UNIVERSIDAD DE MÁLAGA

Facultad De Medicina

Tesis Doctoral

ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE

ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T

Inmaculada Pérez Fernández

MÁLAGA, 2003

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR,

QUÍMICA ORGÁNICA E INMUNOLOGÍA

ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA

CRÓNICA DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN

LINFOIDE T

TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR Dª INMACULADA PÉREZ

FERNÁNDEZ PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN MEDICINA Y

CIRUGÍA

D. MIGUEL MORELL OCAÑA, CATEDRÁTICO Y DIRECTOR DEL

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR, QUÍMICA

ORGÁNICA E IMNUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

CERTIFICA:

Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en

Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez

Fernández a la consideración del Tribunal que designe la

Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido

realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la

encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:

ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA

DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T

Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente

certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.

Fdo: Prof. D. Miguel Morell Ocaña

D. ALEJANDRO SERRANO LOZANO, MÉDICO ADJUNTO DEL

HOSPITAL REGIONAL CARLOS HAYA DE MÁLAGA

CERTIFICA:

Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en

Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez

Fernández a la consideración del Tribunal que designe la

Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido

realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la

encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:

ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA

DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T

Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente

certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.

Fdo: D. Alejandro Serrano Lozano

D. MANUEL MUÑOZ GÓMEZ, PROFESOR TITULAR DEL

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR, QUÍMICA

ORGÁNICA E IMNUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

CERTIFICA:

Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en

Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez

Fernández a la consideración del Tribunal que designe la

Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido

realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la

encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:

ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA

DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T

Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente

certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.

Fdo: Prof. D. Manuel Muñoz Gómez

A mis padres y a mi hijo Pablo.

AGRADECIMIENTOS

Al profesor Dr. D. Miguel Morell Ocaña, Director de esta Tesis Doctoral, por su

orientación y sobre todo por su afecto e infinita paciencia.

Al Dr. Alejandro Serrano Lozano, por su colaboración en la realización de este

trabajo, por su apoyo incondicional y porque me ha enseñado que la

honestidad y el esfuerzo personal consiguen superar barreras que en

ocasiones parecen insalvables.

A Emilio Vadillo Pérez-Cea, por dedicar tantas horas y esfuerzos a la

realización del estudio estadístico y por su disponibilidad en todo momento.

A Jose Luis Eseverri Gutierrez, por su capacidad de trabajo y por la ilusión y

entusiasmo en el montaje de las técnicas de citometría de flujo, sin cuyo apoyo

no hubiese sido posible la creación de esta Unidad.

A todos mis compañeros del Servicio de Hematología del Hospital Clínico

Universitario Virgen de la Victoria, por su comprensión, por su apoyo y

muestras de ánimo en los momentos áridos de este proyecto.

A mi maestra, Dra. Ana Siles, por sus enseñanzas, por haber sabido

transmitirme su entusiasmo por las técnicas de citometría de flujo, y por su

amistad.

A mi tutora durante mis años de residencia, Dra. Betancourt, que desde el

primer momento me hizo compartir su ilusión por la realización de la Tesis

Doctoral.

A la Dra. Villalta y Dra. Bailen, porque siempre han estado a mi lado cuando las

he necesitado y por su apoyo incondicional en los momentos difíciles.

A mi hermano Frank, porque su cariño y ayuda son imprescindibles para

alcanzar mis sueños, entre ellos la realización de esta Tesis. Gracias Frank.

A mis padres porque me han enseñado el valor del trabajo, del esfuerzo y la

coherencia personal y siempre estaré en deuda con ellos. Gracias.

ABREVIATURAS

HLA Sistema mayor de histocompatibilidad

CGP Células germinales pluripotentes

Ac Anticuerpos

MALT Tejido linfoide asociado a mucosas

Ig Inmunoglobulinas

APC Células presentadoras de antígenos

RCT Receptor antigénico de las células T

AcMo Anticuerpos monoclonales

CD Grupos de diferenciación o Cluster of Diferentiation

CMF Citometría de flujo

TdT Transferasa terminal desoxinucleotidasa

FSC Forward scatter o dispersión frontal.

SSC Side scatter o dispersion lateral

FITC Isocianato de fluoresceína

PE Ficoeritrina

PerCP Peridinchlorophyll proteina

Cy5 Ficoeritrina-cianina 5

SLPC Síndromes linfoproliferativos crónicos

LLC-B Leucemia linfática crónica de estirpe B

NK Natural killer o célula asesina natural

LDH Lacticodeshidrogenasa

EDTA Ácido etilen-diamino-tetra-acético

PBS Tampón fosfato

MFI Intensidad de fluorescencia media

ELF Escala logarítmica de fluorescencia

FAB Grupo Cooperativo Franco-Americano-Británico

ÍNDICE

I.- INTRODUCCIÓN

1

1.- Sistema inmune 2

1.1.- Bases estructurales del sistema inmune 2

1.1.1.- Órganos linfoides 2

1.1.2.- Base celular 5

1.1.2.1.- Linfocitos B 6

1.1.2.2.- Linfocitos T 8

1.1.3.- Manifestaciones antigénicas en la diferenciación linfoide 10

1.1.3.1.- Anticuerpos monoclonales 10

1.1.3.2.- Grupos de diferenciación 11

1.1.3.3.- Diferenciación linfoide B 12

1.1.3.4.- Diferenciación linfoide T 15

1.2.- Desarrollo de la respuesta funcional del sistema inmune 21

1.2.1.- Cooperación entre linfocitos T y B para la respuesta de

anticuerpos 22

1.2.2.- Respuesta mediada por células T 23

1.2.3.- Mecanismos de defensa antitumoral

24

2.- Citometría de flujo 26

2.1.- Fundamentos de la citometría de flujo 27

2.2.- Análisis celular. Fundamento de los sistemas de detección 27

2.3.- Componentes de un citómetro de flujo 29

2.4.- Fluorocromos más utilizados en citometría de flujo 35

2.5.- Aplicaciones en Hematología. Caracterización inmunofenotípica

de los síndromes linfoproliferativos crónicos

37

3.- Síndromes linfoproliferativos crónicos con expresión

hemoperiférica. Leucemia linfática crónica de estirpe B 37

3.1.- Epidemiología 41

3.2.- Etiopatogenia 41

3.3.- Citogenética y biología molecular 42

3.4.- Biología y cinética celular del linfocito B neoplásico 43

3.5.- Características inmunofenotípicas 44

3.6.- Alteraciones de la inmunidad 47

3.6.1.- Inmunidad celular 47

3.6.2.- Inmunidad humoral 48

3.7.- Manifestaciones clínicas 49

3.8.- Complicaciones 50

3.9.- Datos de laboratorio 52

3.10.- Diagnóstico 53

3.11.- Factores pronósticos 56

3.12.- Tratamiento 57

II.- PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS 61

III.- MATERIAL Y MÉTODOS 65

1.- Material 66

1.1.- Muestra biológica 66

1.2.- Aparatos 67

1.3.- Productos o reactivos 70

2.- Población de estudio 77

2.1.- Criterios de inclusión 78

2.2.- Criterios de exclusión 80

3.- Métodos 80

3.1.- Variables determinadas 80

3.2.- Obtención y preparación de la muestra 90

3.2.1.- Análisis por citometría de flujo 91

3.2.2.- Análisis por microscopía óptica 93

3.3.- Técnicas de inmunofenotipaje celular por citómetría de flujo 94

3.3.1.- Control de calidad 94

3.3.2.- Metodología seguida: combinaciones de anticuerpos

monoclonales y fluorocromos 99

3.3.3.- Proceso de adquisición de la muestra 101

3.3.4.- Análisis de los datos 103

3.3.5.- Criterios de positividad e intensidad de expresión para un

antígeno 107

3.3.6.- Criterios de identificación de poblaciones celulares 108

3.4.- Identificación morfológica de la población linfoide mediante

técnicas de microscopía óptica 110

3.5.- Método estadístico 110

IV.- RESULTADOS 113

1.- Características de los pacientes incluidos en el estudio 114

1.1.- Características clínicas 114

1.2.- Características hematológicas 115

1.3.- Características bioquímicas e inmunológicas 115

1.4.- Características farmacológicas 116

2.- Características de los pacientes en función de la edad 125

2.1.- Características clínicas en > y ≤ de 60 años 125

2.2.- Características hematológicas en > y ≤ de 60 años 126

2.3.- Características bioquímicas e inmunológicas en > y ≤ de 60 años 126

3.- Características fenotípicas de las leucemias linfáticas crónicas de

estirpe B incluidas en el estudio 134

3.1.- Características fenotípicas generales 134

3.2.- Características fenotípicas de la población B tumoral 134

3.3.- Características fenotípicas de la población T 136

4.- Poblaciones linfocitarias en los controles 142

5.- Comparación de las poblaciones linfocitarias en pacientes

leucémicos y controles 146

5.1.- Linfocitos T 146

5.2.- Linfocitos B

147

6.- Relación entre los linfocitos T de la leucemia linfática crónica y

distintos parámetros clínicos y de laboratorio 153

6.1.- Indicadores de carga tumoral 153

6.1.1.- Estadios clínicos de Rai y de Binet 153

6.1.2.- Otros indicadores de carga tumoral 154

6.2.- Inmunofenotipo de las LLC-B 155

6.3.- Hipogammaglobulinemia 156

V.- DISCUSIÓN 169

1.- Criterios de selección 173

2.- Datos epidemiológicos 174

3.- Parámetros clínico-biológicos en los pacientes leucémicos 175

4.- Estudio inmunofenotípico 181

5.- Alteraciones de la inmunidad en la leucemia linfática crónica B 194

6.- Relación entre las alteraciones de la inmunidad y parámetros clínico-

biológicos

203

VI.- CONCLUSIONES 208

VII.- BIBLIOGRAFIA 211

INTRODUCCIÓN

2

1. SISTEMA INMUNE

1.1. Bases estructurales

El sistema inmune está constituido por una compleja red de células y

moléculas distribuidas por todo el organismo y dotadas con diferentes

capacidades funcionales, que forman su base estructural. El componente

celular del sistema inmune está formado por los linfocitos y las denominadas

células accesorias. La base molecular está formada por el sistema de

complemento, las inmunoglobulinas y las linfocinas y monocinas. La activación

de los componentes celulares del sistema inmune, está estrechamente

relacionada con un grupo de moléculas expresadas en la membrana

citoplasmática de las células nucleadas del organismo, conocidas

genéricamente como sistema mayor de histocompatibilidad o sistema HLA, y

que son específicas de cada individuo (Álvarez-Mon y García Suárez, 1992).

1.1.1. Órganos linfoides

Los linfocitos se distribuyen por todo el organismo en forma de órganos

bien delimitados y encapsulados o en forma de acumulaciones difusas,

configurando en su conjunto lo que denominamos sistema linfático.

Inmunológicamente, los órganos linfoides se dividen en primarios (o centrales)

y secundarios (o periféricos).

Los órganos linfoides primarios son aquellos donde se originan y

maduran los linfocitos a partir de las células germinales pluripotentes (CGP)

(que son el origen de todas las líneas hematopoyéticas) (Abramson y cols,

1977) mediante un proceso independiente del estímulo antigénico; en los

mamíferos estos órganos son la médula ósea (y otros sitios hematopoyéticos

fetales) y el timo.

3

Los linfocitos que maduran en la médula ósea se denominan linfocitos B y

son los responsables de las respuestas frente al estímulo antigénico mediadas

por anticuerpos. Inician su aparición a partir de la 8ª semana de gestación, en

el hígado fetal, el epiplón y la esplacnopleura fetales y, más tarde, en la médula

ósea. Durante la vida postnatal, la linfopoyesis B solo ocurre en la médula

ósea.

Los linfocitos que maduran en el timo se denominan linfocitos T y son los

responsables de las respuestas inmunes mediadas por células, como el

rechazo de injertos, las reacciones de hipersensibilidad retardada y las

funciones de cooperación para que los linfocitos B produzcan anticuerpos (Ac).

La entrada de los progenitores linfoides (procedentes de las CGP de la médula

ósea) en el timo es escasa y se produce en forma de sólo dos o tres oleadas

durante el desarrollo embrionario. Estos progenitores proliferan y dan origen a

todos los demás timocitos, la mayoría de los cuales (más del 96%) mueren in

situ por un proceso de apoptosis. El contacto de los timocitos con las moléculas

del sistema HLA de clases I y II expresadas por las células epiteliales tímicas y

por las células dendríticas derivadas de la médula ósea, es esencial para la

maduración de las células T.

Una vez maduros, los linfocitos pasan a la periferia, distribuyéndose en los

órganos linfoides secundarios, donde desarrollan las respuestas frente al

antígeno. Tales órganos y tejidos no deben considerarse compartimentos

estancos, sino más bien como “estaciones” en el flujo migratorio continuo de

los linfocitos a través de las circulaciones sanguinea y linfática. Incluyen

órganos bien delimitados y encapsulados, como los ganglios linfáticos y el

bazo, y agrupaciones no encapsuladas, como el tejido linfoide asociado a

mucosas (MALT). Los órganos linfoides secundarios presentan en común el

mostrar áreas de linfocitos T y B, y el contener abundantes células auxiliares

como macrófagos y células dendríticas que no participan en el reconocimiento

específico del antígeno, pero que tienen importancia decisiva en el

4

procesamiento y la presentación del antígeno para que los linfocitos puedan

reconocerlo.

Los órganos linfoides secundarios se distribuyen de forma tal que

garantizan que cualquier sustancia extraña (antígeno) que aparezca en el

organismo ya sea por la sangre (bazo), ya sea en territorios viscerales

profundos o en los territorios cutáneos o mucosos (ganglios linfáticos y MALT)

pueda ser filtrada y retenida por ellos.

En la histología de un ganglio se hallan la corteza o zona de células B, la

paracorteza o zona de células T y una médula central con cordones medulares

donde se encuentran linfocitos T y B. La mayoría de los linfocitos se hallan en

la corteza y paracorteza. Las células B de la corteza se organizan formando

agrupaciones ovoides o folículos linfoides, los cuales pueden ser primarios o

secundarios. En los secundarios existe una zona central con intensa actividad

proliferativa, el centro germinal, que corresponde a los linfocitos B activados y

proliferantes en respuesta al estímulo antigénico.

Los linfocitos presentes en los órganos linfoides secundarios no son

componentes fijos, sino sólo residentes temporales mientras dura su tránsito a

través de ellos. Este tránsito continuo ocurre con los linfocitos “naive” o

“vírgenes” (los que no han entrado en contacto con el antígeno), así como con

los linfocitos de memoria que se generan tras la respuesta primaria a un

antígeno. Por el contrario, los linfocitos activados y proliferantes como

consecuencia de su respuesta a un antígeno, pierden su capacidad de circular

y quedan retenidos en el órgano o tejido linfoide secundario.

En los ganglios linfáticos y demás tejidos linfoides, los linfocitos tienen dos

vías de entrada, los vasos sanguíneos y los linfáticos aferentes, mientras que

sólo tienen una vía de salida, el vaso linfático eferente. Desde éste prosiguen

su tránsito a través de toda la circulación linfática, hasta llegar al conducto

torácico, por donde regresan de nuevo a la circulación sanguínea. A este

5

circuito (sangre-sistema linfático-sangre) se le denomina también circulación

linfocitaria y es recorrido por un linfocito en 16-24 horas (se calcula que cada

segundo entran en un ganglio unos 10.000 linfocitos). Este tránsito continuo

constituye un rasgo esencial de la fisiología del sistema inmune, puesto que

implica incrementar las probabilidades de que los escasos linfocitos T y B

específicos de un determinado antígeno tengan oportunidad de encontrarlo,

sea cual fuere su puerta de entrada.

1.1.2. Base celular

Existen dos tipos linfocitarios fundamentales, T y B, que a su vez

constan de diversas subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en

virtud de características inmunológicas, enzimáticas, morfológicas y funcionales

(Jondal y cols, 1973). De acuerdo con los objetivos de este trabajo, nos

centraremos en el estudio exclusivo de ambos tipos celulares, cuyos rasgos

diferenciales básicos vienen detallados en la tabla 1.1

Tabla 1.1

Principales características de los linfocitos T y B maduros humanos

Características Linfocitos T Linfocitos B Origen Célula germinal hematopoyética linfoide Célula germinal hematopoyética linfoide

Adquisición de competencia

inmunológica

Timo Médula ósea

Longevidad Larga (habitualmente) Corta (habitualmente)

Recirculación Importante Menos importante

Ubicación en: Ganglio

Bazo

Zona subcapsular interfolicular

Zona periarteriolar de la pulpa blanca

Folículos linfoides primarios y secundarios

Folículos de pulpa blanca y dispersos en

la pulpa roja

Porcentaje en sangre

periférica

65-75% 10-20%

Antígenos de células T

Antígeno HLA-DR

Ig de superficie

Fragmento Fc de la IgM

Fragmento Fc de la IgG

+

-

-

+ (T colaboradores)

- (T supresores)

+ (T supresores)

- (T colaboradores)

-

+

+ cadena J

-

-

6

Tabla 1.1 (Cont.)

Principales características de los linfocitos T y B maduros humanos

Características Linfocitos T Linfocitos B Función primordial

Memoria inmunológica

Actividad citotóxica

Cultivo mixto linfocitario

Inmunidad celular

Función colaboradora (CD4)

Función supresora (CD8)

Sí

Sí

+

Síntesis de Ac (inmunidad humoral)

Sí

No

-

Características morfológicas

Tamaño

Gránulos citoplasmáticos

Cromatina

Basofilía citoplasmática

Pequeño o mediano

Presentes

Densa

Relativamente acentuada

Mediano o grande

Ocasionales

Menos densa

Menor

1.1.2.1. Linfocitos B

Los linfocitos B recibieron esta denominación por su proceso de

maduración en la bursa de Fabricio en las aves, o en su equivalente en los

mamíferos, la médula ósea (bone marrow). Desde el punto de vista funcional,

un linfocito B se define por su capacidad, única entre las células eucariotas, de

sintetizar inmunoglobulinas (Ig). Se puede considerar que la diferenciación B se

produce en dos fases diferentes y secuenciales que tienen lugar en áreas y

contextos funcionales diferentes.

La primera fase corresponde al trayecto de diferenciación desde la CGP

hasta el linfocito B funcionalmente maduro. Esta fase transcurre en la médula

ósea, es independiente del contacto con el antígeno, y tiene como objetivo

primordial dotar al sistema inmunitario de una colección grande y heterogénea

de linfocitos B inmunológicamente aptos; es decir, capaces de desarrollar en la

membrana, moléculas de Ig con una determinada especificidad, que es

diferente en cada célula. Es esta diversidad de características lo que confiere al

sistema la capacidad de reconocer una cantidad virtualmente ilimitada de

moléculas extrañas (Parreira y Parreira, 1992). En esta etapa se distinguen los

siguientes estadios secuenciales:

7

a) Células pro-B o progenitores linfoides que todavía no han empezado

a reordenar los genes de las inmunoglobulinas, si bien ya están

“comprometidos” para convertirse en linfocitos B.

b) Células pre-B iniciales (también denominadas pre-pre-B) que han

iniciado los primeros reordenamientos de los genes de las cadenas

pesadas de las Ig.

c) Células pre-B tardías, que ya sintetizan cadenas µ, las cuales

permanecen en el citoplasma en su mayor parte.

d) Linfocitos B inmaduros, que sintetizan cadenas ligeras (de tipo κ o λ)

y expresan IgM en la membrana (mIgM).

e) Linfocitos B maduros o linfocitos B que coexpresan mIgM y mIgD; en

un mismo linfocito B ambas inmunoglobulinas tienen las mismas

cadenas ligeras y la misma especificidad, y no las cambiarán a lo

largo de toda su existencia.

Las células pro-B y pre-pre-B tienen aspecto blástico y actividad

proliferativa, mientras que las pre-B tardías son ya quiescentes. La tasa de

producción de células B precoces en los sitios hematopoyéticos es enorme,

pero la mayoría (más del 75%) mueren in situ, por un proceso de apoptosis, y

representan menos del 1% del total de células presentes en la médula ósea de

un adulto. Estas células B eliminadas incluyen las que no han logrado

reordenar los genes de las inmunoglobulinas, así como aquellas que adquieren

mIgM de una especificidad fuertemente reactiva para los autoantígenos

presentes en el sitio hematopoyético.

La segunda fase o etapa de activación, ocurre en los órganos linfoides

secundarios y depende del contacto con el antígeno. Durante esta fase, el

sistema utiliza su enorme potencialidad cognitiva, seleccionando las células

que mejor se adaptan al determinante antigénico, confiriéndoles ventaja

proliferativa (entrada en fase G1 del ciclo celular) y promoviendo su maduración

para ser células secretoras de anticuerpos: célula plasmática. Aún así, no toda

la ascendencia del linfocito B maduro activado por el antígeno se diferencia a

8

célula plasmática, ya que algunas células entran nuevamente en fase G0 del

ciclo celular y constituyen una población en reposo que conserva la memoria

molecular del encuentro con el antígeno. El objetivo final será, por un lado el de

eliminar o neutralizar el agente invasor y, por otro, el de conservar la memoria

del primer encuentro con el antígeno, de manera que en contactos posteriores,

la respuesta inmunitaria sea más rápida y eficaz.

1.1.2.2. Linfocitos T

Un antígeno extraño al organismo es eliminado por la activación del

sistema inmune. En la respuesta inmune intervienen linfocitos T que, mediante

la liberación de linfocinas y por contacto celular, modulan la actividad de

linfocitos B, de los propios linfocitos T y de los monocitos.

Un antígeno extraño es reconocido como tal por unas moléculas

presentes en la superficie de células denominadas presentadoras de antígenos

(APC, antigen presenting cell), como son las células dendríticas o los

macrófagos. Estas células muestran los antígenos a los receptores antigénicos

de las células linfoides T (RCT). Así se inicia un proceso en el que los linfocitos

T estimulan la síntesis de Ig por los linfocitos B, se produce la expansión de

linfocitos T citotóxicos, y en el que también existe un mecanismo de freno,

suprimiendo otros linfocitos T la producción de Ig.

• Receptor antigénico de las células T (RCT). La función de los linfocitos T

en la respuesta inmune se basa en que estas células poseen en la

membrana receptores capaces de reconocer el antígeno. El RCT es un

heterodímero de dos cadenas polipeptídicas (α y β), presentes en la

superficie de los linfocitos T CD3+/CD4+ o CD3+/CD8+. Recientemente

se ha demostrado la presencia de otro RCT formado también por dos

cadenas polipeptídicas (en este caso denominadas γ y δ), presente en

una subpoblación de linfocitos T CD3+, CD4- y CD8- (Arstila y cols,

9

1999; Kruisbeek, 1993; Raulet y cols, 1991; Rudd, 1990; Winito y

Baltimore, 1989).

Asociado a las dos proteinas polimórficas que constituyen el RCT,

se encuentra un grupo de proteínas monomórficas denominadas CD3,

que forman así el complejo RCT-CD3. La molécula CD3 no participa en

el reconocimiento del antígeno pero es esencial para la transmisión de

señales activadoras al interior de la célula, así como para que el RCT se

exprese en la membrana.

Los linfocitos B reconocen antígenos mediante su receptor

antigénico de superficie (que es una Ig). En el caso de los linfocitos T, el

antígeno es primero degrado y procesado en el interior de las APC y los

fragmentos procesados son expuestos en la superficie de las mismas,

en el seno de una molécula del sistema HLA de clase I o clase II. Esto

implica que el haplotipo HLA heredado por un individuo determinado,

condiciona o restringe la especificidad del RCT de sus linfocitos T.

• Desarrollo de los linfocitos T en el timo. En el desarrollo de los linfocitos

T en el timo (timocitos), se distinguen tres estadios:

- Estadio I (timocitos iniciales o pretimocitos): constituyen una

población minoritaria (2-5% de los timocitos) localizada en la

zona subcapsular de la corteza, y corresponde a los

precursores linfoides inmaduros procedentes de la médula

ósea. Tienen aspecto blástico y están dotados de intensa

actividad proliferativa y se renuevan a sí mismos y a todas las

poblaciones tímicas. No expresan el RCT, aunque se ha

iniciado el reordenamiento de los genes de la cadena γ. El

pretimocito, al ponerse en contacto con el epitelio tímico e

influido por hormonas (timosina y timopoyetina) evoluciona

hacia otras fases en el proceso de maduración (Freedman y

Nadler, 1991; von Boehmer, 1993; Winoto, 1991).

10

- Estadio II (timocitos comunes): constituyen la población tímica

mayoritaria (80%) y se hallan en la corteza profunda; la

mayoría de ellos mueren in situ por apoptosis; son pequeños,

carentes de actividad proliferativa y funcionalmente

incompetentes. Expresan niveles intermedios o bajos de RCT

en su membrana.

- Estadio III (timocitos maduros medulares): constituyen el 5-

10% de los timocitos, se hallan en la médula y corresponden a

la pequeña proporción de timocitos comunes que sobreviven y

alcanzan la madurez, siendo indistinguibles fenotípicamente

de los linfocitos T maduros de la perifería. Expresan altos

niveles de RCT en la membrana.

1.1.3. Manifestaciones antigénicas en la diferenciación linfoide

1.1.3.1. Anticuerpos monoclonales

Desde el descubrimiento de la tecnología para la producción de

anticuerpos monoclonales (AcMo) en 1975 (Köhler y Milstein, 1975), el impacto

que esta metodología ha tenido en distintas ramas del saber médico ha sido

enorme. Podríamos decir que gran número de disciplinas diagnósticas

relacionadas con la medicina, han experimentado un gran avance al poder

utilizar anticuerpos altamente selectivos, de producción ilimitada y con

reacciones fácilmente reproducibles. En la hematología en concreto, el

desarrollo de reuniones internacionales para estudiar los antígenos de

diferenciación de leucocitos, ha establecido una nueva “ciencia” al identificar

numerosas moléculas denominadas grupos de diferenciación (Cluster of

Diferentiation o CD). Las reuniones de París (1982), Boston (1984), Oxford

(1986) y Viena (1988), han definido las moléculas que están presentes en los

distintos estadios madurativos de las líneas mielopoyéticas, linfopoyéticas y no-

linaje específicos (Knapp, 1989; McMichel, 1987; Reinheerz y cols, 1986).

11

Estas moléculas se corresponden con los fenotipos de los distintos procesos

leucémicos, siendo de gran utilidad diagnóstica en estas neoplasias.

La producción de AcMo, tecnología desarrollada en 1975 por Köhler y

Milstein, se basa en la fusión de linfocitos B con células de mieloma para dar

un hibridoma inmortal que segregue un único tipo de Ac. El proceso depende

del origen de los linfocitos B, de una célula de mieloma de fusión adecuada y

de una prueba de rastreo eficaz para seleccionar los clones híbridos

productores de los Ac deseados.

Esta técnica de fusión, selección y clonación permite obtener en pocos

meses gran número de AcMo altamente específicos y homogéneos, ya que

están producidos contra un mismo epítopo o grupo químico. Esta metodología

en su día revolucionaria, está ampliamente extendida en gran número de

laboratorios y se utiliza de forma constante para producir nuevos AcMo.

1.1.3.2. Grupos de diferenciación linfoide

Hasta hace pocos años, los procesos de maduración y diferenciación de

los leucocitos eran en gran parte un enigma. La morfología y algunos

marcadores enzimáticos permitían una comprensión escasa y una pobre

división de los procesos madurativos linfoides. Con la producción de AcMo

contra antígenos leucocitarios se han caracterizado moléculas que reciben

cada una de ellas el nombre genérico CD.

Un grupo de diferenciación se define caracterizando la molécula que lo

constituye. Esta caracterización debe abarcar la naturaleza bioquímica de la

molécula, su tamaño y a ser posible su estructura. También su aparición en los

distintos estadios de la diferenciación de las células que la posean y su

distribución en distintos tejidos. En tercer lugar, caracterizando el gen que la

codifica y, por último, analizando o intentando conocer la función que

desempeña. Cada grupo de diferenciación está denominado por la abreviatura

12

CD seguida de un número, por ejemplo CD3, CD4, CD5, etc. Habitualmente

varios AcMo se agrupan constituyendo un CD. Cada CD tiene una sola

molécula que lo constituye (Garrido y Ruiz Cabello, 1992).

Una vez que se posee un AcMo que reacciona con ciertas células

(normales o leucémicas) se procede a la caracterización del antígeno. La

identificación de los antígenos de la superficie celular mediante AcMo ha

significado un gran avance. La caracterización bioquímica de los antígenos de

los linfocitos ha proporcionado información acerca de la genética, estructura y,

en algunos casos, la función de estas moléculas.

1.1.3.3. Diferenciación B

La maduración de las células B en adultos tiene lugar en la médula ósea

a partir de las CGP (Quesenberry y Levitt, 1979). Aunque existía información

sobre este proceso, ha sido en los últimos años cuando se ha alcanzado un

conocimiento más exacto de los distintos estadios de maduración de los

linfocitos B en médula ósea normal y en procesos leucémicos (Krause y cols,

1988; Lovett y cols, 1984; Orfao y cols, 1992). Este avance ha sido posible

gracias al desarrollo de un gran número de AcMo asociados a células B y de

las técnicas de citometría de flujo (CMF) multiparamétricas.

En el proceso de diferenciación de los linfocitos B, se distinguen distintos

estadios madurativos definidos sobre la base de los patrones de expresión

antigénica (Loken y cols, 1987; Look y cols, 1984; Ryan y cols, 1986, 1987). No

obstante, existen algunas discrepancias al respecto, entre ellas, uno de los

puntos más controvertidos es el referido a la secuencia de expresión de los

antígenos CD34, CD19 y CD10. Así, Nadler (1986) propusieron que la

expresión de CD19 precede a la de CD10. En sentido contrario, Uckun (1990)

establecía la existencia de una población CD34+/CD10+/CD19- en médula

ósea fetal, sugiriendo que la expresión de CD10 precede a la de CD19.

Pontvert-Delucq y cols. (1993) en un estudio realizado en cultivos celulares in

13

vitro, observaron que las células CD10+/CD19- de médula ósea, estaban muy

elevadas en colonias de macrófagos pero no en células B. Recientemente, se

ha demostrado que las células B CD19+ de médula ósea normal, expresan

CD22, incluyendo la población CD19+/CD34+ (Hurwitz y cols, 1992).

Actualmente, estas discrepancias han sido clarificadas en el estudio

realizado por Ciudad y cols (1998) en el que se analiza la secuencia de

expresión antigénica de las células B en médula ósea normal, estableciendo

cinco estadios de diferenciación según el grado de maduración:

1- CD19+ /CD34+ /CD22+débil /CD10- /CD20- / CD45-/+débil.

(representan el 0.54±0.40% de las células CD19+ de médula ósea)

2- CD19+ /CD34+ / CD22+débil /CD10++ /CD20-/ CD45-/+débil.

(representan el 3.38±2.7% de las células CD19+ de médula ósea)

3- CD19+ /CD34- / CD22+débil /CD10+ /CD20-/ CD45+.

(representan el 3.5±2.3% de las células CD19+ de médula ósea)

4- CD19+ /CD34- / CD22+débil /CD10+ /CD20+/ CD45+.

(representan el 19±11% de las células CD19+ de médula ósea)

5- CD19+ /CD34- / CD22+ /CD10- /CD20++/ CD45++.

(representan el 73±19% de las células CD19+ de médula ósea)

De estos datos se deduce, que el porcentaje de los distintos tipos de

células B aumenta conforme avanzamos en el proceso de maduración,

indicando que la diferenciación B normal en la médula ósea es paralela al

grado de proliferación (Hollander y cols, 1988). Así mismo, a medida que la

maduración progresa se pierde el CD10, se adquiere el CD20 y aumenta la

intensidad de expresión del CD22 y CD45.

14

En los estadios más inmaduros las células no poseen Ig, pero sí

reordenamiento genético respecto al patrón de la línea germinal;

posteriormente aparecen cadenas pesadas µ en el interior del citoplasma en

ausencia de cadenas ligeras y de Ig de superficie, y parece estar relacionado

con la expresión de CD20 (Orfao y González de Buitrago, 1995). En estadios

más diferenciados se reordenan los genes de las cadenas ligeras que se

transcriben, se sintetizan y ensamblan con las cadenas µ. Las células pasan a

expresar IgM de superficie, poco después, pasan a linfocito maduro, que

sintetiza también IgD. La diferenciación de las células B posterior a la médula

ósea no se conoce muy bien, y no es posible definir con exactitud estadios

concretos por la expresión de antígenos particulares.

- Linfocito B activado. El linfocito B activado incrementa la expresión de las

Ig de superficie y de algunos antígenos de membrana como el CD19 y

CD20. En este momento de activación y proliferación aparecen en la

membrana nuevas moléculas que no se detectan en reposo, como son el

CD23, CD25, FMC7 y en ocasiones el CD10. En este estadio el linfocito

B pierde la IgD, disminuye la intensidad de expresión de la IgM y,

además, puede expresar IgG o IgA (Florensa y Woessner, 1994).

- Células plasmáticas. Representan el estadio final de la diferenciación B y

se caracterizan por una modificación radical del fenotipo de membrana,

con desaparición de los antígenos desarrollados por la mayoría de los

linfocitos B. En contrapartida, desarrollan consistentemente el antígeno

CD38 (Ling y cols, 1987; Ocqueteau y cols, 1998; Terstappen y cols,

1990). Se encuentra ausente la Ig de superficie, aunque son abundantes

las Ig de citoplasma.

- Linfocitos B CD5+. Recientemente se ha identificado una subpoblación

de linfocitos B que desarrollan en la membrana una glicoproteína

reconocida por el AcMo CD5. Esta proteína se consideraba como

exclusiva del linaje linfocitario T en la hematopoyesis normal,

15

admitiéndose que su manifestación en linfocitos B se limitaba a las

células de la leucemia linfática crónica B (LLC-B). Actualmente se

conoce la existencia de linfocitos B normales CD5+. Los linfocitos B

CD5+ son los primeros en aparecer en la ontogenia, y durante la vida

fetal predominan sobre los linfocitos convencionales CD5-, lo que ocurre

también en la sangre del cordón umbilical (50-70% de los linfocitos B) y

durante la infancia (40-60% de los linfocitos B circulantes a los 7 años de

edad); en el adulto (edad superior a 18 años) representan el 10-25% de

los linfocitos B circulantes. En los órganos linfáticos secundarios de los

humanos adultos se hallan en el manto folicular junto al borde del centro

folicular. Su proporción está incrementada en algunas enfermedades

autoinmunes, como la artritis reumatoide, aunque se ignora cuál es el

significado biológico de esta subpoblación linfocitaria (Hayakawa y Hardí,

1988; Riva y cols, 1998).

1.1.3.4. Diferenciación T

La descripción de la diferenciación T, sobre la base de la expresión de

antígenos celulares (de membrana o citoplasma) detectados por el marcaje con

AcMo se muestra en la tabla 1.2.

Tabla 1.2

Esquema de maduración de los linfocitos T

Etapa Antígeno independiente Antígeno dependiente

Órgano Médula ósea Timo Sangre periférica

Célula progenitora linfoide

ProtimocitoPretimocito cortical blástico

Timocitos comunes

Timocito maduro (medular)

Linfocitos T maduros

Reordenamiento de los genes RCT

δ γ β α

TdT + + + + - -

16

Tabla 1.2 (cont.)

Esquema de maduración de los linfocitos T

Etapa Antígeno independiente Antígeno dependiente

Órgano Médula ósea Timo Sangre periférica

Célula progenitora linfoide

ProtimocitoPretimocito cortical blástico

Timocitos comunes

Timocito maduro (medular)

Linfocitos T maduros

Expresión de moléculas

CD34 HLA-DR CD117

CD34 HLA-DR CD117 CD7 CD45RA

CD3ci CD7 CD2 CD5 CD38 CD71

CD7 CD2 CD5 CD3ci CD1a CD4/CD8δγRCT αβRCT

CD7 CD2 CD5 CD3m CD4 o CD8 δγRCT αβRCT

CD7 CD2 CD5

CD45 RA CD3

CD4 o CD8δγRCT

αβRCT CD3ci: CD3 de citoplasma. CD3m: CD3 de membrana

Los linfocitos proceden de una célula primitiva linfoide, progenitor común

a todos ellos, ubicada en la médula ósea y que desde el punto de vista

fenotípico se caracteriza por la expresión de marcadores que expresan

inmadurez.

El desarrollo de las células T en el timo se caracteriza por la adquisición

progresiva de las funciones y de los marcadores antigénicos específicos de los

linfocitos T (Boyd y Hugo, 1991). El esquema más aceptado en la actualidad

establece tres estadios de maduración intratímica (Florensa y Woessner, 1994;

Orfao y González de Buitrago, 1995b; Rudd, 1990):

- Estadio I o pretimocitos: CD2+, CD5+, CD7+. En esta población se

detectan también antígenos de activación/proliferación CD38, CD71, la

enzima transferasa terminal desoxinucleotidasa (TdT). Se caracterizan

por no expresar ni CD4 ni CD8 ni CD3-RCT, si bien expresan CD3

citoplasmático de localización perinuclear, el cual no se exporta a la

membrana porque todavía no se sintetiza el RCT, aunque se ha iniciado

el reordenamiento de los genes de las cadenas pesadas.

- Estadio II o timocitos comunes: en esta fase adquieren el CD1a y se

caracterizan por coexpresar CD4 y CD8 (“dobles positivos”). La molécula

17

de CD3 se encuentra en el citoplasma y aún tienen actividad para la

enzima TdT. La mayoría de los timocitos CD4+CD8+ mueren en el timo.

La muerte intratímica se calcula en el 95-99% de los linfocitos dobles

positivos.

Los linfocitos T experimentan procesos de selección positiva y negativa

durante los cuales se selecciona el CD4 o CD8, según que el RCT esté

restringido a antígenos HLA de clase II o de clase I. Las células que

abandonan el timo son linfocitos T CD4+ caracterizados por restricción

HLA de clase II y linfocitos T CD8+ caracterizados por restricción HLA de

clase I.

- Estadio III o timocito maduro: expresan altos niveles de CD3-RCT en la

membrana, han perdido CD1a, no tienen actividad de la enzima TdT y

pueden expresar CD4 o CD8, pero no ambos. El paso de timocito

maduro a célula T periférica viene señalado por la pérdida de parte de

reactividad del antígeno CD38.

Durante la maduración intratímica, los linfocitos T deben adquirir la

capacidad de reconocer los antígenos extraños al organismo y los antígenos

propios para un sistema inmune normofuncionante. La necesidad de producir

linfocitos T normocompetentes conduce a la eliminación programada de

timocitos con una reactividad demasiado elevada o demasiado escasa para los

antígenos. La masiva mortalidad de los timocitos refleja este proceso de

selección positiva y negativa al que se ven sometidos. Esta selección garantiza

que sólo sobrevivan, maduren y pasen a la periferia los timocitos que adquieren

un RCT capaz de reconocer a los antígenos exógenos presentados por las

moléculas HLA de clase I o de clase II del haplotipo HLA propio, siendo

eliminados aquellos que sean capaces de reconocer autoantígenos.

Subpoblaciones linfocitarias T. Los linfocitos T constituyen el 60-70% de las

células mononucleadas de sangre periférica. En términos generales, se definen

18

dos tipos de linfocitos T: los que expresan en la superficie el CD3 y RCTαβ

(linfocitoαβ), y los que expresan en la superficie el CD3 y RCTγδ (linfocitosγδ)

(Westerman y Pabst, 1990).

Linfocitos T ααααββββ. Los linfocitos T αβ tienen un fenotipo similar al de los

timocitos maduros, siendo o bien CD4+, o bien CD8+, predominando los

primeros sobre los segundos en una relación CD4/CD8: 1,5-2,5. Son los

linfocitos T predominantes en la sangre periférica. Los linfocitos T CD4+

reconocen al antígeno unido a la molécula HLA de clase II, y realizan

funciones de cooperación para todos los tipos de respuestas inmunes,

denominándose por ello linfocitos T colaboradores. Estas células una vez

activadas secretan citocinas como IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, etc. La IL-2

tiene un papel decisivo como factor de crecimiento que media de forma

autocrina y/o paracrina la expansión clonal de las propias células T

CD4+, así como, la de los linfocitos T CD8+. Las células CD4 son

imprescindibles para cooperar con las B en la respuesta de Ac. Dicha

cooperación implica interacciones por contacto y mediadas por citocinas

(como la IL-2, IL-4, IL-6, IL10) que actúan sobre los linfocitos B

promoviendo su activación/proliferación y maduración hacia la célula

secretora de Ac.

Datos recientes indican que los linfocitos T CD4+, cuando se hallan

activados de forma crónica y persistente por el antígeno, tienden a

diferenciarse en dos subtipos funcionales, denominados Th1 y Th2,

caracterizados por su capacidad para producir un diferente espectro de

citocinas en respuesta al estímulo antigénico. No hay marcadores

fenotípicos que identifiquen estas células, lo que sólo puede hacerse tras

su cultivo in vitro y análisis de las citocinas que producen. Los linfocitos

Th1 secretan, sobre todo, IL-2, IFNγ y TNF-β, mientras que los Th2

producen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Los Th1 serían muy efectivos para

promover las reacciones de hipersensibilidad retardada, reacciones de

importancia decisiva para la erradicación de los gérmenes patógenos de

19

crecimiento intracelular. Los Th2, en cambio, serían más eficaces para

ayudar a los linfocitos B a desarrollar una respuesta de Ac,

particularmente de clase IgE, y podrían estar implicados en procesos

alérgicos por Ac de clase IgE, así como en las infecciones por parásitos

helmintos. Es interesante señalar que entre los linfocitos Th1 y Th2 se

establecen interacciones mutuamente inhibitorias. En la actualidad existe

gran interés por el estudio de esos subtipos funcionales de linfocitos T en

diversas enfermedades infecciosas y autoinmunes (Andrian y Mackay,

2000; Sallusto y cols, 1999).

Los linfocitos CD8+ reconocen al antígeno en asociación con las

moléculas HLA de clase I; al unirse al antígeno se activan y adquieren

actividad citotóxica y lisan las células que expresan dicho antígeno en su

membrana unido a las moléculas HLA de clase I. Se trata de linfocitos T

citotóxicos específicos de antígeno y restringidos por la molécula HLA de

clase I, y desempeñan un papel decisivo para eliminar las células

infectadas por virus. Se subclasifican en linfocitos “naive” y de

“memoria”, al igual que los linfocitos T CD4+.

Durante muchos años gozó de gran predicamento la idea de que

existía un subtipo de linfocitos T especializados en suprimir las

respuestas de un modo específico de antígeno (linfocitos T supresores),

al que se atribuía un papel esencial en la regulación de las respuestas,

así como en garantizar la tolerancia a lo propio. Se creía que estos

linfocitos T supresores constituían un subtipo de los linfocitos CD8+.

Actualmente estas nociones se consideran en su mayor parte como fruto

de una interpretación simplista de fenómenos complejos. De todas

formas, hay modelos experimentales en los que se puede demostrar la

existencia de fenómenos de supresión antigenoespecífico mediados por

células T, pero su naturaleza precisa está por aclarar.

20

Tras la activación los linfocitos T adquieren el receptor para la IL-

2. Además, los linfocitos T activados pueden expresar antígenos HLA-

DR, que normalmente no se expresan en reposo, y el CD71 que es el

receptor de la transferrina.

Linfocitos T γγγγδδδδ. Constituyen una pequeña proporción de los linfocitos

T de sangre periférica (menos del 5%). Su expresión en la membrana va

asociada a las moléculas CD3, al igual que ocurre con el RCTαβ. Los

timocitos con RCTγδ no pasan por el estadio de co-expresión de CD4 y

CD8, y en sangre periférica aparecen también sin expresar ni CD4 ni

CD8. Son proclives a albergarse en territorios epiteliales y en el hombre

son frecuentes en el tracto gastrointestinal. Su repertorio de

especificidades antigénicas es muy reducido. No se conoce con

exactitud la función fisiológica de estas células CD3γδ, ni su papel en la

respuesta inmune, aunque se ha demostrado un efecto citolítico contra

diferentes dianas, incluyendo células tumorales. Por este motivo se

sugirió que los linfocitos T γδ podían estar implicados en la vigilancia anti-

tumoral del organismo.

Linfocitos CD3+/CD4+/CD8+. Como hemos expuesto previamente, los

timocitos inmaduros co-expresan en su membrana los antígenos CD4 y

CD8 (timocitos comunes). Al progresar en el proceso de diferenciación

se produce la selección de una de las moléculas, de tal forma que la

mayoría de los linfocitos T maduros de sangre periférica, expresan CD4

o CD8, pero no ambos. Sin embargo, se ha demostrado que en sangre

periférica de individuos sanos existen linfocitos T que coexpresan CD4 y

CD8, en un porcentaje muy bajo (2%) (Blue y cols, 1985), cuya función y

ontogenia se desconocen, ya que es difícil realizar estudios funcionales

en esta subpoblación tan minoritaria.

Se ha descrito un aumento de los porcentajes periféricos de esta

subpoblación T CD4+/CD8+, en pacientes con síndrome de Behcet´s y

21

en pacientes con linfoma linfoblástico (Bernard y cols, 1981; Valesini y

cols, 1985). Hace unos años, se publicó el primer caso de un adulto sano

con un porcentaje muy elevado de linfocitos T CD4+/CD8+ en sangre

periférica, cuyo estudio demostró la ausencia de antígenos tímicos en

estas células y que, desde el punto de vista funcional, no respondían a

mitógenos ni IL-2. Sin embargo, estos linfocitos estimulan la proliferación

de células B y la síntesis y secreción de Ig, siendo pues parcialmente

inmunocompetentes (Key y cols, 1990).

1.2. Desarrollo de la respuesta funcional del sistema inmune

La antigenicidad de una molécula se refiere a que su estructura posee

partes (denominadas determinantes antigénicos o epítopos) capaces de unirse

específicamente a los Ac o de fijarse a las moléculas del HLA, de forma que

sean reconocidas por el RCT de los linfocitos T. La inmunogenicidad se refiere

a la capacidad de inducir la respuesta inmune. Una molécula inmunogénica

implica necesariamente que es antigénica, pero una molécula antigénica puede

no ser inmunogénica, ya que la inducción de una respuesta inmune implica

complejas interacciones entre linfocitos T colaboradores, APC y linfocitos B, lo

que depende de muchos otros factores aparte del reconocimiento del antígeno

por las Ig de membrana del linfocito B. Así, componentes orgánicos muy

simples pueden ser reconocidos como antígenos por las Ig de superficie de

ciertas clonas de linfocitos B, pero carecen de inmunogenicidad por sí mismos.

Este tipo de antígenos se denominan haptenos y para convertirse en

inmunogénicos deben unirse a una proteína portadora o “portador”.

Una molécula será tanto más antigénica e inmunogénica cuanto más

distinta sea su composición con respecto a las sustancias presentes en el

individuo y especie al que éste pertenece, y cuanto más compleja y de mayor

peso molecular sea su estructura (Bjorkman, 1987; Jaraquemada y Gallart,

2000).

22

Se entiende por respuesta inmune el conjunto de procesos que, como

consecuencia del contacto de las células del sistema inmunitario con un

antígeno inmunogénico, conduce a la expansión de las clonas linfocitarias

específicas para dicho antígeno, así como las diversas funciones efectoras que

éstas pueden desarrollar y la forma en que éstas o sus productos operan sobre

el antígeno (Gallard y Vives, 1994b).

1.2.1. Cooperación entre linfocitos T y B para la respuesta de anticuerpos

Para que los linfocitos B específicos contra determinados epítopos de un

antígeno puedan activarse, proliferar y diferenciarse, se requiere la ayuda de

linfocitos T específicos para otros epítopos del mismo antígeno. Actualmente se

sabe que esta cooperación T-B se establece gracias a que el linfocito B actúa

de APC para el linfocito T CD4+. Las Ig de superficie del linfocito B se unen al

hapteno y, como consecuencia de esta unión, se internaliza el conjunto

hapteno-portador. Éste es “procesado”, de forma que un fragmento del portador

es presentado unido a las moléculas del HLA de clase II en la membrana del

linfocito B, donde será reconocido por un linfocito T CD4+ cuyo RCT sea

específico del fragmento portador+HLA de clase II. Esta interacción física,

específica de antígeno y restringida por el HLA de clase II, entre linfocitos T y B

es esencial para que se active de forma óptima el linfocito B (Galagher y

Cambier, 1990; Shevach, 1990), ya que, en ausencia de un linfocito T CD4+

específico del portador, un linfocito B se activará parcialmente pero, en lugar de

proseguir su activación, probablemente muera.

Si la activación del linfocito T CD4+ es óptima pasará a secretar IL-2 y

otras citocinas (IL-4, IL-6, IL-10). La IL-4 contribuye a activar los linfocitos B y,

junto con la IL-2, promueve su proliferación. La IL-2 y la IL-4 median también la

proliferación del propio linfocito T CD4+ activado. La IL-4, la IL-2, la IL-6 y la IL-

10 promueven la maduración del linfocito B hacia células secretoras de Ac. La

IL-4, además, puede inducir el cambio de clase de las Ig de superficie (Bonilla y

cols, 1988).

23

El resultado final de este proceso es que se generan células secretoras

de Ac contra el hapteno, así como linfocitos B de memoria específicos del

hapteno y linfocitos T CD4 de memoria específicos del portador; en este símil

de hapteno-portador, el hapteno representa el epítopo reconocido por el

linfocito B de una molécula inmunogénica dependiente de los linfocitos T, y el

portador, un epítopo distinto del mismo inmunógeno reconocido por el linfocito

T CD4+.

1.2.2. Respuesta mediada por células T

Los linfocitos T CD4+ desarrollan un papel fundamental como células

cooperadoras, tanto para las respuestas de Ac por parte de los linfocitos B

como para las respuestas de citotoxicidad específica de los linfocitos T CD8+.

Los linfocitos T CD4+, a través de las interleucinas liberadas, son capaces de

activar los macrófagos y dar lugar a reacciones de hipersensibilidad retardada.

Los linfocitos T CD8+ reconocen al antígeno en asociación con las moléculas

HLA de clase I y, una vez activados, lisan a las células que lo presentan.

Además de estas acciones, los linfocitos T CD4+ y CD8+ de un individuo

reconocen, respectivamente, a las regiones polimórficas de las moléculas HLA

de clase I y II alogénicas expresadas por los individuos genéticamente distintos

de la misma especie; este fenómeno, denominado alorreactividad, constituye la

base del rechazo de los injertos entre individuos HLA-incompatibles y de la

reacción injerto contra huésped.

Se cree que el principal papel fisiológico de los linfocitos T citotóxicos es

intervenir en la eliminación de las células infectadas por virus. La mayoría de

los linfocitos T citotóxicos son CD8+. Sin embargo, existe cierta proporción de

linfocitos T CD4+ que pueden ser citotóxicos, pero su especificidad está

restringida por las moléculas HLA de clase II.

24

La generación de linfocitos T citotóxicos, al igual que la respuesta de Ac,

obedece a los mismos principios de selección por el antígeno del pequeño

número de linfocitos específicos preexistentes antes del estímulo antigénico y a

la amplificación clonal de tales linfocitos mediante un proceso de proliferación.

El número incrementado de linfocitos T específicos, como consecuencia de la

respuesta primaria, garantiza que la respuesta secundaria sea más potente y

rápida.

Los linfocitos T CD8+ citotóxicos, al unirse al antígeno acoplado a

moléculas HLA de clase I propias o presentes en células alogénicas (p. ej. las

de un órgano trasplantado HLA-incompatible) se activan y pasan a expresar

receptores de IL-2; para que puedan proliferar y expresar su función citolítica,

requieren una fuente de IL-2 que normalmente es proporcionada por los

linfocitos T CD4+ próximos, activados por su unión al antígeno. En respuesta a

la IL-2, además de proliferar, los linfocitos T CD8+ activados pueden efectuar

una lisis celular, de forma que, cuando entran en contacto con las células diana

que expresan el antígeno, las lisan (Gallard y Vives, 1994b; Henkart, 1990).

1.2.3. Mecanismos de defensa antitumoral

Hoy en día se acepta que la inmunidad mediada por células T tiene gran

importancia en el rechazo de tumores (Kripke, 1974). Recientemente se ha

demostrado, en el mastocitoma murino P815, la existencia de un gen que es

capaz de codificar un péptido antigénico tumoral que es reconocido

específicamente por linfocitos T citotóxicos CD8+. Asimismo, se ha

comprobado en tumores humanos que los linfocitos T citotóxicos de sangre

periférica derivados de pacientes con melanoma, son capaces de reconocer

específicamente las células diana (Boon, 1992). Estos estudios han permitido

identificar un gen que codifica un péptido que es presentado por la molécula

HLA a linfocitos T CD8+ citotóxicos autólogos. Al igual que en el mastocitoma

murino P815, los genes que codifican estos péptidos sólo se expresan en

25

células tumorales y son presentados por el sistema inmunológico a través de

una molécula determinada del HLA.

Otro de los mecanismo de defensa inmunológicos frente al desarrollo

tumoral son las células asesinas naturales (NK, natural killer), que se

caracterizan por ser activas contra células infectadas por virus, células

hematopoyéticas inmaduras y células con muy bajos niveles de diferenciación,

y pueden eliminar células tumorales por un mecanismo no restringido por los

antígenos del HLA. No es necesaria una sensibilización previa a un antígeno

determinado para activarlas, lo que indica que podrían actuar como primera

línea de defensa. Se ha demostrado que el tratamiento de células de sangre

periférica con la interleucina 2 activa una población de células denominadas

LAK (lymphokine-activated killer) que son capaces de eliminar células

tumorales resistentes a la acción de las células NK (Algarra y Garrido, 1994).

26

2. CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo (CMF) es, básicamente, un método analítico que

permite la medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz, inducidas

por la iluminación apropiada de células o partículas microscópicas, a medida

que desfilan, de una en una y arrastradas por un flujo portador, frente a un

sistema de detección.

La CMF aprovecha el desarrollo de un amplio número de moléculas

fluorescentes, que se unen específicamente a moléculas celulares, se

acumulan selectivamente en compartimentos celulares o que modifican sus

propiedades a través de reacciones bioquímicas específicas. De esta forma,

permite detectar y cuantificar estructuras y funciones de células individuales o

partículas biológicas aisladas, siguiendo una aproximación multiparamétrica.

Estas características la convierten en una técnica especialmente valiosa para

caracterizar poblaciones celulares heterogéneas a través de un amplio rango

de propiedades biológicas.

Debido al creciente número de parámetros biológicos analizables y al

desarrollo de citómetros de coste accesible, dotados de sistemas informáticos

de uso relativamente sencillo y de alta capacidad operativa, la CMF tiene en la

actualidad un amplio abanico de aplicaciones, tanto en la investigación como

en el diagnóstico clínico, permitiendo identificar células o partículas biológicas,

caracterizar sus propiedades y respuestas funcionales y, en algunos casos,

separarlas físicamente.

La citometría aporta a la hematología un método objetivo y reproducible

para el diagnóstico de clonas celulares anormales de varias líneas

hematopoyéticas, proporcionando información de un gran número de

parámetros de cada una de las células que se analizan, lo que permite

identificar en una muestra subpoblaciones celulares diferentes, incluso cuando

están escasamente representadas.

27

2.1. Fundamentos de la citometría de flujo

La CMF representa un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis

de células, núcleos, cromosomas u otras partículas en suspensión. Mediante

esta técnica son posibles los estudios del ciclo celular, el análisis de antígenos

celulares, la determinación de la ploidía en cánceres y los estudios de diversos

parámetros celulares (pH, apoptosis, etc) (Steward, 1992).

Desde un punto de vista práctico la CMF desarrolla sus aplicaciones a

través de un soporte físico: el citómetro de flujo. El principio en el que se basa

esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en

suspensión, alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La

interacción de las células o partículas con el rayo luminoso genera señales que

se llevan a los detectores adecuados. Las señales luminosas detectadas se

transforman en impulsos eléctricos, que se amplifican y se convierten en

señales digitales que se procesan en un ordenador.

2.2. Análisis celular. Fundamento de los sistemas de detección

La intersección del flujo de un fluido con la fuente luminosa genera

información sobre distintas características morfológicas, estructurales y

funcionales de las partículas contenidas en el primero. En términos generales

dicha información posee un valor relativo y se engloba en dos tipos de

parámetros: los derivados de la dispersión de la luz y aquellos que están

relacionados con la emisión de luz por fluorocromos presentes en la partícula al

ser excitados por la fuente de luz.

2.2.1. Dispersión de la luz

La dispersión de la luz es un proceso físico en el que una célula

interacciona con la luz incidente y como consecuencia de esta interacción

cambia la dirección de la luz, no la longitud de onda. Las características

28

celulares que contribuyen a la dispersión de la luz son el tamaño celular, la

membrana celular, el núcleo y el material granular del interior de la célula.

La luz no se dispersa igual en todas direcciones y la mayoría lo hace en

la dirección frontal:

• La luz dispersada hacia delante, en ángulos cercanos a 0º (forward

scatter, FSC), es una medida del tamaño celular.

• La luz dispersada en ángulo recto (side scatter, SSC) depende de la

estructura interna de la célula, la granularidad, y no del tamaño.

2.2.2. Fluorescencia

El resto de los parámetros medibles por el citómetro de flujo dependen

de la presencia de fluorocromos en la célula, ya sea de forma natural

(autofluorescencia), o unidos a ella artificialmente.

Los compuestos fluorescentes absorben energía luminosa de una

longitud de onda característica para cada compuesto. Esta absorción hace que

suba un electrón a un nivel energético superior. El electrón excitado cae

rápidamente al estado normal, desprendiendo energía. Esta transición radiante

se denomina fluorescencia.

El número de emisiones fluorescentes detectables de forma simultánea

es variable y depende principalmente del instrumento y los fluorocromos

utilizados. En la actualidad la mayoría de los citómetros de flujo que existen en

el mercado suelen disponer de detectores para emisiones fluorescentes de tres

o cuatro longitudes de onda (colores) diferentes, según estén equipados con

uno o dos emisores de láser respectivamente. Al igual que sucede con la luz

dispersada lateralmente, los detectores de fluorescencia están situados

ortogonalmente respecto al láser.

29

2.3. Componentes de un citómetro de flujo

Los citómetros de flujo presentan una configuración ortogonal con tres

ejes principales: el flujo de la muestra, el del rayo de luz y el de los detectores

de fluorescencia (figura 1.1).

Figura 1.1. Esquema de un citómetro de flujo.

Los citómetros de flujo constan de los siguientes componentes: sistema

de inyección de la muestra, cámara de flujo, fuente de luz, sistema óptico,

detectores, amplificador y sistema informático. A continuación se señalan las

principales características de cada uno de los componentes principales de un

citómetro de flujo.

2.3.1. Sistema de inyección de la muestra

Mediante el sistema de inyección, las células a analizar son introducidas

en el centro de un flujo de líquido isotónico o de agua que es impulsado a gran

velocidad a salir por un orificio estrecho. La diferencia de presión existente

entre la parte interna o central del flujo (muestra a analizar) y la porción externa

o periférica del mismo (líquido isotónico o agua) es regulada por el operador,

30

modificando la velocidad de paso de las células, que debe ser la idónea para

que la célula o partícula en estudio no esté sometida a presiones que alteren

sus características físico-químicas o morfológicas.

2.3.2. Cámara de flujo

La cámara de flujo constituye el centro del citómetro, ya que en ella se

genera el flujo laminar de células que posteriormente serán interceptadas por el

rayo luminoso. En la cámara de flujo, las células se introducen por un sistema

de presión en el centro del fluido envolvente, que es impulsado a gran

velocidad a salir por un orificio estrecho. Durante el trayecto, las células han de

permanecer en el centro de un caudal de líquido isotónico y deben cruzar

perpendicularmente, alineadas y de una en una, el rayo luminoso. La velocidad

de las células puede oscilar entre 1.000 y 1.000.000 por minuto.

En un corte transversal, el flujo está constituido por una porción interna

que contiene el líquido con la suspensión celular y una porción externa con el

líquido envolvente. La diferencia de presión entre los dos compartimentos hace

variar la proporción de cada uno de ellos en el área de sección del flujo, lo que

se traduce en cambios de la velocidad de paso de las células. Así, un

incremento del cociente entre la presión del líquido envolvente y la presión del

líquido con la muestra produce una disminución del volumen de muestra que

pasa por delante del rayo luminoso por unidad de tiempo, es decir, una menor

velocidad de paso de las células. A su vez, una disminución de este cociente

se traduce en una mayor velocidad de paso de las células por delante del rayo

luminoso.

2.3.3. Fuente de luz

En la mayoría de los citómetros de flujo la fuente luminosa es un rayo

láser, generalmente de argón con una potencia de emisión de 15 mW, aunque

también puede ser de helio-neón o criptón. En el tubo láser de argón, el rayo

31

láser se halla ajustado a una longitud de onda de 488 nm. Actualmente se

dispone de citómetros provistos de un segundo rayo láser que puede ser

también de argón o de criptón (Shapiro, 1993).

2.3.4. Sistema óptico

La mayoría de los citómetros de flujo poseen cinco sistemas ópticos de

medida: dos de dispersión de la luz (uno hacia delante y otro en ángulo recto) y

tres de fluorescencia. Mediante el sistema de dispersión de luz hacia delante se

determina el tamaño celular, y con el de dispersión en ángulo recto se

determina la granularidad celular, esto es, la complejidad interna de la célula.

Los sistemas de fluorescencia se sitúan en ángulo recto y mediante ellos se

determinan las células marcadas con compuestos fluorescentes (figura 1.2).

Figura 1.2. Representación esquemática del sistema óptico de un citómetro de flujo dotado de tres detectores de fluorescencia: FITC, PE y Cy5. DM: espejo dicroico. SP: Paso de longitudes de onda inferiores (del inglés”short pass”). LP: paso de longitudes de onda superiores (del inglés “ long pass”). (Orfao y cols. 1995)

32

La luz correspondiente a las diferentes emisiones fluorescentes se

recoge en ángulos cercanos a los 90º junto con la luz dispersada lateralmente.

Por ello se hace necesario un sistema óptico que permita separar la luz que,

aunque recogida lateralmente, aporta información diferente sobre las

características de cada célula: la complejidad interna y cada una de las

emisiones fluorescentes correspondientes a los diferentes fluorocromos

presentes en la célula y excitados de forma simultánea. Los fotones con

diferente longitud de onda se seleccionan por medio de un sistema óptico

compuesto por filtros y espejos dicroicos y se envían a un detector específico.

2.3.5. Detectores

Los pulsos de luz que llegan a los detectores contienen desde unas

centenas a varios miles de fotones. En la actualidad se utilizan tres tipos de

detectores:

• Fotodiodos: son detectores de estado sólido, habitualmente empleados

para recoger señales de luz de intensidad relativamente grande, como la

luz dispersada frontalmente. Ello se debe a que este tipo de detectores

son muy simples y transforman la señal luminosa que le llega en un

pulso.

• Fotomultiplicadores: multiplican la señal recibida. Al estar colocadas

estas placas de forma secuencial, el resultado es la multiplicación de la

señal luminosa.

• Detectores monocromáticos: son de reciente introducción en los

citómetros de flujo y se caracterizan por recoger la luz con una longitud

de onda muy concreta.

2.3.6. Amplificador

Cada detector genera una señal electrónica, que es proporcional a la

cantidad de luz dispersada o a la intensidad de la fluorescencia. Estas señales

se amplifican multiplicándolas por un factor lineal o logarítmico. El pulso

33

amplificado se lleva a un convertidor analógico/digital que convierte la altura del

pico, que es proporcional a la fuerza de la señal, en una señal digital que puede

manejarse por un ordenador. Para la mayoría de las aplicaciones, la dispersión

hacia delante y la dispersión lateral se analizan de forma lineal, mientras que la

fluorescencia se analiza logarítmicamente.

La cantidad de fluorescencia emitida por una célula, es proporcional a la

cantidad de compuesto fluorescente asociado con la célula, lo que, a su vez, es

proporcional a la señal producida sobre el detector fluorescente. Así, el tamaño

de la señal electrónica producida por una célula, es una medida cuantitativa de

la cantidad de compuesto fluorescente sobre su superficie, y refleja el número

de receptores/marcadores (Orfao y González de Buitrago, 1995).

2.3.7. Sistema informático

Como hemos visto, todas las señales luminosas que trasmiten distintos

tipos de información sobre las características de cada célula (dispersión de la

luz e intensidad de emisiones fluorescentes) son convertidas en impulsos

eléctricos, amplificadas y transformadas en códigos digitales para que puedan

ser analizadas por un ordenador.

El proceso de análisis de los resultados debe realizarse en tres pasos

consecutivos destinados el primero a la identificación y selección de los

parámetros a medir, el segundo a la identificación de subpoblaciones dentro de

ellos y el tercero a la caracterización de cada uno de los subgrupos

identificados. Cuando se analiza en una célula la reactividad para un

determinado AcMo específico para un antígeno, se obtiene información sobre

la presencia del epítopo del antígeno en la célula y sobre su nivel de expresión

(número de moléculas por célula). Como consecuencia de lo expuesto, los

programas informáticos permiten además de visualizar directamente las

poblaciones celulares, obtener información numérica objetiva, en forma de

34

porcentajes, valores medios o medidas de dispersión como la desviación

estándar y el coeficiente de variación, obtenido para los eventos estudiados.

De acuerdo con las necesidades del operador, el procesador elabora

histogramas con información sobre uno o dos parámetros diferentes. Un primer

histograma de dos parámetros se construye con la intensidad de la dispersión

de la luz en sentido frontal (FSC) y lateral (SSC). Si se analizan leucocitos de

sangre periférica, en este histograma se agruparán las células pequeñas y no

granuladas (linfocitos) en un lugar cercano al origen de ambos ejes; las células

grandes y granulares (polimorfonucleares) se ubicarán, por el contrario, lejos

del origen de ambos ejes; una tercera población de tamaño y granularidad

intermedia (monocitos) se localizará entre las dos poblaciones anteriores

(figura 1.3).

Figura 1.3. Análisis de las poblaciones

leucocitarias de sangre periférica. Rojo:

linfocitos (40%). Verde: monocitos (4%). Azul:

neutrófilos (56%).

35

Sin necesidad de preparar poblaciones enriquecidas en linfocitos, puede

definirse una “ventana electrónica” que aísle a esta población leucocitaria; los

histogramas restantes detectarán solo los eventos contenidos en la “ventana”

correspondientes a los linfocitos o al parámetro seleccionado. El histograma de

fluorescencia verde (FL1) permite la cuantificación del porcentaje de células a

las que se unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz verde; el

histograma de fluorescencia naranja (FL2) permite la cuantificación de las

células a las que se unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz

de este color. El histograma de doble fluorescencia permite además conocer la

proporción de células a las que se unieron de forma simultánea ambos AcMo.

Este tipo de análisis bidimensional es importante para cuantificar ciertas

poblaciones celulares que sólo son definibles por la coexpresión de más de un

antígenos en su membrana (Hoffman, 1988).

2.4. Fluorocromos más utilizados en citometría de flujo

El uso de compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en

CMF ha sido fundamental en el desarrollo de esta técnica. Los láseres emiten

luz monocromática, esto es, luz de una única longitud de onda, por lo que para

que un fluorocromo pueda utilizarse en CMF debe absorber luz de la longitud

de onda del láser.

Cronológicamente, el isocianato de fluoresceína (FITC) fue el primer

fluorocromo utilizado en CMF. Este fluorocromo tenía un conjunto de ventajas

que permitían su uso de forma rutinaria. Por un lado, se trata de una molécula

relativamente pequeña con una importante afinidad por las proteínas. Por otra

parte, el FITC se excita con luz azul (488 nm), lo que permite el uso de láseres

relativamente pequeños y de mantenimiento económico. No obstante, la

fluoresceína presenta algunos inconvenientes relacionados fundamentalmente

con la cuantificación de señales de fluorescencia y con la detección de

antígenos expresados en cantidades relativamente bajas.

36

La ficoeritrina (PE), aunque de aparición posterior, es sin duda el

fluorocromo de mayor potencia en el inmunofenotipaje celular y de elección

para la detección y cuantificación de antígenos concretos, por su gran

absorción, rendimiento y fotosensibilidad. Se trata de un fluorocromo muy

sensible, ya que permite la detección de un pequeño número de moléculas del

antígeno.

La mayoría de los fluorocromos restantes empleados en el fenotipaje

inmunológico por CMF, más que fluorocromos individuales están constituidos

por grupos de fluorocromos unidos entre ellos, bien de forma natural como el

peridinclorofil-proteína (PerCP), o artificialmente, como la ficoeritrina-

cianina 5 (Cy5). En este tándem de fluorocromos, uno de ellos se excita

primariamente con la luz del láser, y la luz que emite se absorbe en su práctica

totalidad por el segundo fluorocromo, cuya emisión de luz es la que se mide.

Cuando se emplea de forma simultánea más de un fluorocromo en el

marcaje inmunofenotípico de células, estos deben cumplir un conjunto de

requisitos, de los que destacan el ser excitables por la luz con idéntica longitud

de onda, a no ser que el citómetro disponga de más de una fuente de luz

(láser), y el emitir en una zona distinta del espectro lo más distante posible.

Todos los fluorocromos mencionados se excitan a 488 nm (luz azul), si bien

emiten en la zona verde, naranja y roja, respectivamente.

Desde el punto de vista práctico, el uso de marcajes múltiples

simultáneos presenta ventajas importantes sobre los marcajes simples; en este

sentido, la utilización de marcajes triples aporta mayor información con relación

a los marcajes dobles, y así sucesivamente (Orfao y González de Buitrago,

1995).

37

2.5. Aplicaciones en Hematología. Caracterización inmunofenotípica de

los síndromes linfoproliferativos crónicos

El análisis multiparamétrico mediante CMF, junto con el enorme

catálogo de AcMo del que se dispone en la actualidad, al tiempo que ha

representado una herramienta fundamental para delinear la diferenciación de

las células hematopoyéticas normales, ha conducido a clasificar las neoplasias

derivadas de estas células, de acuerdo con la ontogenia de las mismas.

La CMF permite establecer el origen celular y el estadio de maduración

de los síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC); posee especial relevancia

al permitir un diagnóstico diferencial rápido entre una linfocitosis reactiva y un

proceso monoclonal, y en este caso contribuir a su filiación diagnóstica. En este

sentido, el empleo del triple marcaje CD19/Kappa/lambda es de gran utilidad en

la detección de monoclonalidad de los linfocitos de estirpe B.

El inmunofenotipo permite la clasificación diagnóstica de los SLPC en

neoplasias de origen B y T. Además, dentro de cada uno de estos subtipos de

hemopatías se han podido definir subgrupos fenotípicamente diferentes con

características clínico-biológicas específicas. En este sentido, dentro de los

SLPC de estirpe B, la leucemia linfática crónica (LLC-B) se caracteriza por

mostrar una infiltración periférica masiva por células que expresan los

marcadores B y positividad para el CD5 y CD23.

3. SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS CON EXPRESIÓN

HEMOPERIFÉRICA. LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE ESTIRPE B

Los SLPC con expresión hemoperiférica, constituyen un grupo de

enfermedades caracterizadas por la circulación en sangre periférica de una

proliferación clonal de células linfoides maduras no inmunocompetentes.

38

En 1989, el grupo FAB (French-American-British Cooperative Group)

propuso una clasificación basada fundamentalmente en la citomorfología y el

inmunofenotipo, que permitió una definición precisa de estas entidades (Bennet

y cols, 1989). Los avances en el conocimiento del inmunofenotipo y de las

alteraciones cromosómicas en las neoplasias linfoides malignas dieron lugar,

en el año 1993, a la aparición de una nueva clasificación de estos síndromes

conocida bajo el nombre de REAL (Revised European-American Classification

of Lymphoid Neoplasm), en la que se describen con exactitud los SLPC con

expresión hemoperiférica (Harris y cols, 1994). Así, según la estirpe de la célula

neoplásica, los SLPC se clasifican en SLPC de origen B o de origen T. A su

vez, en función de la presentación clínica, se distinguen los SLPC

primariamente leucémicos y los linfomas leucemizados. Recientemente, y por

iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS), las sociedades

Americana y Europea de Hematología, han establecido una nueva clasificación

conocida como clasificación OMS (Harris y cols, 1999), basada en la

clasificación REAL. Ambas clasificaciones tienen diferencias menores, la más

relevante es que la clasificación OMS ha reunido las diferentes entidades en

grandes grupos en función de si, en el momento del diagnóstico, se presentan

en forma predominantemente leucémica, nodal o extranodal. Los SLPC con

expresión hemoperiférica incluidos en la clasificación de la OMS se detallan en

la tabla 1.3.

SLPC con expresión hemoperiférica (clasificación OMS)

Linfomas de células B

- Células maduras

Leucemia linfática crónica

Leucemia prolinfocítica crónica

Linfoma B esplénico de la zona marginal

Leucemia de células peludas (tricoleucemia)

Linfoma folicular

Linfoma de células del manto

39

Linfomas de células T y de células NK (clasificación OMS)

- Células maduras

Leucemia prolinfocítica T

Leucemia de células T grandes granulares

Síndrome de Sézary

El diagnóstico de los SLPC se establece tras la integración de los datos

clínicos y de laboratorio. Los datos de laboratorio que pueden contribuir al

diagnóstico son:

• Citomorfología de las células linfoides de sangre periférica.

• Fenotipo inmunológico mediante una batería de AcMo.

• Histopatología de la médula ósea y de los órganos linfoides afectados.

• Citogenética y biología molecular.

El diagnóstico de estos procesos tiene gran importancia clínica, ya que

el pronóstico y el tratamiento dependen de la identificación precisa de cada una

de las entidades que conforman los SLPC.

Los SLPC de estirpe B son los más frecuentes y se originan por la

expansión clonal de linfocitos B en diferentes estadios de diferenciación. El

estudio del inmunofenotipo permite demostrar la monoclonalidad en la mayoría

de los casos. Las principales características inmunofenotípicas se muestran en

la tabla 1.4: LLC TL TL-V LP LEM LM LCF

IgS +/- ++ ++ ++ ++ -/+ ++

CD19 + ++ ++ + + + +

CD22/CD79b -/+ ++ ++ + ++ + +

CD23 ++ - - - - - -/+

CD5 + - - -/+ -/+ + -/+

CD10 - - - - - -/+ +

CD11c -/+ ++ ++ -/+ + -/+ -/+

CD103 - + + - -/+ - -

CD25 -/+ + - - -/+ -/+ -

FMC7 -/+ ++ ++ + + -/+ +/-

LLC:leucemia linfática crónica; TL:tricoleucemia; TL-V:TLvariante; LP: leucemia prolinfocítica; LEM: linfoma esplénico de la zona marginal; LM: linfoma del manto; LCF: linfoma centrofolicular

40

La LEUCEMIA LINFATICA CRONICA DE ESTIRPE B (LLC-B) es la

entidad más representativa de los SLPC. Es una enfermedad caracterizada por

la proliferación y acumulación de linfocitos no inmunocompetentes de pequeño

tamaño, aspecto maduro y fenotipo B (Dameshek, 1967; Dighiero y cols, 1996;

Galton, 1966; Vallespi y cols, 1999). Las manifestaciones clínicas de esta

enfermedad se deben a la infiltración progresiva de la médula ósea, ganglios

linfáticos y otros tejidos por dichos linfocitos, así como a las alteraciones

inmunológicas que acompañan a la misma (Monserrat y Rozman, 1995). La

LLC-B es la forma de leucemia más frecuente en los países occidentales, se

presenta en personas de edad adulta y su incidencia aumenta con la edad. El

curso clínico es sumamente variable: la mediana de supervivencia es de unos 8

años, pero hay pacientes que fallecen al poco tiempo de ser diagnosticados y

otros cuya esperanza de vida no se ve afectada por la enfermedad. Aunque se

han producido avances en el tratamiento, en la mayoría de los casos la LLC-B

es una enfermedad incurable (Monserrat, 2001).

La primera descripción de la LLC-B la realizó Türk en 1903. En 1924,

Minot e Isaacs llevaron a cabo los primeros estudios sobre las particularidades

clínicas y evolutivas de la LLC-B. Las bases de los conocimientos sobre esta

forma de leucemia fueron establecidas por Galton en la Conferencia Burroughs

de 1965 (Galton, 1966). A su vez, Dameshek (1967) formuló la clásica

definición de LLC-B como “enfermedad debida a la acumulación progresiva de

linfocitos no inmunocompetentes”. En 1975, Rai y cols publicaron su

clasificación de la LLC-B en estadios clínicos, lo que renovó el interés por esta

enfermedad y dio un considerable impulso a los estudios clínicos y biológicos

sobre la misma, desde una nueva perspectiva. En 1979, bajo la iniciativa de

Binet, se constituyó el International Workshop on CLL (IWCLL) que agrupa a

investigadores de muy diversos campos particularmente interesados en la LLC

y otros síndromes linfoproliferativos.

41

3.1. Epidemiología

La LLC-B es la leucemia más frecuente entre las personas adultas de los

países occidentales. El riesgo de desarrollar LLC-B se incrementa

progresivamente con la edad y predomina ligeramente en los varones (Diehl y

cols, 1999; Monserrat y Rozman, 1995). La edad media de los enfermos es de

65 años y sólo un 10-15% de los mismos tienen menos de 50 años en el

momento del diagnóstico (Monserrat, 1996). Sin embargo, debido a la práctica

creciente de análisis de forma rutinaria, la LLC-B se diagnostica cada vez con

mayor frecuencia en personas relativamente jóvenes y en la fase asintomática

de la enfermedad.

La LLC-B representa el 0.8% de todos los cánceres y existen notables

diferencias en frecuencia según las razas y países (Kipps, 2000). Así, en los

países occidentales representa el 30% de todas las leucemias, con una

incidencia que oscila entre 2.7 a 3 casos nuevos por 100.000 habitantes y año

(Dighiero y cols, 1991; Finch y Linet, 1992; Foon y cols, 1990). En cambio, en

los países orientales, como Japón o China, es una enfermedad rara,

representando el 3%-5% de todas las leucemias. Estas variaciones,

probablemente, no solo reflejan diferencias reales entre las poblaciones, sino

también variabilidad en la disponibilidad de métodos diagnósticos (Finch y

Linet, 1992). Finalmente, destacar que también se ha observado que la

incidencia de LLC-B puede ser diferente según el área geográfica de un mismo

país (Digiero y cols, 1991; Foon y cols, 1990).

3.2. Etiopatogenia

Aunque existen ciertos factores relacionados con la enfermedad, la

causa de la LLC-B no se conoce pero, a diferencia de lo que ocurre en otras

leucemias, no hay relación entre la LLC-B y la exposición a radiaciones

ionizantes (Rozman y Moserrat, 1995).

42

Se han descrito familias con varios miembros afectados de LLC-B y

otras en las que se han registrados diversos tipos de SLPC e

inmunodeficiencias, y se calcula que entre los familiares en primer grado de

una persona con LLC-B, el riesgo de padecer la enfermedad es de 2 a 7 veces

superior al de la población general. Todo ello podría sugerir que la enfermedad

tiene una base genética, aunque estudios del genoma en gemelos univitelinos

afectos de LLC-B han demostrado su naturaleza adquirida y hasta ahora no se

ha demostrado una alteración genética molecular asociada al desarrollo de la

enfermedad (Monserrat y cols, 1997; Yuille y cols, 1998).

Los factores ambientales no parecen tener un papel importante en la

patogénesis de este tipo de leucemias. De acuerdo con publicaciones previas,

un estudio reciente del Swedish Cancer no encuentra asociación entre el

desarrollo de la LLC-B y la exposición a los rayos solares, pesticidas ni

disolventes (Adami y cols, 1999).

Los virus tampoco han demostrado una influencia directa en la génesis

de la enfermedad. Así, aunque se ha sugerido que puedan contribuir al

desarrollo de neoplasias linfoides, no se ha demostrado una relación clara

entre el herpes-virus 7, el virus de la hepatitis C y el desarrollo de la LLC-B

(Daibata y cols, 1999; Paidas y cols, 1999). Sin embargo, el virus de Epstein-

Barr (VEB) se ha asociado con algunos casos de síndrome de Richter,

especialmente en pacientes con inmunodeficiencia severa (Ansell y cols, 1999).

En estos casos, es posible que la ausencia de vigilancia inmunológica conlleve

al desarrollo de enfermedades linfoproliferativas asociadas al VEB.

3.3. Citogenética y Biología Molecular

En la LLC-B se han descritos diversas alteraciones cromosómicas,

siendo la anomalía más frecuente la del(13q14), seguida por la del(11q22-q23)

y la trisomía del cromosoma 12 (Döhner y cols, 1999; Morgan y cols, 1999;

Stilgenbauer y cols, 1999). Sin embargo, no existen datos concluyentes que

43

asocien estas alteraciones genéticas con formas agresivas de la enfermedad

(Döhner y cols, 1997; García-Marco y cols, 1996), aunque algunos autores han

relacionado alteraciones citogenéticas complejas y la trisomia del cromosoma

12 como factores de mal pronóstico (Kipps, 2000; Wierda y Kipps, 1999).

Por otra parte, la relación entre la LLC-B y determinados genes (Bcl-1,

Bcl-2, Bcl-3) no está clara. En condiciones normales, el gen Bcl-2 previene la

apoptosis o muerte programada de las células. En la LLC-B es frecuente un

incremento de las proteinas Bcl-2 aunque, al contrario de lo que sucede en los

linfomas foliculares, el reordenamiento del gen es excepcional (Hanada y cols,

1993; Raghoebier y cols, 1991). Esto se relaciona con los defectos de la

muerte celular programada (apoptosis) de los linfocitos de la LLC-B y su

acumulación, en forma de células en fase G0 del ciclo celular, a lo largo del

tiempo. Aunque los niveles de expresión del gen Bcl-2 en las células

leucémicas no se corresponde con la masa tumoral, sí parece tener relación

con formas clínicas agresivas y con resistencia a la quimioterapia (Klein y

Miera, 2000; Pepper y cols, 1999).

3.4. Biología y cinética celular del linfocito B neoplásico en la LLC-B

La mayoría de las células de la LLC-B en sangre periférica no están en

una fase de mitosis del ciclo celular (suelen estar en fase G0), lo que sugiere

que la vida media de los linfocitos es muy larga. En este sentido, se ha

comprobado que las células B procedentes de un paciente con LLC-B

transferidas a ratones con inmunodeficiencia combinada severa pueden

sobrevivir durante semanas (Kobayashi y cols, 1992).

La contrapartida normal de los linfocitos de la LLC-B no está aclarada.

Así, en los ganglios linfáticos y sangre periférica de las personas normales

puede identificarse una pequeña población de linfocitos con características

fenotípicas similares a la de los linfocitos B de la LLC-B (CD5+). Estas células

son de aparición temprana en la ontogenia de los linfocitos B y se hallan

44

incrementadas en la sangre del cordón umbilical, lo que condujo a algunos

investigadores a sugerir que los linfocitos B (CD5+) de la LLC-B correspondían

a una expansión de un clon detenido en un estadio inmaduro, aunque esta

hipótesis no ha sido confirmada por otros autores (Dighiero, 1987, 1988).

De forma alternativa, se ha sugerido que las células B (CD5+) de la LLC-

B podrían corresponder a una línea celular aislada (Hayakawa y cols, 1985).

Sin embargo, no hay una demostración clara de que estas células

correspondan a una línea celular B diferente. Investigaciones recientes,

parecen indicar que la contrapartida normal del linfocito de la LLC-B se halla en

la zona del manto de los folículos linfoides. Alrededor del 50% de los casos

tienen mutaciones somáticas de los genes de las Ig, lo que sugiere un origen

de la enfermedad en las células B post-germinales, con memoria inmunológica.

En el resto de los casos, los genes de las Ig no están mutados; en tales casos,

la leucemia surgiría a partir de células B pregerminales, sin memoria

inmunológica (Damle y cols, 1999; Hamblin y cols, 1999).

El carácter monoclonal de los linfocitos de la LLC-B se pone de

manifiesto por la presencia de cadenas ligeras kappa o lambda, pero nunca

ambas, así como por estudio de las isoenzimas de la G-6PD en mujeres

heterocigotas para el mismo, análisis citogenéticos y estudio del

reordenamiento de los genes de las Ig (Foon y cols, 1990).

3.5. Características inmunofenotípicas de los linfocitos B en la LLC-B

Desde el punto de vista inmunofenotípico, las células de la LLC-B se

asemejan al de linfocitos relativamente inmaduros, aunque presentan un grado

de maduración mayor que el de los linfoblastos de la leucemia aguda. Así, las

células de la LLC-B expresan marcadores B, CD19, CD24, CD20 y CD22, con

intensidad inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre

periférica (Witzig y cols, 1994) y tienen Ig de superficie, cuya monoclonalidad

viene determinada por la expresión de una única cadena ligera (Κ o λ), sobre la

45

membrana de la célula (Kipps, 1995). El 60% de los pacientes con LLC-B

expresan Ig con cadena ligera k y el 40% restante tienen cadena ligera λ. La Ig

de superficie más frecuente es Ig M, seguida de IgM mas IgD o IgD sola (Kroft

y cols, 1995). No obstante, el nivel de Ig expresada en la superficie de las

células leucémicas es bajo comparado con los niveles hallados en células B

normales o células neoplásicas de otros procesos linfoproliferativos (Geisler y

cols, 1991; Ternynch y cols, 1994).

Una característica inmunofenotípica relevante es que estas células

leucémicas suelen expresar CD5, un antígeno inicialmente descrito como

específico de células T (Huang y cols, 1999; Kipps, 2000; Zukerberg y cols,

1993) y, aunque un porcentaje pequeño de casos pueden ser CD5 negativo

(Kay y Peterson, 1991; Kurec y cols, 1992), los miembros del International

Workshop en LLC han recomendado que en los ensayos clínicos solo se

incluyan casos de LLC-B CD5+ (IWCLL, 1989).

Además, las células de la LLC-B suelen expresar CD23, un marcador de

activación de células B (Batata y Shen, 1992), que es útil para diferenciar la

LLC-B del linfoma del manto, ya que este último es positivo para el CD5 pero

negativo para CD23 (Harris y cols, 1994). Un 50% de casos expresan otro

marcador de activación celular, CD25, observado en la mayoría de los

pacientes con leucemia de células peludas (tricoleucemia) (Freedman, 1990;

Kroft y cols, 1995).

Otros marcadores menos específicos de LLC-B que se expresan en una

minoría de casos son: CD11c, que es un antígeno mielomonocítico

característico de la tricoleucemia (Hanson y cols, 1990; Wormsley y cols,

1990); el marcador FMC7 no suele presentar reactividad en la LLC-B, al

contrario de lo que sucede en la leucemia prolinfocítica de células B en la que

suele ser positivo (Catovsky y cols, 1981). El Ag CD10 (CALLA) suele ser

constantemente negativo.

46

El patrón fenotípico más ampliamente aceptado en la LLC-B es el

siguiente (Baldini y cols, 1990; Cheson y cols, 1996; Kurec y cols, 1992; Legac

y cols, 1991):

• Suelen expresar bajas cantidades de Ig en su superficie (kappa o

lambda).

• La mayoría de los casos expresan CD5 (con negatividad para el resto de

marcadores T) y CD23 en la membrana.

• Expresan marcadores B, CD19, CD24, CD20 y CD22, con intensidad

inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre periférica.

Los procesos linfoproliferativos B representan una amplia variedad de

enfermedades, caracterizadas por distintos patrones clínicos, morfológicos

inmunofenotípicos e histológicos. Sin embargo, en ocasiones pueden presentar

datos comunes que dificultan el diagnóstico y reflejan la heterogeneidad de

estos procesos. Dado que la evolución clínica y respuesta al tratamiento son

muy diversas, establecer un diagnóstico correcto es de máxima importancia. En

este sentido, la realización de un análisis inmunofenotípico por CMF es

fundamental y precisa de la combinación de varios marcadores inmunológicos,

ya que el análisis de marcadores aislados es insuficiente para distinguir entre

los distintos procesos linfoproliferativos.

Diversos investigadores han intentado establecer un sistema de

puntuación incluyendo varios AcMo para tener una aproximación diagnóstica

fiable (Kurec y cols, 1992). De ellos destaca por su fácil reproductividad,

accesibilidad y simplicidad, el sistema creado por Matutes y cols. (1994) el cual

incluye cinco AcMo: CD5, CD22, CD23, FMC7 e inmunoglobulinas de

superficie, dando una puntuación de 0 a 1, según el patrón fuese típico o

atípico para LLC-B. Una puntuación de 5 indicaría que nos hallamos ante una

LLC-B típica y una puntuación de 0 ante una LLC-B atípica. Aplicando este

sistema a los pacientes con leucemias y linfomas estudiados por este grupo, un

87% de los casos de LLC-B tenían una puntuación de 5 y 4, y solo un 0.4%

mostraban un rango de 0 o 1; mientras el 89% de otras leucemias B y el 72%

47

de los linfomas tenían una puntuación de 0 a 1. Otros AcMo como CD25, CD10

y CD11c no mostraron poder discriminatorio.

Con posterioridad, este mismo grupo, intentó mejorar la precisión de su

sistema diagnóstico incluyendo un nuevo AcMo: CD79beta, así se pasó de un

nivel de precisión del 91.8% al 96.6%, convirtiéndose en uno de los esquemas

más utilizados por los hematólogos en el diagnóstico de los SLPC (Moreau y

cols, 1997). Este sistema de puntuación se describe en el apartado de Material

y Método.

3.6. Alteraciones de la inmunidad

3.6.1. Inmunidad celular

Se han descrito diversas alteraciones de los linfocitos T en la LLC-B,

siendo las más aceptadas el incremento en la cifra absoluta de los mismos

(Briggs y cols, 1991; Kimby y cols, 1987; Töterman y cols, 1989) y la alteración

del cociente CD4/CD8 en sangre periférica (Apostolopoulos y cols, 1990;

Burger y cols, 1990). También se han citado otras anomalías como el aumento

del número absoluto de células T CD8+ y CD4+ (Dighiero, 1993).

La etiopatogenia de estas alteraciones en la población T en la LLC-B y

sus implicaciones en el curso evolutivo de la enfermedad se desconocen,

aunque se han relacionado con estadios avanzados (Zaknoen y cols, 1990) y

con la hipogammaglobulinemia frecuentemente observada en estos pacientes

(Davey y cols, 1987). No obstante, los datos publicados son contradictorios y

no hay consenso en la literatura (Briggs y cols, 1990; Kunicka y Platsoucas,

1988).

Los datos respecto a la función cooperadora, NK y citotoxicidad celular

dependiente de antígeno son también conflictivos y difíciles de interpretar. El

crecimiento de colonias de linfocitos T en cultivo suele estar disminuido. Los

48

pacientes con LLC-B tienen disminuida la actividad NK, pero el número de

células NK suele ser normal o incluso está incrementado (Caligaris-Cappio y

Hamblin, 1999; Wierda y Kipps, 1999).

3.6.2. Inmunidad humoral

La hipogammaglobulinemia aparece en un 10 a 60% de los casos de

LLC-B, según los valores empleados como límite inferior (Dighiero, 1988;

Dighiero y cols, 1991), siendo esta la causa principal de infección en la LLC-B

(Anaissie y cols, 1999; Molica, 1994). Los pacientes con formas precoces de la

enfermedad pueden presentar respuestas defectuosas de Ac específicos frente

a la infección o la inmunización (Chapel y Buch, 1987).

Un marcado componente monoclonal de inmunoglobulinas,

generalmente IgM, solo es observable en un 5% de los pacientes pero,

utilizando técnicas de alta resolución, una pequeña proporción de componente

monoclonal puede detectarse en suero u orina en el 80% de los casos

(Beaume y cols, 1994).

Sobre la base de lo expuesto, los pacientes con LLC-B tienen una mayor

susceptibilidad a las infecciones debido a la hipogammaglobulinemia. Sin

embargo, pueden estar implicados otros factores, como niveles bajos de

complemento (Kipps, 2000), alteración en la expresión del HLA de clase II en

las células leucémicas (Veenstra y cols, 1996) y defectos de la función

granulocítica (Itala y cols, 1996).

Finalmente, anotar que en pacientes con LLC-B se han observado

fenómenos autoinmunes dirigidos contra componentes sanguíneos, cuya

patogenia es desconocida. Se han postulado diversas hipótesis, entre ellas,

destacamos las que implican las anormalidades en los linfocitos B no

neoplásicos como origen de estos procesos autoinmunes (Kipps y Carson,

1993; Montserrat y cols, 1997) y las que responsabilizan a las células

49

neoplásicas (Bartik y cols, 1998; Sthoeger y cols, 1993). Actualmente, se

investiga el papel que puede jugar la población T en la aparición de esta

complicación, al observar que la introducción de nuevos agentes terapéuticos

como son los análogos de las purinas, que producen una importante alteración

de las subpoblaciones linfocitarias T, ha conducido a un aumento en la

frecuencia de anemias y trombopenias de etiología autoinmunes (Pristch y cols,

1998).

3.7. Manifestaciones clínicas

La forma de presentación de la LLC-B ha variado sustancialmente a lo

largo de los últimos años debido, sobre todo, a la creciente práctica de análisis

de rutina. Así, en la actualidad más de la mitad de los casos se descubren de

forma casual, en personas asintomáticas a las que se les realizan exámenes

rutinarios de salud y se detecta en la analítica una leucocitosis con linfocitosis

(Dighiero y cols, 1991; Monserrat y Rozman, 1995;). En el resto, la astenia, la

aparición de adenopatías o las infecciones de repetición son las

manifestaciones que llevan a la sospecha diagnóstica. Por otra parte y a

diferencia de lo que ocurre en los linfomas, la fiebre, sudación y pérdida de

peso son poco frecuentes como forma de presentación de la enfermedad

(Monserrat y cols, 1997).

La exploración física puede ser completamente normal, aunque en cerca

del 40% de pacientes se detectan adenopatías de carácter simétrico. Las

adenopatías mediastínicas o la infiltración del anillo linfático de Waldeyer son

sumamente raras. El bazo suele palparse en el 20-30% de los casos. No es

extraño el hallazgo de hepatomegalia. De forma excepcional pueden detectarse

infiltrados linfoides en diversos tejidos, tales como piel, riñón, glándulas

lagrimales o salivares, pulmón u otros. En estos casos, sin embargo, es

obligado descartar una segunda neoplasia o la progresión de la enfermedad a

linfoma. Se han descrito casos de síndrome nefrótico acompañando a la LLC-

50

B, así como de hipertensión portal por hiperplasia nodular regenerativa del

hígado inducida por la infiltración linfoide del mismo (Monserrat y cols, 1997).

3.8. Complicaciones

Las complicaciones suelen derivar de las alteraciones del sistema

inmunitario, la alta masa tumoral y la progresión de la enfermedad. Entre ellas,

las más frecuentes son las infecciones, los fenómenos autoinmunes, la

transformación de la enfermedad y las segundas neoplasias.

3.8.1. Infecciones

Son más frecuentes en fases avanzadas de la enfermedad y se deben a

las alteraciones de la inmunidad que acompañan a la LLC-B y a las

complicaciones derivadas del tratamiento. Suelen ser de origen bacteriano y de

localización pulmonar; las infecciones virales, en especial por virus herpes, son

asimismo muy frecuentes. La introducción en los últimos años de nuevos

agentes terapéuticos como los análogos de las purinas, ha provocado la

aparición de infecciones oportunistas (Pneumocystis carinii, CMV, Legionella,

Listeria, micobacterias atípicas). Las infecciones son la primera causa de

morbimortalidad (Anaissie y cols, 1999).

3.8.2. Fenómenos autoinmunes

La prueba de Coombs directa es positiva en un 15-35% de los casos, al

inicio de la enfermedad o durante su evolución. Los Ac suelen ser de tipo IgG,

el más frecuente es el factor reumatoideo (Kipps y Carson, 1993). En

ocasiones, la positividad de la prueba de Coombs no se acompaña de una

anemia hemolítica franca. Menos frecuente es la trombocitopenia de tipo

autoinmune que acontece en un 2-5% de casos (Keating, 1999). En raras

ocasiones, la LLC-B se asocia a una aplasia pura de la serie roja, cuyo

51

diagnóstico, cuando la médula ósea está intensamente infiltrada por linfocitos,

no siempre es fácil (Monserrat y cols, 1997).

3.8.3. Transformación de la enfermedad

La forma más habitual (5-10% de los casos) es la transformación

prolinfocitoide, situación en la que en sangre periférica coexisten linfocitos

maduros con prolinfocitos; para la definición de leucemia prolinfocítica se ha

establecido, de forma arbitraria, que el porcentaje de prolinfocitos debe ser

superior al 55% (Melo y cols, 1986). A su vez, en el 3-10% de los pacientes se

asiste a la aparición de un linfoma de células grandes (síndrome de Richter),

posibilidad que deberá sospecharse siempre que el paciente sufra un

empeoramiento inexplicado del estado general, fiebre, aumento del tamaño de

los ganglios linfáticos o del bazo, incremento de la LDH sérica e hipercalcemia

(Giles y cols, 1998). En cerca de la mitad de los casos, el linfoma surge a partir

de la transformación de la clona propia de la LLC-B. Es excepcional que la

LLC-B se transforme en una leucemia aguda. Asimismo, es también posible la

aparición de un mieloma múltiple, que en la mayoría de los casos es un

fenómeno de novo, no relacionado con la clona celular de la leucemia

(Monserrat, 2001).

3.8.4. Segundas neoplasias

La incidencia de neoplasias en los enfermos con LLC-B es superior a la

de la población general. Alrededor de un 10% de los pacientes presentan esta

complicación. Se trata, por lo general, de carcinomas de piel, tubo digestivo y

pulmón. Las segundas neoplasias pueden aparecer de forma previa,

simultánea o tras el diagnóstico de la leucemia, en cuyo caso no guardan

necesariamente relación con el tratamiento (López-Guillermo y cols, 1989).

52

3.9. Datos de laboratorio

Entre las alteraciones analíticas, destaca la leucocitosis, que suele

estar comprendida entre 20 y 150 x 109/L con una linfocitosis superior al 75%.

El estudio morfológico de sangre periférica muestra unos linfocitos de pequeño

tamaño, núcleo redondeado, cromatina condensada en grumos y escaso

citoplasma. Estas células son anormalmente frágiles y se rompen con facilidad

al efectuar las extensiones, dando lugar a las típicas sombras de Gumprecht.

Puede haber un pequeño porcentaje, de linfocitos que presenten hendiduras

nucleares (linfocitos hendidos) y otros con nucléolos (prolinfocitos) (Harris y

cols, 1999; Vallespi y cols, 1999; Woessner y cols, 1991).

La anemia se detecta de forma inicial en el 15-20% de los casos. En

ocasiones es de carácter autoinmune, aunque los signos indirectos de

hemólisis (por ejemplo, reticulocitos) pueden faltar o ser poco evidentes y, por

ello, en todos los casos de LLC-B procede estudiar el test de Coombs. Otras

causas implicadas en la producción de anemia son: reducción en la producción

de hematies asociada a una infiltración masiva de la médula ósea, secuestro

esplénico o aplasia pura de serie roja de probable etiología inmune. La

trombopenia es menos frecuente. La neutropenia de origen inmune es

excepcional (Digiero y cols, 1991). Los niveles séricos de ácido úrico, láctico-

deshidrogenasa (LDH) y bilirrubina total pueden estar elevados.

La hipogammaglobulinemia es frecuente (20-60% de los casos), sobre

todo en los pacientes con enfermedad avanzada. La Ig que con mayor

frecuencia se halla descendida es la IgM, seguida de la IgG e IgA. En el 5-10%

de los casos puede detectarse una gammapatía monoclonal (sobre todo IgM o

IgG).

El aspirado de médula ósea revela una infiltración por elementos

linfoides. En la biopsia medular se han definido diferentes patrones de

infiltración: nodular, intersticial, mixto y difuso (Hernández-Nieto y cols, 1997).

53

El patrón nodular consiste en una infiltración por nódulos linfoides con

conservación de la grasa y celularidad hematopoyética normal. El patrón

intersticial tiene una infiltración linfocitaria intersticial, con celularidad

hematopoyética y adiposa conservada. El mixto consiste en una combinación

de los dos patrones anteriores. Finalmente, en el difuso casi no se observa

celularidad hematopoyética ni grasa debido a la existencia de una gran

infiltración por linfocitos. Los patrones nodular, intersticial y mixto se observan

en las fases iniciales de la enfermedad y el difuso en las más avanzadas

(Monserrat, 2001).

Los ganglios linfáticos tienen una infiltración difusa por linfocitos de

pequeño tamaño. En el bazo hay una infiltración que ocupa principalmente la

pulpa blanca en forma de nódulos linfoides.

3.10. Diagnóstico

Los criterios diagnósticos para la LLC-B han sido establecidos de forma

independiente por dos grupos de trabajo: el International Workshop on Chronic

Lymphocytic Leukemia (IWCLL, 1989) y el National Cancer Institute-

Sponsored Working Group (Cheson y cols, 1996).

• Criterios diagnósticos del International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL, 1989) :

1. Linfocitosis absoluta mantenida, con predominio de linfocitos pequeños

de aspecto maduro en sangre periférica y médula ósea. Deben ser

descartadas otras causas de linfocitosis secundarias.

2. Si la cifra de linfocitos es igual o superior a 10 x 109/L, es necesario

demostrar una infiltración de más de un 30% de linfocitos respecto a

células nucleadas en la médula ósea, o un patrón inmunofenotípico

característico de LLC-B (débil expresión de Ig de superficie y positividad

para CD5).

54

3. Si el contaje de linfocitos es menor a 10 x 109/L, es necesario cumplir

los dos criterios previamente descritos: infiltración por más de un 30%

de linfocitos en médula ósea y un patrón inmunofenotípico característico

de LLC-B.

• Criterios diagnósticos de National Cancer Institute-Sponsored Working

Group (NIC, 1996):

1. Cifra de linfocitos en sangre periférica mayor de 5 x 109/L. Desde el

punto de vista morfológico, estos linfocitos deben ser de aspecto

maduro, aunque se admite que pueden aparecer células grandes o

atípicas, linfocitos hendidos y prolinfocitos. El porcentaje de prolinfocitos

debe ser inferior al 55% o menos de 15 109/L.

2. Inmunofenotipo en sangre periférica característico de LLC-B. Los datos

fenotípicos necesarios para establecer el diagnóstico de LLC-B

incluyen: expresión en la población predominante de marcadores de

células B (CD19, CD20 y CD23) con positividad para CD5. Ausencia de

otros antígenos de células T. Demostración de clonalidad sobre la base

de la expresión de cadenas ligeras kappa o lambda de baja densidad.

La duración de la linfocitosis no es actualmente un criterio diagnóstico.

En la revisión previa establecida por este grupo (NIC) se exigía una linfocitosis

mantenida durante al menos 4 semanas (Cheson y cols, 1988), requisito que

no es necesario en el momento actual, debido a la introducción del

inmunofenotipaje celular por CMF que puede demostrar la clonalidad de la

proliferación.

La realización de aspirado y biopsia de médula ósea no es necesaria

para establecer el diagnóstico. El aspirado debe mostrar un porcentaje de

linfocitos igual o superior al 30% de las células nucleadas y la biopsia permite

conocer el patrón de infiltración que tiene implicaciones pronósticas.

55

El grupo FAB (French-American-British Cooperative Group) distingue tres

variedades morfológicas de LLC-B ( Bennett y cols, 1989):

1. Forma típica, constituida por linfocitos con citoplasma visible pero

escaso, homogéneo y débilmente basófilo, sin gránulos. La cromatina

nuclear es característicamente densa y cuarteada. El núcleo y

citoplasma tienen un contorno regular, aunque en algunos casos se

puede observar irregularidades nucleares con indentaciones. El

nucléolo no es visible mediante microscopia óptica. Deben tener menos

del 10% de linfocitos atípicos.

2. Forma mixta tipo LLC/PL, con un porcentaje de prolinfocitos

comprendido entre el 11% y el 54%.

3. Forma mixta, con linfocitos de tamaño diverso, grandes y pequeños,

pero con menos de un 10% de prolinfocitos.

Recientemente la OMS (Harris y cols, 1999) ha establecido una nueva

clasificación para las LLC-B :

1. LLC típica, en la que la proporción de linfocitos atípicos en sangre

periférica es igual o inferior al 10%.

2. LLC/leucemia prolinfocítica (LLC/LPL), cuando el porcentaje de

prolinfocitos se halla incrementado (por lo general, entre el 11 y el 54%).

3. LLC morfológicamente atípica, en la que existe una proporción variable

de células linfoides atípicas (prolinfocitos, linfocitos grandes y, más

raramente, células hendidas y centrocitos) pero el inmunofenotipo es

característico de la enfermedad.

4. LLC inmunofenotípicamente atípica, en la cual la morfología es típica de

la LLC-B, pero las células leucémicas tienen alguna característica

inmunofenotípica poco usual (p. ej; CD5 -, FMC7 +, CD11c+, SmIg de

fuerte intensidad).

56

Como norma general, no debe aceptarse el diagnóstico de LLC-B atípica

sin haber descartado antes otros procesos linfoproliferativos crónicos.

3.11. Factores pronósticos

La mediana de supervivencia de los pacientes con LLC-B es de 8-10

años, pero el curso clínico es muy variable de un enfermo a otro. Así, mientras

algunos pacientes fallecen pocos meses después del diagnóstico, otros

sobreviven durante más de 10 años, sin apenas problemas médicos y sin

precisar tratamiento. De forma excepcional puede asistirse a la remisión

“espontánea” de la enfermedad, a veces tras sufrir el enfermo una infección

viral (Bernard y cols, 1999; Kipps, 2000; Ribera y cols, 1987).

A partir de la idea de que las manifestaciones de la LLC-B se deben a la

acumulación progresiva de linfocitos, se han establecido diversos sistemas de

clasificación por estadios clínicos que reflejan la masa tumoral. La introducción

de estadios clínicos significó un gran avance en el pronóstico, siendo los

sistemas más utilizados el de Rai (1975) y el de Binet (1981). La supervivencia

disminuye desde los estadios iniciales (0 de Rai y A de Binet) a los estadios

avanzados (III y IV de Rai y C de Binet).

Diversos parámetros no incluidos en los sistemas de Rai y de Binet

pueden ser de utilidad para establecer un pronóstico más preciso, entre ellos

los más importantes son:

• Cifra de linfocitos en sangre periférica, discrimina muy bien dos grupos

con diferente pronóstico, según sea inferior o superior a 30 x 109/L

(Rozman y cols, 1982).

• Tiempo de duplicación del número de linfocitos, mayor o menor a 12

meses (Zwiebel y Cheson, 1998), aunque algunos autores establecen el

punto de corte en 6 meses (Cheson y cols, 1996).

• Patrón histológico de infiltración medular (difuso, no difuso) (Rozman y

cols, 1984).

57

• Alteraciones citogenéticas complejas, incluyendo la trisomia del

cromosoma 12 (Kipps, 2000).

Otros parámetros pronósticos han sido recientemente introducidos, entre

ellos destacamos, tasa de LDH, beta-2-microglobulina y cifras de células

CD19+ en sangre periférica (Hallek y cols, 1997; Molica, 1999). La beta-2-

microglobulina representa la cadena ligera de los antígeno HLA de clase I y su

expresión elevada en suero se acompaña de una disminución en la membrana

del tumor y para algunos autores es un importante factor pronóstico ( Keating,

1999).

En resumen, los enfermos con datos de buen pronóstico (estadio poco

avanzado, patrón no difuso en la biopsia ósea, cifras de linfocitos en sangre

periférica < 30 x 109/L, tiempo de duplicación > 12 meses y ausencia de

alteraciones citogenéticas) tienen un excelente pronóstico, con medianas de

supervivencias que superan los 10 años. Por el contrario, aquellos con factores

desfavorables tienen una esperanza de vida inferior a los 5 años.

Los pacientes en estadio A de Binet con patrón no difuso en la biopsia

medular, hemoglobina mayor o igual a 13 g/dl, cifra de linfocitos menor o igual

a 30 x 109/L y un tiempo de duplicación prolongado (> 12 meses), tienen muy

pocas probabilidades de progresar a un estadio más avanzado y una

supervivencia similar a la de una población control de igual sexo y edad (LLC

smoldering o quiescente) (Monserrat y cols, 1988).

3.12. Tratamiento

Actualmente no existe un tratamiento curativo para la LLC-B y, por ello,

el objetivo del mismo es prolongar la supervivencia de los enfermos y mejorar

su calidad de vida. Debido a que la influencia de la enfermedad en la

supervivencia de los pacientes es sumamente variable, las indicaciones

terapéuticas deben hacerse tomando en cuenta los factores pronósticos y la

edad del paciente. Antes de iniciar el tratamiento es necesario mantener al

58

paciente en observación unas cuantas semanas. Durante este período se

practicarán diversos recuentos sanguíneos para estimar el tiempo de

duplicación linfocitario y se completará el estudio diagnóstico.

Los estadios clínicos son una importante guía para tratar a los enfermos

con LLC-B:

• Pacientes con LLC-B de riesgo bajo (Binet A, Rai 0). No existe ninguna

prueba de que el tratamiento sea beneficioso en estos enfermos

(Dighiero y cols, 1998) y en un estudio multicéntrico publicado

recientemente, se demuestra que la supervivencia a los 10 años, fue

ligeramente peor en los pacientes con estadios precoces tratados de

forma inmediata con quimioterapia, respecto a aquellos en los que el

tratamiento fue diferido (CLLTCG, 1999). Así, la actitud aconsejada en

estos casos es la realización de controles cada 3-6 meses y solo iniciar

tratamiento en caso de progresión de la enfermedad.

• Pacientes con LLC-B de riesgo intermedio-alto (Binet B, C; Rai I-IV).

Algunos pacientes presentan un curso clínico poco agresivo, por lo que

no requieren tratamiento de forma inicial. La mayoría, sin embargo,

acaban por necesitar tratamiento.

Debe plantearse la posibilidad de iniciar tratamiento ante cualquiera de

las siguientes circunstancias (Cheson y cols, 1996; Monserrat, 2001):

• Presencia de síntomas generales (fiebre, sudación, pérdida de peso).

• Existencia de adenopatías o esplenomegalia de gran tamaño que

causen síntomas.

• Descenso paulatino de las cifras de hemoglobina o de plaquetas.

• Estadio clínico avanzado.

• Tiempo de duplicación linfocitario < 12 meses.

• Infecciones de repetición con hipogammaglobulinemia.

59

El clorambucilo ha sido el fármaco más utilizado en las últimas dos

décadas en el tratamiento de la LLC-B. Las posibilidades terapéuticas son las

siguientes:

• Monoquimioterapia: a. Clorambucilo. Respuestas globales 60%; respuestas

completas 10-20%. Para que el tratamiento resulte efectivo

debe efectuarse durante 6-8 meses. Su prolongación más allá

de este período no suele aportar ventaja alguna.

b. Ciclofosfamida. Es una alternativa al tratamiento con

clorambucilo.

• Poliquimioterapia: a. La combinación más utilizada es la de clorambucilo más

prednisona. Respuestas globales 35-90%; respuestas

completas no superan el 10%. En estudios aleatorizados este

esquema no se ha mostrado superior al clorambucilo solo, lo

que hace que, teniendo en cuenta los efectos secundarios de

los corticoides, sea preferible utilizar el clorambucilo de forma

aislada.

b. Otras combinaciones, como ciclofosfamida, adriamicina,

vincristina y prednisona o ciclofosfamida, melfalán, prednisona

no han demostrado ser más eficaces que el clorambucilo, por

lo que su empleo no está justificado (CLLTCG, 1999).

• Nuevas modalidades terapéuticas:

a. Análogos de las purinas. Fludarabina, 2-clorodeoxiadenosina.

La tasa de respuestas completas obtenidas por ambos

fármacos se situán entre el 25 y el 50%. Las respuestas, sin

embargo, no se mantienen y todos los enfermos acaban por

recaer. La mediana de intervalo libre de enfermedad en los

enfermos que responden es de unos 5 años. Los principales

60

efectos secundarios son la mielosupresión y la

inmunosupresión. La comparación de estos fármacos con

clorambucilo demuestra que, si bien la tasa de respuesta

completa y el intervalo libre de enfermedad es superior en los

enfermos tratados con análogos de las purinas, no existe

diferencia en la supervivencia global, por lo que no están

recomendados como tratamiento de primera línea, a no ser en

ensayos clínicos (Cheson, 1998).

b. Otras alternativas terapéuticas actualmente en investigación

son: trasplante de precursores hematopoyéticos y los

anticuerpos monoclonales dirigidos contra el Ag CD52 y CD20.

PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS

62

La respuesta inmunológica conlleva la producción de Ac dirigidos contra

el antígeno (inmunidad humoral), y la proliferación de células con capacidad

citotóxica (inmunidad celular). Existen dos tipos fundamentales de linfocitos, T

(inmunidad celular) y B (inmunidad humoral), que a su vez constan de diversas

subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en virtud de

características inmunológicas, enzimáticas y funcionales. Estos dos sistemas

no son independientes sino que están íntimamente imbricados. Así, para que

los linfocitos B específicos contra determinados antígenos puedan activarse,

proliferar y diferenciarse, se requiere la ayuda de los linfocitos T y a su vez, los

linfocitos B actúan como células presentadoras de antígenos para los linfocitos

T.

Desde el punto de vista inmunofenotípico, los linfocitos B maduros se

definen por la expresión de antígenos característicos de línea B (CD19, CD22,

CD20) e Ig de superficie, y los linfocitos T se dividen en dos subpoblaciones

linfocitarias, en virtud de la expresión de los antígenos CD4 (linfocitos T

colaboradores) o CD8 (linfocitos T citotóxicos).

La LLC-B es la leucemia más frecuente entre las personas adultas de los

países occidentales. Se caracteriza por la proliferación y acumulación de

linfocitos no inmunocompetentes, aspecto maduro y fenotipo B. Desde un

punto de vista inmunológico, las células leucémicas presentan un perfil

fenotípico característico que puede ayudar a su diferenciación de otros

procesos linfoproliferativos. En este sentido, el inmunofenotipaje celular por

citometría de flujo contribuye de forma relevante a la investigación del origen

celular de estas hemopatías y a su clasificación.

La célula neoplásica de la LLC-B presenta defectos de la muerte celular

programada (apoptosis), lo que provoca su acumulación, en forma de células

en fase G0 del ciclo celular. Este proceso de acumulación progresiva de

linfocitos da lugar a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Se han

descrito alteraciones de la inmunidad celular y humoral en la LLC-B, que en

63

principio podríamos pensar que serían debidas a la sustitución de los linfocitos

T y B normales por células tumorales. Contrariamente a lo esperado, los

primeros estudios realizados en este sentido por Kimby y cols. (1987) y

Dighiero (1988) mostraron un aumento del número absoluto de linfocitos T y

una alteración del cociente CD4/CD8, datos no confirmados por otros autores

(Kurec y cols, 1992).

La etiopatogenia de estas alteraciones en la población T en la LLC-B y

sus implicaciones en el curso evolutivo de la enfermedad se desconoce.

Algunos autores lo han relacionado con estadios avanzados de la enfermedad;

(Apostolopoulos y cols, 1990; Burger y cols, 1990), aunque otros investigadores

no han encontrado esta relación (Briggs y cols, 1990).

Probablemente, estas discrepancias observadas en la literatura respecto

a la población linfoide T en la LLC-B se deban a la inclusión de poblaciones de

pacientes muy heterogéneas, sin criterios diagnósticos claros, y a las

dificultades técnicas para obtener la fracción de linfocitos T que está en muy

baja proporción (predominio de la población leucémica).

Los avances tecnológicos en el inmunofenotipaje celular por CMF han

conseguido una mayor objetividad y reproductividad diagnósticas, facilitando la

identificación de subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están

escasamente representadas. Así mismo, recientemente el National Cancer

Institute-Sponsored Working Group (NCI), ha establecido unos criterios

diagnósticos para la LLC-B que por su fácil aplicabilidad en la mayoría de los

laboratorios hematológicos, cuentan con una aceptación general y han

permitido mejorar la uniformidad de criterios

Los avances técnicos en el área diagnóstica, unido al considerable

significado clínico-biológico de las alteraciones de la inmunidad humoral y

celular en la LLC-B y a las discrepancias existentes al respecto, han llevado al

planteamiento de este trabajo, con la finalidad de estudiar las características

64

inmunofenotípicas de las células tumorales, y las alteraciones de los linfocitos

T, su mecanismo etiopatogénico y el papel en las complicaciones asociadas a

la enfermedad (hipogammaglobulinemia). En base a ello se han planteado los

siguientes objetivos:

1. Establecer un patrón inmunológico en las células leucémicas de la

LLC-B, ampliando las características definitorias del perfil

fenotípico.

2. Determinar las alteraciones de las distintas poblaciones de los

linfocitos T normales residuales en la LLC-B.

3. Relacionar las alteraciones de los linfocitos T con indicadores de

masa tumoral.

4. Relacionar las alteraciones de los linfocitos T con el patrón

inmunofenotípico de la célula leucémica.

5. Relacionar las alteraciones de la inmunidad celular con la

hipogammaglobulinemia presente en la LLC-B.

MATERIAL Y MÉTODOS

66

1. MATERIAL

1.1. Muestra biológica

El material biológico utilizado en este estudio ha sido sangre periférica

de 115 pacientes diagnosticados de LLC-B, desde Octubre de 1996 a Junio de

2001. La extracción se realizó por punción venosa en región antecubital

mediante material desechable. Se extrajeron 2 cc de sangre de cada paciente,

introduciéndola en un tubo que contenía como anticoagulante la sal dipotásica

del ácido etilendiaminotetraacético (K2EDTA), que realiza su acción mediante

un efecto quelante sobre el calcio fijándolo, pero sin llegar a precipitarlo. El

International Council for Standardization in Haematology (ICSH) considera a

este tipo de anticoagulante de elección en hematimetría (Vives y Aguilar, 1997),

en base a las siguientes ventajas:

- Respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria, de manera que

permite una demora de 2 horas en la realización de la extensión

sanguínea después de la extracción.

- Asegura la conservación de las células sanguíneas después de

24 horas si la sangre se mantiene a 4ºC.

- No ejerce ningún efecto de dilución sobre la sangre total al

suministrarse de forma seca.

- Al inhibir la aglutinación de plaquetas, facilita su recuento o su

apreciación semicuantitativa a partir de un estudio morfológico de

la extensión sanguínea.

Finalmente resaltar, que hemos considerado la sangre periférica como la

muestra de elección para la realización del estudio morfológico e inmunológico

en la LLC-B, porque en esta patología siempre existe expresión de células

tumorales en este fluido, así como, por su fácil obtención y procesamiento.

67

1.2. Aparatos

1.2.1. Citómetro de flujo

El citómetro de flujo utilizado ha sido FACScan (Becton Dickinson,

Mountain View, California), modular, analizador de células de 8 parámetros y

automatizado, que permite la realización de análisis con posibilidad de trabajar

con tres colores de fluorescencia.

• Óptica de excitación:

- Láser: de argón, de 15 miliwatios, emisión fijada a 488 nm.

• Óptica de emisión:

- Detectores/filtros: con tres fotomultiplicadores de alta eficacia con

filtros de paso de banda de 530 nm, 585 nm y 650 nm, que permite

trabajar, sin necesidad de cambiar de lentes, con FITC, PE y

complejos de PE.

• Óptica de dispersión:

- Gama de dispersión: la radiación se recoge por ángulos de medio

cono de 1.0 a 10 grados.

- Detector de dispersión directa: detector de silicona en estado sólido

con respuesta espectral de 300 nm a 1.100 nm.

- Detector de dispersión en ángulo de 90º: fotomultiplicador de alta

resolución, utilizando separador de rayo en el tren de emisión óptica.

- Reducción del “ruido de fondo” (background): con barrera de

oscurecimiento y hendidura de 100 µ para minimizar la radiación

innecesaria en el detector.

• Sistema de fluidos (en circuito cerrado de flujo):

- Cubeta de cuarzo: sección cruzada interna rectangular de 430 µ x

180 µ.

- Presión de aire: una bomba de aire interna proporciona una presión

del flujo externo de 45 psig y de la muestra de 4.6 y 5.0 psig.

- Velocidades de flujo: hay seleccionadas tres velocidades de flujo de

la muestra, alta 60 µl/min., media 35 µl/min. y baja 12 µl/min. La

68

diferencia de presión entre la cámara y la muestra es regulada y

monitorizada. La velocidad de las partículas en la cámara de flujo es

de 6m/seg.

- Modos de trabajo: el panel de control proporciona tres modos de

trabajo: run, prime y standby. Cuando está en standby se para el flujo

a través de la cámara.

- Concentración de la muestra: suspensión de células aisladas, en la

gama recomendada de 105 a 2 x 107 partículas/ml.

• Procesado de la señal:

- Resolución de medida: 1.024 canales en cada uno de los

parámetros.

- Modos de señal (amplificadores): cualquier combinación de selección

lineal o logarítmica para cada detector.

- Monitorización de la señal: representación pulsátil, independiente

para cada uno de los 5 parámetros, a través del control de amplitud

de pulsos. Histogramas y gráficas en tiempo real en la pantalla del

monitor.

- Compensaciones para fluorescencia doble: se puede compensar la

coincidencia espectral entre los canales de fluorescencia FL1 y FL2,

y entre FL2 y FL3.

- Sensibilidad de fluorescencia: el límite estimado de detección es

equivalente a 1.000 moléculas de fluoresceína por partícula.

- Resolución de Forward y Side Scatter: la función de dispersión está

optimizada para diferenciar linfocitos, monocitos y neutrófilos.

1.2.2. Contador celular hematológico

El contador celular utilizado ha sido Technicon H3 RTX (Bayer

Diagnóstica, Tarrytown, NJ). Este equipo proporciona un diferencial leucocitario

de 5 poblaciones, tras analizar, por un lado el tamaño y el contenido en

peroxidasa de los leucocitos (canal PEROX) y por otro, la lobularidad

leucocitaria junto con el número de basófilos (canal BASO).

69

Para obtener una información cuantitativa de las 5 poblaciones

leucocitarias, el Technicon H3 se basa en las lecturas obtenidas de dos

cámaras de flujo:

• CÁMARA DE PEROX. Las células provenientes de la cerámica de

muestras son incubadas y teñidas en la cámara de PEROX y

conducidas por una corriente a la cubeta de PEROX, en la que se

encuentran los fotodetectores, que suministrarán el recuento de

leucocitos y su distribución en función de su tamaño y grado de

absorbancia. Se obtiene así, información de 4 poblaciones: neutrófilos,

linfocitos, monocitos y eosinófilos.

• CÁMARA DE BASO. En esta cámara se acidifica el medio, con objeto de

alterar la composición citoplasmática de los leucocitos y posterior

alineamiento por una corriente envolvente. Las células son analizadas

en la cubeta RBC/BASO, en la que se enfrentan a una luz de láser de

helio-neón. Este canal ofrecerá un recuento de leucocitos y otro de

basófilos (no afectos por la manipulación realizada en la cámara).

Así, finalmente se dispone de un diferencial leucocitario de 5

poblaciones con la información obtenida por ambas vías.

1.2.3. Otros aparatos y materiales utilizados

• Microscopio óptico, marca Leitz, modelo Orthoplan.

• Centrífuga refrigerada, marca Izasa, modelo Jouan.

• Centrífuga refrigerada, marca Hettich. Modelo Rotina 35R

• Agitador vibracional, marca Velp Scientifica.

• Micropipetas de diversas marcas: Gilson, Menarini, Nichiryo,

Hirschmann.

• Tubos de polietileno (12 x 75 mm) para preparación de muestra en

citometría de flujo, marca Becton Dickinson, modelo Falcon 2052.

• Portaobjetos de 25 x 75 mm, marca Prestige.

70

• Estufa, marca Heraeus, modelo Function line.

• Material de vidrio diverso.

• Material fungible vario.

1.3. Productos o reactivos

1.3.1. Marcadores inmunológicos

A continuación se detallaran las especificidades y fuentes de los distintos

AcMo utilizados en este estudio.

• CD2

Clon: S5.2, deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos

T activados por cultivo mixto linfocitario.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD2 está compuesto por

cadenas pesadas IgG2a y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reacciona con una glicoproteína transmembrana

de 45 a 50 KDa. Este antígeno es conocido también como LFA-2 y es el

receptor de las rosetas de hematíes de carnero.

Distribución del antígeno: el antígeno CD2 está presente en

aproximadamente el 75% de los linfocitos de sangre periférica normal y

en el 95 a 99 % de los timocitos. Reacciona con prácticamente todos los

linfocitos T y con un subtipo de linfocitos natural killer. Su interacción con

CD58 facilita el reconocimiento antigénico por los linfocitos T.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD3

Clon: SK7 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con timocitos

humanos.

71

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD3 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reacciona con un antígeno linfoide T humano, de

22 a 28 KDa. El epítope reconocido por el anticuerpo CD3 es expresado

en la cadena épsilon del complejo RCT.

Distribución del antígeno: el AcMo CD3 está presente en el 61 a 85% de

los linfocitos de sangre periférica normal, en el 60 a 85% de los timocitos

y en la mayoría de los linfocitos T de los órganos linfoides periféricos.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD5

Clon: L17F12 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1/Ag4

de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con

células de leucemia linfoblástica aguda T humana.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD5 está compuesto por

cadenas pesadas IgG2a y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reacciona con una glicoproteína transmembrana

de 67 KDa expresada en los linfocitos T.

Distribución del antígeno: el antígeno CD5 está presente en

aproximadamente el 70% de los linfocitos de sangre periférica normal y

en todos los linfocitos T del timo y de la sangre periférica, así como, en

una subpoblación de células B normales. Reacciona con la mayoría de

las células en las áreas linfoides T del bazo y nódulos linfáticos, en la

LLC-B y en algunos linfomas/leucemias T.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD4

Clon: SK3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos

T de sangre periférica humana.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD4 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

72

Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 59 KDa presente en los

linfocitos T-helper/inductores y monocitos.

Distribución del antígeno: el antígeno CD4 está presente en los linfocitos

T helper/inductores que representan el 28 a 58% de los linfocitos de

sangre periférica normal y en el 80 a 95% de los timocitos normales.

Está presente en baja densidad en la superficie celular de monocitos y

en el citoplasma de monocitos y macrófagos.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD8

Clon: SK1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos

T de sangre periférica humana.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD8 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 59 KDa presente en la

subunidad alfa de un complejo bimolecular disulfídrico.

Distribución del antígeno: el antígeno CD8 está presente en los linfocitos

T supresores/citotóxicos, así como, en un subtipo de células natural

killer. Es expresado en el 19 a 48% de los linfocitos de sangre periférica

normal y en la mayoría de los timocitos.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD19

Clon: 4G7 deriva de la hibridación de células P3-X63-Ag8.653 de ratón

con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con células de

LLC humanas.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD19 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 90 KDa presente en los

linfocitos B humanos.

73

Distribución del antígeno: el antígeno CD19 está presente en

aproximadamente el 7 a 23% de los linfocitos de sangre periférica

humana normal y en el 60% de los linfocitos esplénicos. Reacciona con

las áreas linfoides B de amígdalas y ganglios linfáticos normales. Se

expresa en todos los estadios de maduración de los linfocitos B pero se

pierde en el proceso de maduración final a célula plasmática.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD22

Clon: S-HCL-1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón CD1, inmunizadas con células

totales y preparaciones de membrana de células de tricoleucemia.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD22 está compuesto por

cadenas pesadas IgG2b y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 135 KDa presente en los

linfocitos B humanos.

Distribución del antígeno: el antígeno CD22 se expresa en el citoplasma

de todos los linfocitos B pero solo está presente en la superficie celular

de los linfocitos B maduros. Este antígeno se detecta en las células

linfoplasmocitoides pero disminuye su expresión en las células

plasmáticas que han completado su proceso de maduración.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD23

Clon: EBVCS-5 deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0

de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con una

línea celular de EBV modificadas en vitro.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD23 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 50 KDa presente en el

proceso de diferenciación de los linfocitos B humanos.

74

Distribución del antígeno: el antígeno CD23 está presente en baja

intensidad en la mayoría de los linfocitos B y en alta intensidad en los

linfocitos B activados, linfoblastos activados por el virus de Epstein-Barr

y en las células de la LLC-B. El antígeno CD23 incrementa su intensidad

de forma transitoria en la superficie de los linfocitos B después de su

activación. Su expresión es inducida por la interleukina-4. Este antígeno

no está presente en los linfocitos B inmaduros de médula ósea ni en los

linfocitos T.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD25

Clon: 2A3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos

T humanos activados con PHA.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD25 está compuesto por

cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce una glicoproteina de 55 KDa que es el

receptor humano de baja intensidad para la interleukina 2.

Distribución del antígeno: el antígeno CD25 está presente en los

linfocitos T, linfocitos B y macrófagos activados.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD45

Clon: 2D1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con células

mononucleadas de sangre periférica humana.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD45 está compuesto por

inmunoglobulinas isotipo IgG1 y cadenas pesadas y ligeras de ratón.

Molécula reconocida: reacciona con las isoformas 180, 190, 205, 220

KDa del antígeno presente en la membrana de los leucocitos humanos.

Distribución del antígeno: el antígeno CD45 está presente en todos los

leucocitos humanos, incluyendo linfocitos, monocitos, eosinófilos,

75

basófilos y polimorfonucleares de sangre periférica, timo, bazo y

progenitores leucocitarios de médula ósea.

Procedencia: Becton Dickinson.

• Anti-Kappa/Anti-Lambda

Clon: el clon Anti-Kappa TB28-2 deriva de la hibridación de células

mielomatosas P3-X63-Ag8.653 de ratón con células CB6

(BC57bxBALB/c) de ratón BALB/c, inmunizadas con proteínas

mielomatosas IgG-k humanas. El clon Anti-Lambda 1-155-2 deriva de la

hibridación de células mielomatosas P3-X63-Ag8.653 de ratón con

células BALB C/J de ratón, inmunizadas con proteínas mielomatosas

IgA1-λ humanas.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo Anti-Kappa está compuesto

por cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón. El AcMo

Anti-Lambda está compuesto por cadenas pesadas IgG1 y cadenas

ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: el AcMo Anti-Kappa es específico para las

cadenas ligeras kappa de las inmunoglobulinas humanas. El AcMo Anti-

Lambda es específico para las cadenas ligeras lambda de las

inmunoglobulinas humanas.

Distribución del antígeno: las cadenas ligeras kappa y lambda de las

inmunoglobulinas se expresan en los linfocitos B normales y en las

células leucémicas.

Procedencia: Becton Dickinson.

• CD11c

Clon: S-HCL-3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de

ratón con células esplénicas de ratón CD1, inmunizadas con células

totales y preparaciones de membrana de tricoleucemia.

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD11c está compuesto por

cadenas pesadas IgG2b y cadenas ligeras kappa de ratón.

76

Molécula reconocida: reconoce un antígeno presente en los

monocitos/macrófagos humanos.

Distribución del antígeno: el antígeno CD11c está presente en monocitos

y en baja intensidad en granulocitos y linfocitos natural killer. También lo

expresan las células de la tricoleucemia y algunas leucemias mieloides

agudas.

Procedencia: Becton Dickinson.

• FMC7

Clon: FMC7

Composición de la cadena de Ig: el AcMo FMC7 está compuesto por IgM

y cadenas ligeras kappa.

Molécula reconocida: reconoce una glicoproteína de 105 KDa presente

en los linfocitos B.

Distribución del antígeno: el antígeno FMC7 está presente en los

linfocitos B de sangre periférica y amígdala. No lo expresan los

granulocitos, monocitos, plaquetas, eritrocitos, linfocitos T ni células NK.

Algunos estudios han demostrado que las células B normales FMC7

positivas son más maduras que las células B FMC7-negativas.

Procedencia: Dako.

• CD79Beta

Clon: SN8

Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD79Beta está compuesto por

IgG1 y cadenas ligeras kappa.

Molécula reconocida: reconoce una glicoproteína de 34-39 kDa presente

en el complejo antígeno-receptor de las células B en asociación física

con las inmunoglobulinas de superficie de las células B maduras.

Distribución del antígeno: el antígeno CD79Beta está presente en las

células B normales y neoplásicas, estando ausente en otros tipos

celulares. Aparece en estadios precoces de la diferenciación B. En la

77

LLC-B su expresión es muy débil o negativa, siendo positiva en las

leucemias prolinfocíticas de estirpe B.

Procedencia: Dako.

• Control de inmunoglobulinas de ratón

Clon: X40 deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0-Ag14

de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con KLH.

Composición de la cadena de Ig: está compuesto por cadenas pesadas

IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.

Molécula reconocida: reconoce de forma específica el antígeno KLH, el

cual no es expresado por células ni líneas celulares humanas.

Procedencia: Becton Dickinson.

1.3.2. Otros productos utilizados

• Solución lisante. Origen: Becton Dickinson, FACS Lysing. La función de

esta solución es romper los hematíes sanguíneos como paso previo a la

realización de inmunofluorescencia directa con AcMo y al análisis por

citometría de flujo.

• Tampón fosfato (PBS).

• Solución de colorante May-Grünwald de eosina-azul de metileno

modificada para microscopia. Procedencia: Merck.

• Solución de colorante Giemsa de azur-eosina azul de metileno en

solución para microscopia. Procedencia: Merck.

• Agua destilada.

2. POBLACIÓN DE ESTUDIO

Este trabajo se realizó en el Servicio de Hematología del Hospital

Clínico-Universitario de Málaga, durante el periodo comprendido entre Octubre

de 1996 a Junio de 2001, siendo la población analizada la correspondiente al

78

distrito sanitario de éste Hospital y el grupo de estudio 115 pacientes

diagnosticados de LLC-B.

En los casos remitidos desde los hospitales de referencia (Hospital

Costa del Sol de Marbella y Hospital de la Serranía de Ronda), en nuestro

servicio se realizó la confirmación diagnóstica por análisis inmunofenotípico por

citometría de flujo, completándose el resto del estudio y el seguimiento en los

hospitales de procedencia.

El grupo control estaba compuesto por 121 individuos, procedentes en

su mayoría de donantes de sangre voluntarios y un grupo minoritario de sujetos

en los que se realizó análisis de rutina y que carecían de patología del sistema

inmunitario.

2.1. Criterios de inclusión

A. Población leucémica

• Edad superior a 14 años.

• Cumplir los criterios diagnósticos establecidos por el National Cancer

Institute-Sponsored Working Group en 1996 :

- Cifra de linfocitos en sangre periférica mayor de 5 x 109/L.

Desde el punto de vista morfológico, estos linfocitos deben ser

de aspecto maduro, aunque se admite que pueden aparecer

células grandes o atípicas, linfocitos hendidos y prolinfocitos.

El porcentaje de prolinfocitos debe ser inferior al 55% o menos

de 15 x 109/L.

- Inmunofenotipo en sangre periférica característico de LLC-B.

Los datos fenotípicos necesarios para establecer el

diagnóstico de LLC-B incluyen: expresión en la población

predominante de marcadores de células B con positividad para

el AcMo CD5 y ausencia de otros antígenos de células T.

79

Demostración de la clonalidad sobre la base de la expresión

de cadenas ligeras kappa o lambda de baja intensidad.

• Desde el punto de vista inmunofenotípico, solo se han incluido casos de

LLC-B positivas para el antígeno CD5, siguiendo las recomendaciones

para la realización de ensayos clínicos establecidas por el National

Cancer Institute-Sponsored Working Group, 1988.

• Las células leucémicas deben representar más del 50% de la población

linfoide (Moreau y cols, 1997; Newman y cols, 1993).

• Alcanzar un valor de 4 – 5 en el sistema de puntuación establecido por

la Dra. Matutes para el diagnóstico diferencial de LLC-B con otros SLPC

con expresión hemoperiférica (Matutes y cols, 1994; Moreau y cols,

1997), en el cual se incluyen cinco AcMo con los siguientes valores:

Puntuación

Marcador 1 punto O puntos

IgS Expresión débil moderada/intensa

CD5 positivo negativo

CD23 positivo negativo

FMC7 negativo positivo

CD22/CD79Beta débil/negativo moderada/intensa

IgS: Inmunoglobulinas de superficie

En aquellos casos en que la puntuación obtenida sea inferior a 4 es

necesario, para ser incluido en el estudio, tener una morfología típica de

LLC-B y la realización de una biopsia ganglionar para confirmar el

diagnóstico.

80

B. Grupo control:

• Edad superior a 14 años.

• Recuentos hemoperiféricos normales, incluyendo: cifras de hemoglobina,

plaquetas, leucocitos y contaje diferencial.

• Ausencia de hepatopatía, nefropatía o procesos cancerígenos actuales o

pasados (aún estando en remisión completa), siguiendo las

recomendaciones del International Federation of Clinical Chemistry (IFCC,

1987).

2.2. Criterios de exclusión

• Serán excluidos del análisis de las subpoblaciones linfocitarias T en los

enfermos leucémicos, así como, en el grupo control, los sujetos que

presenten enfermedad de etiología autoinmune, infecciones víricas agudas

o crónicas y vacunaciones recientes.

• Serán excluidos del análisis de las subpoblaciones linfocitarias T en los

enfermos leucémicos, aquellos que hayan recibido tratamiento

quimioterápico o inmunosupresor en los 3 meses previos al estudio.

3. MÉTODOS

3.1. Variables determinadas

3.1.1. Variables somáticas y clínicas

• Edad: cuantificada en años, en el momento del diagnóstico.

• Sexo.

• Antecedentes personales: incidiendo en patologías de etiología

autoinmune y procesos infecciosos.

• Motivo de consulta: indicando la causa por la cual el paciente es

derivado por primera vez a las consultas externas de hematología.

81

• Adenopatías: número de territorios afectos detectados por palpación

exploratoria o por técnicas de imagen, en el momento del diagnóstico.

• Visceromegalias: detección de hepatoesplenomegalia por palpación

abdominal o por técnicas de imagen, en el momento del diagnóstico.

• Tratamiento: en caso de haber recibido tratamiento, se determinará el

tipo de esquema terapéutico administrado y el tiempo, en meses, desde

que se administró la última dosis.

3.1.2. Variables bioquímicas

• Función renal: como parámetros se han incluido los metabolitos urea y

creatinina. Estos parámetros serán considerados patológicos si su valor

es superior a 1.26 veces el valor límite máximo de la normalidad,

siguiendo los criterios establecidos por la OMS.

• Función hepática: se han determinado las enzimas hepáticas aspartato-

amino-transferasa (GOT), alanil-amino-transferasa (GPT), gamma-

glutamil-transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina. Estos parámetros

serán considerados patológicos si su valor es superior a 1.26 veces el

valor límite máximo de la normalidad, siguiendo los criterios establecidos

por la OMS.

• Láctico deshidrogenasa (LDH), determinada en el momento del

diagnóstico.

3.1.3. Variables inmunológicas

• Dosificación de las inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA. La determinación se

realizará en el momento del diagnóstico y durante todo el curso evolutivo

de la enfermedad.

• Proteinograma electroforético con detección de componente monoclonal.

La determinación se realizará en el momento del diagnóstico y durante

todo el curso evolutivo de la enfermedad.

82

• Test de Coombs directo. La determinación se realizará en el momento

del diagnóstico y durante todo el curso evolutivo de la enfermedad.

• β2-microglobulina. El valor de este parámetro se ajustará a la función

renal. En caso de insuficiencia renal los valores se determinarán según

el aclaración de creatinina. La determinación se realizará en el momento

del diagnóstico.

3.1.4. Variables hematológicas

• Como variables hematimétricas se han determinado las cifras de

leucocitos, linfocitos, hemoglobina y plaquetas.

• Tiempo de duplicación linfocitaria: tiempo en el que se produce la

duplicación numérica en el recuento de linfocitos de sangre periférica,

cuantificado en meses.

3.1.5. Variables morfológicas

Siguiendo las indicaciones del Grupo Cooperativo FAB (Franco-Americano-

Británico), se distinguen tres variedades morfológicas de LLC (Bennett y cols,

1989):

• Forma típica, constituida por linfocitos con citoplasma visible pero

escaso, homogéneo y débilmente basófilo, sin gránulos. La cromatina

nuclear es característicamente densa y cuarteada. El núcleo y

citoplasma tienen un contorno regular, aunque en algunos casos se

puede observar irregularidades nucleares con indentaciones. El nucléolo

no es visible mediante microscopia óptica. Deben tener menos del 10%

de linfocitos atípicos.

• Forma mixta tipo LLC/PL, con un porcentaje de prolinfocitos

comprendido entre el 11% y el 54%.

• Forma mixta, con linfocitos de tamaño diverso, grandes y pequeños,

pero con menos de un 10% de prolinfocitos.

83

En aquellos casos en los que el estudio citológico de sangre periférica no

mostrase una morfología típica, será necesario alcanzar un valor de 4-5 en el

sistema de puntuación establecido por Matutes y cols.

3.1.6. Variables inmunofenotípicas

Se ha realizado un estudio amplio de las características antigénicas de

las células linfoides T y B, con el objetivo de establecer una definición correcta

y precisa de la población tumoral y de los linfocitos residuales normales, así

como, de las distintas subpoblaciones celulares presentes en sangre periférica.

A continuación se detallarán las variables fenotípicas estudiadas para

cada población celular. Los valores absolutos (v. abs.) se han calculado como

el producto del recuento de linfocitos obtenidos de un contador celular

hematológico automático (Technicon H·3) y el porcentaje de los distintos

subtipos linfocitarios obtenidos por citometría de flujo (Hulstaert y cols, 1994).

La intensidad de expresión de cada antígeno se ha cuantificado como

intensidad de fluorescencia media (MFI) y en escala logarítmica de

fluorescencia (ELF). El patrón de dispersión del antígeno se ha determinado

como coeficiente de variación (CV) y en escala logarítmica (homogéneo-

heterogéneo). Estos términos serán definidos posteriormente en el apartado

3.3.5.

A. Linfocitos B

• CD19+ (%). Esta variable determina el porcentaje de células CD19

positivas totales, cuantificadas sobre la población linfoide.

• CD19+ (v. abs.). Esta variable indica el valor absoluto de células CD19

positivas.

• CD19+/CD5– (%). Porcentaje de células que son CD19 positivas y CD5

negativas, contabilizadas sobre la población linfoide.

84

• CD19+/CD5– (v. abs.). Valor absoluto de células que son CD19

positivas y CD5 negativas.

• CD19+/CD5+ (%). Porcentaje de células que son positivas para los

AcMo CD19 y CD5, contabilizadas sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/CD5+ (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para

el CD19 y CD5.

• CD19+/CD5+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD5

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

Débil: 1-70. Moderada: 71-130. Fuerte: > 130.

• CD19+/CD5+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD5

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/CD5+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD5 positivas.

• CD19+/CD5+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD5,

cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

Homogéneo: 1-80. Heterogéneo: >80.

• CD19+/CD22+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el CD22.

• CD19+/CD22+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD22

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

Débil: 1-28. Moderado: 29-58. Fuerte: > 58.

• CD19+/CD22+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD22

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/CD22+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD22 positivas.

85

• CD19+/CD22+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD22,

cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

Homogéneo: 1-45. Heterogéneo: >45.

• CD19+/FMC7+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el AcMo FMC7.

• CD19+/FMC7+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno FMC7

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

Débil: 1-35. Moderado: 36-75. Fuerte: >75.

• CD19+/FMC7+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno FMC7

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/FMC7+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células FMC7 positivas.

• CD19+/FMC7+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno FMC7,

cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

Homogéneo: 1-65. Heterogéneo: >65.

• CD19+/CD23+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el CD23.

• CD19+/CD23+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD23

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

Débil: 1-70. Moderado: 71-135. Fuerte: >135.

• CD19+/CD23+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD23

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/CD23+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD23 positivas.

• CD19+/CD23+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD23,

cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

86

Homogéneo: 1-75. Heterogéneo: >75.

• CD19+/CD11c+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el CD11c.

• CD19+/CD11c+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD11c

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

Débil: 1-60. Moderado: 61-170. Fuerte: >170.

• CD19+/CD11c+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD11c

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19

positivas.

• CD19+/CD11c+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD11c positivas.

• CD19+/CD11c+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD11c,

cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

Homogéneo: 1-70. Heterogéneo: >70.

• CD19+/CD79beta+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el CD79beta.

• CD19+/CD79beta+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno

CD79beta determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células

CD19 positivas.

Débil: 1-80. Moderado: 81-120. Fuerte: >120.

• CD19+/CD79beta+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno

CD79beta determinada como ELF, contabilizada sobre el área de

células CD19 positivas.

• CD19+/CD79beta+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina

el patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD79beta positivas.

• CD19+/CD79beta+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno

CD79beta, cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.

Homogéneo: 1-52. Heterogéneo: >52.

87

• CD19+/kappa-lambda+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan la cadena ligera de superficie kappa o lambda.

• CD19+/kappa-lambda+ (MFI). Intensidad de expresión de las cadenas

ligeras kappa o lambda determinada como MFI, contabilizadas sobre el

área de células CD19 positivas.

Débil: 1-85. Moderada: 86-110. Fuerte: >110.

• CD19+/kappa-lambda+ (ELF). Intensidad de expresión de las cadenas

ligeras de superficie kappa o lambda determinadas como ELF,

contabilizada sobre el área de células CD19 positivas.

• CD19+/kappa-lambda+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que

determina el patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo

en escala logarítmica, de las cadenas ligeras kappa o lambda.

• CD19+/kappa-lambda+ (CV). Coeficiente de variación para las cadenas

ligeras kappa o lambda, cuantificadas sobre el área de células CD19

positivas.

Homogéneo: 1-70. Heterogéneo: >70.

• CD19+/CD25+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que

coexpresan el CD25.

• CD19+/CD10+. Porcentaje de células CD19 positivas que coexpresan el

CD10.

• CD19+/CD2+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que coexpresan

el CD2.

• Escore. Sistema de puntuación establecido por Matutes y cols. (1994,

1997), basado en la expresión de los AcMo previamente analizados:

CD5, CD23, FMC7, CD22/CD79beta, cadenas ligeras kappa/lambda.

B. Linfocitos T

• CD3+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas, contabilizadas sobre el

área de linfocitos.

• CD3+ (v. abs.). Valor absoluto de células CD3 positivas.

88

• CD5+/CD19– (%). Porcentaje de células que expresan positividad para

el AcMo CD5 con negatividad para el CD19, contabilizadas sobre el área

de linfocitos.

• CD5+/CD19– (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para

el AcMo CD5 y negativas para el CD19.

• CD5+/CD19− (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD5

determinada como MFI, contabilizada sobre el área de linfocitos.

Débil: 1-70. Moderada: 71-130. Fuerte: >130.

• CD5+/CD19– (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD5

determinada como ELF, contabilizada sobre el área de linfocitos.

• CD5+/CD19– (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el

patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala

logarítmica, de las células CD5 positivas y CD19 negativas.

• CD5+/CD19– (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD5,

cuantificado sobre el área de linfocitos.

Homogéneo: 1-80. Heterogéneo: >80.

• Control de calidad interno. Esta variable compara los porcentajes de

linfocitos T obtenidos en dos tubos distintos y con AcMo dirigidos contra

diferentes antígenos T: (CD3+) − (CD5+/CD19–).

• CD2+/CD19– (%). Porcentaje de células que presentan positividad para

el AcMo CD2 con negatividad para el CD19, contabilizadas sobre el área

de linfocitos.

• CD2+/CD19– (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para

el AcMo CD2 y negativas para el CD19.

C. Subpoblaciones linfocitarias

• CD3+/CD4+/CD8– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el AcMo

CD4 y negativos para el CD8, contabilizados sobre el área de células

CD3 positivas.

• CD3+/CD4+/CD8– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los

AcMo CD3 y CD4 con negatividad para el CD8.

89

• CD3+/CD8F+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el

AcMo CD8 con ELF fuerte y negativos para el CD4, contabilizados sobre

el área de células CD3 positivas.

• CD3+/CD8F+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los

AcMo CD3 y CD8 con ELF fuerte y negativas para el CD4.

• CD3+/CD8M-D+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el

AcMo CD8 con ELF moderado-débil y negativos para el CD4,

contabilizados sobre el área de células CD3 positivas.

• CD3+/CD8M-D+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para

los AcMo CD3 y CD8 con ELF moderado-débil, y negativas para CD4.

• CD3+/CD8T+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el

AcMo CD8 (cifras totales, que incluye las distintas intensidades de

expresión del antígeno) y negativos para el CD4, contabilizados sobre el

área de células CD3 positivas.

• CD3+/CD8T+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los

AcMo CD3 y CD8 (totales) y negativas para CD4.

• Cociente CD4/CD8F. Esta variable se obtiene de dividir el porcentaje de

células CD4 positivas entre las células CD8 positivas con ELF fuerte.

• Cociente CD4/CD8T. Esta variable se obtiene de dividir el porcentaje de

células CD4 positivas entre las células CD8 positivas totales (incluyendo

las distintas intensidades de expresión del antígeno).

• CD3+/CD4+/CD8F+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que

coexpresan CD4 y CD8 (con ELF fuerte).

• CD3+/CD4+/CD8F+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan

CD3, CD4 y CD8 (con ELF fuerte).

• CD3+/CD4+/CD8M-D+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que

coexpresan CD4 y CD8 (con ELF moderado-débil).

• CD3+/CD4+/CD8M-D+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan

CD3, CD4 y CD8 (con ELF moderado-débil).

• CD3+/CD4+/CD8T+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que

coexpresan CD4 y CD8 (cifras totales, que incluye las distintas

intensidades de expresión del antígeno).

90

• CD3+/CD4+/CD8T+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan

CD3, CD4 y CD8 (cifras totales, que incluye las distintas intensidades de

expresión del antígeno).

• CD3+/CD4–/CD8– (%). Porcentaje de células CD3 positivas que no

expresan los antígenos CD4 ni CD8.

• CD3+/CD4–/CD8– (v abs). Valor absoluto de células que son positivas

para el AcMo CD3 pero negativas para CD4 y CD8.

3.1.7. Factores pronósticos

Como variables pronósticas determinantes de la masa tumoral se han

determinado los siguientes parámetros (Bosch, 2002; Vallespi y cols, 1999):

• Estadios clínicos de RAI.

• Estadios clínicos de Binet.

• Cifra de linfocitos en sangre periférica. Estratificando los pacientes en

dos grupos según los valores de linfocitos en sangre periférica al

diagnóstico fuesen > o < de 30x109/L.

• Tiempo de duplicación linfocitaria. Estableciendo dos grupos en

función del tiempo en el que se produce la duplicación numérica en el

recuento de linfocitos en sangre periférica, fuese > o < de 12 meses.

• Cifras de beta-2-microglobulina.

• Cifras de LDH.

• Valores de células CD19+ en sangre periférica. Se estratifico la

población en función del valor porcentual (células CD19+ > o < del

80% de los linfocitos circulantes) y del valor absoluto (células CD19+

> o < de 20x109/L).

3.2. Obtención y preparación de la muestra

Como se ha descrito previamente la muestra utilizada en este estudio ha

sido sangre periférica. La extracción se realizó por punción venosa en región

91

antecubital. Se extrajeron 2 cc de sangre de cada paciente, introduciéndola en

un tubo que contenía como anticoagulante K2EDTA.

3.2.1. Análisis por citometría de flujo

Describimos a continuación las dos técnicas empleadas en la

preparación de la muestra para el análisis por citometría de flujo, según el

método seguido por el grupo de Orfao (Ciudad y cols, 1998).

A. Técnica de inmunofluorescencia directa para la determinación de

antígenos de superficie en sangre periférica

• El primer paso a realizar es un contaje diferencial de las células de sangre

periférica, en un contador celular hematológico automático (Technicon H3

RTX).

• Se ajustará la cantidad de muestra utilizada en función de las cifras de

leucocitos hemoperiféricos:

- 50 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 10 y 15x109/L

- 100 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 4 y 10x109/L

• Añadir el AcMo correspondiente:

- Identificar los tubos con las iniciales del nombre y los apellidos del

paciente (para evitar errores en caso de varios estudios simultáneos),

así como, los AcMo utilizados.

- El orden de los AcMo señalizados en el tubo será: en primer lugar el

marcado con el fluorocromo FITC, en segundo lugar el marcado con

PE y por último el tercer color.

- La cantidad de AcMo es de 10 µl independientemente de la casa

comercial utilizada.

- Al añadir el AcMo, llegar con la pipeta hasta la muestra y agitar bien.

Si estamos trabajando con una batería de tubos, tener la precaución

de cambiar de pipeta cada vez que cambiemos de AcMo.

• Incubar a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 minutos.

92

• Añadir la solución lisante, FACS Lysing, diluida con agua destilada a razón

de 1/10:

- 2 ml si la cantidad de muestra de sangre periférica que hemos

utilizado ha sido de 50 µl

- 4 ml si la cantidad de muestra que hemos utilizado ha sido de 100 µl.

• Agitar bien con una pipeta Pasteur cada tubo.

• Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.

• Centrifugar 5 minutos a 2000 r.p.m.

• Desechar el sobrenadante y lavar con 4 ml de PBS, centrifugando a 2000

r.p.m. durante 5 minutos.

• Desechar el sobrenadante y reconstituir con 200 µl de PBS.

• Adquirir la muestra en el citómetro en las próximas 3 horas; en caso de

tardar en la lectura, mantener a temperatura ambiente y en oscuridad.

B. Técnica de inmunofluorescencia directa para la determinación de

antígenos y cadenas ligeras de inmunoglobulinas kappa/lambda de

superficie

• En primer lugar se realiza un contaje diferencial de las células de sangre

periférica en un contador celular hematológico automático (Technicon H3

RTX).

• Se ajustará la cantidad de muestra utilizada en función de las cifras de

leucocitos hemoperiféricos:

- 100 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 10 y 15x109/L

- 200 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 4 y 10 x109/L

• Realizar dos lavados con PBS; para ello llenar el tubo de PBS y centrifugar

a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y decantar.

• Añadir 2 ml de PBS a cada tubo e incubar a 37º C en baño maría durante

30 minutos (teniendo la precaución de tapar el tubo).

• Centrifugar durante 5 minutos a 2000 r.p.m. y decantar (desechar todo el

sobrenadante).

• Realizar un lavado con PBS, para ello llenar el tubo de PBS y centrifugar a

2000 r.p.m. durante 5 minutos y decantar.

93

• Añadir el AcMo correspondiente:

- Identificar los tubos con las iniciales del nombre y los apellidos del

paciente (para evitar errores en caso de varios estudios simultáneos),

así como, los AcMo utilizados.

- El orden de los AcMo señalizados en el tubo será: en primer lugar el

marcado con el fluorocromo FITC, en segundo lugar el marcado con

PE y por último el tercer color.

- La cantidad de AcMo varía según el marcador: cadenas ligeras

kappa/lambda (Becton Dickinson): 5 µl; CD19 (Becton Dickinson):

10 µl.

- Al añadir el AcMo llegar con la pipeta hasta la muestra y agitar bien.

Si estamos trabajando con una batería de tubos, tener la precaución

de cambiar de pipeta cada vez que cambiemos de AcMo.

• Incubar la muestra 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.

• Añadir la solución lisante, FACS Lysing, diluida con agua destilada a razón

de 1/10:

- 2 ml si la cantidad de muestra de sangre periférica que hemos

utilizado ha sido de 100 µl.

- 4 ml si la cantidad de muestra que hemos utilizado ha sido de 200 µl.

• Agitar bien con una pipeta Pasteur cada tubo.

• Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.

• Centrifugar 5 minutos a 2000 r.p.m.

• Desechar el sobrenadante y lavar con 4 ml de PBS, centrifugando a 2000

r.p.m. durante 5 minutos.

• Desechar el sobrenadante y reconstituir con 200 µl de PBS.

• Adquirir la muestra en el citómetro en las próximas 3 horas; en caso de

tardar en la lectura mantener a temperatura ambiente y en oscuridad.

3.2.2. Análisis por microscopia óptica

El estudio morfológico se ha llevado acabo en extensión de sangre

periférica realizada mediante técnica manual, utilizando el método de los dos

94

portaobjetos. Este es el procedimiento de elección en la práctica clínica y

consiste en extender una gota fina de sangre sobre un portaobjetos (25 x 75

mm) mediante el canto esmerilado de otro portaobjetos de iguales

dimensiones. Para ello se recomienda seguir el método siguiente:

• Colocar una pequeña gota de sangre (aproximadamente 5 µL) de no más

de 3 mm de diámetro, sobre la superficie de un portaobjetos a 2 cm

aproximadamente de uno de sus extremos.

• Colocar el canto de otro portaobjetos esmerilado por la zona anterior a la

gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjetos, formando un

ángulo de aproximadamente 45º, y desplazarlo suavemente hacia atrás

hasta que alcance la gota de sangre.

• Esperar a que por capilaridad toda la sangre se distribuya de manera

uniforme. Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del

portaobjetos sobre el que se realizará la extensión.

• Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro

en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida

sobre la superficie del primer portaobjetos.

• Secado de la extensión a temperatura ambiente y en posición horizontal.

3.3. Técnicas de inmunofenotipaje celular para análisis en citómetro de

flujo

3.3.1. Control de calidad

Se ha realizado un control de calidad, tanto en la fase preanalítica como

en la analítica, estableciendo unos criterios claros y estrictos con el fin de

garantizar la fiabilidad de los resultados.

95

A. Fase preanalítica

• Solicitud de las pruebas. La petición para la realización de un estudio de

citometría de flujo se realiza en un formato que incluye: datos de filiación

(nombre y apellidos, edad, teléfono), número de historia clínica, hospital de

procedencia, servicio y médico peticionario, diagnóstico de sospecha

clínico, valores hemoperiféricos de hemoglobina, leucocitos y plaquetas y

origen de la muestra (sangre periférica, médula ósea, etc.).

• Obtención de la muestra. Se extrajeron 2 cc de sangre por punción venosa

en región antecubital, siguiendo la técnica estandarizada por el National

Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1984), y se introducirá

en un tubo que contenga como anticoagulante EDTA, siguiendo las

recomendaciones del International Council for Standardization in

Haematology (ICSH, 1993).

• Identificación de las muestras. Para la aceptación de una muestra en la

Unidad de Citometría de Flujo, esta debe estar correctamente identificada

incluyendo la rotulación del nombre y apellidos en el tubo junto con el

número de clave asignado en el laboratorio. La extracción e identificación

de la muestra se realizará en la unidad de citometría de flujo, no en sala

general de extracciones, y por el personal que posteriormente realizará la

técnica de inmunofenotipaje.

• Almacenamiento de la muestra. Las muestras que no son procesadas

inmediatamente deben ser almacenadas a temperatura ambiente y tratadas

en las primeras 24 horas.

• Medio de transporte. En caso de muestras derivadas de otros hospitales el

trasporte se realizará a temperatura ambiente.

B. Fase analítica

• Patrones de calidad de los reactivos. Los fluorocromos utilizados en CMF

deben presentar las siguientes características:

96

- Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación

(probabilidad de absorber la luz).

- Alto rendimiento cuántico (emisión de luz).

- Elevada fotoestabilidad.

- Corto estado de excitación.

• Sistema de calibración. La calibración es el proceso por el cual se enfoca

ópticamente el láser y se mide su potencia. Como sistema de calibración se

ha utilizado el método seguido por el grupo de Orfao (Cuidad y cols, 1998),

utilizando sangre periférica para ajustar la autofluorescencia natural de las

células sanguíneas. A continuación se describe la técnica de calibración

utilizada para el citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson):

1. En primer lugar se describen los tubos, con los AcMo y

fluorocromos, necesarios para la realización del proceso:

- Control isotípico negativo con inmunoglobulinas de ratón: FITC /

PE / PerCP.

- CD22 FITC/CD8 PE

- CD8 PE

- CD8 PerCP

- CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP

- CD22 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP

2. En el sistema informático seleccionamos el programa Cell Quest.

3. Se crean cuatro histogramas que serán útiles en los siguientes

pasos de la técnica:

- Eje de X= FSC, eje de Y= SSC.

- Eje de X= FSC.

- Eje de X= FL1-H, eje de Y= FL2-H.

- Eje de X= FL2-H, eje de Y= FL3-H.

4. Abrir en Inst-control los detectores, parámetros amplificadores,

umbral (threshold) y compensación:

97

- Detectores (voltaje): fijar los diferentes parámetros en su valor

mínimo (150).

- Parámetros amplificadores (Amp Gain): comprobar que los

parámetros FL1, FL2 y FL3 están en escala logarítmica y el resto

en escala lineal. Fijar los diferentes parámetros en su valor

mínimo (1).

- Umbral (Threshold): Seleccionar el parámetro FSC y dar un valor

cercano a 50.

- Compensación: Dejar todos los valores al mínimo (0).

5. Adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta, un tubo

de sangre lisada sin marcadores de superficie.

6. En el histograma de FSC al principio la imagen sale pegada al eje de

las Y, aumentar su señal en su correspondiente parámetro

amplificador (amp gain) hasta obtener una imagen correcta.

7. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a SSC.

Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la

imagen correcta.

8. Establecer una región en el área de linfocitos.

9. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL1-H.

Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la

imagen correcta.

10. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL2-H.

Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la

imagen correcta.

11. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL3-H.

Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la

imagen correcta.

12. Debemos comprobar que el ajuste realizado para las áreas

negativas de las fluorescencias FL1-H, FL2-H y FL3-H es

adecuado. Para ello, hay que hacer un estudio estadístico en el

sistema informático del CMF, y comprobar que las áreas negativas

98

tienen unas medias de fluorescencia entre dos y tres, en caso

contrario hay que ajustar la señal.

13. Cerrar las ventanas de los detectores, parámetros amplificadores y

umbral, dejando abierta sólo la ventana señalada como

compensación.

14. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL1-H, eje de Y=

FL2-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta

el tubo CD22 FITC / CD8 PE; en este proceso se elimina del

detector de fluorescencia FL1-H la señal correspondiente a FL2-H

cuya luz no debe recogerse ni leerse en ese detector y viceversa,

se elimina de FL2-H la señal de fluorescencia de FL1-H.

15. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL2-H, eje de Y=

FL3-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta

el tubo CD8 PE; en este proceso se elimina del detector de

fluorescencia FL3-H la señal correspondiente a FL2-H cuya luz no

debe recogerse ni leerse en ese detector.

16. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL2-H, eje de Y=

FL3-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta

el tubo CD8 PerCP; en este proceso se elimina del detector de

fluorescencia FL2-H la señal correspondiente a FL3-H cuya luz no

debe recogerse ni leerse en ese detector.

17. Seleccionar los histogramas:

- Eje de X= FL1-H, eje de Y= FL2-H.

- Eje de X= FL2-H, eje de Y= FL3-H.

- Adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta los

tubos CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP y CD22 FITC / CD8 PE /

CD4 PerCP, para comprobar que las compensaciones son

correctas.

- Guardar los valores para utilizarlos en posteriores adquisiciones

de estudios de citometría de flujo.

99

• Control de calidad interno. El control de calidad se ha realizado mediante la

utilización de especímenes de control y el empleo de un sistema que nos

permita establecer la exactitud de la técnica:

- Especímenes de control.

� Control negativo. Se ha utilizado el control isotípico negativo

con inmunoglobulinas de ratón en los fluorocromos FITC, PE y

PerCP (Becton Dickinson, Mountain View, California).

� Control positivo. Como control positivo se ha utilizado el tubo

CD3-FITC / CD8-PE / CD4-PerCP, ya que en todas las

muestras de los pacientes con LLC-B debe existir una

población residual de linfocitos T y dentro de ellos las

subpoblaciones CD4+ y CD8+.

- Control de exactitud. Como control interno de medida de exactitud se ha

utilizado la población residual de linfocitos T presentes en la sangre

periférica de los pacientes con LLC-B. Para ello se ha calculado la

diferencia entre dos marcadores que miden la misma población de

linfocitos T, incluidos en dos tubos diferentes (tubo 1: CD5-FITC / CD19-

PE y tubo 2 CD3-FITC / CD8-PE / CD4-PerCP), de forma que

(CD5+/CD19 -) – (CD3+) = ± 5%

3.3.2. Metodología seguida: combinaciones de anticuerpos monoclonales y fluorocromos

A continuación se describen los distintos AcMo utilizados para la

realización del inmunofenotipaje celular por CMF:

Número de CD AcMo Procedencia

CD2 S5.2 Becton Dickinson

CD3 SK7 Becton Dickinson

CD4 SK3 Becton Dickinson

CD5 L17F12 Becton Dickinson

CD8 SK1 Becton Dickinson

100

Número de CD AcMo Procedencia

CD10 W8E7 Becton Dickinson

CD11c S-HCL-3 Becton Dickinson

CD19 4G7 Becton Dickinson

CD20 L27 Becton Dickinson

CD22 S-HCL-1 Becton Dickinson

CD23 EBVCS-5 Becton Dickinson

CD25 2A3 Becton Dickinson

CD45 2D1 Becton Dickinson

CD79beta SN8 Dako

CD103 Ber-ACT8 Dako

Anti-kappa TB28-2 Becton Dickinson

Anti-lambda 1-155-2 Becton Dickinson

No-CD FMC7 Dako

Control Ig de ratón X40 Becton Dickinson

La sistemática utilizada para el análisis de la expresión antigénica en la

superficie celular fue la aplicación de triple marcaje. Los AcMo conjugados con

los fluorocromos FITC, PE y PerCP, se combinaron para obtener una buena

discriminación de la población tumoral, para ello, el AcMo CD19 se incluyó

sistemáticamente en todos los tubos. Así mismo, en todos los casos se utilizó

un control isotípico negativo (AcMo contra antígenos de ratón no expresado por

células humanas) y un control positivo formado por CD4 / CD8 / CD4.

A continuación describimos las combinaciones de los AcMo y

fluorocromos utilizados en los distintos tubos:

1. Control negativo de la técnica de inmunofluorescencia directa

para la determinación de antígenos de superficie.

2. CD5 FITC / CD19 PE / CD45 PerCP

3. CD22 FITC / CD23 PE / CD19 PerCP

4. FMC7 FITC / CD11c PE / CD19 PerCP

5. CD79Beta FITC / CD19 PE / CD45 PerCP

6. CD2 FITC / CD19 PE / CD45 PerCP

101

7. CD25-FITC / CD19-PE / CD45 PerCP

8. CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP

9. Control negativo de la técnica de inmunofluorescencia directa

para la determinación de cadenas ligeras de inmunoglobulinas

Kappa/Lambda.

10. Anti-Kappa FITC / Anti-Lambda-PE / CD19 PerCP

En aquellos casos que el análisis inmunofenotípico ofrezca dudas

diagnósticas, se ampliará el panel de AcMo añadiendo los siguientes tubos:

11. CD10 FITC / CD19 / CD20 PerCP

12. CD103 FITC / CD19 PE / CD20 PerCP

Debido a que el origen tumoral de la proliferación linfocitaria viene

determinada por la expresión de una única cadena ligera de inmunoglobulina

(kappa o lambda) en la superficie celular y a las implicaciones diagnósticas que

ello conlleva, se ha utilizado un reactivo que contiene ambas cadenas ligeras,

conjugadas con distintos fluorocromos, en su composición, evitando errores

técnicos que llevarían a un diagnóstico incorrecto.

3.3.3. Proceso de adquisición de la muestra

El proceso de adquisición de la muestra consiste en hacer pasar las

células alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. Para ello,

se utiliza un sistema de inyección mediante el cual las células a analizar son

introducidas en el centro de un flujo de líquido isotónico que es impulsado a

gran velocidad a salir por un orificio estrecho. La diferencia de presión existente

entre la parte central del flujo (muestra a analizar) y la porción periférica del

mismo (líquido isotónico) es regulada por el operador. La interacción de las

células con el rayo luminoso genera señales que se llevan a los detectores

adecuados. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos

102

eléctricos, que se amplifican y se convierten en señales digitales que se

procesan en un ordenador.

La adquisición se realizó en un citómetro de flujo FACScan (Becton

Dickinson) y el programa utilizado fue CellQuest (Becton Dickinson). La

sistemática aplicada en este proceso fue la siguiente:

• Selección de una velocidad de adquisición alta.

• Conexión del programa informático con el citómetro de flujo.

• Abrir la plantilla de adquisición previamente elaborada que incluye los

siguientes histogramas:

- Eje de X=FSC-H, eje de Y= SSC-H.

- Eje de X= FL1-H, eje de Y= SSC-H.

- Eje de X= FL2-H, eje de Y= SSC-H.

- Eje de X= FL3-H, eje de Y= SSC-H.

- Eje de X= FL1, eje de Y= FL2-H-H.

- Eje de X= FL1, eje de Y= FL3-H.

- Eje de X= FL2, eje de Y= FL3-H.

• Introducir los parámetros de la calibración.

• Elegir el lugar donde se almacenará la información.

• Identificar la muestra que se va a adquirir (número de estudio e iniciales

del nombre y apellidos del paciente).

• Seleccionar el panel previamente elaborado para el estudio de los

SLPC.

• El proceso de adquisición de la muestra se realiza en dos pasos:

- Se adquieren 10.000 células correspondientes a la población total.

- Seleccionar la población CD19+, para lo cual, se establece una

ventana para las células CD19+ en el histograma X: CD19, Y: SSC, y

se adquirieren 10.000 eventos. En el tubo CD3-FITC / CD8-PE /

CD4- PerCP la ventana se realiza en las células CD3+ del

histograma X: CD3, Y: SSC, se adquieren, así mismo, 10.000

eventos.

103

Al finalizar el proceso de adquisición la información está almacenada

en el sistema informático, donde posteriormente podrá ser analizada.

3.3.4. Análisis de los datos

El análisis de los datos se realizó con el programa Paint-A-Gate Pro

(Becton Dickinson), incluyendo la opción de transformación polinomial de los

valores del SSC, que permite una mejor definición de las células leucémicas de

acuerdo con las propiedades de dispersión de la luz de estas.

El análisis multiparamétrico se basó en la combinación de parámetros

que permitieran la identificación de las células blásticas y de los linfocitos B y T

normales residuales; para ello se establecieron los siguientes histogramas:

1. Eje de X=FSC-H, eje de Y= SSC-H.

2. Eje de X= FL1-H, eje de Y= SSC-H.

3. Eje de X= FL2-H, eje de Y= SSC-H.

4. Eje de X= FL3-H, eje de Y= SSC-H.

5. Eje de X= FL1, eje de Y= FL2-H-H.

6. Eje de X= FL1, eje de Y= FL3-H.

7. Eje de X= FL2, eje de Y= FL3-H.

En el primer histograma constituido con la intensidad de dispersión de la

luz en sentido frontal (FSC) y lateral (SSC), se analizan los leucocitos de

sangre periférica, las células pequeñas y no granulares (linfocitos) se

agruparán en un lugar cercano al origen de ambos ejes; las células grandes y

granulares (polimorfonucleares) se ubicarán, por el contrario, lejos del origen

de ambos ejes; una tercera población de tamaño y granularidad intermedia

(monocitos) se localizará entre las dos poblaciones anteriores.

Sin necesidad de preparar poblaciones enriquecidas en linfocitos, puede

definirse una “ventana” electrónica que “aísle” a esta población leucocitaria y

condicionar que la detección de fluorocromos se limite a ella. Los histogramas

restantes detectarán solamente los eventos contenidos en la “ventana”

104

correspondiente a los linfocitos: el histograma de fluorescencia verde (FL1)

permite la cuantificación del porcentaje de células a las que se unió un AcMo

conjugado con un fluorocromo que emite luz verde; el histograma de

fluorescencia naranja (FL2) permite la cuantificación de las células a las que se

unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz de este color. El

histograma de doble fluorescencia permite además conocer la proporción de

células a las que se unieron de forma simultánea ambos AcMo. Este tipo de

análisis bidimensional es importante para cuantificar ciertas poblaciones

celulares que sólo son definibles por la expresión simultanea de más de un

antígeno en su membrana.

El análisis de los datos obtenidos mediante citometría de flujo

proporciona para cada célula dos tipos de información: cualitativa y cuantitativa.

Así, cuando se analiza en una célula la reactividad para un determinado AcMo

específico para un antígeno, se obtiene información sobre la presencia del

epítopo del antígeno en la célula y sobre su nivel de expresión (número de

moléculas por célula).

Cuando se consideran poblaciones celulares, la citometría de flujo añade

a la información anterior datos sobre la homogeneidad o heterogeneidad de las

medidas. Como consecuencia de lo expuesto, el programa informático permite

además visualizar directamente las poblaciones celulares, obtener información

numérica objetiva, en forma de porcentajes, valores medios o medidas de

dispersión como la desviación estándar y el coeficiente de variación obtenido

para los eventos estudiados.

El proceso de análisis se realizó en cuatros pasos consecutivos:

1. Cuantificar las distintas poblaciones leucocitarias en el histograma

FSC/SSC, tras excluir las células de desecho y los agregados (figura

3.1).

105

Figura 3.1. Cuantificación de las poblaciones leucocitarias en sangre periférica, en un paciente afecto de LLC-B. Rojo: linfocitos (75%). Verde: monocitos (3%). Azul: neutrófilos (22%).

2. Abrir una “ventana” electrónica en la población linfoide, definida en el

histograma anterior (figura 3.2).

Figura 3.2. Ventana electrónica en área de linfocitos.

3. Calcular los porcentajes de las distintas poblaciones linfocitarias en

esta área seleccionada: linfocitos B tumorales, linfocitos B normales,

linfocitos T y subpoblaciones T (Figura 3.3).

106

Figura 3.3. Triple marcaje para la identificación de las poblaciones linfocitarias en un paciente

con LLC-B. Rojo: linfocitos B (79%). Verde: linfocitos T (16%).

4. Abrir una “ventana” electrónica en la población a estudio y analizar

las positividades de los distintos AcMo e intensidad de expresión de

los mismos (figura 3.4).

Figura 3.4. Selección linfocitos B. Rojo: linfocitos B con coexpresión de CD19/CD5 (99,5%).

Verde: linfocitos B con positividad para CD19 y negatividad para CD5 (0,5%).

107

3.3.5. Criterios de positividad e intensidad de expresión para un antígeno

El análisis de los distintos antígenos expresados en la superficie celular

suele ser cuantitativo y definido en base a la positividad o negatividad de los

mismos. Para un análisis más completo y exhaustivo de los antígenos celulares

se han incluido los siguientes parámetros:

- Estudio del número de moléculas de un antígeno expresadas en cada célula

o intensidad de expresión. Esta información se puede obtener a través de

dos métodos:

1. Intensidad de fluorescencia media (MFI). Corresponde a los canales

medios de fluorescencia para la población positiva. Para realizar esta

determinación de forma correcta, a la fluorescencia medida en el

área positiva hay que sustraerle la fluorescencia del control negativo

medido en las mismas condiciones. Se establecieron distintos puntos

de corte, de forma arbitraria, para establecer las intensidades de

expresión débil, modera y fuerte para cada marcador.

2. Escala logarítmica de fluorescencia (ELF). Se determina en base a

los valores logarítmicos expresados en los histogramas de las

fluorescencias, definiéndose tres intensidades:

Débil: cuando el pico de positividades coincide con el primer percentil

logarítmico.

Moderado: cuando el pico de positividad coincide con el segundo

percentil logarítmico.

Fuerte: cuando el pico de positividad coincide con el tercer percentil

logarítmico.

- Patrón de dispersión del antígeno. Es la determinación de la

homogeneidad o heterogeneidad en la expresión del antígeno. Esta

información se puede obtener a través de dos métodos:

1. Coeficiente de variación (CV). Determina la dispersión en la

intensidad de expresión de un antígeno para las distintas

108

partículas que constituye la población celular a estudio. Se

establecieron distintos puntos de corte, de forma arbitraria, para

establecer el patrón de distribución homogéneo o heterogéneo

para cada marcador.

2. Escala logarítmica de fluorescencia (heterogéneo-homogéneo).

Un antígeno se considera homogéneo cuando su nivel de

expresión es inferior a una década de logaritmo en la escala de

intensidad de fluorescencia y heterogénea si es superior a dicha

medida.

- Determinación del porcentaje de células que expresan un marcador, de

forma independiente al concepto de positividad o negatividad del mismo,

es decir analizar cada antígeno como variables continuas

De acuerdo con lo expuesto, en este trabajo se han analizado para cada

marcador los siguientes parámetros:

• Positividad o negatividad del marcador. Un antígeno se considera

positivo si se expresa en más del 20% de las células tumorales,

señalizándose con la sigla +, y negativo si es inferior a dicho

porcentaje, señalizándose con la sigla -.

• Intensidad de expresión del antígeno. Determinada como MFI y en

escala logarítmica (ELF).

• Patrón de distribución del antígeno Determinada como CV y en

escala logarítmica (heterogéneo-homogéneo).

• Porcentajes de células que expresan un antígeno.

3.3.6. Criterios de identificación de las poblaciones celulares

La definición de las distintas poblaciones celulares se ha realizado de

acuerdo a la composición antigénica de la membrana celular, para ello como ya

se ha expuesto previamente, se ha utilizado una amplia batería de AcMo que

ha permitido identificar no solo la población tumoral sino también las células

109

normales residuales presentes en la sangre periférica de estos pacientes. Las

poblaciones linfocitarias vienen definidas por:

• Linfocito de estirpe B. Identificado por la positividad para el AcMo CD19.

• Linfocito de estirpe B normal residual. Cuya caracterización antigénica

es la siguiente:

- CD19 positivo

- CD5 negativo

- CD22 positivo moderado-fuerte

- Positividad para las cadenas ligeras de superficie kappa y lambda de

intensidad moderada-fuerte.

• Linfocito de estirpe B tumoral. Desde el punto de vista inmunofenotípico,

se define al linfocito B leucémico por la expresión monoclonal de las

cadenas ligeras de inmunoglobulina, kappa o lambda, en su superficie

celular, utilizando los criterios de monoclonalidad establecidos por Taylor

(1979) en base al cociente entre las cadenas ligeras kappa y lambda: ratio

κ:λ ≥3 y ratio λ:κ ≥ 2.

• Linfocito B tumoral perteneciente a la LLC. Para el diagnóstico

diferencial entre la LLC y otros SLPC de estirpe B se han utilizado, de

acuerdo con el sistema de puntuación establecido por Matutes (Matutes y

cols, 1994; Moreau y cols, 1997), los siguientes AcMo:

- CD23: positividad o negatividad.

- FMC7: positividad o negatividad.

- CD5: positividad o negatividad.

- CD79beta, CD22: positividad o negatividad, e intensidad de

expresión.

- Cadenas ligeras de superficie: intensidad de expresión.

Además se ha incluido el AcMo CD11c ya que aporta una información adicional

en el diagnóstico diferencial.

• Linfocitos de estirpe T. Los linfocitos T se han definido de acuerdo con la

expresión de los siguientes AcMo:

- CD3 positivo.

110

- CD2 positivo con negatividad para el CD19.

- CD5 positivo con negatividad para el CD19.

• Subpoblaciones linfocitarias T. Identificadas por la expresión de los

antígenos CD4 y CD8.

3.4. Identificación morfológica de la población linfoide mediante técnicas

de microscopia óptica

La clasificación de los distintos tipos de linfocitos tumorales se ha

realizado de acuerdo con las recomendaciones establecidas por el Grupo

Cooperativo Franco-Americano-Británico (FAB), sobre la base de determinadas

características morfológicas que se describen a continuación (Bennett y cols,

1989):

• Linfocitos pequeños: tamaño < 14 µm (< 2 hematíes), cromatina nuclear

densa y cuarteada de contorno regular, nucléolo ausente y escaso

citoplasma.

• Linfocitos grandes: tamaño > 14 µm (> 2 hematíes), cromatina nuclear

densa, nucléolo ausente o muy pequeño y mal definido, y citoplasma

relativamente abundante.

• Prolinfocitos: tamaño > 14 µm (> 2 hematíes), cromatina nuclear densa,

nucléolo central y prominente, y variable cantidad de citoplasma.

• Linfocitos hendidos: tamaño 7 - 14 µm, cromatina homogénea y densa,

nucléolo ausente o muy pequeño y mal definido, citoplasma no visible o

escaso y una hendidura nuclear de base angular.

3.5. Método estadístico

Para el análisis estadístico de todos los pacientes de la serie y del grupo

control, se ha realizado en primer lugar una análisis descriptivo con la intención

de obtener una idea global sobre los datos de la muestra, obteniendo las

medidas de centralización media, rango, desviación estándar y error estándar

111

de la media para las variables cuantitativas, y tablas de frecuencias para las

variables categóricas junto con gráficos de barras para la expresión de

frecuencias o porcentajes.

La tabla de registros fue analizada con la ayuda de los programas

informáticos SPSS y Epiinfo versión 6.0, mediante el análisis de comparación

de medias para variables independientes, comparación de proporciones y

estudio de correlación. Se aceptó una significación estadística cuando el error

alfa era menor de 0.05.

En el análisis descriptivo bivariante dependiendo del tipo de variable, se

han utilizado los siguientes tests:

• Variables cuantitativas: t-student o análisis de varianza cuando

podía asumirse una distribución normal y Kruskal Wallis en otros

casos.

• Variables categóricas: test de Chi cuadrado. Se han tenido en

cuenta las condiciones de validez del test.

Para el estudio estadístico fue preciso categorizar algunas variables para

permitir el análisis comparativo, definiéndose los siguientes grupos:

� Edad al diagnóstico

Pacientes con edad menor o igual a 60 años.

Pacientes mayores de 60 años.

� Intensidad de expresión antigénica (MFI)

Antígenos con intensidad de expresión débil.

Antígenos con intensidad de expresión moderada.

Antígenos con intensidad de expresión fuerte.

112

� Patrón de dispersión antigénica (CV)

Antígenos con patrón homogéneo.

Antígenos con patrón heterogéneo.

� Población linfoide T en los pacientes con LLC-B

Pacientes con valores de subpoblaciones T superiores a la

media del grupo control.

Pacientes con valores de subpoblaciones T inferiores a la media

del grupo control.

� Cifras de linfocitos en sangre periférica

Cifras de linfocitos inferiores a 30x109.

Cifras de linfocitos superiores a 30x109.

� Cifras de células CD19+ en sangre periférica

Células CD19+ < 20x109.

Células CD19+ < 20x109.

Células CD19+ < 80%.

Células CD19+ > 80%.

RESULTADOS

114

1. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES INCLUIDOS EN EL ESTUDIO

1.1. Características clínicas

Se incluyeron 115 pacientes diagnosticados de LLC-B en el Servicio de

Hematología del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Victoria de Málaga,

entre Octubre de 1996 y Junio de 2001; la edad media fue de 66 años (29-84) y la

distribución por sexo de 64 (55,7%) varones y 51 (44,3%) mujeres, con un ratio de

1.3:1 (figuras 4.1 y 4.2). La incidencia de la LLC-B en nuestra área poblacional se

cifró en 3,5 casos nuevos por 100.000 habitantes y año.

Respecto al motivo de consulta, 2/3 de los pacientes fueron derivados a las

consultas externas de hematología por presentar anormalidades en la analítica de

rutina, aunque se encontraban asintomáticos. En el resto de los casos la astenia,

anorexia (16,7%) y los procesos infecciosos de repetición (12%) fueron las

manifestaciones más frecuentes que llevaron al diagnóstico de cuadro leucémico

(tabla 4.1).

En la exploración inicial no se detectaron afectación de territorios

adenopáticos en el 66,7% de los casos, mientras que el 22.2% presentaban

afectación de un solo territorio. La presencia de visceromegalias se objetivó en el

30,9% de los pacientes, siendo el bazo el órgano más frecuentemente afectado

(tabla 4.2).

El estadiaje clínico se realizó utilizando las clasificaciones de Rai y de Binet.

Como se observa en la tabla 4.3, según la clasificación de Rai el 51.3% de los

pacientes estaban en el grupo de bajo riesgo (0), el 42,6% en el grupo de riesgo

intermedio (I-II) y el 6,1% en alto riesgo (III-IV). En la clasificación de Binet, el

grupo de bajo riesgo (A) representó el 88.7% de los casos, el grupo de riesgo

intermedio (B) el 7% y el grupo de alto riesgo el 4.3%. Estos datos indican que la

115

mayor parte de los pacientes se diagnosticaron en fases iniciales de la

enfermedad.

1.2. Características hematológicas

En la tabla 4.4.A se muestran las características hematológicas generales

de los pacientes incluidos en el estudio, observándose importantes cambios en la

serie blanca, mientras que las series roja y megacariocítica están escasamente

afectadas. Los pacientes presentaban unas cifras de hemoglobina dentro de la

normalidad en el 87% de los casos (100 pacientes) y tan solo un 13% (15

pacientes) mostraban anemia. Respecto al recuento de plaquetas, un 3% de los

pacientes presentaban trombocitopenia con cifras inferiores a 100 x 109/L y por

encima de dicho valor obtuvimos el 97% de los casos (112 pacientes).

En lo que se refiere al recuento leucocitario, el 99,2% de los casos

presentaban valores anormales con cifras superiores a 10 x 109/L y tan solo 1

paciente estaba dentro de la normalidad. Así mismo, es de reseñar la gran

variabilidad en los valores de este parámetro con un rango que oscila entre un

límite inferior de 10 y uno superior de 556 x 109/L. La distribución de los pacientes

según el recuento leucocitario y linfocitario, muestra que el 68,7% presentaba < 30

x 109/L leucocitos y el 71,4% < 30 x 109/L linfocitos al diagnóstico (tabla 4.4.B).

Finalmente, evaluamos el tiempo de duplicación linfocitaria (tiempo en el que se

produce la duplicación numérica en el recuento de linfocitos en sangre periférica),

siendo este mayor de 12 meses en el 84,2% (tabla 4.4.C).

1.3. Características bioquímicas e inmunológicas

La tabla 4.5.A muestra los valores medios de los parámetros bioquímicos e

inmunológicos estudiados. Cuando se clasifican en función de la normalidad o

anormalidad de los resultados obtenidos, se observaron valores patológicos de β2-

116

microglobulina en más de la mitad de los pacientes, mientras que tan solo

presentaban cifras anormales de LDH y positividad para el test de Coombs directo

el 18% y 12% de los casos respectivamente. Además se encontró una función

hepática alterada en un porcentaje significativo de pacientes (tabla 4.5.B).

Respecto a las cifras de inmunoglobulinas, éstas se hallaron descendidas,

en algún momento de la evolución, en el 50.4% (58 pacientes) siendo el isotipo

más frecuentemente afectado la IgM (50%), seguido por IgA (26%) e IgG (24%). El

aumento de las mismas se detectó en el 12,1% de los casos (14 pacientes),

presentando componente monoclonal tan solo 3 pacientes (figura 4.3).

1.4. Características farmacológicas

De los 115 pacientes incluidos en el estudio, tan solo 15 (13%) recibieron

tratamiento quimioterápico, aunque este fue suspendido al menos 3 meses antes

de la inclusión en el estudio. El esquema terapéutico más frecuentemente

empleado fue la asociación de Clorambucil y Prednisona en pauta discontinua

(tabla 4.6). Ningún paciente había recibido tratamiento con análogos de las

purinas.

Figura 4.1. Distribución de los pacientes en función de la edad

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

14-50 años 51-60 años >60 años

Figura 4.2. Distribución de los pacientes en función del sexo

Varones56%

Mujeres44%

117

Tabla 4.1

Distribución de casos según el motivo de consulta

Frecuencia Porcentaje

(n=115)

Porcentaje válido

(n=108)

Porcentaje acumulado

Análisis de

rutina 73 63,5 67,6 67,6

Síndrome

constitucional 18 15,7 16,7 84,3

Infección 13 11,3 12,0 96,3

Anemia 2 1,7 1,9 98,1

Otros 2 1,7 1,9 100

Total 108* 93,9 100 100

*Nota: en 7 pacientes se desconocía el motivo de consulta

118

Tabla 4.2

Número de territorios adenopáticos afectados y presencia de visceromegalia en la exploración inicial

Frecuencia Porcentaje

(n=115)

Porcentaje válido

(n=108)

Porcentaje acumulado

0 72 62,6 66,7 66,7

1 24 20,9 22,2 88,9

2 7 6,1 6,5 95,4

4 2 1,7 1,9 97,2 5 2 1,7 1,9 99,1

6 1 0,9 0,9 100

Total 108 93,9 100 100

*Nota: en 7 pacientes no constaban estos datos en la Historia Clínica

Pacientes* Incidencia Porcentajes

Esplenomegalia 113 34 30,1% Hepatomegalia 113 14 12,4%

*Nota: en 2 pacientes no constaban estos datos en la Historia Clínica

119

Tabla 4.3 Clasificación de los pacientes según el estadio clínico al diagnóstico

A. Estadios clínicos de RAI

Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado

0 59 51,3 51,3

I 20 17,4 68,7

II 29 25,2 93,9

III 4 3,5 97,4 IV 3 2,6 100

Total 115 100 100

B. Estadios clínicos de Binet

Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado

A 102 88,7 88,7

B 8 7,0 95,7 C 5 4,3 100

Total 115 100 100

120

Tabla 4.4

Características hematológicas de los pacientes

A. Parámetros hematimétricos de los pacientes incluidos en el estudio

Parámetros m ± DEM

Mínimo Máximo

Leucocitos (x109/L) 35,84 ± 57,03 10 556 Linfocitos (x109/L) 28,12 ± 50,88 5,5 500 Hemoglobina (g/dL) 13,5 ± 1,8 6,2 16,5 Plaquetas (x109/L) 190,11 ± 59,10 40 389

B. Distribución de los pacientes según el recuento leucocitario y

linfocitario al diagnóstico.

Grupos Leucocitos x109/L

n % Linfocitos x109/L

n %

<15 x109/L 27 23,5 31 27,0

15-30 x109/L 52 45,2 51 44,4

30-50 x109/L 20 17,4 18 15,6 >50 x109/L 16 13,9 15 13,0

C. Distribución de los pacientes según el tiempo de duplicación linfocitaria.

Tiempo de duplicación n Porcentajes

< 12 meses 16 15,8

> 12 meses 85 84,2

121

Tabla 4.5

Características bioquímicas e inmunológicas de los pacientes

A. Parámetros bioquímicos e inmunológicos de la población de pacientes incluidos en el estudio

Parámetros

m ± DEM

Mínimo - Máximo

LDH 362,7 ± 172,1 133 1330

ββββ2-microglobulina 2,9 ± 1,5 0,7 7,9

IgG 1030,9 ± 451 292 3324

IgM 99,6 ± 207,4 10 1230

IgA 176,5 ± 135,6 24 849

B. Distribución por grupos de los diferentes parámetros

bioquímicos e inmunológicos en función de la normalidad o anormalidad de los valores

Parámetros Normal n %

Patológicos n %

LDH* 93 82,3 20 17,7

ββββ2-microglobulina* 29 42,6 39 57,4

IgG 81 71,1 33 28,9

IgM 52 45,6 62 54,4

IgA 80 70,1 34 29,9 Componente monoclonal**

84 96,6 3 3,4

Test de Coombs Directo**

64 87,7 9 12,3

Función hepática 99 87,6 14 12,4

Función renal 112 97,4 3 2,6

*Valores al diagnóstico; ** Normal = negativo; patológico = positivo 122

Figura 4.3. Niveles de inmunoglobulinas en los pacientes con LLC-B

50% IgM

26% IgA

24% IgG

Igs. Normales38%

Igs. Elevadas12% Igs. Descendidas

50%

123

Tabla 4.6

Quimioterapia utilizada en los pacientes tratados y distribución de los mismos

Pacientes

Incidencia Esquema de tratamiento

Pacientes tratados n (%)

No tratados

100 ---------- -------------

Tratados 15 Clorambucil + Prednisona 11 (9,6%)

Clorambucil pauta continua

2 (1,7%)

Otros 2 (1,7%)

124

125

2. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES EN FUNCIÓN DE LA EDAD

Todos los parámetros anteriormente descritos fueron reanalizados

distribuyendo la muestra estudiada, en función de la edad, en mayores (n=84) y

menores o iguales a 60 años (n=31).

2.1. Características clínicas en > y < de 60 años

Los pacientes < de 60 años representaron el 27% de la población

leucémica general. La distribución por sexos en ambos grupos, mostró que en los

> de 60 años los hombres representaban el 52% (ratio 1.1:1), mientras que en el

grupo de < de 60 años el porcentaje aumenta al 65% (ratio: 1.8:1), sin que estas

diferencias alcanzasen significación estadística (figura 4.4 y 4.5).

Al igual que la población total, el motivo de consulta más frecuente fue el

hallazgo de anormalidades en la analítica de rutina, sin diferencias entre los

grupos etarios. Sin embargo, la consulta por síndrome constitucional fue

significativamente más frecuente en los menores de 60 años, mientras que se

observó un aumento de los procesos infecciosos, sin alcanzar significación

estadística, en el grupo de mayores de 60 años (tabla 4.7). Tampoco se

observaron diferencias significativas respecto al número de territorios

adenopáticos afectados ni en la presencia de visceromegalias entre los dos

subgrupos establecidos (tabla 4.8).

Respecto a los estadios clínicos de Rai y de Binet, aunque no se detectaron

pacientes de riesgo alto (estadios III-IV de Rai y C de Binet) en el grupo de

menores de 60 años mientras que si los hubo en el grupo de mayores de 60 años,

las diferencias entre ambos grupos no fueron significativas (tabla 4.9).

126

2.2. Características hematológicas en > y < de 60 años

Los recuentos leucocitarios y linfocitarios fueron significativamente mayores

en el grupo de pacientes < de 60 años, estando el recuento medio de linfocitos en

este grupo por encima de 30 x 109/L (x= 37,33x109/L); así mismo, los niveles de

hemoglobina fueron significativamente mayores en dicho grupo, aunque la

diferencia no es clínicamente relevante (tabla 4.10 A). Sin embargo, no hubo

diferencias respecto al tiempo de duplicación linfocitaria entre ambos grupos (tabla

4.10. B).

2.3. Características bioquímicas e inmunológicas en > y < de 60 años

En el análisis de los parámetros bioquímicos e inmunológicos globales de

los pacientes incluidos en el estudio, se observaron niveles significativamente

menores del isotipo IgM en el grupo de pacientes < de 60 años, así como, unas

cifras discretamente mayores de LDH en dicho grupo (tabla 4.11). Sin embargo, la

distribución por grupos en función de la normalidad o anormalidad de los valores

(tabla 4.12) no muestra diferencia significativas entre ambos grupos etarios,

aunque se observa un mayor porcentaje de pacientes que presentan alteraciones

de la función hepática en el grupo de < de 60 años (p= 0.07).

Figura 4.4. Distribución de los pacientes con LLC-B en función de la edad

27%

73%

< 60 años> 60 años

Figura 4.5. Distribución de los pacientes en función de la edad y sexo

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

< 60 años > 60 años

VaronesMujeres

127

Tabla 4.7

Distribución de casos según el motivo de consulta, en función de la edad

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años

Motivo de

consulta Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje

Análisis de

rutina

19 61,3 54 64,3

Síndrome

constitucional 8 25,8* 10 11,9

Infección 2 6,5 11 13,1

Anemia 0 0 2 2,4

Otros 0 0 2 2,4

Desconocido 2 5

Total 31 100 84 100

* p= 0.045

128

Tabla 4.8 Número de territorios adenopáticos afectados y presencia de visceromegalia en la exploración inicial, según la edad

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje

0 20 64,5 52 61,9

1 7 22,6 17 20,2

2 1 3,2 6 7,1

4 1 3,2 1 1,2

5 1 3,2 1 1,2

6 0 0 1 1,2

Desconocido 1 3,2 6 7,1

Total 31 100 84 100

Hepatomegalia 5 16,1 9 10,7

Esplenomegalia 9 29,0 25 29,8 Diferencias NS

129

Tabla 4.9

Clasificación de los pacientes según el estadio clínico en función de la edad

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje

A. Estadíos clínicos de Rai

Estadío 0 18 58,1 41 48,8

Estadío I 4 12,9 16 19,0

Estadío II 9 29,0 20 23,8

Estadío III 0 0 4 4,8

Estadío IV 0 0 3 3,6

B. Estadíos clínicos de Binet Estadío A 29 93,5 73 86,9

Estadío B 2 6,5 6 7,1

Estadío C 0 0 5 6,0

Diferencias NS

130

Tabla 4.10

Distribución de los pacientes según los parámetros hematimétricos al diagnóstico, en función de la edad

A. Parámetros hematimétricos de los pacientes incluidos en el estudio

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años

m DEM m DEM

Leucocitos (x109/L) 46,76** 97,94 31,77 30,19

Linfocitos (x109/L) 37,33*** 88,64 24,44 25,43

Hemoglobina (g/dL) 14,2* 1,1 13,2 1,9

Plaquetas (x109/L) 197,74 49,64 187,25 62,30

*p=0,047 **p=0,025 ***p= 0,021

B. Distribución de los pacientes según el recuento leucocitario / linfocitario al diagnóstico y según el tiempo de duplicación linfocitaria, según la edad

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años

Leucocitos x 109/L

Grupos Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje

<15 x 109/L 8 25,8 19 22,6

15-30 x 109/L 15 48,4 37 44,0

30-50 x 109/L 3 9,7 17 20,2

>50 x 109/L 5 16,1 11 13,1

Linfocitos x 109/L

n % n %

<15 x 109/L 15 48,4 37 44,0

15-30 x 109/L 10 32,3 29 34,5

30-50 x 109/L 2 6,5 11 13,1

>50 x 109/L 4 12,9 7 8,3

Tiempo de Duplicación

n % n %

< 12 meses 5 17,9 11 15,1

> 12 meses 23 82,1 62 84,9

131

Tabla 4.11

Características bioquímica e inmunológicas en función de la edad

Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años m DEM m DEM

LDH 377,4 257,8 357,3* 128,6

ββββ2-microglobulina 2,5 1,2 3,1 1,6

IgG 887,8 303,9 1084,3 485,7

IgM 46,9 26,9 119,3** 239,9

IgA 148,7 88,3 186,9 148,6

* p = 0,049; ** p = 0,01

132

Ta

bla

4.1

2

Dis

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Pac

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n %

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p=0

.07

133

134

3. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE LAS LLC-B INCLUIDAS EN EL

ESTUDIO

3.1. Características fenotípicas generales

Las características fenotípicas generales de las poblaciones linfocitarias de

los pacientes con LLC-B se muestran en la tabla 4.13. Como cabría esperar, se

aprecia una inversión de la ratio linfocitos T/linfocitos B, a favor de estos últimos

(80.4%). La población B total, identificada por la expresión del Ac Mo CD19, está

formada mayoritariamente por los linfocitos B tumorales (CD19+/CD5+), que

representan un 76,9% de la celularidad linfoide. Así mismo, se identifica una

mínima población de linfocitos B (CD19+/CD5 -) y T normales residuales que

representan un 9% y un 16% respectivamente de la población linfoide de sangre

periférica. Además, es de destacar que el control de calidad interno de medida de

exactitud, rindiese valores del 1.4% de diferencia entre los recuentos realizados

con diferentes Ac Mo específicos de células T, situándose el límite superior

admitido de dicho control en el 10%.

3.2. Características fenotípicas de la población B tumoral

La distribución de los diferentes anticuerpos monoclonales, la intensidad de

expresión y el patrón de dispersión antigénica en la población tumoral se muestran

en la tabla 4.14. Así, el análisis por CMF de la expresión de antígenos de

superficie mostró que en todos los casos las células leucémicas expresaban

CD19, así como CD5, un marcador de células T. No se detectó positividad para

otros antígenos de células T (CD2 y CD3) en ningún caso de la serie.

La expresión de otros marcadores característicos de células B, como son el

CD22 y CD79Beta, fue positiva en más del 80% de los casos, mostrando una

intensidad de expresión débil y un patrón de dispersión homogéneo en la mayoría

135

de los pacientes. La evaluación de la clonalidad determinada por la expresión de

una única cadena ligera (kappa o lambda) sobre la membrana celular, mostró que

el 64,4% de los pacientes expresaban inmunoglobulinas con cadena ligera kappa

y el 35.6% restante tenía cadena ligera lambda, predominando un patrón débil y

homogéneo en las cadenas kappa, y moderado y heterogéneo en las cadenas

lambda.

Respecto a los marcadores de activación celular, el Ac Mo CD23 se

expresó en la mayoría de los casos (99,9%), mientras que el CD25 tan solo lo hizo

en el 21.1% de los pacientes. La expresión de CD23 fue de intensidad moderada y

su distribución heterogénea.

Finalmente, en lo que se refiere a la expresión de otros marcadores menos

específicos, el FMC7 presentó una intensidad débil y el CD11c moderada, en

ambos casos la distribución fue predominantemente homogénea.

Por otra parte, los valores cuantitativos de la intensidad de expresión y del

patrón de dispersión antigénica de los diferentes anticuerpos monoclonales en la

población CD19+ tumoral se muestran en la tabla 4.15; observándose una alta

intensidad de fluorescencia media y una gran heterogeneidad para el CD23 y

CD11c.

La tabla 4.16 muestra la distribución de los pacientes según el sistema de

puntuación del grupo de Matutes (1997). Aplicando este sistema un 86.8% de los

casos tenían una puntuación de 4 y 5, y tan solo un 3.5% mostraban un rango de

1 o 2, no se incluyó ningún caso con valor 0.

136

A modo de resumen, el patrón inmunofenotípico de las células tumorales de las

LLC-B de nuestra serie, fue el siguiente:

CD19+/CD5+moderado-heterogéneo/CD22+débil-homogéneo/CD23+moderado-heterogéneo/

CD79Beta+débil-homogéneo/FMC7+débil-homogéneo/cadenas kappa+débil-homogéneo/

CD11c -/CD25 -/CD10 -/CD2 -

3.3. Características fenotípicas de la población T

Las características fenotípicas de los linfocitos T normales residuales en los

pacientes con LLC-B se detallan en la Tabla 4.17; en ella, se muestran los valores

tanto absolutos como porcentuales (calculados sobre el área de células CD3+) de

las distintas subpoblaciones linfocitarias: linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+,

linfocitos T CD4+/CD8+ y linfocitos T CD4 -/CD8 -. Se observa un predominio de

los linfocitos CD4+ (54.3%) y linfocitos CD8+ (41.1%), respecto al resto de las

subpoblaciones, con un cociente CD4/CD8 de 1.6.

Ta

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4.1

3

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29

,1 ±

17,

2 15

12

0 46

,3 ±

14,

5 27

12

5

CD

19

+/C

D2

3+

18

2,3

± 11

5,6

33

547

95,9

± 1

8,6

57

143

CD

19

+/F

MC

7+

87

,5 ±

149

,5

16

942

64,9

± 3

3,3

24

155

CD

19

+/C

D1

1c

+

148

± 72

,2

47

321

70,4

± 2

0,5

43

139

CD

19

+/C

D7

9B

eta

+

56,1

± 3

1,8

19

132

46,6

± 8

,0

28

63

CD

19

+/k

ap

pa

35

,5 ±

42,

4 9

262

60,4

± 2

0,9

19

138

CD

19

+/L

am

bd

a

209,

0 ±

283,

824

15

95

60,4

± 2

0,9

19

138

139

Tabla 4.16

Distribución de casos según el sistema de puntuación de Matutes

Puntuación Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado

1 1 0,9 0,9

2 3 2,6 3,5

3 11 9,6 13,2

4 57 50 63,2

5 42 36,8 100

Total 114 100 100

140

Ta

bla

4.1

7. L

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cit

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± D

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M

ìnim

o -

Má

xim

o

m ±

DE

M

Mìn

imo

- M

áxi

mo

CD

5+/C

D19

-

16,2

± 1

3,8

0,4

48,3

2,

489

± 1,

941

0,52

0 18

,50

CD

3+

16,0

± 1

3,9

0,5

49,8

2,

487

± 2,

051

0,42

0 20

,00

(CD

3+)-

(CD

5+)

1,4

± 2,

6 0

5,0

CD

3+/C

D4+

/CD

8-

54,3

± 1

4,9

12

88

1,4

± 1,

3 0,

190

12,6

0

CD

3+/C

D8

F+

/CD

4 -

38,2

± 1

4,3

6 82

0,

941

± 0,

765

0,07

5,

80

CD

3+/C

D8

M-D

+/C

D4

- 3,

3 ±

2,2

0 10

,8

0,08

6 ±

0,09

5 0

0,78

CD

3+/C

D8

T+

/CD

4 -

41,1

± 1

4,4

7 85

1,

017

± 0,

831

0,10

5 6,

60

CD

3+/C

D4+

/CD

8F+

0,

2 ±

0,5

0 4,

5 0,

007

± 0,

035

0 0,

37

CD

3+/C

D4+

/CD

8T+

2,

6 ±

3,2

0 20

,0

0,07

5 ±

0,17

0 0

1,65

CD

3+/C

D4+

/CD

8M

-D+

2,

4 ±

3,0

0 17

,5

0,06

8 ±

0,13

7 0

1,26

CD

3+/C

D4-

/CD

8-

4,0

± 3,

1 0

20

0,09

2 ±

0,10

1 0

0,72

Co

cien

te C

D4/

CD

8 F

1,9

± 1,

8 0,

15

14,6

Co

cien

te C

D4/

CD

8T

1,6

± 1,

4 0,

12

12,4

141

142

4. POBLACIONES LINFOCITARIAS EN LOS CONTROLES

El grupo control estuvo compuesto por 121 individuos, en su mayoría

donantes voluntarios de sangre, con una edad media de 41 años (18-70) y una

distribución por sexo de 75 (64.7%) varones y 41 (35.3%) mujeres, ratio 1.8:1

(figuras 4.6 y 4.7). Las características generales de las poblaciones linfocitarias de

dichos controles se muestran en las tablas 4.18 y 4.19, en las cuales los

porcentajes totales de linfocitos T y B se han calculado sobre el área de linfocitos y

las subpoblaciones T sobre el área de linfocitos T CD3+

Como cabría esperar, se aprecia un predominio de los linfocitos T (71%)

sobre los linfocitos B (9.3%). En lo concerniente a las subpoblaciones T, existe

una clara preponderancia de los linfocitos T CD4+ (61.9%) sobre los linfocitos T

CD8+ (31.5%), con un cociente CD4/CD8 de 2; el resto de las subpoblaciones T

representan poblaciones cuantitativamente minoritarias en la sangre periférica

normal. Por su parte, los linfocitos B, definidos por la positividad de CD19,

coexpresan el antígeno CD5 en un 12.8% de los casos (tabla 4.19).

Figura 4.6 Distribución de los controles en función de la edad

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

14-50 años 51-60 años >60 años

Figura 4.7. Distribución de los controles en función del sexo

Varones65%

Mujeres35%

143

Ta

bla

4.1

8. L

info

cit

os

T e

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tro

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taje

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x 10

9 /L

m ±

DE

M

M

ìnim

o -

Má

xim

o

m ±

DE

M

Mìn

imo

- M

áxi

mo

CD

5+/C

D19

-

71,0

± 6

,9

48

83

1,33

8 ±

0,44

1 0,

537

2,50

7

CD

3+

71,3

± 6

,9

50

83

1,32

7 ±

0,48

4 0,

561

3,20

7

(CD

3+)-

(CD

5+)

1,7

± 1,

3 0

4,2

CD

3+/C

D4+

/CD

8-

61,9

± 8

,2

42

79

0,83

8 ±

0,32

0 0,

408

2,37

3

CD

3+/C

D8

F+

/CD

4 -

30,7

± 6

,2

14

42

0,43

0 ±

0,18

3

0,19

4 1,

00

CD

3+/C

D8

M-D

+/C

D4

- 1,

9 ±

1,3

0 9

0,02

5 ±

0,02

0 0

0,12

8

CD

3+/C

D8

T+

/CD

4 -

31,5

± 5

,9

15

45

0,45

8 ±

0,17

0 0,

204

1,12

3

CD

3+/C

D4+

/CD

8F+

0,

14 ±

0,2

5 0

2 0,

002

± 0,

004

0

0,04

3

CD

3+/C

D4+

/CD

8T+

1,

26 ±

1,3

6 0,

1 7,

6 0,

018

± 0,

024

0,00

1 0,

151

CD

3+/C

D4+

/CD

8M

-D+

1,

12 ±

1,2

4 0,

1 7,

3 0,

016

± 0,

021

0,00

1 0,

130

CD

3+/C

D4-

/CD

8-

2,7

± 2,

3 0,

6 15

,6

0,04

8 ±

0,0

39

0,00

5 0,

307

Co

cien

te C

D4/

CD

8F

2,1

± 0,

6 1,

2 3,

9

Co

cien

te C

D4/

CD

8T

2 ±

0,6

1,1

3,5

144

Ta

bla

4.1

9

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10

9 /L

m ±

DE

M

M

ìnim

o -

Má

xim

o

m ±

DE

M

Mìn

imo

- M

áx

imo

CD

19

T+

9,

3 ±

3,5

3 19

0,

177

± 0,

089

0,03

2 0,

527

CD

19

+/C

D5

-

8 ±

3 2,

5 16

0,

151

± 0,

079

0,02

9 0,

493

CD

19

+/C

D5

+

1,4

± 1

0

4,9

CD

19

+/C

D5

+ *

12

,8 ±

7,7

1

30

*

Por

cent

ajes

sob

re á

rea

de c

élul

as C

D19

+.

145

146

5. COMPARACIÓN DE LAS POBLACIONES LINFOCITARIAS EN PACIENTES

LEUCÉMICOS Y CONTROLES

5.1. Linfocitos T

En la tabla 4.20 se presentan las medias ± DE de las subpoblaciones

linfocitarias T en los pacientes leucémicos y en los controles, expresadas tanto en

porcentajes como en valores absolutos. El análisis comparativo de las mismas

(figura 4.8), muestra un significativo aumento del valor absoluto de los linfocitos T

totales en la población leucémica; por el contrario, el valor porcentual es

significativamente menor en los pacientes respecto a los controles.

En lo que respecta a las subpoblaciones de linfocitos T, el valor porcentual

de los linfocitos T CD4+ es menor en los pacientes leucémicos respecto a los

controles (p<0.05); sin embargo, al comparar las cifras absolutas se observa un

aumento de dicha subpoblación en el grupo de leucémicos (p=0.03). El valor

absoluto de los linfocitos T CD8+ totales en la población leucémica duplica al

hallado en los controles (figura 4.9). Este significativo aumento de los linfocitos

CD8+ se observa para las distintas intensidades de expresión del antígeno

(CD8fuerte y CD8moderado-débil), tanto en valores absolutos como porcentuales.

En consecuencia, el cociente CD4/CD8 está significativamente descendido en los

casos respecto a los controles.

Finalmente reseñar, que la población de linfocitos T dobles negativos

(CD3+/CD4-/CD8-) y linfocitos T dobles positivos (CD3+/CD4+/CD8+) se

encuentran significativamente aumentados en los pacientes leucémicos (figura

4.10). Así mismo, observamos diferencias en la intensidad de expresión del

antígeno CD8 en los linfocitos T dobles positivos y los linfocitos T CD8+/CD4-

(predominantes en sangre periférica), presentando en los primeros una expresión

débil-moderada y fuerte en los segundos.

147

En la tabla 4.21 se muestran los porcentajes de pacientes que presentan

valores patológicos de las distintas subpoblaciones linfocitarias respecto a los

controles, observándose que más de 2/3 de los pacientes muestran elevación del

valor absoluto de los linfocitos T (CD5+/CD19– y CD3+) y de la subpoblación

CD8+, en sus distintas intensidades de expresión del antígeno. Así mismo, más de

la mitad de los casos presentan un aumento del valor porcentual de dichos

linfocitos T CD8+.

5.2. Linfocitos B

El valor absoluto de los linfocitos B normales residuales en la sangre

periférica de los pacientes leucémicos (2.100x109/L), es significativamente

superior al grupo control (0.177x109/L) (p=0.009) (figura 4.11).

El estudio comparativo de la intensidad de expresión para el antígeno CD5

en linfocitos B tumorales, fenotípicamente definidos por la coexpresión de

CD19+/CD5+, y en los linfocitos T normales (CD5+/CD19-), muestra una

intensidad media de fluorescencia menor en la población tumoral (MFI=43.3)

respecto a los controles (MFI=88.4)(p=0.0001) (figura 4.12).

Ta

bla

4.2

0. C

om

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rac

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de

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9 /L

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cie

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Co

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Pa

cie

nte

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Co

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s

CD

5+

/CD

19

-

16,2

± 1

3,8*

71

,0 ±

6,9

2,

489

± 1,

941 *

1,

338

± 0,

441

CD

3+

16

,0 ±

13,

9*

71,3

± 6

,9

2,48

7 ±

2,05

1*

1,32

7 ±

0,48

4

CD

3+

/CD

4+

/CD

8-

54,3

± 14

,9

61,9

± 8

,2#

1,4

± 1,

3#

0,83

8 ±

0,32

0

CD

3+

/CD

8F+

/CD

4 -

38

,2 ±

14,

3#

30,7

± 6

,2

0,94

1± 0

,765

* 0,

430

± 0,

183

CD

3+

/CD

8M

-D+

/CD

4 -

3,3±

2,2

#

1,9

± 1,

3 0,

086

± 0,

095*

0,

025

± 0,

020

CD

3+

/CD

8T+

/CD

4 -

41

,1±

14,4

#

31,5

± 5

,9

1,01

7 ±

0,83

1*

0,45

8 ±

0,17

0

CD

3+

/CD

4+

/CD

8F+

0,

2± 0

,5#

0,14

± 0

,25

0,00

7 ±

0,03

5*

0,00

2 ±

0,00

4

CD

3+

/CD

4+

/CD

8T+

2,

6 ±

3,2*

1,

26 ±

1,3

6 0,

075

± 0,

170*

0,

018

± 0,

024

CD

3+

/CD

4+

/CD

8M

-D+

2,4

± 3,

0*

1,12

± 1

,24

0,06

8± 0

,137

* 0,

016

± 0,

021

CD

3+

/CD

4-/

CD

8-

4,0±

3,1

* 2,

7 ±

2,3

0,09

2 ±

0,10

1*

0,04

8 ±

0,0

39

Co

cie

nte

CD

4/C

D8

F

1,9±

1,8

#

2,1

± 0,

6

Co

cie

nte

C

D4

/CD

8T

1,6±

1,4

#

2 ±

0,6

#

p<

0.0

5; *

p<

0.01

148

Figura 4.8. Comparación de la población linfoide T general en los

pacientes y en el grupo control

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

CD3+ CD4+ CD8+

PacientesControles

149

Figura 4.9. Linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+

0

500

1000

1500

2000

2500

CD4+ CD8+

PacientesControles

Figura 4.10. Linfocitos T dobles negativos y linfocitos T dobles positivos en pacientes y controles

0

20

40

60

80

100

120

140

160

CD4+/C

D8+T

CD4+/C

D8+m-d

CD4-/CD8-

PacientesControles

150

151

Tabla 4.21

Porcentajes de pacientes que presentan valores patológicos de las distintas subpoblaciones T respecto a los controles

Subpoblaciones Porcentajes Células x109/L

Valores patológicos Valores patológicos

n % n %

CD5+/CD19 - 115 100 74 67.3

CD3+ 115 100 79 68.7 CD3+/CD4+/CD8- 17 14.8 65 56.5

CD3+/CD8F+/CD4 - 60 52.2 76 66.1

CD3+/CD8M-D+/CD4 - 49 42.6 73 63.5

CD3+/CD8T+/CD4 - 70 60.9 88 76.5

CD3+/CD4+/CD8F+ 15 13.0 28 24.3

CD3+/CD4+/CD8T+ 39 33.9 46 40.0

CD3+/CD4+/CD8M-D+ 41 35.7 54 47

CD3+/CD4-/CD8- 22 19.1 42 36.5

Cociente CD4/CD8F 26 22.6

Cociente CD4/CD8T 18 15.7

Figura 4.11. Valor absoluto de linfocitos B normales en pacientes y

controles

2100

177

0

500

1000

1500

2000

2500

Pacientes Controles

CD19+

Figura 4.12. Intensidad de expresión (MFI) para el marcador CD5 en

linfocitos B tumorales y linfocitos T normales

43

88

0102030405060708090

Linfocitos Btumorales

Linfocitos Tnormales

CD5+ MFI

Linfocitos B tumoralesLinfocitos T normales

152

153

6. RELACIÓN ENTRE LOS LINFOCITOS T DE LA LLC-B Y DISTINTOS

PARÁMETROS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO

6.1 Indicadores de carga tumoral

6.1.1. Estadios clínicos de Rai y de Binet

En la tabla 4.22, se muestra la relación entre las alteraciones de las

distintas subpoblaciones T en los pacientes leucémicos y los estadios clínicos de

Rai y de Binet de la LLC-B. Para establecer dicha relación los linfocitos T de los

pacientes han sido categorizados en dos grupos, según que la media presente

valores > o < respecto al mismo parámetro en los controles.

Los resultados muestran una correlación entre los estadios clínicos de Rai y

de Binet y el porcentaje de pacientes que presentan unas cifras de linfocitos T

CD8+ superiores a la media de los controles. Así, el aumento de la subpoblación

linfocitaria CD8+, definida desde el punto de vista fenotípico como

CD3+/CD8+/CD4-, es mayor en los estadios clínicos avanzados respecto a los

estadios precoces de la enfermedad. Esto es así, tanto para la población total

(CD3+/CD8T+/CD4-) como para aquella que presenta una intensidad fuerte de

expresión del antígeno (CD3+/CD8F+/CD4-) y que suele ser la población CD8+

mayoritaria en la sangre periférica. En la población CD8+ con una intensidad de

expresión del antígeno débil-moderada (CD3+/CD8m-d+/CD4-) se observa esta

tendencia, aunque sin alcanzar significación estadística.

Los linfocitos T dobles negativos, definidos desde el punto de vista

fenotípico como CD3+/CD4-/CD8-, muestran valores porcentuales

significativamente superiores a los controles, en una mayor proporción de

pacientes de los estadios avanzados (III y IV de la clasificación de Rai y C de la

154

clasificación de Binet) con respecto a los precoces (0 de Rai y A de Binet) o

intermedios (I-II de Rai y B de Binet) (figura 4.13 y 4.14).

Finalmente, el valor absoluto de la población CD3+ aumenta con los

estadios de Binet, pero dicha progresión no alcanza significación estadística (tabla

4.22).

6.1.2. Otros indicadores de carga tumoral

En las tablas 4.23 y 4.24 se expresan la relación entre los parámetros de los

linfocitos T y los siguientes indicadores de carga tumoral:

• Cifras elevadas de β2- microglobulina

• Cifras de linfocitos en sangre periférica al diagnóstico, categorizadas en > o

< de 30 x109/L

• Cifras elevadas de LDH

• Tiempo de duplicación del número de linfocitos en sangre periférica

• Porcentaje de células CD19+ en sangre periférica

• Valor absoluto de células CD19+ en sangre periférica

Los resultados muestran el porcentaje de pacientes que presentan un valor

porcentual (tabla 4.23) o absoluto (tabla 4.24) por encima de la media del grupo

control para cada uno de los parámetros.

La elevación de los linfocitos T CD8+ por encima de la media del grupo

control, es mas frecuente en los pacientes que presentan cifras aumentadas de β2-

microglobulina, unas cifras de linfocitos > 30 x109/L, LDH elevada, porcentaje de

células CD19+ >80% y un valor absoluto de células CD19+ > 20 x109/L, aunque,

tan solo se halló significación estadística con el valor absoluto de células CD19+ >

20 x109/L (tabla 4.25 y 4.26) y unas cifras de linfocitos en sangre periférica >30

x109/L (tabla 4.27).

155

Así mismo, la elevación de los linfocitos T dobles negativos (CD3+/CD4-

/CD8-) es significativamente mas frecuente en los pacientes que presentan un

valor porcentual de células CD19+ >80% (tabla 4.28), un valor absoluto de las

mismas >20 x109/L (tabla 4.29) y unas cifras de linfocitos en sangre periférica >30

x109/L (tabla 4.30).

A modo de resumen, podríamos decir que entre todas las subpoblaciones

linfocitarias son los linfocitos CD8+ y los linfocitos T dobles negativos los que se

relacionan con una mayor carga tumoral, especialmente con estadios avanzados

de Rai y de Binet y con cifras elevadas de linfocitos y células CD19+ en sangre

periférica (tabla 4.31).

6.2. Inmunofenotipo de las LLC-B

Se estableció una correlación entre las subpoblaciones T y los distintos

parámetros fenotípicos evaluados en las LLC-B; observando que los pacientes

que presentaban unas cifras de linfocitos T CD8+ superiores a la media de los

controles, mostraban un patrón fenotípico característico:

CD22+fuerte,moderado-heterogéneo/CD79Beta+moderado-heterogéneo/

CD23+fuerte-homogéneo/cadenas ligeras lambda+moderado-heterogéneo/ CD25+

El estudio comparativo de dicho patrón fenotípico con el patrón fenotípico

general de las LLC-B de nuestra serie, se muestra en la tabla 4.32; en ella, se

observa como en el grupo de pacientes que presentaban unas cifras de linfocitos

T CD8+ superiores a la media de los controles, la intensidad de expresión de

marcadores característicos de células B, CD22 y CD79Beta, era superior al grupo

general, así mismo mostraban un patrón de dispersión antigénica heterogéneo.

Respecto a los marcadores de activación celular, la positividad para el marcador

156

de activación celular CD25 fue superior en dicho grupo, así como, una mayor

intensidad de expresión del Ac Mo CD23 que mostró una distribución homogénea.

Finalmente, la evaluación de la clonalidad determinada por la expresión de una

única cadena ligera (kappa o lambda) sobre la membrana celular, mostró que en

el grupo de pacientes con cifras de linfocitos T CD8+ superiores a la media de los

controles, predominaba la expresión de la cadena ligera lambda de intensidad

moderada y un patrón de dispersión antigénica heterogéneo, frente a un

predominio de la cadena kappa de intensidad débil y distribución homogénea en el

grupo general de LLC-B.

El análisis de las características inmunofenotípicas de las LLC-B en los

pacientes que presentaban unos valores de linfocitos T dobles negativos

superiores a la media de los controles, a diferencia que lo sucedido en los

linfocitos T CD8+, no mostró un patrón fenotípico definido y característico de dicho

grupo.

6.3. Hipogammaglobulinemia

El análisis de la correlación de los linfocitos T con la

hipogammaglobulinemia, no mostró relación entre las alteraciones de las distintas

subpoblaciones T y el descenso de las Ig en la LLC-B de nuestra serie.

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CD

3+/C

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/CD

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15

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CD

3+/C

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/CD

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(70)

CD

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+/C

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(64)

44

(50)

43

(70)

33

(67)

50

(69)

41

(60)

43

(86)

50

(70)

CD

3+/C

D8

T+

/CD

4 -

50*

(77)

50

* (8

3)

61*

(78)

67

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2)

94*

(75)

53

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5)

80*

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) 86

* (7

5)

CD

3+/C

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/CD

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10

(27)

17

(22)

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31

(32)

10

(24)

14

(14)

25

(30)

CD

3+/C

D4+

/CD

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33

(40)

33

(33)

35

(39)

17

(17)

44

(56)

33

(39)

29

(29)

40

(50)

CD

3+/C

D4+

/CD

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-D+

36

(42)

33

(44)

35

(56)

17

(33)

44

(56)

35

(44)

29

(71)

40

(50)

CD

3+/C

D4-

/CD

8-

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(35)

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CD

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CD

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12

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0

15

157

158

Figura 4.13. Relación entre los linfocitos T CD8+ y linfocitos T dobles

negativos y el estadio clínico de Binet

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

Binet A Binet B Binet C

CD4-/CD8-CD8+

Figura 4.14. Relación entre los linfocitos T CD8+ y linfocitos T dobles

negativos y el estadio clínico de Rai.

0%20%40%

60%80%

100%120%

140%160%

Rai 0 Rai I Rai II Rai II RaiIV

CD4-/CD8-CD8+

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4.2

3.

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CD

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CD

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CD

3+/C

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T+

/CD

4 -

52

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58

68

59

70

65

50

57

64

56

69

CD

3+/C

D4+

/CD

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13

CD

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CD

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CD

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CD

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CD

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5.

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4.2

4.

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CD

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CD

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CD

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CD

3+/C

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CD

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CD

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CD

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09 /L.

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5.

160

Tabla 4.25

Relación entre el porcentaje de linfocitos T CD8+ con expresión fuerte del

antígeno y los valores de células CD19+

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor porcentual de

linfocitos T CD8+ con fuerte expresión antigénica, superiores o inferiores a la

media del grupo control, en los dos grupos categorizados según las cifras de

células CD19+.

CD19+

< 20x109 >20x109

Total

< Controles

n

% CD8+F

% del total

39

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16

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55

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47.8

> Controles

n

% CD8+ F

% del total

31

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29

64.4

25.2

60

52.2

52.2

Total

n

% CD8+ F

% del total

70

100

60.9

45

100

39.1

115

100

100

161

Tabla 4.26

Relación entre el valor absoluto de linfocitos T CD8+ con expresión fuerte

del antígeno y los valores de células CD19+

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de

linfocitos T CD8+ con fuerte expresión antigénica, superiores o inferiores a la

media del grupo control, en los dos grupos categorizados según las cifras de

células CD19+.

CD19+

< 20x109 >20x109

Total

< Controles

n

% CD8+F (v.abs)

% del total

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39

33.9

33.9

> Controles

n

% CD8+F (v.abs)

% del total

40

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36

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66.1

66.1

Total

n

% CD8+F (v.abs)

% del total

70

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60.9

45

100

39.1

115

100

100

162

Tabla 4.27

Relación entre los linfocitos T CD8+ totales

y las cifras de linfocitos en sangre periférica

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de

linfocitos T CD8+ totales, superiores o inferiores a la media del grupo control,

en los dos grupos categorizados según las cifras de linfocitos.

Linfocitos

< 30x109 >30x109

Total

< Controles

n

% CD8+T

% del total

25

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1.8

27

23.9

23.9

> Controles

n

% CD8+T

% del total

66

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58.4

20

90.9

17.7

86

76.1

76.1

Total

n

% CD8+T

% del total

91

100

80.5

22

100

19.5

113

100

100

163

Tabla 4.28

Relación entre los linfocitos T dobles negativos y el porcentaje de células CD19+ en sangre periférica

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de

linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo

control, en los dos grupos categorizados según el porcentaje de células

CD19+.

CD19+

< 80% >80%

Total

< Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

41

73.2

36.0

32

55.2

28.1

73

64.0

64.0

> Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

15

26.8

13.2

26

44.8

22.8

41

36.0

36.0

Total

n

% CD4-/CD8-

% del total

56

100

49.1

58

100

50.9

114

100

100

164

Tabla 4.29

Relación entre los linfocitos T dobles negativos y el valor absoluto de células CD19+ en sangre periférica

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de

linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo

control, en los dos grupos categorizados según las cifras de células CD19+.

CD19+

< 20x109 >20x109

Total

< Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

52

74.3

45.2

21

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18.3

73

63.5

63.5

> Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

18

25.7

15.7

24

53.3

20.9

42

36.5

36.5

Total

n

% CD4-/CD8-

% del total

70

100

60.9

45

100

39.1

115

100

100

165

Tabla 4.30

Relación entre los linfocitos T dobles negativos

y las cifras de linfocitos en sangre periférica

Los resultados indican los pacientes que presentan un valor porcentual de

linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo

control, en los dos grupos categorizados según las cifras de linfocitos.

Linfocitos

< 30x109 >30x109

Total

< Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

77

84.6

68.1

15

68.2

13.3

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81.4

81.4

> Controles

n

% CD4-/CD8-

% del total

14

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6.2

21

18.6

18.6

Total

n

% CD4-/CD8-

% del total

91

100

80.5

22

100

19.5

113

100

100

166

Tabla 4.31

Correlación entre las subpoblaciones linfocitarias T

y el aumento de masa tumoral

La tabla muestra las subpoblaciones T que presentan correlaciones

significativas positivas con un aumento de la masa tumoral

Subpoblaciones Parámetros de carga tumoral

CD3+/CD8+/CD4 - Rai/Binet CD19+ > 20x109 Linfocitos >30x109

CD3+/CD4 -/CD8 - Rai/Binet CD19+ > 20x109

CD19+ > 80% Linfocitos > 30x109

167

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168

DISCUSIÓN

170

Los SLPC con expresión hemoperiférica constituyen una serie de

neoplasias hematológicas caracterizadas por la existencia de una proliferación

clonal de células linfoides maduras no inmunocompetentes en sangre

periférica. Aparecen generalmente en personas de edad avanzada, con un

cuadro clínico derivado de la presencia de síntomas constitucionales y de la

infiltración de órganos linfoides (adenopatías, esplenomegalia, etc). Desde un

punto de vista biológico, el rasgo más característico es la leucocitosis periférica

a expensas de células linfoides. El curso clínico, como su propio nombre indica,

es relativamente prolongado, si bien hay casos de evolución abrupta. Junto a

estos rasgos comunes existen importantes diferencias que confieren entidad

propia a cada una de estas enfermedades. La leucemia linfática crónica es la

enfermedad más característica y representativas de los SLPC.

La clasificación de los SLPC ha sido motivo de conflicto durante muchos

años para patólogos, citólogos y clínicos, y ha sufrido múltiples modificaciones

a lo largo del tiempo. Los avances en el conocimiento del inmunofenotipo y de

las alteraciones cromosómicas en las neoplasias linfoides malignas dieron

lugar, en el año 1993, a la aparición de una clasificación de estos síndromes

conocida bajo el nombre de REAL (Revised European-American Classification

of Lymphoid Neoplasm) (Harris y cols, 1994) en la que según la estirpe de la

célula neoplásica, los SLPC se clasifican en SLPC de origen B o de origen T.

Recientemente y por iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS),

las sociedades Americana y Europea de Hematología, han elaborado una

nueva clasificación de las neoplasias linfoides, en ella sólo se reconocen

enfermedades con características biológicas y clínicas definidas; la leucemia

linfática crónica se incluye dentro de las neoplasias de células B maduras

(Harris y cols, 1999).

El diagnóstico diferencial de estos procesos tiene gran importancia

clínica, ya que el pronóstico y el tratamiento dependen de la identificación

precisa de cada una de estas entidades. En este sentido, el inmunofenotipaje

171

celular por CMF contribuye de forma decisiva a la investigación del origen

celular de estas hemopatías, a su diagnóstico y clasificación.

La CMF constituye un método de análisis celular, mediante el estudio de

diversas propiedades físico-químicas y biológicas de la célula, que alcanza

especial relevancia al permitir un diagnóstico diferencial rápido entre una

linfocitosis reactiva y un proceso monoclonal tumoral. Su reciente introducción

en el análisis inmunofenotípico de las células linfoides, ha permitido establecer

el origen celular y estadio de maduración de los SLPC, así como, su

clasificación en neoplasias de origen B y T. El análisis multiparamétrico junto

con el enorme catálogo de AcMo del que se dispone en la actualidad, la han

convertido en una herramienta fundamental para delinear la diferenciación de

las células hematopoyéticas normales, al tiempo que han permitido clasificar

las neoplasias derivadas de estas células de acuerdo con la ontogenia de las

mismas.

La realización de un estudio inmunofenotípico por CMF precisa de la

combinación de varios marcadores inmunológicos, ya que el análisis de

marcadores aislados es insuficiente para distinguir entre los distintos procesos

linfoproliferativos. La LLC-B tiene un perfil inmunológico característico, pero

ningún marcador le es absolutamente específico. Diversos investigadores han

intentado establecer un sistema de puntuación incluyendo varios AcMo para

tener una aproximación diagnóstica fiable (Kurec y cols, 1992; Molica y cols,

1998). De ellos destaca por su fácil reproductividad, accesibilidad y simplicidad,

el creado por Matutes y cols en 1997, que utiliza cinco marcadores, valorando

su presencia o ausencia así como su intensidad de expresión, permitiendo

diferenciar la LLC-B de otros procesos linfoproliferativos B con expresión

leucémica.

La LLC-B es, como ya se ha mencionado, la entidad más representativa

de los SLPC. Es una enfermedad caracterizada por la proliferación y

acumulación de linfocitos no inmunocompetentes de pequeño tamaño, aspecto

172

maduro y fenotipo B. Es la forma de leucemia más frecuente en los países

occidentales, se presenta en personas adultas y su incidencia aumenta con la

edad. Las manifestaciones clínicas se deben a la infiltración progresiva de la

médula ósea, ganglios linfáticos y otros tejidos por linfocitos tumorales, así

como a las alteraciones inmunológicas que acompañan a la enfermedad.

Desde el punto de vista inmunofenotípico, las células de la LLC-B

expresan marcadores B con intensidad inferior a la de los linfocitos B maduros

normales de sangre periférica, y tienen Ig de superficie, cuya monoclonalidad

viene determinada por la expresión de una única cadena ligera sobre la

membrana celular. Una característica altamente relevante, es que estas células

leucémicas suelen expresar CD5 (un antígeno inicialmente descrito como

específico de células T), aunque un porcentaje pequeño de casos puede ser

CD5 negativos.

Los criterios diagnósticos para la LLC-B han sido establecidos de forma

independiente por dos grupos de trabajo: el International Workshop on Chronic

Lymphocytic Leukemia (IWCLL) (1989) y el National Cancer Institute-

Sponsored Working Group (NCI) (1996), y en esencia son la presencia de

linfocitosis, morfología típica y fenotipo compatible con este tipo de leucémia.

El curso clínico es sumamente variable: la mediana de supervivencia es

de unos 8 años, pero hay pacientes que fallecen al poco tiempo de ser

diagnosticados y otros cuya esperanza de vida no se ve afectada por la

enfermedad. En este sentido, la introducción de los estadios clínicos ha

significado un gran avance en el pronóstico, siendo los sistemas más utilizados

el de Rai y el de Binet. Finalmente, aunque se han producido avances en el

tratamiento, en la mayoría de los casos la LLC-B es una enfermedad incurable.

173

1. CRITERIOS DE SELECCIÓN

En nuestro estudio una de las premisas fundamentales fue la utilización de

unos criterios de inclusión y exclusión claros y exhaustivos, con la finalidad de

seleccionar tan solo aquellos casos que realmente correspondían a LLC-B. Tal

rigurosidad obedece a que los procesos linfoproliferativos incluyen una amplia

variedad de enfermedades, que en ocasiones pueden presentar datos

comunes que dificultan el diagnóstico y refleja la heterogeneidad de estos

procesos.

En este sentido, elegimos los criterios diagnósticos establecidos por el

NCI porque a diferencia del IWCLL, exige la demostración de clonalidad,

mediante técnicas de inmunofenotipaje por CMF, sobre la base de la expresión

de cadenas ligeras kappa o lambda en la superficie celular, siendo a nuestro

juicio un requisito imprescindible para diferenciar los procesos tumorales de las

linfocitosis reactivas. Así mismo, el NCI detalla aquellas características

morfológicas y fenotípicas que deben presentar las células leucémicas, y

considera que la realización de aspirado y biopsia de médula ósea no es

necesaria para establecer el diagnóstico, motivo por el cual dicho parámetro no

ha sido incluido en el estudio.

Desde un punto de vista inmunofenotípico, solo se incluyeron los casos

de LLC-B positivas para el AcMo CD5, siguiendo las recomendaciones para la

realización de ensayos clínicos establecidas por el National Cancer Institute-

Sponsored Working Group (Cheson y cols, 1988), pues existe controversia

sobre la autenticidad de aquellas LLC-B que son negativas para dicho AcMo.

Con este criterio se pretende incluir en los ensayos clínicos tan solo aquellos

procesos que realmente corresponde a la LLC-B, evitando el sesgo que

representaría la inclusión de otros cuadros linfoproliferativos distintos a este

tipo de leucemias. Para la diferenciación inmunofenotípica de los SLPC se

eligió el sistema de puntuación elaborado por el grupo de Matutes y cols.

debido a que es el más ampliamente utilizado y punto de referencia para poder

174

comparar nuestros resultados con los publicados por otros autores; se han

incluido las leucemias que presentaban una puntuación alta (4 o 5), indicando

un patrón inmunológico típico, y en aquellos casos con puntuaciones inferiores

a 4 fue necesaria la realización de biopsia ganglionar y de médula ósea para

confirmar el diagnóstico.

Con la finalidad de asegurar la expresión hemoperiférica del proceso

neoplásico se estableció que las células leucémicas debían representar más

del 50% de la población linfoide de sangre periférica, de acuerdo con lo

establecido por Moreau y cols (1997) y Newman y cols (1993).

Los criterios de inclusión del grupo control se realizaron de acuerdo con

las recomendaciones establecidas por la International Federation of Clinical

Chemistry (IFCC, 1987) para la elaboración de valores de referencia.

Finalmente, el análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones

linfocitarias T constituía uno de los aspectos básicos del estudio, por ello, se

excluyeron aquellos pacientes que presentaban patología concomitante que

pudiese alterar los linfocitos T (enfermedades autoinmune, infecciones víricas,

administración de tratamientos inmunosupresores, etc).

2. DATOS EPIDEMIOLÓGICOS

La LLC-B, como se ha expuesto previamente, es la leucemia más

frecuente del adulto en los países occidentales, representando alrededor del

30% de todas las leucemias y el 90% de las leucemias crónicas. Su incidencia

ha ido aumentando en los últimos años, reflejando no solo un incremento real

de la misma sino también un cambio en la disponibilidad de métodos

diagnósticos y la práctica creciente de análisis de forma rutinaria. En nuestra

serie ésta se cifra en 3,5 casos nuevos por 100.000 habitantes y año, dato que

se aproxima a lo publicado en revisiones recientes por Kipps (2000) y Bosch

(2002), y difiere de lo descrito en la década de los 80 que se situaba en torno al

1.5 (Dighiero y cols, 1991; Foon y cols, 1990). Por último, señalar que la

175

incidencia en nuestra serie es aproximada, ya que el estudio no está diseñado

para la realización de un análisis epidemiológico de la población, y contó con

determinados elementos de confusión, pues la introducción de la CMF en

nuestra área hospitalaria, supuso la confirmación diagnóstica de linfocitosis

seguidas en consultas externas con anterioridad.

En nuestro estudio la edad media de los enfermos en el momento del

diagnóstico fue de 66 años, reflejando la tendencia actual de un aumento de la

misma, que la cifra en torno a 65-70 años (Bosch, 2002; Keating, 1999), lo que

contrasta con los 60 años de hace unas décadas (Gale y Foon, 1987). Estos

cambios pueden ser el resultado del aumento de la esperanza de vida en la

población general. Sin embargo, debido a la práctica creciente de análisis de

forma rutinaria, el diagnóstico se realiza cada vez con mayor frecuencia en

personas relativamente jóvenes; así, en los últimos años se ha observado un

creciente número de pacientes diagnosticado con menos de 50 años de edad;

en nuestra serie estos representan un 11% de todos los casos, coincidiendo

con los datos aportados recientemente que lo cifran en un 10-15% (Bosch y

Monserrat, 2002; Wierda y Kipps, 1999), frente al 5-7% en las series de Molica

(1994) y Catovsky (1995) a mediados de los 90. Además, coincidiendo con el

resto de autores observamos un predomio del sexo masculino (1,3:1).

3. PARÁMETROS CLÍNICOS Y BIOLÓGICOS EN LOS PACIENTES

LEUCÉMICOS

3.1. Población leucémica general

En nuestra serie el motivo de consulta más frecuente fue la realización

de un hemograma de rutina en personas asintomáticas, representando el 68%

de los casos, coincidente con los últimos datos publicados por el grupo de

Bosch y Montserrat (2002). En el resto de los pacientes la astenia, la anorexia y

los procesos infecciosos de repetición fueron las manifestaciones más

frecuentes que llevaron a la sospecha clínica y posterior diagnóstico del

176

proceso leucémico. A diferencia de lo que ocurre en los linfomas, la fiebre de

origen tumoral, la sudoración y la pérdida de peso, fueron poco frecuentes

como forma de presentación de la enfermedad, lo que concuerda con lo

publicado en por otros autores (Monserrat y Rozman, 1995; Monserrat y cols,

1997).

La exploración física puede ser completamente normal, no se detectó

afectación de territorios adenopáticos en el 67% de los casos, datos algo más

elevados que lo reseñado de forma clásica en la literatura que lo cifraba en un

40% (Rozman y Monserrat, 1995), pero que se asemejan a las series actuales

(Bosch y Monserrat, 2002).

El curso clínico de los pacientes con LLC-B es muy variable de un

enfermo a otro. El pronóstico puede variar desde una corta supervivencia hasta

una esperanza de vida igual a la de la población con la misma edad y sexo. A

partir de la idea de que las manifestaciones de la LLC-B se deben a la

acumulación progresiva de linfocitos, se han establecido diversos sistemas de

clasificación por estadios clínicos que reflejan la masa tumoral. La utilización de

los estadios clínicos significó un gran avance en el pronóstico y actualmente

constituyen el parámetro pronóstico más útil en la LLC-B. Los sistemas más

utilizados son el de Rai y el de Binet. La supervivencia disminuye desde los

estadios iniciales (0 de Rai y A de Binet) a los estadios avanzados (III y IV de

Rai y C de Binet). Con respecto a las formas más avanzadas de la enfermedad,

definidas por la presencia de anemia y/o trombopenia, es de reseñar que en

estos sistemas de estadiaje no se establece ninguna distinción en función del

mecanismo de la citopenia: infiltración de la médula ósea, hiperesplenismo o

inmune. La mayoría de los autores han sugerido que los enfermos con

citopenias de origen inmune tendrían un pronóstico mejor que aquellos en los

que la anemia o la trombopenia se deben a la infiltración medular (Mauro y

cols, 2000; Pritsch y cols, 1998; Sthoeger y cols, 1993). De acuerdo con ello,

en nuestro estudio las citopenias de etiología inmune no han sido consideradas

como definitorias de estadiaje, ya que consideramos que no se correlacionan

177

necesariamente con la masa tumoral. La utilización de uno u otro sistema de

estadiaje clínico depende de los grupos de trabajo, los investigadores europeos

tienden a emplear el sistema de Binet, mientras que los americanos suelen

utilizar el de Rai. En nuestra serie hemos incluido ambos porque pensamos que

pueden aportar información complementaria, tal como indican las

recomendaciones para la realización de ensayos clínicos establecidas por el

National Cancer Institute-Sponsored Working Group. Con ambos métodos

observamos un claro predominio de estadios precoces de la enfermedad en el

momento del diagnóstico.

El análisis de los parámetros clínicos de nuestra población, indican que

en la actualidad el aumento de la esperanza de vida, junto con la implantación

de los exámenes de salud preventivos y los avances tecnológicos en el área

diagnóstica, han llevado a un aumento en la incidencia de la LLC-B, junto con

un cambio en la forma de presentación, detectándose un predominio de las

fases asintomáticas y un aumento del porcentaje de pacientes con edades más

tempranas.

Entre los hallazgos de laboratorio, la característica principal de este tipo

de leucemias es la linfocitosis absoluta en sangre periférica, que puede

oscilar entre 5 x 109/L, hasta más de 100 x 109/L, pero la mayoría de los casos

se diagnostican con una linfocitosis moderada (20-50 x 109/L). Estos datos

concuerdan con los obtenidos en nuestra serie, en la cual la mayoría de los

pacientes presentaban unas cifras de linfocitos < a 30 x 109/L y tan solo en una

minoría de casos la linfocitosis era superior a 50 x 109/L. Los histogramas

bioparamétricos proporcionados por los actuales analizadores hematológicos

facilitan la detección de los casos con linfocitosis leve. Así, en nuestra serie

observamos que una cuarta parte de la población leucémica presentaba unas

cifras de linfocitos al diagnóstico inferior a 15 x 109/L.

El estudio morfológico de sangre periférica muestra unos linfocitos de

aspecto maduro, cromatina condensada en grumos, citoplasma agranular y

178

escaso, y la presencia de las características sombras de Gümprecht

producidas por la rotura mecánica de las células al realizar la extensión. Puede

haber un pequeño porcentaje de linfocitos que presenten hendiduras nucleares

(linfocitos hendidos) y otros con nucléolos (prolinfocitos). En nuestro estudio el

porcentaje de linfocitos debía ser inferior al 55%, ya que un valor superior

definiría otro tipo de proceso linfoproliferativo crónico como es la leucemia

prolinfocítica de estirpe B.

La anemia se detecta de forma inicial en el 15-20% de los casos. En

ocasiones es de carácter autoinmune, aunque los signos indirectos de

hemólisis (por ejemplo, reticulocitos) pueden faltar o ser poco evidentes. Por

ello, en todos los casos de LLC-B procede estudiar el test de Coombs, que es

positivo en un 15-35% de los casos, al inicio de la enfermedad o durante su

evolución, coincidiendo estos datos con los hallados en nuestra serie (12%).

Otras causas implicadas en la producción de anemia son: reducción en la

producción de hematíes asociada a una infiltración masiva de la médula ósea,

secuestro esplénico o aplasia pura de serie roja de probable etiología inmune.

La trombopenia es menos frecuente y en nuestra serie se presentó en un 3%

de los casos.

Respecto a los parámetros bioquímicos, es de reseñar, el hallazgo en

nuestra serie de un significativo porcentaje de pacientes que presentaban

alteración de la función hepática, (patrón de citolisis), en los cuales se

descartó patología concomitante causante de daño hepático. En la bibliografía

revisada no hemos encontrado la prevalencia general de este tipo de alteración

en la LLC-B, por lo que no podemos realizar un análisis comparativo de

nuestros resultados. Pensamos que la causa de esta alteración es la infiltración

leucémica hepática, que no conlleva a una insuficiencia hepatocelular grave,

por lo cual tan solo se realizaron controles analíticos periódicos sin estudio

histológico que hubiese conducido a un diagnóstico etiológico.

179

La hipogammaglobulinemia es frecuente (20-60% de los casos), sobre

todo en los pacientes con enfermedad avanzada. La Ig que con mayor

frecuencia se halla descendida es la IgM . En el 5-10% de los casos puede

detectarse una gammapatía monoclonal (sobre todo IgM o IgG). Esta gran

variabilidad en el porcentaje de casos que presentan hipogammaglobulinemia,

puede indicar la disparidad de criterios respecto a las determinaciones a

realizar en el diagnóstico y seguimiento de estos pacientes. En nuestra serie

ésta se cifra en un porcentaje elevado (50%), lo cual puede ser el reflejo de la

realización de dosificaciones periódicas de Ig en el curso evolutivo de la

enfermedad.

Finalmente, reseñar que los datos epidemiológicos y los parámetros

clínicos-biológicos que definen la población leucémica incluida en el estudio,

son coincidentes con lo publicado en la literatura por otros grupos de trabajo, lo

que sugiere que la muestra elegida es representativa de este tipo de neoplasia,

sin sesgos de selección importantes. Aspecto este que consideramos de una

gran relevancia para poder extraer conclusiones fiables del estudio

inmunofenotípico realizado sobre este grupo poblacional.

3.2. Pacientes menores de 60 años

La incidencia de la LLC-B varía con la edad, tal como se ha señalado

previamente; así, mientras que en los individuos menores de 30 años la

incidencia es inferior a un caso por cada 100.000 habitantes y año, en

pacientes mayores de 80 años es de 25 casos por 100.000 habitantes y año.

En la última década, se ha observado un interés creciente en evaluar la

influencia de la edad en la forma de presentación, el curso clínico y el

pronóstico de la enfermedad. Los enfermos jóvenes y mayores tienen una

mediana de supervivencia similar (de aproximadamente 10 años), pero las

causas de fallecimiento son diferentes. Mientras que los pacientes jóvenes

fallecen por causas relacionadas con la leucemia, hay una notable proporción

de enfermos mayores que fallecen por otras causas no relacionadas con el

180

proceso neoplásico, pues estos pacientes presentan un mayor número de

enfermedades intercurrentes, lo que podría influir en la supervivencia global y

en la tolerancia a los diferentes tratamientos.

En 1991 el Grupo Cooperativo Español para LLC, en un estudio

retrospectivo y multicéntrico, realizó un análisis comparativo respecto a la

forma de presentación y los factores pronósticos de este tipo de leucemias en

pacientes menores y mayores de 50 años, observando un incremento en la

proporción del sexo masculino y unos niveles mayores de las cifras de

hemoglobina en el grupo de pacientes jóvenes, no hallando diferencias

respecto a indicadores de carga tumoral como son los estadios clínicos de Rai

y de Binet, el contaje de linfocitos en sangre periférica y el tiempo de

duplicación linfocitaria. Así mismo, concluyeron que los factores pronósticos

que clásicamente se utilizaban en los pacientes mayores, eran igualmente

útiles en los pacientes jóvenes (Monserrat y cols, 1991). Estos resultados

fueron confirmados por otros estudios, entre los que destaca el realizado por

Mauro y cols. (1999), reafirmando que la mayoría de las características

examinadas eran similares entre los dos grupos, excepto para la concentración

de hemoglobina, la cual era 1 g/dL mayor en los pacientes jóvenes, y el

predomino del sexo masculino en dicho grupo. El límite de edad para la

inclusión de los pacientes en cada grupo varió según la series de 50 a 55 años.

En nuestro trabajo el límite para definir los grupos en función de la edad

se estableció en 60 años por varios motivos. En primer lugar porque se trata de

un estudio que incluye una única área hospitalaria (no-multicéntrico) y el

número de pacientes con edad < 50 años era bajo, lo cual dificultaba el análisis

comparativo. En segundo lugar, consideramos que esta división es más útil en

la práctica clínica, ya que los avances técnicos y el mayor conocimiento de las

medidas de soporte, han hecho posible que el límite de edad para la inclusión

de los pacientes en programas de quimioterapia intensiva (trasplante de

médula ósea) haya ido aumentando, situándose actualmente en este nivel (60

años). Nuestros resultados, de acuerdo con lo previamente descrito, muestran

181

un predominio del sexo masculino y unos niveles mayores de las cifras de

hemoglobina (1 g/dL) en el grupo de menores de 60 años. El predominio del

sexo masculino, que llevaría a un aumento de las cifras de hemoglobina en el

grupo, podría ser explicado por una hipotética función endocrina protectora en

las mujeres. El hallazgo de un aumento del porcentaje de pacientes

sintomáticos al diagnóstico en el grupo de menores de 60 años, junto con unas

cifras de linfocitos y LDH mas elevadas, así como un aumento de la

hipogammaglogulinemia (dato no recogido en otras series), podría sugerir una

evolución clínica diferente en dicho grupo. El situar el límite para la definición

de los dos grupos etarios en los 60 años frente a los 50-55 años establecido

por otros autores, puede reflejar, de una forma más precisa, la influencia de la

edad en el curso clínico y pronóstico de la enfermedad, no obstante, estos

datos tendrían que ser confirmados con otras series.

4. ESTUDIO INMUNOFENOTÍPICO

Los avances en el diagnóstico hematológico han ido asociados a la

incorporación de nuevas técnicas, que han contribuido a conseguir una mayor

objetividad y reproductividad diagnósticas, como punto de partida para la

utilización de una uniformidad de criterios. Así, al diagnóstico clínico en

hematología se ha unido el examen morfológico, las tinciones citoquímicas, el

recuento celular, los análisis citogenéticos, bioquímicos y moleculares. Más

recientemente, el estudio inmunofenotípico se ha incorporado a la batería

tecnológica, empleada en el diagnóstico hematológico.

En nuestro estudio la técnica utilizada para realizar el análisis

inmunofenotípico ha sido la CMF, que constituye un método reciente e

innovador de análisis celular, basado en el estudio de diversas propiedades

físico-químicas y biológicas de la célula, incluida en un flujo de líquido

isotónico, aportando fundamentalmente la posibilidad de realizar un análisis

multiparamétrico y célula a célula, de gran rapidez, sensibilidad y objetividad.

182

En ella se conjugan diversas tecnologías, como son la producción de

AcMo, la química de los fluorocromos, las tinciones citoquímicas, la tecnología

láser y la informática. El desarrollo sufrido por la informática en los últimos años

ha hecho posible que, de los primeros citómetros de flujo complejos y difíciles

de manejar, haya surgido una nueva generación de instrumentos pequeños y

sencillos que se han incorporado a la rutina de muchos laboratorios clínicos. La

hematología ha sido, sin duda, una de las especialidades biomédicas que más

se ha beneficiado de estas transformaciones debido, entre otros motivos, a la

facilidad en obtener células monodispersas en suspensión tanto a partir de

sangre periférica como de los órganos hematopoyéticos, al gran monomorfismo

celular de las hemopatías malignas y a la relativa facilidad para obtener

muestras para realizar estudios secuenciales en los pacientes hematológicos.

4.1. Control de calidad

En hematología, el laboratorio tiene como finalidad realizar medidas

(cualitativas, cuantitativas o estructurales) sobre materias o sistemas

relacionados con la sangre o los órganos hematopoyéticos que contribuyan al

diagnóstico, tratamiento o pronóstico de las enfermedades. Por ello, es de

extraordinaria importancia clínica que todas y cada una de las operaciones que

intervienen en la realización de estas medidas cumplan criterios de calidad.

Estos criterios no sólo afectan las etapas o fases implicadas en la realización

de los procesos analíticos o técnicas propiamente dichas (fase analítica), sino

también todos los procesos indirectamente relacionados con ellos y que se

realizarán antes (fase preanalítica) o después de ella.

Entre los procesos inherentes a la fase preanalítica destacan la solicitud

de las pruebas, la obtención de las muestras y la identificación de los

especimenes, y su transporte al laboratorio. La fase analítica propiamente

dicha, consiste en la realización técnica de las pruebas.

183

En citometría de flujo, como en todas las técnicas analíticas, para

proporcionar unos buenos resultados es fundamental un adecuado programa

de garantía de calidad, que implica la optimización del análisis, de forma que

las células idénticas den los mismos resultados en una muestra, en distintas

muestras en un mismo día, y día a día en un laboratorio, así como en distintos

laboratorios.

Por todo lo expuesto previamente, para conseguir el mayor grado

posible de rigor científico en la realización de un estudio, adquiere un papel

fundamental la garantía de calidad. Conscientes de todo ello, en este trabajo se

ha considerado un aspecto preponderante el control de calidad, estableciendo

unos criterios claros y estrictos, tanto en la fase preanalítica como en la

analítica, con el fin de garantizar la fiabilidad de los resultados.

4.1.1. Fase preanalítica

En la LLC-B la célula leucémica está presente tanto en médula ósea

como en sangre periférica, presentando el mismo perfil inmunológico en ambas

localizaciones. En nuestro estudio se eligió el análisis inmunofenotípico en

sangre periférica por su fácil accesibilidad, que nos permitía repetir la

extracción en caso de necesitar ampliar el estudio o confirmar determinados

resultados. Respecto al material utilizado para depositar la muestra, este puede

variar según los laboratorios (tubo con heparina, EDTA, etc), en nuestro caso,

seguimos las recomendaciones del International Council for Standardization in

Haematology que aconseja la utilización de un tubo que contenga EDTA como

anticoagulante (Vives y Aguilar, 1997), porque pensamos que es conveniente

seguir métodos estandarizados y aceptados por la mayoría de los grupos de

trabajo. Otro aspecto que consideramos importante fue la identificación de la

muestra, por ello, para evitar errores en esta fase del proceso analítico se

tomaron una serie de medidas, tal como se ha expuesto en el apartado de

material y métodos (doble sistema de identificación, extracción de la muestra

en la Unidad de Citometría), que aunque exhaustivas las consideramos

184

necesarias, ya que, en el laboratorio donde se realizó el estudio se procesan

una gran cantidad de muestras y se realiza análisis por CMF no sólo para los

procesos neoplásicos hematológicos, sino también para subpoblaciones

linfocitarias en pacientes inmunodeprimidos, en un espacio físico cercano.

Por último, reseñar que la temperatura y el tiempo de transporte y

almacenamiento pueden influir sobre la viabilidad celular y la expresión

antigénica, alterando de esta manera las poblaciones celulares, por ello en la

mayoría de los casos las muestras se procesaban en el día. En los casos en

los que fue necesario su almacenamiento, éste se realizó siguiendo las

recomendaciones del grupo de Orfao, por ser las más ampliamente aceptadas

por la mayoría de los laboratorios (Orfao y González de Buitrago, 1995)

4.1.2. Fase analítica

En la fase analítica es imprescindible emplear técnicas estandarizadas,

equipos convenientemente calibrados y reactivos de calidad garantizada. La

calidad de la fase analítica exige, además de la correcta selección de las

técnicas a emplear, la utilización de materiales de control.

Los reactivos empleados en este trabajo cumplen una serie de requisitos

que consideramos de gran importancia para obtener información sobre la

estructura y la distribución antigénica celular. Así los fluorocromos utilizados

presentan las siguientes características:

• Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación

(probabilidad de absorber la luz).

• Alto rendimiento cuántico (emisión de luz).

• Elevada foestabilidad.

• Corto estado de excitación.

185

El sistema de calibración del citómetro de flujo es un aspecto básico y

fundamental de todo el proceso técnico, ya que garantiza la optimización de la

recogida de la señal óptica y el funcionamiento global de la electrónica del

aparato, asegurando la fiabilidad de los resultados obtenidos. En la citometría

de flujo la calibración es el proceso por el cual se enfoca ópticamente el láser y

se mide su potencia. Un aspecto fundamental en el proceso de calibración es la

compensación de fluorescencia. Para la mayoría de los fluorocromos utilizados

en los marcajes múltiples con AcMo, existe un cierto grado de interferencia al

introducirse la luz emitida por un fluorocromo concreto en más de un detector

de fluorescencia, ya que los espectros de emisión de los fluorocromos son

relativamente amplios. Con el fin de resolver este problema, se ha hecho

necesaria la compensación de fluorescencias como fase final del sistema de

calibración. Así pues, este proceso consiste en eliminar de un detector de

fluorescencia toda la señal correspondiente a un fluorocromo cuya luz no debe

recogerse y leerse en ese detector. De esta forma, se consigue que la señal

procesada en cada detector corresponda de forma exclusiva a la luz de un

fluorocromo y por lo tanto de un anticuerpo monoclonal/antígeno específico.

El sistema de calibración utilizado ha sido el método descrito por el

grupo de Orfao (Ciudad y cols, 1998) que utiliza sangre periférica en lugar de

microesferas comerciales. Este aspecto lo consideramos primordial, pues las

células sanguíneas presentan una autofluorescencia natural que hay que tener

en cuenta para realizar un ajuste adecuado de los distintos fluorocromos. En

los sistemas que utilizan las microesferas se puede cometer el error de

considerar como positivo un marcador cuando tan sólo indica un

desplazamiento del mismo por la autofluorescencia natural de las células

sanguíneas.

El control de calidad interno tiene como objetivo garantizar la fiabilidad

de las determinaciones que se realizan en el laboratorio e incide sobre todos y

cada uno de los procesos que se desarrollan en éste, de forma que la

relevancia clínica del resultado (es decir, su contribución al diagnóstico, el

186

tratamiento o la prevención de la enfermedad) quede siempre garantizada.

Para ello, el control de calidad interno consiste en disponer de todos los medios

adecuados para reconocer posibles errores y aplicar, en su caso, las medidas

correctoras necesarias.

En este trabajo se ha orientado el control de calidad interno en dos

aspectos fundamentales: la utilización de especimenes de control y el empleo

de un sistema que nos permita establecer la exactitud de la técnica. Los

controles son un material que produce unos resultados esperados (conocidos).

Se usan para monitorizar las prestaciones o reproductividad de los reactivos y

la calidad de los métodos de preparación celular. En nuestro trabajo se han

utilizado dos tipos de controles: positivos (reactivo que se debe unir a la

superficie de las células incluidas en la muestra) y negativos (reactivo contra

antígenos no presente en la superficie de las células utilizadas en la muestra).

Se necesitan controles negativos para descartar uniones inespecíficas del

fluorocromo (son causa de tinción inespecífica los fragmentos Fc de las

inmunoglobulinas, las células muertas, debrís, etc.) y seleccionar el umbral de

autofluorescencia. Los controles positivos son también esenciales para

comprobar que la técnica funciona, si no se emplean, los resultados negativos

de una muestra que se espera positiva no se sabe si son por alteración

antigénica o fallo en el marcaje. Para el control de exactitud se ha admitido,

que la diferencia entre los dos marcadores que miden la misma población de

linfocitos T, no sea superior al 5%; se ha establecido un porcentaje más

restrictivo que en otros trabajos publicados que admiten el 10% de porcentaje

diferencial (Ciudad y cols, 1998; Urbano y Villamayor, 1992) porque

consideramos que éste es un aspecto esencial en el control de calidad de la

técnica.

187

4.2. Criterios de positividad, intensidad de expresión y patrón de

dispersión para un antígeno

El análisis de los distintos antígenos expresados en la superficie celular

suele ser cuantitativo y definido en base a la positividad o negatividad de los

mismos. Así, el criterio de positividad establecido en nuestro estudio ha sido el

aceptado por la mayoría de los autores, que de forma arbitraria, consideran un

marcador positivo cuando se expresa en más del 20% de las células tumorales

(Lopez-Matas y cols, 2000; Molica y cols, 1998).

Para un análisis más completo de los antígenos celulares, incluimos

otros parámetros que ofrecieran una información más detallada y compleja

sobre la composición antigénica celular, así, se determinó el número de

moléculas de un antígeno expresadas en cada célula o intensidad de

expresión, y la homogeneidad o heterogeneidad en la expresión del mismo.

Esta información se obtuvo a través de dos métodos diferentes con la finalidad

de incrementar la veracidad de los resultados; un método establecido por el

grupo de Matutes (1994) y Orfao (1999), caracterizado por su simplicidad y

rapidez, basado en los valores logarítmicos expresados en los histogramas de

las fluorescencias; el segundo método, utilizado por algunos grupos de

investigadores como Molica (1998) y Lavabre (1994), es más complejo y

precisa consultar con el sistema estadístico del programa informático del

citómetro de flujo para determinar el MFI y CV de cada marcador. Es

interesante reseñar que los resultados son similares por ambos sistemas de

trabajo, por lo que se aconseja utilizar la técnica de Matutes y Orfao por las

ventajas, simplicidad y reproductividad, que supone su empleo en el estudio

inmunofenotipo que se realiza en los laboratorios de rutina.

4.3. Análisis inmunofenotípico de las LLC-B

Los linfocitos B maduros pasan de la médula ósea a la sangre periférica

(donde constituyen el 10-20% del pool de linfocitos circulantes) y se dirigen a

188

los órganos linfáticos periféricos para ubicarse en los folículos linfoides. Aquí,

bajo un estímulo antigénico adecuado, se activan y proliferan formando el

centro germinal en el interior del folículo linfoide. Si no se produce contacto con

el antígeno, los linfocitos regresan de nuevo a la circulación y mantienen su

comportamiento migratorio. Hay que considerar que la mayoría de los linfocitos

B maduros que salen de la médula ósea nunca encontrarán un antígeno. Estas

células morirán después de unos días o semanas, verificándose una enorme y

constante pérdida celular. A pesar de ello, el sistema se mantiene en

permanente equilibrio gracias a la producción diaria de nuevos linfocitos por la

médula ósea. Los linfocitos leucémicos de la LLC-B suelen estar en fase G0 del

ciclo celular, su tasa de proliferación es muy baja, y su acumulación no se

produce por un crecimiento desmedido, uno de los fenómenos implicados en el

desarrollo de la mayor parte de los tumores, sino por la inhibición de la muerte

celular programada (apoptosis).

En la diferenciación linfoide los primeros marcadores que definen una

célula como de estirpe B, son la adquisición del antígeno CD19 y el

reordenamiento de los genes que codifican la síntesis de las inmunoglobulinas.

Tras una serie de pasos madurativos, el linfocito adquiere las inmunoglobulinas

en la membrana, convirtiéndose así en una célula inmunocompetente, con

capacidad de reconocimiento del antígeno. La proliferación linfoide a partir de

este estadio va a constituir los SLPC-B. Por ello, en nuestro estudio el antígeno

CD19 se ha considerado un marcador de línea B definitorio de la población

tumoral y la expresión de una única cadena ligera (kappa o lambda) en la

superficie celular como un indicador de clonalidad.

La LLC-B es el proceso linfoproliferativo crónico más inmaduro desde el

punto de vista inmunofenotípico. Se caracteriza por la presencia de

inmunoglobulinas de superficie de baja intensidad y la expresión del antígeno

CD5 propio de la línea T. Esta proteína se consideraba como exclusiva del

linaje linfocitario T en la hematopoyesis normal, admitiéndose que su

manifestación en linfocitos B se limitaba a las células de la LLC-B. Actualmente

189

se conoce la existencia de linfocitos B normales CD5+, que son los primeros en

aparecer en la ontogenia, predominan durante la vida fetal sobre los linfocitos

convencionales CD5-, y han sido identificados en la sangre periférica de

individuos normales.

En nuestro trabajo hemos analizado los linfocitos B CD5+ en sangre

periférica de controles sanos, observando que representan una población

numéricamente menor de los linfocitos B circulantes (13%), dato que coincide

con lo publicado recientemente por Molica y cols. (1998) que lo cifran en un 10-

20%. Así mismo, analizamos las características fenotípicas del antígeno CD5

en las células leucémicas y en los linfocitos T, observando, que el número de

moléculas expresadas por los linfocitos tumorales era menor que en los

linfocitos T normales, esto podría indicar que el estadio de maduración en el

cual se adquiere este antígeno es diferente en ambas poblaciones.

El equivalente normal de los linfocitos de la LLC-B no está aclarado.

Investigaciones recientes, parecen indicar que la contrapartida normal del

linfocito de la LLC-B, no se halla en esta subpoblación de linfocitos B CD5+

presentes en la sangre periférica de individuos normales, sino en la zona del

manto de los folículos linfoides. Alrededor del 50% de los casos tienen

mutaciones somáticas de los genes de las Ig, lo que sugiere un origen de la

enfermedad en las células B posgerminales, con memoria inmunológica. En el

resto de los casos, los genes de las Ig no están mutados; en tales casos, la

leucemia surgiría a partir de células B pregerminales, sin memoria

inmunológica (Damle y cols, 1999; Hamblin y cols, 1999).

La LLC-B presenta un perfil inmunológico que permite su diferenciación,

en la mayoría de los casos, de otros SLPC-B. En nuestra serie se ha realizado

un estudio amplio de las características antigénicas de las células linfoides B,

con el objetivo de establecer una definición correcta y precisa de la población

tumoral. Debido a que el origen tumoral de la proliferación linfocitaria viene

determinada por la expresión de una única cadena ligera de inmunoglobulina

190

(kappa o lambda) en la superficie celular y a las implicaciones diagnósticas que

ello conlleva, proponemos la utilización sistemática de un reactivo que

contenga en su composición ambas cadenas ligeras, conjugadas con distintos

fluorocromos, evitando errores técnicos que llevarían a un diagnóstico

incorrecto.

El patrón inmunológico expresado por las células leucémicas de nuestra

serie coincide con lo publicado por la mayoría de los autores, confirmándose

una expresión de marcadores B (CD19, CD22, CD79Beta) con una intensidad

inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre periférica (Witzig y

cols, 1994). No obstante, hemos hallado alguna discrepancia respecto al

porcentaje de casos que expresaban positividad para el AcMo CD22,

observando en nuestro trabajo un discreto aumento del mismo, respecto a lo

referido por otros autores (Bennett y cols, 1989; Kurec y cols, 1992). El motivo

de esta discrepancia podría deberse a la metodología técnica utilizada, ya que

en la década de los 80 y 90 el método empleado por estos investigadores era

la inmunofluorescencia indirecta con un marcaje simple de las células. En

nuestro trabajo hemos empleado un método de inmunofluorescencia directa,

realizando un triple marcaje con AcMo que nos permite ampliar la información,

ya que nos indica la expresión simultanea de los tres antígenos en una misma

célula; esto unido a un claro avance de los sistemas informáticos, ha permitido

aumentar la sensibilidad y especificidad de la técnica en la cuantificación de la

expresión antigénica de las células leucémicas. Por ello, pensamos que este

sistema de análisis aumenta la fiabilidad de los resultados y siempre que el

soporte técnico lo permita, debe realizarse inmunofluorescencia directa, triple

marcaje y un análisis informático que permita un estudio dinámico de los

diferentes marcadores. Este aumento porcentual de las leucemias que

expresaban el AcMo CD22, no se ha visto reflejado en un cambio del sistema

diagnóstico internacional de puntuación establecido por Matutes y cols. (1997),

ya que la mayoría de las leucemias tenían una expresión débil de estos

marcadores, y en este sistema se asigna la misma puntuación tanto a los casos

191

con negatividad para el marcador como aquellos que lo expresaban de forma

débil, no alterándose el diagnóstico final.

Los linfocitos B proliferantes expresan un menor número de moléculas

de Ig en su superficie celular en comparación con los linfocitos B normales, y la

monoclonalidad viene determinada por la expresión de una única cadena ligera

(kappa o lambda) sobre la membrana celular. En nuestra serie se confirman los

resultados reportados por Molica y cols (1998) y Catovsky (1995), que indican

un predominio de las leucemias que expresan la cadena ligera Kappa. Este

hallazgo podría explicarse porque en la hematopoyesis normal, las clonas que

generan linfocitos con cadenas ligeras kappa representan el doble de las que

originan linfocitos con cadenas lambda, con lo que la probabilidad de que

prolifere estas clonal kappa se duplica.

Tal como se ha reseñado previamente, una característica

inmunofenotípica fundamental es que estas células leucémicas suelen expresar

CD5, aunque un porcentaje pequeño de casos pueden ser CD5 negativos.

Actualmente se discute si las LLC-B con negatividad para el antígeno CD5,

pertenecen realmente a este tipo de leucemias o corresponde a otro SLPC, por

ello, el Internacional Workshop en LLC (1989) ha aconsejado que en los

ensayos clínicos solo se incluyan casos de LLC-B CD5+, siguiendo estas

recomendaciones en nuestra serie tan solo hemos incluido casos con

positividad para dicho marcador.

Las células de la LLC-B pueden expresar el receptor transmembrana

CD23, que funciona como un receptor para la IgE y parece tener un papel en el

control del crecimiento y la proliferación de los linfocitos. El porcentaje de

leucemias que expresan este marcador es controvertido, pues la literatura

recoge una variabilidad en la expresión según las series consultadas. Los datos

recogidos por Dighiero y cols (1991) lo cifran en el 60%, mientras que Newman

y cols (1993) lo sitúan en un 70% de los casos, nuestra serie muestra

porcentajes claramente superiores (99%) coincidentes con el grupo de Matutes

192

y cols. (1994). Pensamos que estas diferencias son debidas a la falta de

uniformidad en los criterios diagnósticos de los SLPC-B, pudiéndose incluir

casos como LLC-B que son CD5 positivos y CD23 negativos, cuando en

realidad se trataba de linfomas del manto. En este sentido, consideramos de

especial relevancia la elaboración del sistema de puntuación del grupo de

Matutes (1997), que es aceptado por la mayoría de los autores y colabora a

aunar criterios. Por todo lo expuesto, pensamos que la realización de un

estudio de SLPC-B debe incluir como requisito fundamental dicho sistema

diagnóstico, que permite comparar los resultados con otros grupos de trabajo y

aumentar el rigor científico de los mismos.

Otros marcadores menos específicos de LLC-B que se expresan en una

minoría de casos son: el CD11c, que es un antígeno característico de otro

SLPC-B, la tricoleucemia, pero que a diferencia de esta en que suele tener una

intensidad de expresión fuerte, en la LLC-B es moderada o débil, y el antígeno

CD10 (CALLA) que suele ser negativo, datos coincidentes con lo hallado en

nuestro estudio.

Respecto al marcador de activación celular CD25, en nuestra serie el

porcentaje de casos positivos es inferior al referido por otros autores (Newman

y cols, 1993). Esto podría ser debido a diferencias metodológicas o a que el

fluorocromo utilizado en nuestro estudio es el isocianato de fluoresceína (FITC)

que presenta algunos inconvenientes en la detección de antígenos expresados

en cantidades relativamente bajas. Para confirmar nuestros resultados se

debería realizar el marcaje con ficoeritrina (PE), que es sin duda el fluorocromo

de mayor potencia en el inmunofenotipaje celular y de elección para la

cuantificación de antígenos concretos, ya que permite la detección de un

pequeño número de moléculas.

En lo que se refiere a la expresión de otros marcadores de línea T,

distintos del CD5, no hallamos expresión de CD2 ni CD3 en ningún caso,

hallazgo similar a lo publicado en revisiones recientes que lo cifran en el 1%

193

(Cheson y cols, 1996); probablemente el aumento del tamaño muestral en

nuestra serie conduciría a porcentajes similares a los reseñados. Esto

contrasta con lo comunicado en 1992 por Kurec y cols que lo cifraban hasta en

un 28% de las leucemias, creemos que estas diferencias se deben a que las

muestras utilizadas por este autor probablemente estaban contaminadas por

linfocitos T normales, ya que el marcaje utilizado fue simple empleando un solo

AcMo en cada determinación, lo que dificulta la distinción de la población

tumoral de los linfocitos normales residuales.

A modo de resumen, podríamos decir que el perfil fenotípico de las LLC-

B aceptado por la mayoría de los autores es el siguiente:

• Expresión de bajas cantidades de cadenas ligeras en la superficie

celular.

• La mayoría de los casos expresan el marcador de activación celular

CD23 y el antígeno CD5 (con negatividad para el resto de marcadores

T).

• Expresan marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos B

maduros normales de sangre periférica.

Las leucemias incluidas en el estudio presentaban el patrón inmunológico

característico de las LLC-B previamente reseñado, sin embargo, consideramos

que se podía ampliar las características definitorias del perfil fenotípico

añadiendo un concepto nuevo como es la dispersión en la expresión

antigénica, es decir, determinar si las células de una misma leucemia

expresaban una intensidad antigénica similar (patrón homogéneo) o por el

contrario expresaban distintas intensidades para el mismo antígeno (patrón

heterogéneo). Este concepto fue empleado por el grupo de Orfao (1999) para

la caracterización fenotípica de la leucemia aguda promielocítica, pero no había

sido utilizado en los procesos linfoproliferativos crónicos. Así mismo, pensamos

que era interesante establecer un sistema cuantitativo que permitiese

establecer con exactitud las distintas intensidades de expresión y la dispersión

194

de los marcadores, por ello se estableció, de forma arbitraria, distintos puntos

de corte para el MFI y el CV para cada AcMo, que aunque conscientes de que

no es un método ágil para ser empleado de forma rutinaria, si puede servir para

los casos en que el sistema de escala logarítmica de los histogramas ofrezca

dudas. En base a ello, el patrón inmunológico de la LLC-B puede quedar

definido de la siguiente forma:

• Expresión de marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos

B maduros normales de sangre periférica, y un patrón homogéneo.

• La mayoría de los casos expresan el marcador de activación celular

CD23 y el antígeno CD5 (con negatividad para el resto de marcadores

T), con intensidad débil o moderada y un patrón heterogéneo.

• Baja intensidad de expresión de cadenas ligeras en la superficie celular,

con un patrón homogéneo para las cadenas kappa y heterogéneo para

las cadenas lambda.

5. ALTERACIONES DE LA INMUNIDAD EN LA LLC-B

El sistema inmune está constituido por una compleja red de células y

moléculas distribuidas por todo el organismo y dotadas con diferentes

capacidades funcionales, que forman su base estructural. La característica

biológica esencial y distintiva de este sistema, es la capacidad que algunos de

sus componentes poseen de reconocer de forma específica fragmentos

moleculares o antígenos. Esta capacidad de reconocimiento, con la

subsiguiente activación celular y desarrollo de los mecanismos efectores,

conceden al sistema inmune una función relevante entre los mecanismos de

defensa del organismo frente a infecciones y neoplasias. Escapar al control del

sistema inmune es una de las estrategias de persistencia tumoral, en el caso

de la LLC-B, se añade la peculiaridad de que las propias células neoplásicas

son parte de la respuesta inmune.

195

El componente celular de este sistema está formado por una serie de

poblaciones de características morfológicas y funcionales muy heterogénea.

Existen dos tipos linfocitarios fundamentales, T y B, que a su vez constan de

diversas subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en virtud de

características inmunológicas, enzimáticas, morfológicas y funcionales.

Los linfocitos T constituyen el 60-70% de las células mononucleadas de

sangre periférica. En términos generales, se definen dos tipos de linfocitos T:

los que expresan en la superficie el antígeno CD3 y RCTαβ (linfocitoαβ), y los

que expresan en la superficie el CD3 y RCTγδ (linfocitosγδ):

• Linfocitos T ααααββββ. Los linfocitos T αβ tienen un fenotipo similar al de los

timocitos maduros, siendo o bien CD4+, o bien CD8+, predominando los

primeros sobre los segundos en una relación CD4/CD8: 1,5-2,5. Son los

linfocitos T predominantes en la sangre periférica. Los linfocitos T CD4+

desarrollan un papel fundamental como células cooperadoras, tanto para

las respuestas de Ac por parte de los linfocitos B como para las

respuestas de citotoxicidad específica de los linfocitos T CD8+. Los

linfocitos T CD8+ reconocen al antígeno y una vez activados, lisan a las

células que lo presentan, se trata de linfocitos T citotóxicos y

desempeñan un papel decisivo para eliminar las células infectadas por

virus y están implicados en los mecanismos de defensa antitumoral.

• Linfocitos T γγγγδδδδ. Constituyen una pequeña proporción de los linfocitos T

de sangre periférica, menos del 5%, en nuestra serie representan el 4%.

Su expresión en la membrana va asociada a las moléculas CD3, al igual

que ocurre con el RCTαβ. Los timocitos con RCTγδ no pasan por el

estadio de coexpresión de CD4 y CD8, y en sangre periférica aparecen

también sin expresar ni CD4 ni CD8. No se conoce con exactitud la

función fisiológica de estas células CD3γδ, ni su papel en la respuesta

inmune.

196

• Linfocitos CD3+/CD4+/CD8+. La mayoría de los linfocitos T maduros

de sangre periférica, expresan CD4 o CD8, pero no ambos. Sin

embargo, se ha demostrado que en sangre periférica de individuos

sanos existen linfocitos T que coexpresan CD4 y CD8, en un porcentaje

muy bajo que en nuestro estudio se sitúa en el 1.3%, cuya función y

ontogenia se desconocen, ya que es difícil realizar estudios funcionales

en esta subpoblación tan minoritaria.

En este trabajo se ha realizado un análisis de estas subpoblaciones

linfocitarias T en individuaos sanos y en pacientes con LLC-B.

5.1. Poblaciones linfocitarias en controles

La determinación de las distintas subpoblaciones linfocitarias en un

grupo control, que sirviera de rango de referencia para realizar un posterior

estudio comparativo con la población leucémica, requería establecer unos

criterios metodológicos estandarizados y que contasen con el mayor consenso

entre los distintos grupos de trabajo, pues de la veracidad de estos resultados

dependía la fiabilidad del análisis comparativo, así, errores en la selección de la

población, la muestra utilizada, los reactivos o la metodología, invalidarían los

resultados y las conclusiones derivadas de ellos. La revisión de la literatura

mostraba poca uniformidad en las técnicas, criterios de análisis o de

expresividad de los distintos marcadores, en base a ello, en 1994 se elaboró un

documento consenso para la obtención de valores de referencia de las

subpoblaciones linfocitarias (McCoy y cols, 1994), en el se establecían las

distintas condiciones que deben reunir este tipo de estudios y que han sido

seguidas en el nuestro:

� El método de elección es el inmunofenotipaje celular por CMF.

� Se aconseja la utilización de marcajes múltiples (dobles o triples) que

permiten un análisis multiparamétrico de la expresión antigénica.

197

� Establecen como requisito básico la realización de un control de calidad

interno.

� Aconsejan elaborar la técnica en las primeras 24 horas tras la

extracción, y en el caso que las muestras tengan que ser guardadas se

realice a temperatura ambiente.

� Utilización de técnicas de lisado de hematíes para facilitar la separación

de la población linfocitaria.

� Los datos poden ser expresados en porcentajes o valores absolutos.

Entre las variables biológicas que pueden influir en los valores de las

subpoblaciones linfocitarias se encuentra la edad, así, nos planteamos si

teníamos que establecer un rango de edad estricto en el grupo control o por el

contrario este podía ser amplio. Hay consenso en la literatura respecto a la

existencia de diferencias entre la infancia y la edad adulta, los hallazgos

sugieren que el porcentaje de células que expresan CD4 (linfocitos T

colaboradores) y células CD19 positivas (linfocitos B), así como, el número

absoluto de linfocitos es mayor en la infancia y decrece con la edad. Por el

contrario, el porcentaje de células que expresan CD8 (linfocitos T supresores)

es menor en la infancia y se incrementa con la edad. Respecto a las

variaciones en las distintas etapas de la edad adulta, la revisión de la literatura

muestra que existen pocos cambios antes de los 65 años, sin embargo, a partir

de los 65-70 años se sugiere una tendencia a un débil descenso en el

porcentaje y valor absoluto de las células T CD3+ y que esto es debido a un

descenso de los linfocitos T CD8, que conlleva a un incremento del cociente

CD4/CD8. En relación con las repercusiones clínicas de estos cambios, en la

mayoría de los ensayos clínicos estas diferencias no son significativas (Goto y

Nishioka, 1989; Tollerud y cols, 1990), y el documento de consenso (McCoy y

cols, 1994) indica que actualmente no existe ninguna razón para establecer

unos rangos específicos en la etapa geriátrica en los laboratorios de citometría

de flujo ni en la evaluación de las leucemias agudas o crónicas. En nuestro

estudio la edad media del grupo control era menor que en la población

leucémica, y pensamos que de existir algún nivel de sesgo, éste sería el

198

hallazgo de unos porcentajes de CD8 inferiores en los casos, pero por el

contrario, como se discutirá posteriormente, se hallo un aumento significativo

de células CD8 en los casos respecto al grupo control, lo que indica que a

pesar del descenso de la población CD8 con la edad en los pacientes

leucémico se producía un aumento relevante de dicha subpoblación.

Otra variable biológica a considerar era el sexo, en este sentido, algunos

estudios señalan un débil aumento del número de células T CD4+, un

descenso de linfocitos CD8+ y el mismo número de linfocitos T CD3+ en

mujeres comparadas con los hombres (Goto y Nishioka, 1989). Estas

diferencias son mínimas y no han sido confirmadas por todos los

investigadores, al mismo tiempo, algunos datos indican que si estas diferencias

existen, desaparecerían con el aumento de la edad. En este sentido, el

documento consenso establece que si la población a estudio incluye ambos

sexos deben ser utilizados rangos de referencias comunes, criterio que hemos

seguido en nuestro trabajo.

Para la realización de un estudio comparativo entre nuestros resultados

y lo publicado por otros investigadores, era aconsejable alcanzar un buen nivel

de reproductibilidad y que las series comparadas utilizaran unos criterios de

estandarización similares tanto en la fase preanalítica como en la analítica. En

este sentido, recientemente el grupo italiano ha publicado un estudio

multicéntrico para establecer los valores normales de referencia de las

subpoblaciones linfocitarias de sangre periférica en adultos sanos

(Santagostino y cols, 1999). En este estudio el tamaño muestral era de 1311

controles, el método utilizado el inmunofenotipaje celular por CMF requiriendo

la adquisión de 10.000 eventos y la creación de una ventana en el área de

linfocitos; la fase pre-analítica y analítica se realizó siguiendo los criterios del

International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), así mismo, utilizaron un

aspecto metodológico que consideramos fundamental, como es el empleo de

un doble marcaje que incluya el AcMo CD3, que permite la definición de las

subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y CD8+. Tradicionalmente se ha empleado

199

un marcaje simple (CD4 o CD8) que es una fuente potencial de confusión, ya

que, tan solo el 80% de las células CD8 expresan CD3, incluyéndose como

linfocitos T las células NK. Todo ello, conduce a que el cociente CD4/CD8 haya

sido de forma convencional menor que lo recogido por publicaciones más

actuales. En nuestro trabajo se siguen criterios metológicos similares a los

empleados por el grupo italiano y los resultados son similares a lo reseñado por

dicho grupo, tanto en lo referente a los valores porcentuales como absolutos, y

a su vez coincide con lo publicado en otra serie reciente por Hulstaert y cols

(1994). Por último reseñar, que en ninguna de las series mencionadas se han

cuantificado dos poblaciones minoritarias en sangre periférica, los linfocitos T

dobles negativos (CD4-/CD8-) y los linfocitos dobles positivos (CD4+/CD8+),

para ello se ha recurrido a lo publicado por Stewart y Stewart (1993), que

analizan estas subpoblaciones estableciendo límites máximos y mínimos,

observando datos similares a los obtenidos en nuestro estudio.

5.2. Poblaciones linfocitarias en pacientes

En la LLC-B las primeras investigaciones se centraron en el estudio de la

célula B tumoral, alcanzándose un avance significativo en el conocimiento de la

biología del clon maligno. Recientemente numerosos estudios han sido

orientados al análisis de las células inmunoreguladoras no malignas

circulantes, para determinar la existencia de defectos inmunes que pudiesen

estar implicados en el origen de la neoplasia y en su comportamiento maligno.

El primer atributo de las células de la LLC-B es su autonomía, por la cual

no responderán de manera apropiada a la compleja serie de mecanismos

reguladores que gobiernan la proliferación y la diferenciación de las células

linfoides normales. El proceso por el que se genera la neoplasia puede ser

debido a una serie de cambios celulares por los que una célula normal, o un

clon celular, se vuelve refractaria a la regulación de su diferenciación y

proliferación.

200

Las células que han sufrido de ese modo un cambio en su

comportamiento biológico y se han trasformado en malignas, podrían expresar

antígenos alterados y ser reconocidas y destruidas por las células citotóxicas

de vigilancia inmunológica. Por tanto, para el desarrollo del proceso leucémico

son necesarios otros cambios, además de la pérdida de la disciplina de

crecimiento, como, por ejemplo, la supresión de la expresión de moléculas de

superficie necesarias para el reconocimiento inmune. Otro mecanismo que

explicaría el desarrollo neoplásico es la existencia de una alteración simultánea

del sistema de vigilancia inmunológica. En este sentido, nuestro estudio analiza

la población linfoide T y sus distintas subpoblaciones para investigar posibles

alteraciones de la inmunidad celular y su relación con las características

clínicas y biológicas de la enfermedad.

La revisión de la literatura muestra resultados discordantes respecto a

los cambios en las subpoblaciones linfocitarias T, que pueden reflejar

diferencias en los criterios diagnósticos establecidos para seleccionar la

población a estudio, así como, en las técnicas utilizadas. Los primeros estudios

se realizaron con suspensiones de linfocitos T enriquecidos que podían estar

contaminados con linfocitos B, posteriormente se utilizaron técnicas de

inmunofenotipaje celular con marcaje simple que dificultaba la discriminación

de las distintas subpoblaciones. Las series publicadas en la década de los 80

presentaban algunas limitaciones técnicas que unido al escaso número de

pacientes incluidos dificultaba la elaboración de conclusiones. En los últimos

años los avances en el inmunofenotipaje celular por CMF con la introducción

de citómetros que permiten realizar un análisis multiparamétrico, el desarrollo

de AcMo de alta sensibilidad y la elaboración de unos criterios diagnósticos que

gozan de una amplia aceptación y consenso, nos han llevado a realizar un

nuevo análisis de estas las subpoblaciones T y sus implicaciones en la

patogenia de la enfermedad.

En los pacientes con LLC-B la célula predominante es el linfocito B

tumoral, representando los linfocitos T un mínimo porcentaje de las células de

201

sangre periférica. Sería lógico pensar, que la acumulación de los linfocitos

leucémicos en la médula ósea llevaría a una anulación del resto de las series

incluidos los precursores linfoides T. Sin embargo, nuestros resultados

muestran un aumento significativo del valor absoluto de los linfocitos T en los

pacientes leucémicos respecto a los controles, confirmando lo publicado en la

literatura por la mayoría de los autores (Brigss y cols, 1991; Kimby y cols, 1987;

Tötterman y cols, 1989). No obstante, una revisión exhaustiva sobre este

aspecto, nos ha llevado a encontrar resultados contradictorios en el estudio

reciente realizado por Frolova y cols. (1995) que no encuentran un aumento de

los valores absolutos de los linfocitos T. Sin embargo, estos hallazgos no

deben cuestionar los resultados anteriores, ya que, el diseño del estudio estaba

más orientado a un análisis genético que inmunofenotípico, y el escaso número

controles (11 controles) incluidos imposibilita la elaboración de valores de

referencia para realizar el análisis comparativo y ponen en duda la veracidad

de los resultados.

La expansión de esta población de células T es probablemente de

naturaleza policlonal como parece deducirse de la ausencia de anormalidades

cromosómicas y la heterocigozidad para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

La razón para esta expansión policlonal de células T en la LLC-B se

desconoce. Para explicar este aumento de las células T, establecimos la

hipótesis que podría ser un mecanismo reactivo del sistema inmune de lucha

antitumoral, por ello, como posteriormente veremos, estas alteraciones se

relacionaron con parámetros clínicos-biológicos de carga tumoral.

Respecto a las distintas subpoblaciones linfocitarias, la revisión de la

literatura mostraba datos discordantes. La mayoría de los investigadores

coincidían en reseñar un aumento de los linfocitos T CD8+ y un descenso del

cociente CD4/CD8 (Burger y cols, 1990; Tötterman y cols, 1989), aunque otros

hallaban un incremento de los linfocitos T CD4+ con normalidad o aumento del

cociente (kimby y cols, 1989; Vuiller y cols, 1988).

202

Pensamos que estas divergencias de resultados podían ser debidas a

diferencias metodológicas. Así, observamos que en la mayoría de los casos el

estudio inmunofenotípico se realizaba con marcaje simple, es decir, para la

identificación de las distintas subpoblaciones se empleaba un solo AcMo, CD4

o CD8, sin inclusión del CD3, como consecuencia se podía incluir un factor de

confusión, al contabilizar como linfocitos T CD8+, células NK. Las células NK

se definen desde el punto de vista inmunológico por la positividad para el

antígeno CD56, negatividad para CD3 y expresión débil de CD8. Para una

cuantificación precisa de las poblaciones T es necesario realizar como mínimo

un doble marcaje de las células con los AcMo CD3-CD4, y CD3-CD8. Pero con

este sistema no se puede cuantificar los linfocitos dobles negativos (CD4 -

/CD8-) ni la población doble positiva (CD4+/CD8+), siendo necesario para ello

la introducción de técnicas con triple marcaje.

Otro de los motivos para la heterogeneidad de resultados podía ser

debido a la inclusión de pacientes que habían recibido los tres meses previos al

estudio tratamiento citostático, pues, como demostró Kimby y cols. (1989), tras

la administración de quimioterapia se producía una disminución de los linfocitos

T CD8+ y un incremento del cociente CD4/CD8.

Por todo lo expuesto previamente, para evitar estos posibles elementos

de sesgo, en nuestro estudio se realizó inmunofenotipaje celular por CMF con

utilización de técnica de triple marcaje e inclusión de pacientes que no habían

recibido tratamiento citostático o éste había dejado de ser administrado al

menos tres meses antes del estudio inmunológico.

Nuestros resultados muestran un porcentaje de linfocitos T CD4+

significativamente menor en los pacientes leucémicos respecto a los controles,

por el contrario, los linfocitos T CD8+ están aumentados y el valor absoluto de

los mismos en la población leucémica duplica el hallado en los controles, en

consecuencia, el cociente CD4/CD8 está significativamente descendido en los

casos respecto a los controles. Estos datos coinciden con lo publicado

203

recientemente por otros autores que utilizan una metodología similar a la

empleada en nuestro trabajo (Dianzani y cols, 1994; Podhorecka y cols, 2001),

y, así mismo, confirman lo publicado previamente por otros investigadores que

aunque tenían algunos defectos técnicos, el gran predominio de la población T

CD8+ les condujo a conclusiones similares.

Finalmente, quisiéramos reseñar que aunque la mayoría de los linfocitos

T maduros expresan CD4 o CD8, en la sangre periférica de individuos sanos

existen linfocitos T que coexpresan ambos antígenos (linfocitos T dobles

positivos) y linfocitos T que no expresan ninguno de los dos marcadores

(linfocitos T dobles negativos), representando un porcentaje muy bajo de la

celularidad linfoide, que en nuestro estudio se sitúa en el 1.3% y 2,7%

respectivamente, y cuya función y ontogenia se desconocen. En nuestra serie

ambas poblaciones se encuentran elevadas en los pacientes leucémicos, sin

embargo, estos datos no han podido ser contrastados, pues, en las revisiones

realizadas no hemos encontrado ninguna publicación que analice estas

poblaciones minoritarias de sangre periférica.

6. RELACIÓN ENTRE LAS ALTERACIONES DE LA INMUNIDAD EN LA

LLC-B Y PARÁMETROS CLÍNICOS-BIOLÓGICOS

6.1. Indicadores de masa tumoral

En nuestro estudio se han analizado distintas variables determinantes de

la masa tumoral, entre ellas destacan los estadios clínicos desarrollados a

principios de los años 80 por Rai y por Binet, basados en parámetros biológicos

y clínicos fáciles de obtener, siendo extremadamente importantes en la

definición del pronóstico de los pacientes con LLC-B, y continúan constituyendo

el criterio más ampliamente utilizado en la práctica clínica y en los ensayos

terapéuticos.

204

La relación de las distintas subpoblaciones linfocitarias con los estadios

clínicos de Rai y de Binet en nuestra serie, mostró que el porcentaje de

linfocitos T CD8+ era significativamente mayor en estadios clínicos avanzados

respecto a estadios precoces. Estos hallazgos confirman lo publicado por otros

autores (Aguilar-Santelises y cols, 1995; Geisler y cols, 1991; ZaKnoen y Kay,

1990) y, aunque su patogenia es desconocida, pensamos que las alteraciones

de la inmunidad celular pueden estar relacionada con la severidad clínica de la

enfermedad.

Otra subpoblación que se hallo incrementada en los estadios clínicos

avanzados de la LLC-B en nuestro estudio, fue los linfocitos T dobles

negativos. Estos datos no han podido ser contrastados con otras series, porque

en las revisiones realizadas no hemos encontrado ninguna publicación que

analice esta subpoblación linfocitaria en este tipo de leucemias.

El análisis de otros indicadores de carga tumoral mostró que la elevación

de los linfocitos T CD8+ por encima de la media del grupo control, fue más

frecuente en los pacientes que presentaban cifras elevadas de β2-

microglobulina, LDH, linfocitos y células CD19+ en sangre periférica, aunque

tan solo alcanzaron significación estadística las cifras de linfocitos y células

CD19+. Resultados similares se hallaron en la subpoblación de linfocitos T

dobles negativos. Al igual que en el apartado anterior, estos datos no han

podido ser comparados con otras series porque en la literatura consultada tan

solo se han evaluado los estadios clínicos de Rai y de Binet, sin inclusión de

otros parámetros pronósticos.

En síntesis, podríamos decir que los hallazgos de nuestro estudio

muestran que entre todas las subpoblaciones linfocitarias son los linfocitos T

CD8+ y los linfocitos T dobles negativos los que se relacionan con una mayor

carga tumoral. Pensamos que estas alteraciones de la inmunidad celular en la

LLC-B podrían ser debidas a una respuesta inmunitaria específica frente al

proceso leucémico. Los linfocitos T CD8+ reconocen péptidos unidos a

205

moléculas HLA de clase I y se comportan como linfocitos T citotóxicos frente a

determinadas proteínas sintetizadas por las células, como los antígenos

tumorales. Por ello, los linfocitos T CD8 podrían jugar un papel relevante frente

a los procesos tumorales. Respecto a los linfocitos T dobles negativos no se

conoce con exactitud la función fisiológica de estas células, ni su papel en la

respuesta inmune, aunque se ha demostrado un efecto citolítico contra

diferentes dianas, que podría incluir las células tumorales, por este motivo se

ha sugerido que pueden estar implicados en la vigilancia anti-tumoral del

organismo.

6.2. Patrón inmunofenotípico de las LLC-B

En nuestro estudio se analizó la posible correlación entre las

subpoblaciones T y los distintos parámetros fenotípicos de la LLC-B,

observando que en el grupo de pacientes que presentaban unas cifras de

linfocitos T CD8+ superiores a la media de los controles, las células leucémicas

mostraban unas características inmunológicas diferentes a las del grupo

general. Así, la intensidad de expresión de los antígenos característicos de

células B, CD22 y CD79β, y del marcador de activación celular CD23 era

superior al grupo general, con un patrón de dispersión distinto. La positividad

para otro marcador de activación celular, el CD25, fue superior en dicho grupo

y la cadena ligera predominante en la superficie celular fue la cadena lambda

de intensidad moderada. Estos datos no han podido ser contrastados porque

en las revisiónes de la literatura realizadas, no hemos encontrado ningún

estudio que relacione las alteraciones de la población T con las características

inmunofenotípcas de las células leucémicas.

Todo ello sugiere que un determinado patrón inmunofenotípico en la

célula leucémica, con expresión de un mayor número de moléculas

antigénicas y cambios en el patrón de dispersión, podría ir asociado a un

aumento de linfocitos T CD8+. Una explicación de este hallazgo, podría ser que

esta expresión antigénica, favorecería el reconocimiento en la célula leucémica

206

de determinados péptidos y supondrían una señal de activación del mecanismo

citotóxico mediado por los linfocitos CD8+.

6.3. Alteraciones de la inmunidad humoral

La hipogammaglobulinemia es la principal causa de infección en los

pacientes con LLC-B, aunque su patogenia no está completamente dilucidada,

puesto que este fenómeno es raro en otras neoplasias de células B.

Entre los posibles mecanismos patogénicos se incluye el propuesto por

Briggs y cols. (1990) que sugieren como causa de la hipogammaglobulinemia

el desplazamiento de los linfocitos normales por el clon leucémico. Sin

embargo, como se demuestra en nuestro estudio, los valores absolutos de

linfocitos T y células B no tumorales son normales o están aumentados en

estos pacientes.

Respecto al papel que las distintas subpoblaciones T pudieran

desempeñar en el desarrollo de la hipogammaglobulinamia, los datos sobre las

células cooperadoras y supresoras son contradictorios y no hay consenso al

respecto en la literatura (Apostolopoulos y cols, 1990; Chapel y Buch, 1987;

Kunicka y Platssoucas, 1988). En este sentido, en nuestro estudio no se hallo

relación entre las alteraciones de las subpoblaciones T y el descenso de las

cifras de inmunoglobulinas. Pensamos que el origen de la

hipogammaglobulinemia es probablemente multifactorial e incluiría alteraciones

funcionales de los linfocitos T que, aunque presentan valores normales, son

funcionalmente incompetentes (defectos en la secreción de determinadas

citoquinas) para realizar la activación de las células B no tumorales.

Finalmente, las alteraciones de la inmunidad celular y sus implicaciones

con determinadas características biológicas de la LLC-B halladas en nuestro

trabajo, podrían sugerir la posibilidad de manipular la respuesta inmunitaria en

estrategias terapéuticas contra el cáncer. En este sentido, los esfuerzos

207

actuales van encaminados a aumentar la potencia y especificidad de la

respuesta inmunitaria frente a los tumores. Así, un área de creciente interés es

el empleo de células dendríticas modificadas, que presentarían antígenos

tumorales, generando una respuesta muy potente de células T CD8+

citotóxicas específicas frente a ese tumor. Otra estrategia empleada en la

inmunoterapia de las leucemias es la manipulación de las mismas células

leucémicas para potenciar su inmunogenicidad y estimular la respuesta del

sistema inmune frente a ellas. Actualmente se están diseñando ensayos

clínicos para investigar los efectos inmunológicos y clínicos que producen las

células dendríticas y las vacunas con células tumorales modificadas.

Por todo lo anteriormente expuesto, pensamos que el análisis de las

características inmunofenotípicas de las poblaciones linfocitarias realizadas en

nuestro estudio, puede contribuir a un mejor conocimiento del papel que las

alteraciones del sistema inmunorregulador pueden tener en la LLC-B.

CONCLUSIONES

209

1. Los linfocitos B CD5+ son las células predominantes en la sangre periférica de

los pacientes con LLC-B, en cambio en los individuos sanos representan una

población numéricamente menor de los linfocitos B circulantes. El análisis

inmunofenotípico del antígeno CD5 muestra que el número de moléculas

expresadas por los linfocitos tumorales es menor que en los linfocitos T

normales, lo que podría sugerir que el estadio de maduración en el cual se

adquiere el antígeno es diferente en ambas poblaciones.

2. El perfil inmunofenotípico característico de la LLC-B, en base a nuestros

resultados, puede quedar definido de la siguiente forma:

• Expresión de marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos

B maduros normales de sangre periférica y un patrón homogéneo.

• Expresión del marcador de activación celular CD23 y el antígeno CD5,

con intensidad débil o moderada y un patrón heterogéneo.

• Expresión de bajas cantidades de cadenas ligeras en la superficie

celular, con un patrón homogéneo para las cadenas kappa y

heterogéneo para las cadenas lambda.

3. El estudio de las células inmunorreguladoras no malignas circulantes muestra

un aumento del valor absoluto de los linfocitos T y células B normales en los

pacientes leucémicos respecto al grupo control.

4. El análisis inmunofenotípico por citometría de flujo de las distintas

subpoblaciones T en los pacientes con LLC-B, mostró un descenso del

porcentaje de linfocitos T CD4+ y un aumento de los linfocitos T CD8+, de los

linfocitos T dobles positivos y de linfocitos T dobles negativos.

210

5. La relación de las distintas subpoblaciones linfocitarias con los indicadores de

masa tumoral, mostró que el porcentaje de linfocitos T CD8+ y linfocitos T

dobles negativos se relacionan con una mayor masa tumoral. Pensamos que

estas alteraciones de la inmunidad celular en la LLC-B podrían ser un

mecanismo reactivo del sistema inmune de lucha antitumoral.

6. Nuestros datos indican que un determinado patrón inmunofenotípico en la

célula leucémica, con expresión de un mayor número de moléculas

antigénicas y cambios en el patrón de dispersión, se asocian a un aumento de

linfocitos T CD8+. Una explicación de este hallazgo, podría ser que esta

expresión antigénica, favorecería el reconocimiento en la célula leucémica de

determinados péptidos y supondrían una señal de activación del mecanismo

citotóxico mediado por los linfocitos CD8+.

7. Las alteraciones del sistema inmunorregulador y sus implicaciones con

determinadas características biológicas de la LLC-B halladas en nuestro

trabajo, sugieren la posibilidad de emplear estrategias de inmunoterapia en

este tipo de neoplasias, encaminadas a aumentar la potencia y especificidad

de la respuesta inmunitaria frente al tumor.

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