curso para tÉcnicos de anatomÍa … para tÉcnicos de anatomÍa patolÓgica fijaciÓn y...
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DPTO ANATOMIacuteA PATOLOacuteGICA HHUU VIRGEN DEL ROCIacuteO
Lola I Segura
CURSO PARA TEacuteCNICOS DE ANATOMIacuteA PATOLOacuteGICA
FIJACIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
FIJACIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
bull MICROTOMIacuteA
bull TINCIOacuteN (Hematoxilina-Eosina tricroacutemico hellip)
bull TEacuteCNICAS HISTOQUIacuteMICAS ( Carbohidratos Proteiacutenas y liacutepidos)
ndash Carbohidratos
ndash Proteiacutenas Enzimas Inmunohistoquiacutemica
ndash Liacutepidos
RECEPCIOacuteN DE MUESTRAS MACROSCOPIacuteA Y TALLADO LABORATORIOS
ESTUDIO MICROSCOacutePICO
Y DIAGNOacuteSTICO
EQUIPO CLIacuteNICO
Y PACIENTES SALA DE INFORMES
Microscopio
La fijacioacuten de los tejidos va en paralelo con el uso
del microscopio tanto por la necesidad de conseguir
cortes suficientemente finos que puedan de ser
atravesados por la luz como para conseguir la
conservacioacuten de las muestras
FIJACIOacuteN
iquest Por queacute es necesario fijar las muestrasPorque si no el material se autolisa es decir se autodestruye
bullVesiacuteculas rodeadas de
membrana que tienen en su
interior hasta 40 tipos de enzimas
Es el ldquoaparato digestivordquo de la
ceacutelula
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
bull MICROTOMIacuteA
bull TINCIOacuteN (Hematoxilina-Eosina tricroacutemico hellip)
bull TEacuteCNICAS HISTOQUIacuteMICAS ( Carbohidratos Proteiacutenas y liacutepidos)
ndash Carbohidratos
ndash Proteiacutenas Enzimas Inmunohistoquiacutemica
ndash Liacutepidos
RECEPCIOacuteN DE MUESTRAS MACROSCOPIacuteA Y TALLADO LABORATORIOS
ESTUDIO MICROSCOacutePICO
Y DIAGNOacuteSTICO
EQUIPO CLIacuteNICO
Y PACIENTES SALA DE INFORMES
Microscopio
La fijacioacuten de los tejidos va en paralelo con el uso
del microscopio tanto por la necesidad de conseguir
cortes suficientemente finos que puedan de ser
atravesados por la luz como para conseguir la
conservacioacuten de las muestras
FIJACIOacuteN
iquest Por queacute es necesario fijar las muestrasPorque si no el material se autolisa es decir se autodestruye
bullVesiacuteculas rodeadas de
membrana que tienen en su
interior hasta 40 tipos de enzimas
Es el ldquoaparato digestivordquo de la
ceacutelula
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
RECEPCIOacuteN DE MUESTRAS MACROSCOPIacuteA Y TALLADO LABORATORIOS
ESTUDIO MICROSCOacutePICO
Y DIAGNOacuteSTICO
EQUIPO CLIacuteNICO
Y PACIENTES SALA DE INFORMES
Microscopio
La fijacioacuten de los tejidos va en paralelo con el uso
del microscopio tanto por la necesidad de conseguir
cortes suficientemente finos que puedan de ser
atravesados por la luz como para conseguir la
conservacioacuten de las muestras
FIJACIOacuteN
iquest Por queacute es necesario fijar las muestrasPorque si no el material se autolisa es decir se autodestruye
bullVesiacuteculas rodeadas de
membrana que tienen en su
interior hasta 40 tipos de enzimas
Es el ldquoaparato digestivordquo de la
ceacutelula
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Microscopio
La fijacioacuten de los tejidos va en paralelo con el uso
del microscopio tanto por la necesidad de conseguir
cortes suficientemente finos que puedan de ser
atravesados por la luz como para conseguir la
conservacioacuten de las muestras
FIJACIOacuteN
iquest Por queacute es necesario fijar las muestrasPorque si no el material se autolisa es decir se autodestruye
bullVesiacuteculas rodeadas de
membrana que tienen en su
interior hasta 40 tipos de enzimas
Es el ldquoaparato digestivordquo de la
ceacutelula
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN
iquest Por queacute es necesario fijar las muestrasPorque si no el material se autolisa es decir se autodestruye
bullVesiacuteculas rodeadas de
membrana que tienen en su
interior hasta 40 tipos de enzimas
Es el ldquoaparato digestivordquo de la
ceacutelula
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN
Con la palabra FIJACIOacuteN queremos indicar en este campo de la Anatomiacutea Patoloacutegica el procedimiento mediante el cual detenemos la destruccioacuten la autoacutelisis de las ceacutelulas y el material extracelular que se produciriacutea en las biopsias y en general en cualquier muestra de material orgaacutenico una vez separado del organismo al que perteneciacutea por la accioacuten de las enzimas liberadas por los lisosomas destruidos
Pero no es soacutelo esto (esto lo podriacuteamos llamar ldquoconservacioacutenrdquo) con la FIJACIOacuteN se pretende ademaacutes mantener la ordenacioacuten espacial tridimensional de ceacutelulas y fibras ( Baker 1963)
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN
La FIJACIOacuteN pretende no soacutelo la conservacioacuten de
la microanatomiacutea sino ademaacutes de los componentes
quiacutemicos tisulares
the best compromise for fixation and processing should minimize
changes in tissue following its removal from the living organism in both
organizational structure and chemical composition (Grizzle 2001
Grizzle et al 2007)
Grizzle WE The use of fixatives in diagnostic pathology J Histotechnol
200124151ndash152
Grizzle WE Fredenburgh J Myers RB Fixation of tissues In Bancroft J Gamble M
editors Theory and Practice of Histological Techniques 6th ed Edinburgh UK
Churchill Livingstone 2007 pp 53ndash74
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN
FIJADOR IDEAL Caracteriacutesticas
bull Prevenir la autoacutelisis
bull Preparar el tejido para el procesado posterior
bull Prevenir el dantildeo osmoacutetico
bull Preparar al tejido para la ldquotincioacutenrdquo posterior
bull Endurecer el tejido para facilitar su faacutecil seccioacuten
bull Prevenir al tejido de retraccioacuten y de rotura
bull Hacer que los componentes tisulares resistan la extraccioacuten por el agua y los solventes orgaacutenicos
bull Preservar el tejido en un estado similar al ldquoestado vivordquo
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIOacuteN Y CONTENIDO DE LAS PROTEIacuteNAS
EXISTENTES
- Lipoproteiacutenas existentes en las membranas celulares
- Los aacutecidos nucleiacutecos asociados a nucleoproteiacutenas
- Proteiacutenas globulares y fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteiacutenas mucosas y estructurales
- Glicoproteiacutenas fibrosas extracelulares
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Fijadores Quiacutemicos
bull Fijadores simples
No coagulantes Producen un efecto aditivo con las proteiacutenas
Formaldehiacutedo tetroacutexido de osmio aacutecido aceacutetico
Coagulantes Producen grave alteracioacuten de la estructura
proteiacuteca desnaturalizacioacuten y sin embargo hay una buena conservacioacuten de
los carbohidratos Etanol metanol aacutecido piacutecrico cloruro de mercurio
bull Mezclas fijadorasClarke (etanol y aacutecido aceacutetico)
Carnoy (etanol aacutecido aceacutetico cloroformo)
Bouin ( Formalina aacutecido piacutecrico aacutecido aceacutetico)
Metacarn (etanol metanol)
Formol sublimado ( con sales de zinc)
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Fijadores Quiacutemicos
Los maacutes utilizados son los compuestos aldehiacutedicos
que establecen puentes con grupos aminos de las
proteinas
ndash Formaldehido HCHO ( Solucioacuten
acuosa formalina )
ndash Glutaraldehido CHO-CH2- CH2-CH2-
CHO
1 Carbono 1grupo aldehiacutedo
5 Carbonos 2 grupos aldehiacutedos
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Fijadores Quiacutemicos Formaldehiacutedo
Reaction of formaldehyde with proteins cross-linking of amino
groups with phenol imidazole or indole groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Biol Chem Jul 174 (3) 827-43 1948
The reaction of formaldehyde with proteins cross-linking
between amino and primary amide or guanidyl groups
FRAENKEL-CONRAT H OLCOTT HS
J Am Chem Soc Aug 70 (8) 2673-84 1948
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Reaccioacuten del formaldehiacutedo con grupos aminos de las proteiacutenas
iquestCUacuteAL ES LA ACCIOacuteN QUE REALIZAN LOS FIJADORES
ALDEHIacuteDICOS EN LAS CEacuteLULAS PARA FIJARLAS
ES UNA UNION ENTRE GRUPOS NH2
DE LAS PROTEINAS Y LOS
ALDEHIacuteDOS DE LOS FIJADORES
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN Formol (formaldehiacutedo)
bull Fijador maacutes usado para microscopia oacuteptica
bull Este aldehiacutedo de foacutermula H-CHO lo encontramos en solucioacuten acuosa (formalina) a una concentracioacuten de 37 a 40 pv Esto quiere decir que en 100 ml de formol ldquocomercialrdquo hay 37-38 gramos de formol
bull La concentracioacuten de uso es el 10 vv o 37- 4 pv en una solucioacuten tamponada a pH neutro
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN Formol
Se utiliza al 10 vv a pH 70 (formol tamponado neutro) Esto se prepara antildeadiendo 10ml de la solucioacuten de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de uacutena solucioacuten tamponada (fosfato de Sorensen) a pH 7 A pH neutro la mayoriacutea de los grupos aminos y amidos de los aminoaacutecidos baacutesicos son muy reactivos con el formaldehiacutedo A pH baacutesico son aminoaacutecidos como la alanina los maacutes reactivos
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
REPERCUSIONES DE LA ACCIOacuteN FIJADORA DEL FORMOL
La fijacioacuten es un punto crucial para conseguir una buena morfologiacutea y
unos resultados fiables en la demostracioacuten molecular Llegar a un
tiempo oacuteptimo es importante (Un rdquoexcesordquo de fijacioacuten bueno para
la morfologiacutea puede interferir la demostracioacuten de moleacuteculas)
-Las proteiacutenas se pueden demostrar tras fijacioacuten en formol por meacutetodos
inmunohistoquiacutemicos tras recuperacioacuten antigeacutenica pero no se puede
demostrar actividad enzimaacutetica y tenemos que hacer congelacioacuten
- Los aacutecidos nucleicos (ADN ARN) ADN se puede demostrar tras
fijacioacuten en formol pero para ARN tenemos que hacer congelacioacuten
-Los liacutepidos grasas neutras se pierden en su mayor parte tras la fijacioacuten
en formaldehiacutedo por el procesado posterior previo a la inclusioacuten en
parafina
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Glutaraldehiacutedo (CHO-CH2-CH2-CH2-CHO)
bull Fijador maacutes usado para microscopiacutea electroacutenica por su mayor
capacidad de fijacioacuten que la del formaldehido ya que es una
moleacutecula con dos grupos aldehiacutedos Fueacute introducido por Sabatini en
1963
bull La penetracioacuten en el tejido es mucho maacutes lenta que la del
formaldehido por dos razones
- Es una moleacutecula de mayor tamantildeo (5 carbonos) El
glutaraldehiacutedo penetra en 24h un grosor de no maacutes de 2mm
- Las primeras micras fijadas por el glutaraldehiacutedo
constituyen una barrera para la ulterior penetracioacuten del fijador
FIJACIOacuteN
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
ldquoAs a tool immunofluorescence is simple in concept but its succeful use requires knowledge of immunology and skill in its aplicationrdquo
NACE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
(COONS 1964)
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
La fijacioacutendesde el punto de vista de la Inmunohistoquiacutemica
tiene que conseguir un compromiso entre las condiciones para
obtener una morfologiacutea adecuada y la necesidad de respetar
los lugares antigeacutenicos de las moleacuteculas que
pretendemos demostrar
Sea cual fuere el meacutetodo inmunohistoquiacutemico refinado de
deteccioacuten o la automatizacioacuten elegidos
el resultado final va a depender del manejo que hagamos de la
muestra tisular oacute citoloacutegica y de forma fundamental de la fijacioacuten
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEIacuteNAS
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
bull Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido
bull El efecto de cada fijador sobre un antiacutegeno puede ser distinto
seguacuten la localizacioacuten histoloacutegica y anatoacutemica de dicho antiacutegeno
bullExisten determinados antiacutegenos de superficie o receptores
nucleares cuya determinacioacuten en tejidos fijados no proporciona
buenos resultados por eso debe realizarse en tejido congelado
bull En muestras de gran volumen la fijacioacuten por inmersioacuten en la
solucioacuten fijadora proporciona resultados variables en cuanto a
positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas
se tentildeiraacuten maacutes que las maacutes profundas
FIJACIOacuteN E INMUNOHISTOQUIacuteMICA
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
OrsquoLearyrsquos group suggests that there may be at least three ways by
which formaldehyde can reduce immunorecognition of the epitopes
of proteins These include
1) ldquoformation of extensive crosslinks by fixation reduces penetration of
the primary antibody to the antigen targetrdquo
2) ldquoreaction of formaldehyde with the target epitope reduces
immunoreactivityrdquo
3) ldquothe reaction with formaldehyde (of the antigen) causes changes in
protein secondary structure and that reduces immunoreactivityrdquo
While these are the most likely there probably are other possibilities
These include blocking the access of the secondary detection system
to the primary antibody via structural changes upon fixation by
aldehydes
Protein fixation and antigen retrieval chemical studies Biotech amp Histochem 2009 OrsquoLeary TJ
Fowler CB Evers DL Mason JT
Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure a calorimetric and infrared
spectroscopic investigation J Histochem Cytochem 1991 Feb39(2)225-9
Mason JT OLeary TJ
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Am J Surg Pathol 2000 Jul24(7)1016-9
Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry
Werner M Chott A Fabiano A Battifora H
Abstract
Although immunohistochemistry is routinely performed by many pathology
laboratories its standardization still lags behind A major cause of variation in the
reproducibility of immunohistochemical staining is induced by tissue fixation
and to a lesser degree tissue processing This report stemming from the first
meeting of the International Consensus Group on Standardization and Quality Control
(ICGSQC) in Nice France summarizes the problem and suggests solutions to begin
to achieve standardization of fixation and processing Most laboratories use neutral-
buffered formalin (10) for tissue fixation which introduces cross-links whereas
coagulative fixatives are less popular Problems with formalin fixation comprise
delay of fixation and variations in the duration of the fixation mainly Solutions
to these problems could be to start fixation soon (lt30 min) after surgical
removal of the tissue and to avoid overfixation (gt24-48 hrs)
FIJACIOacuteN en formol e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
J Histochem Cytochem 1989 Jul37(7)1063-8 Histochemical blockade of the antigen-antibody reaction using immunoperoxidase demonstration of lysozyme in paneth cells and lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a model system Montero C Segura DI
Departamento de Anatomiacutea Patoloacutegica Hospital Universitario Virgen del Rocio Sevilla Spain
Nitrosation and acetylation two histochemical blocking procedures for amino
groups were used to establish the extent to which these groups intervene in
the antigen-antibody reaction in immunohistochemistry We used the
peroxidase-antiperoxidase method (PAP) to demonstrate lysozyme in Paneth
cells and in lamina propria mononucleocytes of human small intestine as a
model system We studied the relationship of these groups to fixation
concentration of the primary antiserum and length of blockade as well as the
possibility of reversing blockade as proof of specificity Our findings support
the contention that amino groups are also an important factor in antigen-
antibody binding even in fixed tissue Fixatives influence the binding process
in many ways with acetylation producing a more successful result than
nitrosation in tissue fixed in Bouin without acetic acid whereas the reverse is
true in formaldehyde-fixed tissue
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN e INMUNOHISTOQUIacuteMICA
Histochem J 1991 Mar23(3)125-31 Blockade of the antigen-antibody
reaction using benzil condensation with the guanidyl residue of
arginineMontero C Segura DI Gutierrez MDepartment of Pathology University Hospital Virgen del Rocio Sevilla Spain
Benzil blockade of the guanidyl group of arginine was tried on sections of
paraffin-embedded tissue fixed in two different fixatives in an attempt to
evaluate the relevance of this amino acid to the reaction of several proteins
with their corresponding antibodies The two fixatives were 10
formaldehyde and Bouins fluid without acetic acid Both polyclonal and
monoclonal antibodies against proteins or peptides (lysozyme
adrenocorticotropic hormone growth hormone placental lactogen and
prolactin) were used on human biopsies or material from autopsies The
blockade was effective when monoclonal antibodies were used whereas no
effect or only a small decrease of the intensity of the reaction was observed
with polyclonal antibodies The least definitive result was obtained with
prolactin where a complete blockade was never achieved with monoclonal
antibodies Calcitonin a peptide that does not contain arginine was used as
a control not susceptible to benzil blockade no blockade of immunostaining
was observed
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical
pathologyTitford ME Horenstein MG Arch Pathol Lab Med 2005 Apr129(4)502-6
Department of Pathology University of South Alabama Mobile USA
In 1987 the Formaldehyde
Standard became law in the
United States alerting laboratory
workers to the potential
carcinogenicity of formaldehyde
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
The Impact of Tissue Fixatives on Morphology and Antibody-based Protein Profiling
in Tissues and Cells L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Examples of discrepancies in
immunohistochemistry staining between
differently fixed tissues and cells The left
column represents NBF-fixed tissues or
cells (A) NBF-fixed intestinal tissue
presented negative staining with an antibody
to the opioid κ receptor whereas ZBF-fixed
intestinal tissue showed a dot-like granular
protein expression (B) (C) A subcellular
staining discrepancy in liver in which NBF-
fixed liver tissue showed a cytoplasmic
pattern Liver tissues fixed with NEO-FIX (D)
and Glyo-fixx (E) showed a membranous
pattern in accordance with the literature An
antibody to β-galactosyltransferase
demonstrated very weak or negative staining
in NBF-fixed tubular cells of the kidney (F)
whereas the same tissue type fixed in Glyo-
fixx showed a strong granular-like
cytoplasmic staining pattern (G)
The Impact of Tissue Fixatives on
Morphology and Antibody-based
Protein Profiling in Tissues and Cells
L Paavilainen et al
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 58 (3) 237-246 2010
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN QUIacuteMICA
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN (Parafina Epon)
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
1 Biopsias intraoperatorias
2 Histoquigravemica enzimaacutetica
- Biopsia rectal por succioacuten Ache NADH deshidrogenasa
- Piezas de reseccioacuten por enfermedad de Hirschsprung Ache NADH
deshidrogenasa
- Biopsias musculares ATPasas NADH deshidrogenasa SDH
deshidrogenasa Mioadenilatodeaminasa Fosforilasa Fosfofructoquinasa3
3Inmunofluorescencia
- Biopsias de piel ndash Biopsias de rintildeoacuten
4 Muestras para algunas teacutecnicas moleculares (ARN)
5 Muestras para Banco de tumores
Muestras en fresco Congelacioacuten
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Congelacioacuten Metodologiacutea
bull El nitroacutegeno liacutequido tiene una
temperatura de -190ordmC 85ordmK
Su manejo requiere precaucioacuten
y se utilizan gafas y guantes
para extraerlo de la bombona a
traveacutes de un dispensador
bull Para que tras la congelacioacuten la
morfologiacutea quede bien
conservada y no se formen
cristales gruesos de
congelacioacuten del agua
intracelular la congelacioacuten
tiene que ser raacutepida
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Congelacioacuten Metodologiacutea Preparacioacuten de las muestras
bull Nitroacutegeno liacutequido (-190ordmC)
- No es aconsejable realizar una inmersioacuten directa en eacutel ya que se forman gases de nitroacutegeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelacioacuten y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la ceacutelula que distorsionan la morfologiacutea
- Se obtiene una congelacioacuten maacutes raacutepida y mejor morfologiacutea congelando en metilbutano (isopentano) previamente congelado en nitroacutegeno liacutequido
- Otra opcioacuten es espolvorear la muestra en polvo talco previamente a su inmersioacuten en nitroacutegeno liacutequido
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
bullCONGELADOR CON SISTEMA DESEGURIDAD
bullALARMA LOCAL
bullALARMA TELEFOacuteNICA
bullAPORTE DE CO2
bullGRUPO ELECTROGEacuteNICO INDEPENDIENTE
bullCANDADO CONVENCIONAL
CONTENEDOR DE NITROacuteGENO LIacuteQUIDO
VAacuteLVULAS DE APERTURACIERRE
LLENADO CON DISPENSADOR
GUANTES PROTECTORES
GAFAS PROTECTORAS
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
bullNoblett HR A rectal suction biopsy tube for use in the diagnosis of
Hirschsprungs disease J Pediatr Surg 1969 Aug4(4)406ndash409
La demostracioacuten del aganglionismo es la clave que
sustenta el diagnoacutestico
iquest En queacute material lo demostramos
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico en la biopsia
rectal por succioacuten
Enfermedad de Hirchsprung
iquest Por queacute hacer enzimas
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Aplicacioacuten de la demostracioacuten de acetilcolinesterasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
En el segmento aganglioacutenico de la enfermedad de Hirschsprung hay una hiperplasia colinergica proveniente del parasimpaacutetico sacro extramural que demostramos con la teacutecnica de acetilcolinesterasa
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Aplicacioacuten de la demostracioacuten enzimaacutetica de NADH diaforasa al estudio de la biopsia rectal por succioacuten
ENFERMEDAD DE HIRSCHSPRUNG
Diagnoacutestico anatomopatoloacutegico
Se realizan 50 - 60 secciones de 15 micras por muestra Se observan 2 ganglios por cada 10 secciones
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA LA
INVESTIGACIOacuteN EN ONCOLOGIacuteA
Muestras en fresco
CONGELACIOacuteN
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
bull FIJACIOacuteN
bull CONGELACIOacuteN
bull INCLUSIOacuteN
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
Procesado posterior a la fijacioacuten previo a la inclusioacuten en parafina
bull Tallado de las muestras Es criacutetico hacer correctamente la toma de tejidos
bull Inclusioacuten en casettes y a continuacioacuten introducirlos en los procesadores automaacuteticos
iquestQueacute es lo que se estaacute realizando de forma automaacutetica en los procesadores
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
En los procesadores automaacuteticos se realiza
1 Deshidratacioacuten a traveacutes de una serie de alcoholes (etanol) de graduacioacuten ascendente
2 Disolvente de las grasas (xileno bencenotolueno etc
3 Bantildeos de parafina (59-60ordm)
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
Razones de por queacute hay que dar estos pasos
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
-
La deshidratacioacuten de los tejidos tiene dos finalidades
- Un endurecimiento de las muestras
Extraer el agua del interior de las muestras para
que la parafina oacute las resinas (epon) que no son miscibles
con el agua puedan penetrar posteriormente en el proceso
de inclusioacutenDisolvente de las grasas (xileno bencenotolueno
- Eliminar el alcohol residual y las grasas
Bantildeos de parafina (59-60ordm)
- Preparar el tejido para la inclusioacuten
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull La inclusioacuten consiste en impregnar los tejidos en una
sustancia liacutequida que penetre en el interior de la
muestra y ocupe los lugares del agua extraiacuteda y
posteriormente pase a un estado soacutelido
Razones de por queacute hay que dar este paso
bullEste procedimiento se realiza para que las muestras adquieran una dureza determinada y una estabilidad homogeacutenea y asiacute poder obtener cortes finos y uniformes para poderlos estudiar con el microscopio oacuteptico o electroacutenico
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
INCLUSIOacuteN EN PARAFINA O PLAacuteSTICOS
bull Parafina Como medio de inclusioacuten la parafina es la sustancia maacutes utilizada Es una cera que tiene un punto de fusioacuten entre 45ordm y 60ordm C y que solidifica a temperatura ambiente Permite secciones de 3-5 micras para estudio con microscopio oacuteptico
bull Plaacutesticos (epon) La inclusioacuten en resinas acriacutelicas se basa en la polimerizacioacuten de una sustancia de bajo peso molecular y su transformacioacuten en un producto transparente y soacutelido de mayor dureza que la parafina Debido a la dureza de los bloques asiacute obtenidos es posible realizar cortes de 50Aring con cuchillas de vidrio para estudio con microscopio electroacutenico
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
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INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
OBJETIVOS DE CALIDAD
FASE PREANALIacuteTICA
- FIJACIOacuteN Y PROCESADO DE LA MUESTRA
El mayor obstaacuteculo
para tener una
estandardizacioacuten es la
variabilidad debida a
la fijacioacuten y procesado
ERRORES
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
AacuteREAS DE MEJORA
Hacer las cosas
precisas Saber coacutemo
las hacemos
iquestEstamos haciendo lo que debemos hacer
iquestEstamos consiguiendo los resultados esperados
iquestLo conseguimos en tiempo y costes aceptables
iquestCoacutemo asegurar que lo hacemos con un nivel de
calidad correcto
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
La recomendacioacuten es normalizar protocolizar
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
PNT ENVIO DE BIOPSIAS
INTRAOPERATORIAS
bull PREPARACIOacuteN DE LA MUESTRA
La muestra tras su extraccioacuten debe envolverse en gasa o pantildeo humedecida en suero fisioloacutegico para evitar que se seque e introducirse en un envase o bote de tamantildeo adecuado a la pieza
bull ENVIacuteO DE LAS MUESTRAS
bull 1 Las muestras deben ser enviadas EN FRESCO sin fijador alguno con la hoja de solicitud de estudio debidamente cumplimentada donde se especifique la hora de la toma de la biopsia Asiacute mismo el nuacutemero del teleacutefono de contacto y los datos de identificacioacuten del quiroacutefano a la Recepcioacuten de Muestras del servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica ubicada en la puerta oeste del edificio (frente al Centro de Diagnoacutestico y Tratamiento)
bull 2 El transporte de las muestras intraoperatorias hasta el servicio de Anatomiacutea Patoloacutegica debe ser inmediato y corre a cargo del servicio peticionario
bull 3 El envase debe estar identificado adhiriendo a la pared del mismo la etiqueta de Identificacioacuten del paciente
bull 4 En caso de remitir maacutes de una pieza del mismo paciente se debe identificar por separado la localizacioacuten de cada muestra
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN Fase preanaliacutetica Cuestiones praacutecticas
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador No depende directamente de nosotros generalmente
Actuaciones por parte del personal de la Unidad de Patologiacutea
- Material hospitalario Reuniones con los responsables de quiroacutefanos
- Material extrahospitalarioReunioacuten con responsables de distritos
ESTABLECIMIENTO DE UNA UNIDAD DE COMUNICACIOacuteN DEL SERVICIO
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
SALA DE MACROSCOPIacuteA Y TALLADO
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
FIJACIOacuteN Cuestiones praacutecticas
La relacioacuten de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 120 como miacutenimo Este punto lo podemos subsanar
Antildeadir maacutes volumen de fijador
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa pues de lo contrario las zonas centrales no se fijaran bien El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm Este punto lo podemos subsanar
Apertura de piezas grandes y soacutelidas para permitir la penetracioacuten del fijador
El tiempo de fijacioacuten es variable dependiendo fundamentalmente de las dimensiones de la muestra a fijar Muestras pequentildeas no maacutes de 8 horas Muestras grandes no maacutes de 24 horas Depende de nosotros
En el tallaje de la pieza tener en cuenta aquellas muestras que van a llevar estudio inmunohistoquiacutemico y tomar cortes de zonas bien fijadas no excesivamente grandes para prevenir problemas posteriores Ej Piezas con caacutencer de mama y de colon
Dr Claudio Montero
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