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NOMBRE :
. .
! z . ''" k G U E Z ENRIQUEZ ,SIwA :: / ' i
TELEFONO PARTICULAR: 5 37 18 55
MATRICULA: 87344949
UNIDAD : UNIVERSX2.W AUTONOMA METROFOLITANA-IZTAPALAFA
DIVISION : CIENCIAS SXCLOGICAS Y DE LA SALUD
LICENCIATURA: BIOLOGIX ZXi'ERIMENTAL
TRIMESTRE LECTIVO :
HORAS A LA SEMANA:
TITULO DEL TRABAJO:
9 4 - 1
20
"AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE MITOCONDRIAS DE
PANCREAS"
Noi'4BRE DE LOS ASESORES:
QFB AXLA CUELLAR IBmEZ
INVESTIGADOR ASOCIADO "C"
DR RAFAZL MORENO-SANCHEZ
IhVCTISADCR TITULAR 'IC"
LUGAR DONDE SE F W U I Z O EL TRABAJO:
DEPARTAMENTO 3iOQUIMICA DEL INSTITUTO
NACION-U EZ CiG.DI3LOGIA "IGNACIO CHAVEZ"
Juan Badiana ?:2.1, Sección XVI, Tlalpan.
FECHA DE INICIO:
FECHA DE TERMINACION:
CLAVE :
2 DE JUNIO DE 1993
2 DE JUNIC DE 1994
DR RAFAEL MORENO-SANCHEZ
"AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE MITOCONDRIAS DE PANCREAS"
INDICE . . . . - . . ..I.
Pág.
1. INTRODUCCION.
1.1.Páncreas ...........................................,..l
1.2. Fosforilación Oxidativa ..............................5
1.2.1. Sistema Oxidante ..............................6
1.2.2. Sistema Fosforilante.........................ll
1.2.3. Regulación de la vía de Fosforilación
Oxidativa ..................t.........;.......i4
1.2.3.1. El Ca2+ como regulador de la vía.. . . . . .16 1.3. Fosforilación Oxidativa en mitoccndrias de páncreas.18
2. OBJETIVOS.
2.1. Objetivo General ...............................21
2.2. Objetivos específicos .......,..................21
3. MATZRIAL Y METODOS.
3.1. Preparación mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
3.2. Determinación de proteína ...,..................23
3.3. Micrografias electrónicas. .....................23
3.4. Enzimas Marcadpras
3.4.1. Citocromo Oxidasa....... ............ 24
3.4.2. Monoamino oxidas? ....................24
3.4.3. Glutamato deshidiogenasa ............ 24 3.4.4. Glucosa-6 fosfataca ................. 25 3.4.5. 5’-Nucleotidasa ..................... 25
3.5. Consumo de Oxígeno .............................26
3.6. Actividad de la 2-Oxogluturato deshidrogenasa .. 26 3.7. Consumo de Oxígeno en presencia de Caz+ ........ 27 3.8. Potencial de membrana y GradFente de pH ........ 27 3.9. Captación de Ca2+ .............................. 27
3.10.Amortiguadores de Ca2+/EGTA .................... 28
4 . RESULTADOS . 4.1. Micrografías electrónicas ...................... 29
4.2. Actividad de las enzimas mgrcadoras .... ; ....... 31 4.3. Oxidación de sustratos por las mitocondrias .... 32 4.4. Modulación de la 2-OGDH por Ca2+ ............... 33 4.5. Transporte de Ca2+ ..... ...................... 40
4.6. Respiración del Estado 3 inducida por Ca2+ ..... 42 4.7. Gradiente electroquímico de Protones ........... 45
. .
5.DISCUSION Y CONCLUSIONES ............................... 48
6.PER8PECTIVAS ........................................... 51
7 . B I B L I ~ ~ I A ........................................... 52
Y
\ e... . ..--v.. . .. -I -. .........
1 . INTRODUCCION.
1.1 .PANCREAS.
El páncreas es una glándula acinar, constituida por
una parte exócrina, que secreta dilriamente de 1200 a 1500 ml de jugo pancreático esencial para la
digestión de carbohidratos, grasas Y proteínas
provenientes de los alimentos; y una parte endócrina,
constituida por acúmulos de células que secretan hormonas
esenciales para el control del metabolismo de carbohidratos
[Fawcett, 1992; Ganong, 19891.
La porción exócrina del páncreas (figura 1) , se
encuentra constituida por células acinares de forma
piranidal, en cuyo citoplasma se encuentran contenídos-
gránulos de secreción muy refringentes, también llamados
gránulos acidófilos de zimógeno, porque contienen a l os
precursores de las abundantes enzimas que constituyen al jugo
pancreático y cuya función principa:. es la digestión de
hidratos de carbono, lípidos y proteínas de los
alimentos [Fawcett, 19921. Las enzimas más importantes son: " I
la a-amilasa pancreática (degrada glucógeno y almidón) y la
lipasa pancreática (hidroliza la grasa a glicerol y a
ácidos grasos). También se encuentran enzimas proteolíticas
como la tripsina, la quimiotri&qa, la carboxipeptidasa,
la ribonucleasa y la desoxirribonucleaza, las cuales al ser
liberadas al exterior en forma de gránulos de zimógeno, se
activan por las enzimas duodenales en La luz del intestino
[Ganong, 1989; Ham, 19691.
Si estas enzimas se activaran antes de llegar al
intestino, el páncreas se destruiría as í mismo (pancreatitis
aguda) por tanto, los acinos pancreáticos sintetizan al mismo
tiempo, un inhibidor de la tripsina para impedir la
activación prematura dentro de las células . La porción endócrina está constituida por grupos de
células endócrinas de tamaño diminuto, que forman los
llamados islotes de Langerhans que se encuentran distribuidos
en toda la glándula (figura 1).
Dentro de los islotes se localizan tres tipos distintos
de células cuya función principal es la secreción de hormonas
diferentes : las células a (6 A) las células B (6 B) y las
células 6 (6 D) que secretan glucagon, insulina y
somatostatina, respectivamente.
Estas hormonas controlan el nivel de glucosa sanguínea
del organismo [Fawcett, 1992; Ganong, 1989; Ham, 19691.
Cuando la glucosa sanguínea cae ppr debajo de un nivel
óptimo [60-100 mg/dl (humano normal en ayuno)], las células a
secretan glucagon, para elevar la glucosa sanguínea.
Cuando el nivel de glucosa se eleva demasiado, las células B
secretan insulina que disminuye ese nivel. La somatostatina
producida por las células 6 es capaz de suprimir la secreción
tanto de insulina como de glucagun y así, modular la
actividad de estas células, para mantener los niveles de
glucosa normales [Fawcett,1992].
2
t
3
Fig. 1 . Miorografía
muestra las
electrónica de1,páncreas humano, que
porciones exocrlna y endocrina. 4,
>T L b
I
, [Tomado de Ganong, 19891.
4
La elevación de la glucosa sanguínea no es el único
factor que provoca la liberación de insulina por las células
B. Este evento también puede ser estimulado por
neurotransmisores como epinefrina y acetilcolina, y por
cantidades elevadas de ATP extracelular [Wollheim y
Sharp,l981; Geshind et al, 19891. Se ha determinado que en
presencia de glucosa se eleva la concentración citosólica
de Ca2+, lo que provoca la apertura de los canales de Ca2+
dependientes de voltaje y la liberación de Caz+ del retículo
endoplásmico. Este evento parece ser l a señal de transducción
para la liberación de insulina en e1 páncreas [Prentki y
Matschinsky,l987; Aschcroft y Rorsman, 19901.
Al elevar la concentración de Ca2+ citosólico, se
estimula la vía de fosforilación 3xidativa que provee
energia necesaria para que se lleve a cabo el proceso
exocitótico.
Existe evidencia que sugiere 'in enlace entre el
metabolismo mitocondrial y la secreción de insulina:
1. La velocidad respiratoria [Lonyo et a1,1991] y la
actividad de las deshidrogenasas mitccondriales sensibles a
Ca2+ [McCormack et al, 1990; Sener et a1,1990] se incrementa
cuando se eleva la concentración de glucosa en las células B.
2. La rotenona, un potente inhibidor de la cadena
respiratoria mitocondrial, induce la activación de canal'es
de K+ sensibles a ATP presentes en las células 8 , sobretodo
cuando disminuye el suministro de ATP celular [Ashcroft et
al, 19873; estos canales de K+-ATP mantienen un potencial
4
A
transmembranal muy alto, lo que produce un cierre de l o s
canales de Ca2+ [Ashcroft y Rorsman et al, 19931, y en
consecuencia un bloqueo de la s-creción de insulina
[Aschcroft et al, 1987; Duchen et al, 19931.
3. Un aumento en el flujo del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos inducido por el ácido 2-cetoisocaproico
aumenta la secreción de insulina, así como la respiración
mitocondrial [Hutton y Malaisse, 19801 y provoca una
disminución en la actividad de los canales de K+-ATP
[Aschcroft et al, 1987; Duchen et al, 19931.
4 . La glucosa y el ácido 2-cetois~~íaproico junto con la
actividad disminuida de los canales de K+ATP provocan un
aumento de NAD(P)+ mitocpdrial reducido, de potencial
transmembranal y de calcio citosólico [Duchen et al, 19931
1.2. FOSFORILACION OXIMTIVA. El alto suministro de ATP
requerido para que la célula parcreática realice sus
funciones estímulo-secretoras es proporcionada por la vía de
fosforilación oxidativa que tiene lugar en la mitocondria. En
este proceso, la oxidación de sustratos provenientes del
ciclo de los ácidos tricarboxilicos (llamado sistema
oxidante) está acoplada a la síntesis de ATP (llamado sistema
fosforilante) , a través del potencial transmembranal generado por la cadena respiratoria [ver Moreno-Sánchez et al, 1991 (a) ;
Moreno-Sanchez, 1991 (b) J .
5
6
1.2.1 Sistems Oxidante.
Para ser oxidados completamente hasta COZ y agua, l os
sustratos provenientes de la degradación de carbohidratos,
lípidos y proteínas deben ser transportados a la mitocondria
a través de acarreadores específiccls localizados en la
membrana interna mitocondrial. Una vez en la matriz
mitocondrial, estos sustratos son oxidados por el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos (CAT) (fig 2).
Los equivalentes reductores (NACH y FADH2I producidos
por el CAT ceden sus electrones a los complejos enzimáticos
de la cadena respiratoria, siendo el aceptor final el oxígeno
molecular [Williamson y Cooper, 19801 . El 2-oxoglutarato, succinato, y los tricarboxilatos
(citrato e isocitrato) entran a la matriz mitocondrial en
intercambio con malato [LaNoue y Schooiwerth, 19791.
El piruvato y probablemente el glutamato son
transportados en un proceso dependiente del gradiente
electroquímico transmembranal. El glutamato también puede ser
transportado en intercambio con aspxtato (fig 2 ) .
Los ácidos grasos una vez transportados al interior de
la mitocondria, por medio de la aci! carnitin transferasa,
son oxidados por un ciclo de reacciones que elimina dos
átomos de carbono de su estremo carboxilo. De esta manera se
genera una molécula de acetil COA er. cada vuelta del ciclo
de la B-oxidación de los ácidos graso:; (Fig. 2 ) .
, -
I 7
I
!
Fig. 2 Esquema de la Foiforilaoión Oxidativa y del Cialo CAT eon los diferente8 tipo. de rcrrrerdore8: A, Transportador de dicarboxilatos; B, acilcarnitintransferasa; C, Transportador de piruvato; D, Transportador de 2- Oxoglutarato; E, Lanzadera de Clutpmato; F, Transportador de Glutamato; O, Transportador de los tricarboxilatos; H, Uniportador de Ca2' ; H'. Transportador de Ca2' (En higado y rrñ6n, el intercambio es con, H-, en corazón es con Na+).
[Modificado de Moreno-Sánchez,l991 y LaNoue,1979].
7
8
El piruvato, proveniente de la glicólisis es
transformado dentro de la mitocondria en Acetil-COA por el
complejo de l a piruvato deshidrogenasa.
Los sustratos transportados al interior de la
mitocondria sufren una serie de oxidaciones catalizadas por
diferentes deshidrogenasas dependientes de NADt, excepto el
succinato que es oxidado por una deshidrogenasa dependiente
de FADt.
Otro componente del sistema oxidativo es l a cadena
respiratoria mitocondrial (figura 3 ) que puede verse como
una serie de reacciones de oxido-reducción acopladas de tal
manera, que los electrones transferidos desde los sustratos
de la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular
conllevan a una translocación de protones que genera una
diferencia de potencial electroquímico, y ésta a su vez es
utilizada para la síntesis ,de f.'TL. De acuerdo a la
clasificación propuesta por Hatefi, la cadena respiratoria
consta de 5 complejos enzimáticos:
El Complejo I Ó NADH:Ubiquinona Oxidoreductasa está
compuesto por 25 polipéptidos dispuestos en tres fracciones
denominadas HP Ó fracción insoluble; IP Ó fracción
ferroproteínica y FP Ó fracción flavoproteínica [Hatefi y
Stigga11,1976,; Peach,1982]. Este complejo cataliza la
transferencia de dos electrones desde el NADH hasta la
ubiquinona y es inhibido por rotenona [Nicholls, 19821,
piericidina A y rhein (inhibidor natural de l a NADH
deshidrogenasa) [Singer, 19795
9 I
El Complejo I1 ó succinato:ubiquinona oxidoreductasa
está compuesto por 4 polipéptidos- dos subunidades de
succinato y dos subunidades de citocromo b560. [Hatefi, 19851 . Cataliza la transferencia de electrones del succinato a la
ubiquinona,
El Complejo I11 ó ubiquino1:citocromo c oxidoreductasa
tiene un peso molecular de 250 kD y está constituido por 11
polipéptidos diferentes. Tres de las subunidades de este
complejo contienen grupos prostéticos: un citocromo b, un
citocromo c1 y un centro Fe-S. A este; complejo también se le
conoce como complejo bcl mitocondrial ya que ambos citocromos
y el centro Fe-S son los que intervienen en el transporte de
electrones. Cataliza la oxidación de ubiquinona a ubiquinol
y la reducción del citocromo c; es inhibido por antimicina
A (que actúa a nivel del citocromo b y evita la reducción de
la ubiquinona), mixotiazol y bA¿/ 2,3-dimercaptopropanol
(destruye el centro Fe-s) [Hatefi, 19851.
El Complejo IV ó Ferrocitocromo C :oxígeno
oxidoreductasa, es el último paso de ia cadena respiratoria y
presenta dos grupos prostéticos importantes: un grupo hem0 y
dos Cu2+. Esta enzima reduce al oxígeno molecular hasta agua
y es inhibido por DCCD (inhibe la translocación de protones),
cianuro, azida de sodio, CO y polilisina [Hatefi, 19851.
Fig.3 Esquema de l a Caden? Transportadora de Electrones
[Tomac:, de Nicholls, 19891.
11 I
El transporte de electrones a través de tres de estos
complejos (1,111 y IV) genera un potexial transmembranal al
inducir la salida de protones al citosol.
1 . 2 . 2 . Sistema Fosforilante.
La ATPsintetasa mitocondrial, catalogada por Hatefi
como el complejo V, es una enzima multimérica que contiene
18 polipéptidos divididos en dos fracciones: una fracción
soluble (F1) que es periférica donde se encuentran los
sitios catalíticos de la enzima en ties de sus subunidades
denominadas "í3"; y otra fracción insoluble (Fo) que es
transrnembranal . La ATPsintetasa mitocondrial cataliza la hidrólisis Ó
síntesis de ATP sin que se produzca un intermediario
fosforilado a diferencia de ATPasas presentes en otros
organelos como la ATPasa de Caz+ y de Na+/K+. La síntesis de
ATP está acoplada a l a energía del Zradiente electroquímico
de protones generado por la cadena respiratoria
[Mitchell, 19851.
Se han propuesto varias teorías para explicar este
acoplamiento:
I) La teoría del Acoplamiento directo, (propuesta por
Mitchell) postula que los protones translocados a través de
Fo intervienen de manera directa en las reacciones que se
llevan acabo en el sitio catalítico de F1 (interacciones de
tipo molecular entre los protones y los sustratos) para la
síntesis de ATP. El ADP y el fosfato se unen a la subunidad 13
11
en su sitio catalítico y liberan uno Ó dos protones a la
matriz mitocondrial. Los oxígenos que rodean al fosfato
interactúan con la subunidad catalítica formándose una
especie muy reactiva que es capaz de interactuar con el ADP y
formar ATP. Por cada tres protones que atraviesan la enzima,
se forma una molécula de ATP [Vásquez-Laslop,l989]. 11) La
teoría del Acoplamiento indirecto !propuesta por Boyer)
postula la existencia de un ciclo para la síntesis de ATP en
el que la energía del potencial transmembranal da como
resultado una serie de cambios conformacionales en las
fracciones Fo y F1 de l a ATPsintetasa. El ADP y el Pi se
unen débilmente a un sitio catalítico en l a subunidad B,
cuando los protones atraviesan Fo y provocan un cambio
conformacional en F1 que permite que el ADP y el Pi se unan
espontáneamente en un ambiente con una baja polaridad para
formar ATP. El ATP permanece fuertemonce unido a este sitio
catalítico hasta que otra molécula de ADP se une al mismo
sitio.. Esto ocurre de manera simultánea en las tres
subunidades í3 de la fracción F1.
De esta manera el efecto del potencial electroquímico
transrnembranal es un efecto "a distancia" sobre los sitios
catalíticos de F1 el cual promueva la síntesis de ATP
[Vásquez-Laslop, 19891 . Entre los inhibidores de la ATPsintetasa se encuentra el
DCCD que se une a la enzima en la fracción Fo e inhibe la
translocación de protones; aurovertina, NBF-C1 (4-cloro-7
nitrobenzofurazano), efrapeptina (que reaccionan con la
12
13
subunidad B, bloqueando el sitio actilm); y oligomicina (que
inhibe la translocación de protones, así como la hidrólisis
de ATP). Algunos compuestos mercuriales así como la
venturicidina inhiben la hidrólisis de ATP [Hatefi,1985].
Dos componentes mas de la membrana interna mitocondrial
forman parte del sistema fosforilante: el translocador de
adenin nucleótidos (acarreador ATP/ADP) que intercambia una
molécula de ADP citosólico por una de ATP sintetizada en el
interior de la mitocondria, durante la fosforilación
oxidativa. El otro componente es el acarreador de fosfato que
transporta Pi inorgánico del citosol a la matriz mitocondrial
en intercambio con iones hidroxilo (Fig 2)[LaNoue y
Schoolwerth, 19791 . La actividad tanto del sistema oxidante como del
sistema fosforilante está acoplada al gradiente
electroquímico de protones generado por la cadena
respiratoria. Este gradiente es utilizado por la ATPsintetasa
para la sintesis de ATP y consta de dos componentes:
z
1. Un gradiente de p H .
2. Un gradiente eléctrico
Ambos forman parte del potencial electroquímico que está
dado por la siguiente expresión:
ApH+ = Acp - 2.3 RT/F ApH
13
14
Donde A ~ H + es el potencial electroquímico, Av es el
potencial eléctrico generado por la translocación de cargas
eléctricas y ApH es la diferencia en concentración de
protones a ambos lados de la membrana. El valor de 2.3 RT/F
se obtiene multiplicando R (cte. de l os gases, con un valor
de 8.314 Julios/mol°K) por T (temperatura absoluta) , entre F (cte. de Faraday, que equivale a 96.67 Julios/mol mV). Por lo
tanto a 25, 30 y 37oC, 2.3RT/F tiene un valor de 59, 60 y
62 mV, respectivamente.
1.2.3 Regulación de la vía de Fosforilación Qxidativa. El flujo a través de la vía de fosforilación oxidativa
depende de varios factores entre 1.0s que se incluyen. la
concentración de sustratos (ADP, Pi, 02) , cofactores (NADH) , y reguladores positivos (Caz+).
En la última década se han propuesto diferentes teorías
que tratan de explicar los sitios posibles de regulación.
Una de las primeras teorías fue l a propuesta por Chance
y Williams (1956), donde se propone que en condiciones in
vivo, la velocidad de síntesis de ATP está controlada por la
disponibilidad del ADP 6 por la relación ATP/ADP. Por tanto,
el intercambiador ATP/ADP es un paso limitante de la vía ya
que existe existe una competencia entre el ATP y el ADP
externos por los sitios de enlace en el acarreador. Esto ha
sido documentado en mitocondrias de diferentes tejidos
[Chance y Williams,1956; Moreno-Sánchez.l991(a)J.
15 < . 1.
4
Otros autores (Erecinska y Wilson, 1982), a diferencia
de Chance y Williams, proponen ' que l a s enzimas que actúan
cerca del equilibrio como el acarreador de ATP/ADP, no
pueden ser pasos limitantes de la via por que catalizan
reacciones rápidas, en cambio, las eri&imas que actúan lejos
del equilibrio como la citocromo c. oxidasa y el complejo I de
la cadena respiratoria pueden regulas el flujo de la vía ya
que catalizan reacciones lentas; así si un regulador
determinado afecta su actividad, tendrá un efecto sobre la
velocidad total de la via. A esta tecría se le conoce como
"teoría del equilibrio cercano" [Erecinska y Wilson,1982].
Posteriormente se describió la teoría del Control
Multiple por Kacser y Burnst (1973, 1979) y Heinrich y
Rapoport (1976). Esta teoría propone que el control total de
la vía de fosforilacibn oxidativa no se da en un solo paso
enzimático sino en toda la vía, donct todas las reacciones
están conectadas y el control varía de acuerdo a las
condiciones experimentales. Se
limitantes en la vía son el acarzeador de ATP/ADP, la
citocromo oxidasa, el acarreador de dicarboxilatos, la ATP
sintetasa y el complejo I de la cadena respiratoria. Para
llegar a tal deducción realizaron un análisis cuantitativo de
la actividad de cada enzima de l a vía para evaluar su
contribución en el flujo total ,[,:;r~en et a1,1990]. Se
hicieron curvas de titulación con inhibidores específicos
competitivos, no competitivos e irreversibles para determinar
el coeficiente de Control de Fluj-, [Ci], que permite
15
16
cuantificar las variaciones que tiene el flujo si se cambia
la actividad de la enzima.
Gracias al uso de inhibidores y al descubrimiento de
estos puntos de regulación se pueden proponen soluciones
atractivas a modelos como el de la citocromo oxidasa, y
acarreador ATP/ADP, que no habían podido ser explicados
cuantitativamente.
1.2.3.1. El Calcio c a e regulador de la vía de Eosforilacfón
QKids tfva.
Denton y McCormack (19801, Hansford (1980,1985),
Moreno-Sanchez (1985, 1990,1991) y Murphy (1990) han
desmostrado que la fosforilación oxidativa está controlada
por los niveles de Caz+ intracelular, el cual es capaz de
activar a tres deshidrogenasas componentes de la vía: la
piruvato deshidrogenasa-fosfatasa la isocitrato
deshidrogenasa y la 2-oxoglutarato deshldrogenasa.
La activación de estas enzimas a concentraciones
fisiológicas de calcio (0.1-1 pM1, ha sido demostrada en
numerosos tejidos de mamíferos [para referencia ver Hansford,
1985; McCormack et al, 19901. El calcio es introducido a la
mitocondria por un uniportador.elecuoforético [Puskin et al,
19761 que utiliza la energía del gradiente electroquímico de
protones generado por la cadena resrlratoria y por tanto
16
17
compite con el sistema fosforilante por la utilización de
esta fuente de energía [Moreno-Sánchex et a1,1983].
La entrada de Ca2+ puede ser inhibida por
concentraciones fisiológicas de Mg2+ (ImM), y por otros
inhibidores no fisiológicos como rojo de rutenio y iones
lantánidos [McCormak et a1,1990]. El mecanismo de salida al
citosol es principalmente por int,rrambio electroneutro con
Na+, en el caso de corazón y con H+ en el caso de hígado y
riñón [Akerman y Nicholls, 19831.
Una manera para determinar el eLecto máximo del calcio
(K0.5) en la vía de fosforilación oxidativa es evaluando la
actividad de cada enzima a concentraciones fisiológicas del
ión donde se asegura la máxima activación de la enzima, es
decir, en el intervalo de 0.05 a lpM de Ca2+. [Moreno-Sánchez
y Hansford, 1988; Reers, 19891.
La estimulación sobre la enzima inducida por Caz+ puede
ser modificada por los iones Mg2+, por Na+ ó H+ y por
poliaminas naturales (espermina), esta última actúa como
activador del transporte de Ca2+ [Lenzen et a1,1986;
Nicchitta et al, 19841. La capacidad del Mg2+ para inhibir la
actividad del uniportador de Ca2+ puede ser un mecanismo de
protección de la mitocondria contra una sobrecarga de Ca2+
[Lenzen et al, 19861.
La regulación de la síntesis de ATP por Ca2+ ya ha sido
demostrada en mitocondrias de corazón y riAón incubadas a
bajas concentraciones del sustrato ;Moreno-Sánchez et al,
1990,1991 J .
17
18
Por lo anterior, la posible activación de la vía de
fosforilación oxidativa por Ca2+ en páncreas requeriría de
una concentración de Ca2+ dentro de &a mitocondria en el
rango submicromolar de (0.1-1.0 pM) , y esto sucede cuando la
concentración de Ca2+ citosólica se aumenta como consecuencia
de una elevada concentración de glucosa.
1 3 . Fosforilación Oxidativa en mitocondrias de pancreas.
No existen estudios de la regulación de la vía de
fosforilación oxidativa en mitocondr:-;s de tejido glandular
mixto, Las preparaciones mitocondrlales de tejidos como
hígado, riñón y corazón se obtienen fácilmente debido a su
homogeneidad celular. Sin embargo, el páncreas que presenta
un tejido muy heterogéneo, dificulta la obtención de
mitocondrias libres de otros organrlos subcelulares. Los
gránulos de zimógeno que sedimentan a la misma velocidad que
las mitocondrias son el contaminante más frecuentemente
observado. Debido a lo anterior existe11 pocos estudios de la
fosforilación oxidativa en este tipo de mitocondrias.
Lieber reportó por primera vez l a obtención de
mitocondrias de páncreas utilizando irhibidores de proteasas
como dibucaína [Lieber et al, 1987 y 19891. El uso de esta
Última que es también un inhibidor del transporte de calcio y
de las deshidrogenasas dependientes de NAD puede explicar la
baja actividad de fosforilación oxidat,va en esta preparación
[Rottenberg, 1989; Lieber, 19863.
18
19
Tomando en cuenta estos antecedentes, nuestro interés
fue obtener mitocondrias funcionalmedte intactas y libres
de gránulos de zimógeno para dilucidar varios aspectos, que
desde el punto de vista bioenergéticcj se desconocen en este
tipo de mitocondrias.
Para la obtención de las mitocandrias de páncreas se
hicieron algunas modificaciones a Aas técnicas convencionales
de centrifugación diferencial, tomando en cuenta
procedimientos descritos por otros autores [Lieber,1984;
Clark, 19701.
La metodologia propuesta en esto trabajo se basa en el
principio de centrifugación dife.iencia1 con gradiente
discontinuo de Percoll [Thénevod et ,2l,19921.
El Percoll, que consiste en una silica coloidal
recubierta por polivinil pirrolidona. ha sido empleado para
remover los contaminantes de preparaciones y fracciones
celulares, incluidas las mitocondrias de hígado y cerebro en
rata [Sims,1990; Clark y Nicklas,’97C; Lai y Clark,1979] y
de placenta en humano (Gasnier et a1,1993].
Existen otras sustancias utilizadas para formar los
gradientes de separación, entre lac que se encuentra la
sacarosa y el ficoll [Lai y Clarck, 19761, sin embargo se ha
demostrado que el Percoll, a diferencia de los anteriores,
no somete a las mitocondrias a cmdiciones marcadamente
hipertónicas lo que provoca un empobrecimiento de sus
propiedades metabólicas.
19
20
Aspectos de la fosforilación oxidativa como la oxidación
de sustratos, control respiratorio, actividad de
deshidrogenasas y efecto del calcio sobre l a actividad de la
vía no han sido estudiados en mitocondrias de ningún tejido
glandular, por lo que nuestro principal objetivo fuC
caracterizar estos aspectos en la preparación mitocondrial de
páncreas, libre lo más posible de otros organelos
subcelulares.
20
21
2. OBJETIVOS.
2.1. Objetivo General.
Desarrollar una metodología para el aislamiento y
purificación de mitocondrias intactas de páncreas normal.
Caracterizar l a actividad de 1.a vía de fosforilación
oxidativa en esta preparación y deterrlinar si el Caz+ ejerce
un papel regulador sobre la misma.
2.2. Objetivo8 específicos.
1. Evaluar la pureza de la preparación mitocondrial
ensayando la actividad de diferentes erizimas marcadoras.
2. Medir el consumo de oxígeno en presencia de
diferentes sustratos como ácidos grasos e intermediarios del
CAT.
3. Evaluar l a actividad de la 2-oxoglutarato
deshidrogenasa en presencia y ausencia de Ca2+.
4 . Evaluar el potencial transarmbranal generado por
estas mitocondrias y el efecto del ea2'+ sobre este parámetro.
5. Evaluar el efecto del Caz+ sobre el consumo de
oxígeno.
1
22
3. MATERIAL Y METODOG.
3.1 Preparación mitocondriai. Las mitocondrias fueron
aisladas de pancreas de perro normal, El perro se sacrificó
por choque eléctrico 6 por sobredosis de pentobarbital
sódico (0.5ml/kg de peso) .Se obtuvo el páncreas y se colocó
en un medio (MA) que contenía 0.25M de sacarosa, lOmM
HEPES, 0.3% de albúmina bovina libre de ácidos grasos y
1mM de EGTA ajustado a pH 7.4 co:, KOH. El homogenado
obtenido se centrifugó a 750 x g durante 8 minutos, dos
veces. Los sobrenadantes se centrif cjaron una vez a 10800 x g durante 10 minutos. La pastilla obtenida se resuspendió en
4 ml de MA, que contenía 12% de Percoll. Esta suspensión fue
aplicada a un gradiente discontinuo de Percoll consistente
en 10 ml al 20% y 12 rnl al 40%. Se centrifugó a 16000 x g
durante 5 minutos. Los gránulos de zimógeno sedimentan en el
fondo del tubo mientras que las mitocondrias se recuperan
de la porción que queda en la interfase de Percoll
correspondiente a las diluciones de 20 y 40%. Las
mitocondrias se lavaron con MA al triple de su volumen y se
centrifugaron a 10800 x g durante 10 minutos. La pastilla de
mitocondrias se resuspendió con 3-4 IT., de MA, se añadió 1mM
de MgC12 y 2mM de ADP; se incubarm por 5 minutos con
agitación suave a 4OC.
I
Se realizó la Última centrifugación a 10800 x g, 10
minutos y se resuspendieron en el mismo medio.
22
, ----.e-- - I-. . -
23
Se obtienen de 1-1.5 ml de preparación mitocondrial con
una concentración de proteína alrededor de los 15 mg/ml.
3.2 Determinación de proteína. E.1 método empleado fue el
de Lowry-Folin [Lowry et a1,1951]. A 5-10 p1 de la muestra
mitocondrial, se adicionaron 4 ml de solución D, 1 ml de
agua y 0.4 ml de rectivo de Folin, se agitó y se incubó en
baño maría hirviendo durante 1 minutc. Se ieyó a 640-670 nm,
contra un blanco de solución D-react:vo de Folin y agua. La
curva estandar se preparó con albúmina sérica de bovino libre
de ácidos grasos cristalizada 1 mg/ml.
solución D: 9.8 ml de solución A, 0.3 ml de solución B y
0.3 ml de solución C.
solución A: NasC03 al 2% en NaOH 0.1 N
solución B: Tartrato de sodio-potasio al 2%
solución C: CuSOq-SH2O al 1%
3 . 3 Microqrafias electrónicas. La Ixieparación mitocondrial
fue fijada en glutaraldehído 2% (vol/vol) en l O O m M de
amortiguador de fosfato, pH 7.2 y procesada para microscopía
electrónica como se ha reportado previamente [Carabez-Trejo y
Possani, 1982).
1 23
24
3.4. Enximas marcadoras
3.4.1. Citocromo Oxidasa. Las mitocondrias y las
diferentes fracciones (1 mg/ml) fueron incubadas en un medio
con 7mM ascorbato, 25mM tris-acetato, 5 m citocromo C, 1pM
antimicina; a 25%. Después de un minuto de actividad se
adicionó 1pM de CCCP, se esperó un minuto más y se marcó la
línea base. Posteriormente se adicionó 1.41104 de TMPD, para
iniciar la reacción [Moreno-Sánchez et al, 19911.
3.4.2. Monoamino-oxidasa. Las mitocondrias y las
diferentes fracciones (0.1 mg/ml) fueron incubadas en un
medio con 50mM de amortiguador de fosfatos ajustado a pH 7.5,
con NaOH y benzilamina 5 mM. La reacción fue iniciada por la
adición de la proteínam y se midio el incremento en l a
absorbancia a 250nm por la formación de benzaldehído. Se leyó
un espectrofotómetro de doble ray- AMINCO DW-2.. La
actividad específica fue calculada ucilizando el coeficiente
de extinción molar 13/mM/cm [Reagan et al, 19871.
3.4.3. Glutamato Deehidrogenasa. Las mitocondrias y
las diferentes fracciones (0.075pg) se incubaron en un medio
que contiene 0.1M amortiguador de fosfato, 2.5mg/ml NADH,
0.75M acetato de amonio y 30mM EDTA. La reacción se inició
por la adición de 0.15M 2-oxoglut5rato. Se leyó en un
espectrofotómetro de doble rayo Amirico DW-2 a 340 nm. La
actividad específica fue calculada utilizando el coeficiente
de extinción molar de 6.22/mM/cm a 349 nm del 2-oxoglutarato
[Plummer, 1978 J .
~ 23
25
3.4.4, Glucosa 6 Foefatasa. Las mitocondrias y las
diferentes fracciones (0.5mg) se adicionaron a 0.80 ml de
solución de mezcla con 5OmM glucosa 6-fosfato, 0.1 M MES, pH
6.5 cdn NaOH y lOmM EDTA, pH 6.5. Se jncubaron a 37OC en baño
maría, con agitación suave durante 6C minutos. Se detuvo la
reacción adicionando 1 ml de TCA al 10%. Se centrifugaron en
una centrífuga clínica durante 5 minutos y se recuperaron los
sobrenadantes. Se adicionaron 2 ml de reactivo de Fiskie-
Soubarrow, para la determinacih de fosfato. Se cuantificó el
fosfato liberado con un espectrofot4ntetro Beckman a 660 nm y
se comparó contra una curva estandar de fosfato 5mM en 0.5%
de TCA a diferentes concentraciones uue equivalen a O, 125,
250, 375 y 500 nmoles de fosfato [Plwmer 19781.
3.4.5. 5'-Nucleotidasa. Las mitocondrias y las
diferentes fracciones (20pg) se adicionaron a O. 80ml de
solución de mezcla que contiene 5OmM Na-AMP, pH 7.0, 0.5M
glicina, ajustado a pH 9.1 con YaOH y 0.1M MgC12. Se
incubaron a 37OC en baño maría, con agitación suave durante
60 minutos. Se detuvo la reacción a'dicionando 1 ml de TCA al
10% y se recuperaron los sobrenadantes. Se adicionaron 2 ml
de reactivo de Fiskie-Soubarrow para la determinación del
fosfato liberado. El procedimiento para determinar el fosfato
es igual al de la técnica anterior [Nathan,1974].
3.5. Consumo de oxfgeno. Fue medido polarográf icamente con un
electrodo tipo Clark utilizando como medio base 125 mM KC1,
10 mM HEPES, lOmM amortiguador de losfatos y 0.5 mM EGTA
I 25
26
ajustado a pH 7.2 con KOH. Los sustratos utilizados fueron
glutamato, citrato, isocitrato, 2-oxoglutarato a lOmM,
piruvato y succinato 5mM, malato 2mM, palmitil LD-Carnitina
20pM y octanil LD-Carnitina 50pM. Se inició la reacción con
260mM de ADP. Los sustratos dependientes de NAD fueron
acompañados con 2mM de malato.
3 . 6 . A c t i v i dad de l a 2-Chroglutarato deshidrogenasa (2-ffiDH) . Las mitocondrias (0.7-1.3 mg/ml de proteína) fueron
incubadas en un medio estandar cGn 12OmM KC1, 25mM K-MOPS,
0.5mM EGTA, [KME] pH 7.2 a 30OC, con adiciones de 0.3mM de 2-
Oxoglutarato. La toma de O2 fue medida en un electrodo tipo
Clark. La solubilidad del O2 en equil'.brio con aire se tornó
de 200 nmol/ml a 3OoC.
Determinación de la actividad de la enzima: a) se
incubaron las mitocondrias en el amortiguador KME, en
presencia y ausencia de 0.5mM espermina y en presencia de ImM
Mg2+, 2mM Pi y 0.2mM ADP. La reacción se inició con 0.3mM de
2-oxoglutarato y b) se incubaron las mitocondrias en el
mismo amortiguador en presencia de diferentes concentraciones
de espermina (0.lmM y 0.3mM) ; y diferT2ntes concentraciones de
Mg2+ (1mM y 0.4mM). En ambos casos se disparó la reacción con
0.3mM de 2-oxoglutarato y se hicieron adiciones subsecuentes
de los amortiguadores de Ca2*k'EGTA a diferentes
concentraciones.
27
base se adicionó 0.3mM 2-oxoglutarato y amortiguador de
Ca2+/EGTA (0 .65 ) La reacción se inició añadiendo ADP 0.4pM.
3.8. Potencial de ¡&mbrarra y Gradiente de pH. Para calcular
el potencial de membrana se utilizá la distribución de 3H-
TPPt dentro de la mitocondria y La ecuación de Nerst. El
cálculo se corrigió por el enlace inespecífico del 3H-TPP+ a
las membranas mitocondriales, determinado en presencia de
0.25 pM de CCCP + 0.25 pM rotenona. El potencial de membrana
se calculó siguiendo l a formulación propuesta por Rottenberg
(1983), el cual involucra la corrección del enlace
inespecífico tanto de la face externa como de la fase interna
de l a membrana mitocondrial. El gradiente de pH fue
determinado midiendo l a distribucion de l4C-DMO (5, 5-
dimetiloxazolidina-Z,$-diona) I 3H20 y 14C-Sacarosa de acuerdo
a Rottenberg (1979).
3.9. Captacidn de Cazi.. Este parámetro fue medido siguiendo
los cambios de absorbancia a 675-685 nm de mitocondrias
incubadas con 50 pM de arsenazo I11 a 3OOC. [Scarpa et a l ,
19791 en un espectrofotómetro dual. El contenido de Ca2+
intramitocondrial fue determinado en estas mitocondrias,
incubando con amortiguadores de 45Ca2+/EGTA (actividad
específica 3473-698229 cpm/nmol) en 0.5 r n l de medio estandar
(KME) + 1mM Mg2+ a 30OC. La reacción fue iniciada por l a
adición de las mitocondrias (0.6-0.8 mg de proteína) y un
27
28
específica 3473-698229 cpm/nmol) en 0.5 ml de medio estandar
( W E ) + 1mM Mg2+ a 3OoC, La reacción fue iniciada por la
adiciGn de las mitocondrias (0.6-0.8 mg de proteína) y un
minuto más tarde la adición de 0.6 mM de 2-oxoglutarato. Las
mitocondrias se llevaron al equilibrio con 45Ca2+ durante 5
minutos; la reacción fue detenida por filtración (Millipore
Filters 0.45pM diameter). Los filtros fueron lavados con
lOml de solución fría que contiene KC1 0.15M y HEPES l O m M a
pH 7 . 4 . La radiactividad fue medid3 en un contador de
centelleo Beckman LS-7800.
3.10. Amortiguadores de Ca2+/EGTA. Las soluciones de los
diferentes amortiguadores de Ca2+/EGTA se hicieron en
presencia de MOPS O.lM, guardando la concentración final de
EGTA a 0.25M y el valor de pH a 7.22 [Moreno-Sánchez et al,
19881. Alicuotas de estos amortiguadores fueron adicionados a
las mitocondrias incubadas en el medio estandar (EGTA 0.5 mM,
pH 7.2) para estabilizar las diferences concentraciones de
Caz+ extramitocondrial libre. Los cálculos de las
concentraciones de Cazt fueron hechas utilizando el programa
de computadora Chelator [Schoenrnakers,l9?11
29
4 . RESULTADOS . 4.1. Micrografias electrónicas. La figura 3 muestra
micrografías electrónicas de transmisión de la preparación
mitocondrial. Antes de que Ea fracción mitocondrial sea
p u r i f i c a d a por el gradiente discontinuo de percoll (A) se
observan tanto mitocondrias condensadas como una gran
cantidad de gránulos de zimógeno. Después del gradiente de
percoll (B) se disminuye importantemente la contaminación p o r
estos gránulos.
Aún cuando se observa en la preparación
mitocondrial (B) gran cantidad de retl.culo endoplásmico
rugoso, mantienen intactas sus membrano externa e interna.
29
A. Fracción mitocondrial obtenida por s,mple centrifugación muestra numerosas partículas electrodensas que diferencial
corresponden a los gránulos de zimógeno.
de los gránulos contaminantes.
, ’C” @
B, Fracción mitocondrial obtenida después de la centrifugación con una gran disminución gradiente discontinuo de Percoll, muestra
I. f ? & -
Fig. 4 , Micrografias electrónicas da mitocondrias de “i 3 A
pancreas normal. , bir&
30
30
31
4.2. Actividad de l a s enziznas marcadoxas.
Para evaluar el grado de pureza de la fracción
mitocondrial, se hicieron ensayos con diferentes enzimas
marcadoras. En la tabla 1 se observa que la actividad de la
Glucosa-6 fosfatasa y S'-Nucleotidasa disminuye en la
fracción mitocondrial después dw ser purificada con el
gradiente de Percoll, mientras que la actividad de la
citocromo C oxidasa, monoamino oxidasa y glutamato
deshidrogenasa se ve incrementada. Esto indica que l a
fracci6n mitocondrial después del gradiente de percoll ha
sido enriquecida, y sin embargo aún presenta contaminación
por retículo endoplásrnico y membrana plasmática. _ _ Los valores obtenidos para la actividad de las enzimas
marcadaras son mayores que los reportados por otros autores
en mitocondrias de cerebro [Lai y Clark, 19761.
T-LA 1
Fraccrón Celular
Homoqcnado
Sobrenadante Antes Percol
I'r .Mi tocondria 1 Ancas Peccoll
Cobrenadante despuas Parco11
Fr.Mitocondria1 despuer Percoll
Cit ox MA0 GDH G6asa 5-Nasa
( 4 1 ( 3 ) (3) (3) ( 3 )
30.8i1.3 12.3i5.3 4.2i0.5 153.2IS 1 4 9 . 0 m
8.5f0.6 O 1.9f0.1 38.3f5.4 7.4f2 .I
126 .21 i5 .7 50.4f11.2 5.410.6 LjS.315.2 80.3f3.4
9.lf0.005 O 2.210.4 24.lfi. 6 4 . 6 I 1 . 3
236.9f0.7 125.6i8.2 12.4f0.9 149.4f3.1 32.2fl. 6
Los valores representan l a inedia f error eotandar. El número de experimentos se indrca
La actrvrdad de l a C i t Ox se ?xpresa en rAQ/min/rng ptct, MA0 y GDH se expresan en entre parbntesis.
nmolfmin/m$ prot ¿ 2SoCj 56aaa y 5 Nasa se expresan er nmol de Pi/rnq prot a 37OC.
Abreviaciones: Cit Ox, citocromo oxidas&; W, iibibonin.c$ oxidasa; GDH, qlutamaco < .
deshrdroqenasa: G6asa, qlucosa 6 fosfatasa: j-Nasa, 5-N~cleotrdasa.
-___ UUI "--
32
4.3. Oxidación de sustratos por las mitocondrias de pancreas.
Las mitocondrias obtenidas son capaces de oxidar
diferentes sustratos (tabla 2), tanto ácidos grasos como
intermediarios del CAT. Interesantemente se observó la
oxidación de citrato e isocitrato, indicando la presencia del
acarreador de tricarboxilatos en cstas mitocondrias, a
diferencia de las mitocondrias de múscuio esquelético y
cerebro [Lai y Clark,1976] que no lo presentan.
El sustrato que oxidan con maycr velocidad es el 2-
oxoglutarato (Tabla 2 ) seguido del succinato e isocitrato. El
glutamato, piruvato y LD-palmitil carnitina son oxidados
mucho más lentamente. Esto sugiere que la 2-OGDH es más
activa que las otras deshidrogenasas 5 bien, que el sistema
de transporte de glutamato y piruvato en estas mitocondrias,
es más lento que el acarreador de 2-oxoglutarato.
Aunque hay una oxidación signi €icante de palmitil-LD-
carnitina no hay oxidación de octanil-1.n-carnitina.
El control respiratorio calculado para estas
mitocondrias oscila entre 3 y 10, dependienck del sustrato, y
la relación ADP/O oscila entre 1.5 y 2.9. El empleo de
albúmina sérica de bovino y EGTA en el medio de resuspensión
permitió que se conservara la integridad de las membranas aún
después de 18 hrs a 4OC. El control respiratorio después de
este tiempo fué so lo ligeramente menor ó igual. I En el caso de l o s sustratos dependientes de NAD, los
~ ensayos se hicieron en presencia de malato 2mM. Sin embargo,
~ utilizando solamente este último como sustrato, la velocidad
32
33
respiratoria fue similar a l a obtenida ccn otros sustratos
exceptuando al succinato lo cual evidencía la presencia de
gran cantidad de sustratos endógenos en nuestra preparación.
TAI)XA 2
Oxtdaoi6n d. Los diferentes iustratos por l+a mitoaondxraa de pinoxera n o d .
9 f l llfl 17f1 :Gf2 17f2 1 5 . 5 f i 16fl ED0 4 1 3 i l 28f4
6 f 0 . 5 4 i 0 . 2 3f0.05 5f0.2 10f0.2 6:') 1 5 f 0 . 1 3.3f0.05 4 f 0 . 8 l I I
ADP/O, 2.910.2 2.9fO.3 2.8iO.1 2.3f0.2 2.6f0.2 2.7IO.2 2.5f0.2 2.6f0.1 1.7i0.1
I
I -
Los valores representan la media f error estandar E l n h e r o de experimentos se indica entre parentes is . Los resultados da l o s Edos 3 y 4 estan dados en .íAO/min/mg prot io 25OC.
Abreviaturas: CR, control r e sp i r a to r l o .
33
34
4 4 Modulación de l a enzima 2-Cbcoglutarato deshidrogenasa
(Z-WDH) por caz+.
La activación de la 2-OGDH por Caz+, puede ser
monitoreada por el incremento en el nivel de NAD(P)H de la
matriz mitocondrial, cuando son incubadas a bajas
concentraciones de 2-oxoglutarato lhansford y Castro,l981;
McCormack, 1985; Moreno-Sánchez et al, 19911.
La señal de fluorescencia del NAD(P)d se calibró con
valores mínimos y máximos para cada c.ondición experimental.
El valor mínimo [O% NAD(P)Hl se obtuvo después de una larga
incubación (8-10 minutos) en ausencia del sustrato oxidable.
No hubo cambio significativo de la fluorescencia cuando se
adicionó ADP 6 CCCP. El valor máxiiiio [lo08 NAD(P)Hl fue
generado por la adición de rotencria 3 1 final de cada
experimento (Fig. 5 ) .
Para bloquear l a actividad de l a 2-OGDH sensible a Ca2+
se utilizó rojo de rutenio -I- Na+ lo 1'12 nos confirmó que el
incremento en l a concentración de Ca2i en la matriz [ (Ca2+)m]
es un factor de modulación en las mitoconcrias de páncreas
(figura no mostrada).
La figura 6 muestra la sensibilidad de la 2-OGDH al Caz+
externo bajo diferentes condiciones experimentales. Si se
Y se incuban las mitocondrias en presencia de 1mM Mg2+
adiciona ADP y Pi no se modifica 1-3 concentración media
máxima (K0.5) requerida para estimular a l a enzima. Sin
embargo, si se incuban en presencia de espermina (0.5mM) el
I
-
35
-l
Fig 5. Estimulación de la actividad do la 2-OGDfl por Ca2+ en mitocondrias de páncreas normal. Mitocondrias de páncreas (0.77 mg prot.) fueron incubadas a 3OoC en medio estandar + 1mM de Mg2+ por algunos minutos, hasta alcanzar la línea basal.La fluorescencia intrínseca de los piridin nucleótidos fue medida como se decribe en métoao,s.Después de la adición de 0.4mM de 2-oxoglutarato, se adicionaron diferentes amortiguadores de Ca2+/EGTA para estabilizar la[Ca2+]ex. Para obtener l a máxima fluorescencia se adicionó rotenona a l final de cada experimento.
35
36
3 Y r Y .- > Y o U
.-
I P r3 O
I -Spe 0 . 6 6 0.66 0 . 6 6 I SPS (1.20 0.25 0 - 2 4 J
r~ 100
8 0 .
8 0 .
# I I 1
7.0 6.5 6.0 5.8 7.3
01rnM Mg2+ WlmM Mg2++0.2mM ADP AlmM Mg2++2mM Pi
p ca2*
t'
OimM Mg2'+0.5mM sper OlmM Mcj2++0. 2mM ADPtO. 5mM sper AlmM Mg2++2mM .Pi+O. 5mM sper
I
F i g 6.Modulrción de l a actividad do la P-OGDH por Ca2+,Mg2+, P i , ADP y rmprrmina en mitocondrias de phcrroas normal. El
porciento de actividad de la enzima fue determinado como se describe en métodos. La K0.5 para Caz+ de la 2-OGDH fue calculada bajo las condiciones qiit se muestran e n - los recuadros.
36
37
la matriz, la actividad de las desh..drogenasas sensibles a
Ca2+ y por lo tanto l a síntesis de ATP. Así una variación eri
~
I
~ fosforilación oxidativa a una [ C ' a 2 + l externa constante.
la relación espermina/Mg2+ puede tener relevancia fisiológica I
I I en l a actividad de l a 2-OGDH , y en la velocidad de I
38
En l a figura 7 se observa el etecto del Ca2+ externo
sobre la actividad de la 2-OGDH a diferentes relaciones
espermina/Mg*+. Un incremento en esta relación, ya sea
aumentar-do ?a corizentra :ión de espermina Ó disminuyendo la
concentración de MgZt, rrovoca un descenso en los valores de
K0.5 para Ca2+ de esta enzima. El experimento se realizó en
presencia (fig 7Ai y eii ausencia (713) de Pi 2mM, donde se
observan resultados idinticos, a excepción de la relación
espermina/Mg2+ 0.1 dond,: el valor de K0.5 fue mas alto en
presencia de Pi (0.713lA-4) que en ausencia del mismo (0.44pM).
A una [Ca2+]ex coistante , por ejemplo 0.3w (pCa2+
6.52), la actividad de la 2-OGDH,aunienta considerablemente
del 2-8% al 65-7!51~1, ciando existe un incremento en la relación
espermina/Mg2+ de 3 . 1 a . ) , 75 en presencia y ausencia de Pi.
39 I
p c t '
0 0.lmM sper/lmM Mg2+
A 0.lmM sper/0.4mM Mg2+
' o 0.3mM sper/lmM Mg2+
A 0.3mM sper/O.rimM Mg2+
Fig. 7 .Modul&ci¿n de l a aatividad de &I) 2-000H por Caz+ a diferentes rrlaciones emprrMna/b4qZ+. Las mitocondrias de páncreas se incubaron en presencia (A) y en ausencia ( 8 ) de 2mM P i . La act iv idad de l a 2-OGDH estimulada por d i f e rentes amortiguadores de Ca2+/EGTA fue calculada como se descr ibe en métodos.
39
40
4 . 5 Transporte de Ca2+ en las mitocondrias de pancreas.
La estimulación de entrada de Ca2+ al interior de la
mitocondria inducida por espermi.ia, ha sido descrita en
mitocondrias de diferentes tejidos [Nicchitta Y
Williamson,l984; Lenzen et a1,1986;1992] . Por tanto cuando se preincuban las mitocondrias con altas concentraciones de
espermina se induce un incremento en la velocidad de entrada
de Ca2t (fig 8A); esta reacción pudo ser bloqueada con rojo
de rutenio y con el desacoplante CCCP (fig. no mostrada)
Observamos que l a cantidad de Caz+ en la matriz aumentó
en presencia de espermina cuando las mitocondrias fueron
incubadas a concentraciones submicramolares de Ca2+ (fig 8B) . A 0.27 pM de Ca2+ externo, el contenido de Ca2+ en la matriz
fue significativamente más ait? (pCO.01) cuando los
expermientos se hicieron en presencia de expermina,
obteniendose una concentración interna de 1.5010.15 nmol
Ca2+/mg prot contra 0.9310.17 nmol Caz+/mg prot en ausencia
de espermina.
Estos valores del contenido de (:a2+ en la matriz estan
en el intervalo donde las deshidrDGenasas mitocondriales
pueden ser moduladas y correlacionadas con valores
reportados en otras mitocondrias de rnamífero, incubadas en
las mismas condiciones [Hansford, 198.<; McCormack et a l , 19891.
Una acumulación masiva de Caz+ file obtenido a [Ca2+lex
' ~ criticas de 0.59pM (pCa2" 6.22) en piesencia y de 0.93 pM I
I (pCa2+ 6.031 en ausencia de espermina (fig 8B).
40
41
A
Fig.8 captura dr. C.*+ en mitocondrirs de pinateas normil. Las mitocondrias (0.95mg prot) fueron incubadas a 3OoC como se describe en métodos. (A) La captura cie Caz' fue medida a diferentes concentraciones de espermina; O(a) , 0 . 2 ( b ) , 0.3(c) y O.SmM(d).Se adicionó también 4 1.iM A-23187 (A-23),60 nmol EGTA y una segunda adición de 50 nmol Ca2'. (R) La medición del Ca2+ intramitocondrial fue medido como se describe en métodos a diferentes adiciones de Ca2+/EGTA.
1 5 3 8 1 2
41
42
4.6 Respiración del Estado 3 inducida por ea2+.
El efecto del Ca2+ en la velocidad respiratoria del
estado 3 (fosforilación) inducida por bajas concentraciones
de 2-oxoglutarato fue examinada en estas mitocondrias. De
acuerdo con los datos de la actividaa de la 2-OGDH, el Ca2+
externo también estimula marcadamente l a velocidad de
respiración en el estado 3 (fig 9A); el valor de K0.5 para la
respiración fue comparable a los val.-)res abtenidos para la
actividad de la 2-OGDH, bajo l a s mismas condiciones de Mg2+,
Pi y ADP.
La presencia de espermina incremantó la sensibilidad por
Ca2+ en la velocidad de respiración del estado 3 ,
disminuyendo el valor de K0.5 de 0.49 a 0.25pM. La velocidad
del estado 4 y la relación ADP/O permanecieron constantes
aunque se utilizaron diferentes concentraciones de [Ca2+l ex.
Las velocidades absolutas de respiracihn fueron 60f14 (Edo 3)
y 9st03 (Ed0 4 ) ausencia de espermina; 67+12 (Edo 3) y 12f3
(Ed0 4 ) ng A 02/mg/min en presencia de espermina. La relación
ADP/O para las mismas condiciones fueron 2.07kO.09 y
1.97Sr0.13, respectivamente. Esto nos indica que el efecto
estimulatorio del Caz+ en la velocidad respiratoria del
estado 3 no aumentó la permeabilidad membranal. Estas
observaciones son semejantes a las obszrvadas en mitocondrias
de corazón de rata [Moreno-Sanchez et al, 1990; 19911, donde la
2-OGDH juega un papel limitante en 12 sintesis de ATP.
Se encontró que una variacion en la relación
espermina/Mg2+ a [Ca2+] ex constante también ejerce un control
42
.
en la velocidad de respiración del estado 3 (fig 9B). Te
manera similar a los resultados obtenidos para la a c t i v i d a d
de l a 2-OGDH, el incremento en la reiación espermina/MgZ+ (de
0.4a 0.75) a una [CaS+]ex constante de 0.2W (pCa2+ 6 . 7 ) ,
induce una estimulación del 40% (d.el 184 al 224%) en la
velocidad de respiración del estado 3 (fig 9 C ) .
43
2%
C Q .- c1
iI! n n 200 .- * oc m
U
* 170
130
100
j; s
8 7
8
/
8.5 6.0 5-B
pca2+
4, I 1 I 1 a l 1 I 1
8 7 &3 e.2 pCa2' M
O ImM Mg2+ t2mM Pi 0 1mM MgZt t2mM Pi t 0.5mM sper.
Fig.9 Control del Estado 3 rcngaratorio (fo8forilación) por Caz+, e' y espezmina en mitocondrian de píncrcra normal. Las mitocondrias de páncreas fueron incubadas en el medio estandar y con diferentes concentraciones de Ca2+/EGTA, bajo las condiiones que aparecen en los recuadros. Después de 1 min se adicionaron 0.3mM 2- oxoglutarato, seguido de 0.6-1.8 mMADP, 2 min más tarde. La velocidad de respiracibn del Edo. 3 fue corregido restando la velocidad de Edo 4 antes de :a adicTók, del sustrato y normalizado al v a l o r obtenido con Ca2+ contaminante (10 nM) .
44
45
potencial transmembranal acompañado de una elevación
significante del gradiente de pH a 692 y 1023 nM de Ca2+
4 7 eradiente eiectroquimico & jWtdhds
Cuando se estimula la actividad de l a 2-OGDH por Caz+,
se tiene en consecuencia un incremento en la velocidad de
I externo; la fuerza protón motriz resultante fue más alta en I
I
I presencia de Ca2+ en una orden de 6 mV a 1023 nM de Ca2+
(tabla 3) .
45
46
hpn ApH+
ICaZ+lax Ed0 4 Edo 3 Edo 4 Edo 3 Edo 4 Edo 3 --
361nM 197*3.6(4) 154.5f1.614) 20.5f6(5) 18.6t417) í144f1.8 (41 ílOStl(41
1023nM 197i2 (4) 162flí43 29f5143 32f6 6) I147f4 ( 4 1 I113f1(41
218 188 (1691 (1391
217.5 173 (16C.51 [1241
232.5 [l80.51 [
226 [1761
183 331
194 1451
PCO.01 contra lOnM de Caz+ externo. Los valnrer entre paréntesis cuadrados es la aproximación segun Rottenberg, 1 9 8 4 .
POTMCIAL ELtCTRICO
Re l a c i ón
Sper O.ImM/Mq+2lmM (0.11
Sper 0.3mM/Mg+21mM (0.31
Sper O.lmM/Mg+20.4mM í0.251
Sper 0.3mM/Mg+20.4mM (0.751
Estado 3(mVl Estado 4imVi
173.3f6.5143 193.5f4.314)
170.2f9.3 ( 4 I 188.2i5.6(4 I
Los valores entre parentes is son e l numero de experimentos rea l izados . Lor va lores entre parbntesis cuadrados es l a re lac ion espemna/Mg2+ u t i l i z ada , que se obtzene de d i v i d i r l a concentracion de espernuna entre l a concentracion de Mg2'.
Abreviaturas: spar, cspernuna.
46
Corno 13 ve-ocidac de síntesis de ATP es dependiente tie
I I (igr i tuci 9e.I grad,, rite electroquímico de protones [Azzoiie
e + . -1,1978;Aoelders e' al, 19881 resulta difícil ensayar con
1 I:; t é c n i c , . ~ > i t i l i z a !as si hay un ligero cambio en c i 1
qr:i(i:ente a( pr3z;nes < i 3 mV ó menos.
Se ob:( rvó c ? n las n-tocondrias de páncreas una tendencia
5 toi CIS I i t I O : ( ! ( i t ,lo .cncial de neinbrana en el estado :3
I :o se i.i-icrE'nieritG la relación espermina/Mg*+ a uria
[ 1; ' le:.: d e :i.L<p:.I ( * i.l)la 3) a pesar de que existe ur.a
e +:i.-iulciciijr si(jtlif.Lcal :va en la actividaa de la 2-OGDH y c.e
1 : v~clocidnc: r e s p : r a t c r i a del estado 3.
4:'
--.--.- . I .. * .- 1,11-, , ,# ,,.*. ._,#. , , ,,,,. -.,. - ,I ._,--- --.#w- * .I .,..--ai--
48
5. DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Un paso simple y crítico de ceqtrifugación diferencial
con gradiente discontinuo de Percoll, fue necesario para
obtener mitocondrias sin los contaminantes gránulos de
zimógeno y con una actividad enzimática superior a la
observada en otras mitocondrias.
Pese a que estan contaminadas con retículo endoplásmico
y membrana plasmática, presentan contrcles respiratorios y
relaciones ADP/O muy altos. El sustrato más preferentemente
oxidado por estas mitocondrias es el 2-oxoglutarato, por
encima del piruvato y del glutamato, :.U que sugiere que el
acarreador de 2-oxoglutarato o bien la enzima 2-OGDH pueden
ser puntos críticos en l a vía de F:sforiiación oxidativa
encontrada en este tipo de mitocondrias.
Se han descrito numerosos reportes que explican la
modulación de las diferentes deshidrogenasas por Caz+ Y la
relacibri de este suceso con el aumento de actividad celular
[Hansford, 1985; McCormack et al, 1991 I . Así, cuando se
incrementa la [Ca2+lc se incrementa tmbién la actividad de
algunas funciones celulares como son la contracción y la
secreción, eventos acompañados de una eievación en la
actividad de las deshidrogenasas, partic.llarmente la piruvato
deshidrogenasa y la 2-oxoglutarato deshidrogenasa. Este
aumento de trabajo celular obviamente requiere de un
concomitante suministro de ATP.
Una hipótesis atractiva del control de l a fosforilación
oxidativa i n vivo postula que un incremento en la [Ca2+]c
48
49
trae como consecuencia un incremento en ia [~a2+]m necesario
para que se activen las deshidrogerasas sensibles a Ca2+,
dependientes de NAD. A l llevarse a cabo este evento, habrá un
incremento en la relación NADH/NAD+ y por tanto una elevación
del gradiente electroquímico de protones y en la velocidad de
síntesis de ATP [Denton y McCormack,l985]. Sin embargo, en
el caso de las mitocondrias de páncreas este suceso no se
llevó a cabo, aunque se encontró c? sumento en la actividad
de l a 2-OGDH y del flujo de fosforilación. Lo anterior puede
ser explicado de la siguiente manera: se ha demostrado que el
Ca2+ aparte de estimular reacciones que producen energía
(deshidrogenasas) también estimula reacciones que consumen
energía (p. ejemp. ATPsintetasa, el acarreador ATP/ADP, el
acarreador de Pi) por ende, a l estar activadas ambas reacciones mantienen constante a su intermediario: el
gradiente de protones.
Además, se ha sugerido que existen otros sitios en la
fosforilación oxidativa !aparte de las deshidrogenasas) que
son sensibles a Caz+, como son el acarreador ATP/ADP [Moreno-
Sánchez,1985], la ATPsintetasa [Yamada y Huze1,1988], el
citocromo bcl de la cadena respiratoria [Murphy et a1,1989];
por tanto no se debe excluir un incremento en la actividad de
estos sitios, cuando aumenta la [Ca2+1r.
Debido a la heterogeneidad celular, la preparación de
mitocondrias de páncreas utilizadas en cste estudio no puede
extrapolarse a los estudios hechos en células B pancreáticas.
Sin embargo, la observación de que el Caz+ extramitocondrial
50
(citosólico) puede modular la actividad de la 2-OGDH y la
velocidad de síntesis de ATP, implica que un incremento en
la [Ca*+]c provocado por algún estímulo fisiológico en
páncreas, como por ejemplo la elevacitn de glucosa, participa
en las reacciones rnitocondriales.
La fosforilación cxidativa puede ser modulada por
diferentes mecanismos, uno de ellos es variando la relación
espermina/Mg2+ que se explica de la siguiente manera: el
uniportador de Cazt puede activarse cl inhibirse dependiendo
de la concentración de espermina y Mg2+ citosólicos, de esta
manera se controla el influjo de Ca2+ y por tanto se modifica
l a [Ca2']m [Lenzen et a l , 1992;Moreno-:3ánchez y Hansford, 1988;
McCormack,l989] Ó bien puede ser que l a espormina y el Mg2+
interactúen con algunas enzimas de la vía. Se ha descrito que
el Mg2+ p e r se regula la actividad del acarreador ATP/ADP y
la ATPsintetasa cuando se varía su co;,centración citosólica.
Interesantemente el AMPc y el ADP inducen una salida de Mg2+
celular y mitocondrial en hígado, la cual es bloqueada por
inhibidores del acarreador ATP/ADP [Romani et a1,1991]. De
hecho, la [Mg2+1c 'es modificada por un incremento de glucosa
y carbacol en las células B del páncreas [Gylfe,1991].
Aunque no existe evidencia de que la concentración de
esperrnina cambia en presencia de estimulos fisiológicos, es
concebible postular que la relaciói espermina-Mg2+ puede
controlar l a velocidad de fosforilación oxidativa sin que
haya un cambio en la concentración de Ca2+, como se muestra
en este estudio.
1 I
51
6 . PERSPECTIVAS.
Como se ha mencionado, una ae las señales de disparo
para la secrecibn de insulina por las células B del páncreas,
es el incremento de Ca2+ intracelular [Théler et a1,19902;
Duchen et a1,1993], lo que provoca a su vez un incremento en
[Caz+], y por tanto la modulación de la vía de fosforilación
oxidativa; sin embargo, no se conoce a que concentración
intramitocondrial en mitocondrias de páncreas, el Caz+ es
capaz de activar a estas deshidrogenasas sensibles al catión.
Por tanto, es interesante determinar cuantitativamente la
concentración de Ca2+ intramitocondrial libre para esclarecer
a qué concentración real del catión son activadas las
enzimas.
La técnica empleada sería la fluorimétrica, utilizando
indicadores fluorescentes sensibles a Caz+ con alta
eficiencia cuántica, como son el Fluo-3, Fura-2 Ó Indo-1,
disueltos preferencialmente en DMSO (dimetilsulfóxido) para
mantener la homeostásis del Ca2+. El punto de interés en esta
técnica es lograr l a internalizacjón de los indicadores
flourescentes en la mitocondria y evitar su salida [Moreno-
Sánchez et al, 19931.
Hemos demostrado en este estudio, que una manera de
modular el influjo de Ca2+ a la mitocondria es variando l a
relación espermina/Mg*+ extramitocondrial; sin embargo parte
de esta espermina total (encontrada en el citoplasma en
condiciones fisiológicas) entra a la mitocondria y se ha
"-.-I---- --
52
demostrado que afecta a una de las enzirnas importantes de la
vía, la piruvato deshidrogenasa-fosfataEa.
Se ha descrito que la concentración total de espermina
en el citoplasma sólo cambia durante la etapa de
diferenciación celular [Lenzen et al, 19861 pero cuando la
célula está totalmente diferenciada la concentración de
espermina permanece constante; poi tanto para que la
espermina sea un modulador de la vía, su transporte al
interior de la mitocondria debe ser muy rápido, lo que
implica la presencia de un transportador regulable que sería
interesante caracterizar.
Además, si una determinada concer.traci6n c de espermina
modula la piruvato desh idrogenasa- fos fa tasa , sería factible
que al variar su concentración se afectaran otros sitios de
la vía. La técnica empleada para tal caso sería seguir el
desplazamiento de espermina marcada radiactivamente.
Ahora bien, se demostró que en presencia de Ca*+, las
deshidrogenasas aumentan su actividad, sin embargo faltó en
este estudio llevar a cabo una medición de la síntesis de
ATP, para ver si realmente el Caz+ estimula a toda la vía.
52
53
7..BIBLIOGR?kFIA.
l.Aschcroft, F.M. y Rorsman,P (1989) . Prog. Biophys. Mol.
Biol. 54: 87-143.2.
Z.Caracbez-Trejo,A y Possan1,L. (1982). Neurosci.Lett.
32:103-107.
3.ChancerB. y Williams,G.R. (1956). 7 . Biol. Chem. 217:409-
427.
4.Clarck,J.B. y Nicklas,W.S. (1970). J. Biol. Chem, 245:4724-
4731.
5.Dent0n~R.M. y McCormack, J.C., (1980). Febs Letters. 119:l-
8.6.
G.Duchen,M.R.,Smith,P.A. y Aschroft,F.M. (1993). Biochem. J.
294 : 35-42.
7.ErecinskarM y Wilson,D,F. (1982). J. Membrane. Biol. 70:l-
14.
8.Ganong, W.F. 1989. Review of Medical Physiology. 1989.
Appleton 61 Lange. 421-433.
9,Gasnic, F. , Rousson,R. , Lermé, F. , V iganay, E. , Louisot, F. y
Gateau-Roesch,O. (1993). Anal. Biochem. 212:173-178.
lO.Geschwind,S.F.,Hiriat, M., Glennon,bí.C. , Naj af i , H ., Corkey,B.E. , Matschinsky,F.M. 1 7 Prent :i,M. (1989) . Biochim. Biophys. Acta. 1012:107-115.
ll.Groen,A. y Westerhoff,H.V. ( 1 9 9 0 ) . Plenum Press, N .Y . 101-
1 1 8 .
12 .Gy l fe , E., Grapengresser, E. , He1 Linan, B. ( 1 9 9 1 ) . Cell
Calcium. 12:229-240.
13.HarnfA. 1969. Histology, Lippincolt, Phil.
53
54
14.Hansford,R.G. (1980). Curr.Top.Blo?nerg. 10:217-278.
lS.Hansford,R.G. (1985). Rev. Physiol. Biochem.Pharmaco1.
102: 1-72.
lG.Hansford,R.G, y Castro,F. (1981). Blochem. J. 198:525-533.
17.Hatefi,Y (1985) Ann. Rev. Biochem. 54:1015-1069.
18.Hatefi,Y y Stiggal1,D.L. (1976). The Enzymes. Vol X I I I .
19,Heinrich,R y Rapoport,T.A. (1974). Eur. J. Biochem. 42:85-
95.
20.Kacser,H. y Burns,S.A. (!973). Symp. Soc. Exp. Biol.
27: 65-104.
Zl,Kahn,D. y Westerhoff,H.V. (1991). J, Theor. Biol. 153:255-
285.
22 .Lai, J.C.K. y Clark, J.B. (1976
23.La.1, J.C.K. y Clark, J.B. (1979
24.LaNouerK. y Scoolwerth,A.C.
4 8 : 871-922.
. Biochem. J. 154:423-432.
. Meths. Erizymol. LV: 51-60. (1979). Ann.Rev. Biochem.
25.Len~en,S.~ Hichethier,R. y Pantcri,U. (1986). J. Biol.
Chem. 261(35) :16478-16483.
26.Lieber,C.S. , Wilson, J.S. y Korster,, M.A. (1984) . Biochim. Biophys. Ress. Corn. 121(2):545-551.
27.Lieber,C.S. , Wilson, J.S. , Korsten,M,A. y Leo,M. (1986) . J. Lab.Clin. Med. 107(1):51-58.
28.Long0,E.A. , Torheirn,K., Deer zl-, $J.T. I Varnum,B.A. I
Tillotson,D. , Prentki,M y Corkey,B.E. t l C 3 l ) . J.Bio1. Chem.
266:9314-9319.
29.Lowry, O.H. , Rosebrough,N. J., Far1,A.L. y Randal1,R.S.
(1951). J.Bio1. Chem. 193:265-275.
54
,
30.M~Cormack~J.G. (1985). Biochem. J. 231:581-595.
31.McCormack, J.G., Halestrap,A.P. y Denton,R.M. (1990) . Fhysiol. Rev. 70:391-425.
32,McCormack, J . G . I Long0,E.A. y Corkey,B.E. (1990). Biochem.
J. 267:527-530.
33.Mitchel1,P (1985). J. Biochem. 97: L-18.
34.Moreno-Sánchez,R. y Tórres-Márquez,M.E. (1991). Int. J.
Biochem. 23:1163-1174.
3S.Moreno-SáncheztR. y Tórres-Márque2,M.E. y GÓmez-Pouyu,A.
(1991). Trends in Biomembranes & Bioenergetics. 1:119-150.
36.Moreno-Sánchez,R., Hogue,B.H., Hansford,R.G. (1990).
Biochem. J. 268:421-428.
37.Murphy,A.N., Keller, J.K. y Fiskum,G. (1990). J. Biochem.
Chem. 265:10527-10534,
38.Nathan,N., Aronson, J. y Touster,O. (1974). Meth. Enzymol.
XXXI. p32.
39.Nicchitta,C, y Williamson, J. .,(1984). J. Biol. Chem.
256(22) :12978-12983.
40.Nicholls,D. y Akerman,K. (1983). 3iochim. Biophys. Acta.
683:57-88.
41.Nicholls,D.G. 1982. Bioenergetics. Academic Press Inc. p
191.
42. Peach, C. (1982) Biochim. 31 ophys. Res. Commun . 104 (4) :1454-1458.
43.Plummer,D.T. (1978). An Introduction to Practical
Biochemistry. McGraw-Hill. pp 324-325.
55
56
44,Prentki,M y Matschinsky, F.M. (1987) Piiisiol. Rev. 67:1185-
1248.
45,Puskin, J. , Bunter, T .E. , Gunter, K. y Russell, R.R. (1976) J.
Biochem. 15:3842.
46.Reaga11,C.I.~ W i 1 son, 14. T. , Darley-Usmar, V .M. Y
Lowe,P,N.1987. Mitochondria IRL. Press, ;3p 82-83.
47.Romani,A., Martella,C. y Scarpa,A. (1993). J. Biol. Chem.
268:15489-15495.
48,Romani,A.,Dowell,E. y Scarpa,A. (1991). J. Biol. Chem.
266:24376-24384.
49.RottenberglH. (1979). Meths. Enzymol. LV:547-569.
SO.Rottenberg,H. (1984). J. Memb.Bio1. 81:127-138.
51,ScarparA., Brinley, F.J., Fiffert,T, y Dubyak, G.R.
(1978). Ann.N.Y. Acad. Sci. 307:86-112.
52 . S cho enma ke r s , T . J. M . , Theuvenet,A.P.R: (1991). Biotechiques. 12:870-879.
53.Sener, A., Rasschaer, J. Y Malaisse I W, J. (1990) . Biochim.
Biophys. Acta. 1019:42-50.
54.Sims,N.R. (1990). J. Neurochem. 55(2) 698-707.
55.Singer,T.P. (1979). Methods Enzymol. vo l L'J:454-463.
56.Thénevod,F., Haase,W. y Hopter,U. (1.992). Anal. Biochem.
202:54-60.
57.Vásquez-Laslop,N. y Dreyfus,G. (19tSi. Ciencia. 4 0 : 147-
155.
58.Williamson, J.R. y Cooper,R.H. ( 1 9 8 0 ) . Febs Letters.
Visser,G. J., Flik, G Y
117: k73-k85.
57
59.Wollheim, C.B., y Sharp,G.W. (1981). P h y c i o l . Rev. 61: 91~1-
973.
GO.Yamada,E,W. Y Huze:,K.J. (1988). Eiochem. J. 263: 11495-
11503,
I
,
- - 1 I