la tinción vital con IP.

El proceso de vitrificación con OPS, aumentó significativamente el riúmero de owocitos con

alteraciones nucleares, valorados luego de la desvitrificación, mediante análisis citogeiiético.

El protocolo de vitrificq~ih con OPS utilizado en este estudio, comprometió la ~alsacidac de

desarrollo de los ovocitos bovinos criopreservados madurados in vitro provenientt: de viicas

mestizas, al encontrar reducidas tasas de fecundación y ausencia de división embrioriaiia.

La calidad de los embriones bovinos producidos in vitro correspondientes al gi-upo copgrol

valorados con una tinción doble diferencial demostró que la mayoría de las blast6meras no

presentaron alteración de membrana.

(Lim y col., 2007). La prueba de apoptosis es la de iiíayor frecuencia, eii la q-ie destacai la

fi-aginentacióii del DiqA (TUNEL), citocroii~o C, condensaci9n de la croinstinl, 3

fiecuentenwnte el análisis de ploidia (tinción con Gieinsa $941, en busca de ernbri Incs hapl idcs

(u) , diploides (h), poliploicles (,31,) (Wwi~g y col., 2008).

Eii este trabajo, la tasa de blaslocistos del grupo coiitrol lile de 98,18%, a los que sr lec:

determinó el núinero y ctilidad dc blast6tneras mediante la. tinción diterencial. El phrcentaie de

blastocistos a! igual que e1 riúi~ieio lotal de Islastó~neras ii; los 7 días de cultivo, cbtrnidas :ni i:i

p ~ s e i i t e trabajo f~ieinii siinilares a 10s obteiiidos por Asada y col. (20021, S~igi;/aaiia y col.

(2C$03), Poinar y col. (2005), brlor;itiP y col. (2008), Wang y col. (2008), con proinedio dc 23 % dc

hlastocistos y de 105 del rota1 de h1astóiner;is a los 3 d de cultivo.

Saii varios los autores qiie eniplesn la tinciian con 1P para valorar los efectos de la -1i1rific: ción

en eirzbriones equinos ('~harasaiiit y col., 3006) y bovii~os (Poiiiar y col,, 2005; blucci y col.,

2006; Cesari y col., 2006; Mori y col., 3006; Liin y col., 2007), siendo cada vez inis los traljajcs

qut valoran la sobrevivencia emhrionaria, iiiedida por la integridad de la inembrana a travchs de

la iincióri vital, cinpleando urio p~ la coinbinacion de \arios fluorocroinos en etnbri07es boj iiios

frescos o criopreservadus PIV. Eii este trabajo, en cu:iiito al ~iúniero de blastóiiiei~as positi1,as d

1P, se encontró iina inedia de 4 ,04~2,3 para los einbiioiies de 7 d J e cultivo, 1 1 cual re;ultó

sigi~iticativameiite inayor (P<O,O5) 211 coiiipararla con los einbriones que siguieron en cultivo

hasta el día S (9,88*6,9).

Ei1 cl trabajo reali~ado por Mari j col. (200G). obser\iarc)n que en el ZPi4 de I:is bl:ist.5ineras, del

gnipo de einbrioiies qiie tio i'u'ueron soinetidos a niiigUii tratamiento, iiñostraron alrcració 1 de

iiieiiibraiia, iitili/ando 1P + Hoechsl 333412, lo qiie se traduce en 1 1 s ~ proinedio d ~ , G c6l iias,

ii~aiiifesiaiido clue este tipo de altisracirín piierie ser coiisecuensia de i i~i dallo o trauma cel ilar,

car:,ctcrístico del dcsordcii cii Iü cstructiira cclular, que inicia Con un hinchanicntu cxrpo

resilitado de los cambios de periiieabilidad j1 qiie culininri con I;i ruptura de la mem ?rana . PCIS s ~ i

parle, Kaidi y col. (1999), reportan qiie los einbriones del griipo control, soiiietidos a la iiiisiiia

ticion, ~nucstrcin una proporcióii dc cClulas tcñidas con 1P dc O,1*1 ,S, y cn el grupo de einbrionc:;

tratcidos con diferentes crioprotcctorcs las proporcioiies oscilan entre 1 , i;k 18 y 3 1 ,; L ,7, cuz iido

fiieron ~ometidos a diferentes concentraciones de galactosa, concluyeiid~n que la alteración di* las

me:nbrana aparecía cuando los embriones son expuestos a un shock osm~tico prog-icido per Ias

concentraciones altas del críoprotector, en unei solución de 1200 d s m . Mucci y t:o1. (2(Q6),

una media de %M,5 (1,8%) cdulas con me alterada p m el EPp tml,

mie:ntras que para los embriones vit3?ficados n valores de hasta 42,7==1,9 (42,*I%),

hdicmdo que esto se debe d &o causado por la congelación en N2k y al efecto ti~xico d : las

sol iiciones crioprotectoras.

En la valoración realizada por Poinar y col. (2005), donde compararon la intsg-idad ce la

membrana de embriones bovinos producidos in vivo e in vitro valorados en fresco, arrojaror: una

proporción de: 1.2*7,5 y 4,5*7,5, rcspectivamente. Este último similar a los obtenidos en este

estudio. Los autores indican que el porcentaje de daño celular por blastocisto (basándose eii los

resiiltados de integridad de membrana y fragmentación del DNA) fue niás baja en 'os embri mes

producidos in vivo, comparados con los producidos in vitro, concluyendo que lis diferercias

entre los orígenes de prodiicción de los blastocistos es baja, evidenciantio la puesta a punto (le ia

técnica de PIV de embriones bovinos y como 1s aparición de células con merrbrana ce ular

alterada es indicativo de las condiciones de cultivo, por lo que esta doble tincióri puede ser

utilizada como criterio para el análisis de las condiciones de cultivo, prueba de calidatl de

bla:rtocistos, ya que incluye el conteo del total de blastónieras y además revelar los eFectos (le la

criclpreservación.

A pesar del progreso significativo en la criopreservacion de ovocitos y embriones mamíft~ros,

muchos de los eventos inoleculares y bioquímicos en los que se basan estas tecnologías no están

del todo entendidos. En los años recientes, las investigaciones se centran en la ohtencióii dc

ovocitos viables, competentes para el desarrollo. Aún en las condiciones más favo -at-des, se hari

obtenido solo exitos limitados cuando se compara con ovocitos frescos que son los uiilizados de

mariera rutinaria en la producción de embriones in vitro.

Los dafios caiisados por la congelación y los efectos tóxicos de los crioprotecto1.e~ son las

principales consecuencias adversas luego de los crioprocedimientos. Se están ;iesarrollcndo

diferentes estrategias para mejorar los resultados de la criopreservación. Estas estrategias

incluyen la reduccióii de los volúmelies de los contenedores, el incremerito del grad er~te tértr ico,

los rambios en la relación superti~:ie/volumen, el mejoramiento de la ci-iotoleranci,~ rnedianie la

, . c c , I ?>tos , ( ~ I ~ O C I I I ~ ~ L ~ I ~ ~ O . M, Y , ! , ~ I . a ilii,> & ~ l ~ : r i o ; ~ l ~ i i : ~ c ~ ~ ~ i ; ~ i i ~ ~ ~ ~ ; t o ~ i t x ,~\i;citc j l!c;t~t> a -,, L!

ic~iiica rcprodi!c.tiva ~o t : : i~ i i~~ i f t~ hi.ntiribrc cii 21 futi~ir) C C I . C ~ I I O . E<; claro quts no ha) utia

iiec:csidad iirgente de iiiipleatieiitar la coiigelaciUn de ovocitos t-rítre las t:ciiologiaj ce

1-eyroducciori asistida qiie \c. iitiii7aii cii la ticti~alidad. Sieiiipie esta la 17l)deros~i iiieioc'nlogía de i ~ l

coiigelaciOii de einbriones coino :ilteriiati\~:i coiil'iable. No se trata de ii~aiisloriiiar a cí~iigel;ici6r

ococitaria eii iii1 sustitiito de la congclacióii de einbriones. pero sí de darle su destii,o propio. Ha4

áreas espccilicas en las qiic la congclacióii obocitaria pucde scr ~álida.

En procliiccióii aiiiiiial clásica. las pioduciorcs piiílicrai1 ,ircscr\ar Iíncas t'cmci~ina,, cic alto 'ra1c.r

gei~klico, coiiierciulirnr o\ ocitos m54 qile embriones eii los qiie el padre ya Iia r ido escoa;ido,

preqervar el iitaterial genitico Seiilenino de especies en peligro de extinción, la prrsducci \n y

inai~teniinierito de líneas de aniiiiales transgthicos, cuyas capacidades rc:productiva:; son pob .es y

más aUn toinaiido eii cuenta que Isr prodiicci0ii de estas líiteas es un proceso leiitc y eos oso.

C'~tlndo esté coinpletainciitc optin11í;ada. ia criopreseivación obociiaria tciicirá apiicaci , i i a

niditiples.

CONCLUSIONES

Los ovocitos bovinos madurados in vitro criopreservados, conservan su rnorfolc~gía tras el

proceso de vitrificación en OPS, valorados tanto con la evaluación morfológica cc+n~~encional

como con la tinción vital con IP.

E:l proceso de vitrificación con OPS, aumentb significativamente el número de o,docritos con

alteraciones nucleares, valorados luego de la desvitrificación, mediante análisis citogenético.

El1 protocolo de vitrificq~ir;ui con OPS utilizado en este estudio, comprometió la c;ipiicidad Je

clesarrollo de los ovocitos bovinos criopreservados madurados in vitro proveniente de vacas

mestizas, al encontrar reducidas tasas de fecundación y ausencia de divisihn embrionriria.

1,a calidad de los embriones bovinos producidos in vitro correspondientes al gnipo con$3l,

valorados con una tinción doble diferencial demostró que la mayoria de las b1ai;tómeras no

presentaron alteración de membrana.

La incorporación del DMSO al protocolo de vitrificación utilizado es este estudio podría mej )rar

la c,%paidad de desarrollo de ovocitos bovinos madurados in va'tpo.

Evaluar la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos vitrificados hasta el estadio de

bls;tocistos, seleccionados después de la valoración de sobrevivencia niorfológica a través c e la

tinción vital con P.

Implementar la tinción de TUNEL para la valoración de apoptosis en embrimes bovinos

producidos zn vitm.

Iml~lementar la vitrificación en OPS de embriones bovinos producidos in vitm

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