1. fijación

ATLAS de HISTOLOGÍA VEGETAL y ANIMAL

Técnicas histológicas

FIJACIÓN

Manuel Megías, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Biología Funcional yCiencias de la Salud.

Facultadde Biología. Universidadde Vigo.

(Versión: Diciembre 2015)

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Introducción .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

El proceso hisológico .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Fjiación .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Métodos de fijación .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Tipos de fijadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

ÍNDICE

En estas páginas dedicadas a las técnicashistológicas vamos a describir los procesosexperimentales necesarios para obtener seccionesteñidas y listas para observar al microscopiopartiendo de tejidos vivos extraídos de un animalo de una planta. Por tanto, dedicaremos espaciosa la obtención, fijación, inclusión, corte y tinciónde los tejidos. Todos estos apartados seguirán elmismo esquema que los capítulos dedicados a lostejidos o a la célula, partir de un esquema básicoy ampliar la información sucesivamente enpáginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto devista operativo, pero sí a la conveniencia de suuso y a sus capacidades.

La mayoría de las técnicas histológicas vanencaminadas a preparar el tejido para suobservación con el microscopio, bien sea ésteóptico o electrónico. Ello es debido a que laestructura de los tejidos está basada en laorganización de los tipos de células que loscomponen y, salvo contadas ocasiones, las

características morfológicas de las células sólo sepueden observar con estos aparatos.

Existen procedimientos rápidos y simples parala observación de tejidos y células vivas quereciben el nombre de vitales. Por ejemplo, laobservación del flujo sanguíneo en capilares delsistema circulatorio. Otra forma de observarcélulas o tejidos vivos es mediante las técnicashistológicas supravitales, en los que las células ylos tejidos se mantienen o se hacen crecer fueradel organismo, como es el caso de los cultivos decélulas y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales sonaquellas en las que las células mueren durante elproceso, pero las características morfológicas ymoleculares que poseían en estado vivo seconservan mejor o peor dependiendo del tipo detécnica. Estas páginas estarán dedicadas a estetipo de técnicas, puesto que son las máscomúnmente usadas en los laboratorios dehistología.

Introducción

Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.

4Técnicas histológicas. Introducción.

Denominamos proceso histológico a una seriede métodos y técnicas utilizados para poderestudiar las características morfológicas ymoleculares de los tejidos. Hay diversos caminospara estudiar los tejidos, es decir, series detécnicas que se utilizarán dependiendo de quécaracterística deseemos observar. En el siguienteesquema se muestran los métodos y técnicascomúnmente empleados para el procesamientode los tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o electrónico. Sin embargo,hay que tener en cuenta que existen muchasvariantes a estos "caminos" y su eleccióndependerá del resultado final que queramosobtener.

El proceso histológico comienza con laobtención del tejido objeto de estudio. En el casode los tejidos vegetales directamente se tomanmuestras de los distintos órganos que componenel cuerpo de la planta, mientras que para lostejidos animales podemos optar por dos opciones:coger una porción del tejido u órgano yprocesarla o procesar primero el animal completoy luego extraer la muestra que nos interese. Encualquier caso las muestras son habitualmentefijadas con unos soluciones líquidas denominadasfijadores, las cuales se usan para mantener lasestructuras celulares y moleculares inalterablesdurante el procesamiento posterior y con unaorganización lo más parecida posible a como se


El proceso histológico

Esquema del proceso histológico.

5Técnicas histológicas. Proceso histológico.

encontraban en la muestra viva. Tambiénpodemos fijar las moléculas de los tejidos porcongelación rápida. Fijar un tejido es como haceruna fotografía de dicho tejido, su estructura semantendrá hasta su observación. La fijación porcongelación se emplea cuando la fijación químicao los procesos histológicos posteriores alteran lascaracterísticas de la muestra que queremosestudiar, por ejemplo una molécula sensible adichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede aincluir el tejido para posteriormente obtenersecciones. Cuanto más delgada queramos que seanuestra sección más tenemos que endurecernuestra muestra. Esto se consigue embebiendo eltejido con sustancias líquidas que posteriormentepolimerizarán (resinas) o se volverán consistentes(ceras). También se puede conseguir el mismoefecto mediante congelación rápida. Cortes másgruesos de 40 Cm se pueden cortar sin necesidadde inclusión usando el vibratomo. Los medios deinclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de lostejidos por solventes orgánicos liposolubles yposteriormente sustituirlos por el medio deinclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede acortar los tejidos, es decir, obtener secciones.Existen diferentes aparatos de corte que permitenconseguir secciones ultrafinas (del orden denanometros), semifinas (de 0.5 a 2 Cm), finas(entre unas 3 y 10 Cm) y gruesos (mayores a 10Cm). Habitualmente las secciones se procesan

para poder observarlas y estudiarlas, aunqueciertos tipos de microscopía, por ejemplo concontraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las seccionesse tiñen con colorantes que son hidrosolubles, porlo que hay que eliminar el medio de inclusiónpara que los colorantes pueden unirse al tejido.Las secciones ultrafinas (observadas con elmicroscopio electrónico) o semifinas (observadascon el microscopio óptico) se pueden contrastarcon metales pesados o con colorantes,respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con losmicroscopios. Existen dos tipos básicos demicroscopios: óptico y electrónico. Los primerosofrecen una gran versatilidad en cuanto a modosde observar los tejidos: campo claro,fluorescencia, contraste de fase, polarización ocontraste de interferencia diferencial, mientrasque los segundos permiten un gran poder deresolución, pudiéndose observar característicasultraestructurales.

Como dijimos al comienzo existen múltiplesvariaciones sobre este esquema general deprocesamiento histológico. Por ejemplo, sepueden observar tejidos con el microscopioelectrónico de barrido sin necesidad de incluir nicortar, pero sólo observaremos superficies. En lassiguientes páginas veremos con cierto detallealgunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los tejidos.


6Técnicas histológicas. Proceso histológico.

Todos los tejidos, bien cuando se extraen deun organismo o bien cuando el organismo en elque están muere, sufren dos tipos de procesosdegradativos: autolisis por acción de enzimasintracelulares, es decir, autodigestión, yputrefacción por acción bacteriana. Además, elprocesamiento histológico posterior del tejidopara poner de manifiesto y observardeterminadas estructuras supone una metodologíaque puede degradar las estructuras tisulares. Fijarun tejido es preservar sus característicasmorfológicas y moleculares lo más parecidasposibles a las que poseía en su estado vivo. Escomo hacer una fotografía del tejido vivo y poderobservarla, tras cierto tratamiento, con elmicroscopio. Así, los fijadores deben evitar laautolisis, proteger frente a ataques bacterianos,insolubilizar elementos solubles que se quierenestudiar, evitar distorsiones y retraccionestisulares, penetrar y preparar el tejido para poderllevar a cabo tinciones específicas posteriores, sies necesario, etcétera.

No existe un fijador universal, ni un método defijación único. Incluso podemos usar variosfijadores secuencialmente según nuestrasnecesidades. La elección depende de lascaracterísticas fijadoras que necesitemos. Porejemplo, si queremos estudiar actividadesenzimáticas debemos usar un fijador que no nosaltere el centro activo de las enzimas en las queestamos interesados, y quizá para ello tengamosque sacrificar en cierta medida la morfologíatisular. Si queremos estudiar la ultraestructuracelular debemos usar fijadores que la preserven yque protejan a las membranas celulares durante elprocesamiento de inclusión en resinas, y quizáesto altere su apetencia por los colorantesgenerales. Si queremos teñir un determinadocomponente celular difícilmente teñible quizádebamos usar un fijador que lo modifique paraque sea reconocido más fácilmente por loscolorantes. En cualquier caso hay característicasde los fijadores que tenemos que tener en cuentaantes de su uso:

Velocidad de penetración. El proceso defijación ha de ser rápido y la velocidad dedifusión de la sustancia fijadora en los tejidos es

un factor determinante. Este parámetrocondiciona el tamaño de la pieza que queramosfijar, más pequeña cuanto menor sea la velocidadde difusión del fijador empleado, y tambiéndetermina el tiempo de fijación, mayor cuantomenor tiempo de difusión.

Velocidad de fijación. Esta característica nodependen de la velocidad de difusión sino de laspropiedades químicas del fijador y condiciona eltiempo que debe permanecer el tejido encontacto con el fijador.

Endurecimiento. Los fijadores generalmenteendurecen los tejidos, lo cual depende del tipo defijador y del tiempo que el tejido haya estadoexpuesto a él.

Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambiosde volumen en la células producidos por unaosmolaridad del fijador diferente a la del tejido.Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad delas soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar.No es necesario añadir sustancias complejas. Porejemplo, para los tejidos de animales terrestresbasta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Sonsales que no afectan a la capacidad del fijador.Normalmente se suelen usar solucionestamponadoras a un pH semejante al del tejido eisoosmóticas con dicho tejido.

Efecto mordiente. Algunas estructuras tisularesson difíciles de teñir puesto que tienen pocaapetencia por los colorantes. Esta apetenciapuede ser incrementada con un tratamientoprevio. Algunos fijadores, además de fijar,modifican químicamente a ciertas estructurascelulares para que posteriormente puedan unirsea ellas los colorantes. Este este tipo demodificación química se le denomina efectomordiente.

Artefactos. Los procesos de fijación puedenacarrear alteraciones tisulares como variacionesmorfológicas, cristalización de compuestos,desplazamiento de sustancias, etcétera. Estoscambios pueden producirse por las característicasdel fijador o por un mal uso de éste. En cualquiercaso deben tenerse en cuenta para no describircomo características tisulares lo que es unartefacto introducido durante la fijación.


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Fijación

Técnicas histológicas. Fijación

Existen diferentes formas de fijar los tejidosdependiendo del tipo de fijador, de la estructura afijar y de lo queramos observar. Los métodos defijación se pueden clasificar en dos tipos: físicosy químicos.

Los fijadores físicos se basan o bien en unacongelación muy rápida del tejido o bien en laaplicación de calor elevado. Se utilizan cuandocuando los fijadores químicos alteran laestructuras que queremos observar, cuandonecesitamos una fijación muy rápida, o cuando eltipo de tejio y la ténica que usaremos lo requiera.La congelación rápida es un buen método depreservación de las caraterísticas moleculares y esconveniente que sea rápida puesto que así seimpide la formación de grandes cristales de hieloque nos destrozarían la estructura del tejido.Existen variantes de esta técnica como son lacriodesecación o liofilización y la criosustitución.La criodesecación parte de tejido previamentecongelado al que posteriormente se le sublima elhielo, es decir, el agua pasa de estado sólido agaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminarel agua se impide que se den reaccionesquímicas, por lo que, además de la fijación, estemétodo preserva el tejido en el tiempo. Lacriosustitución también parte de tejido congeladopero en este caso se produce una sustitución lentadel hielo por una solución fijadora. Con ello seposibilita una fijación química sobre un materialque no ha sufrido deterioro puesto que estácongelado. Los métodos de fijación por calor noson frecuentemente usados, excepto para elestudio microorganismos.

Los métodos químicos utilizan solucionesacuosas compuestas por moléculas fijadoras queestablecen puentes entre las moléculas del tejido,manteniéndolas en sus lugares originales eimpidiendo su degradación. Hay dos métodosbásicos de fijación con fijadores líquidos:inmersión y perfusión. En cualquier caso elfijador debe llegar a todas las partes el tejido lomás rápidamente posible.

Inmersión. En el método de inmersión laspiezas de tejido se sumergen en la solución

fijadora. Hay que tener en cuenta algunasprecauciones.

1 ) Las piezas de tejido no deberían superar los0.5 cm de espesor para que el fijador alcance elinterior de la pieza antes de que ésta comience adeteriorarse. Esto depende de la velocidad depenetración del fijador y de las características deltejido. Por ejemplo, si tiene cavidades por dondepenetre la solución fijadora el volumen podría sermayor.

2) El volumen recomendado de fijador es 20veces superior al volumen de la pieza.

3) La osmolaridad del tejido y de la soluciónfijadora deben estar equilibradas.

4) El pH del fijador debe ser próximo alfisiológico.

5) El tiempo de fijación depende de cada tipode fijador. Una agitación suave durante la fijaciónayuda a la penetración del fijador y disminuye eltiempo.

Perfusión. Por este procedimiento la soluciónfijadora se introduce a través del sistemacirculatorio por el cual accede a todas las célulasdel tejido gracias a la red de capilares. Medianteeste método se puede fijar un animal completointroduciendo la solución fijadora a través delventrículo izquierdo del corazón. El fijadorllegará a todas las células irriegadas por la sangrebombeada por dicho ventrículo (circuitocorporal). Si se quieren fijar los pulmones habríaque introducir el fijador por el ventrículo


Métodos de fi jación

8Técnicas histológicas. Métodos de fi jación

Fijación por inmersión


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derecho. También podemos fijar un únicoórgano en el caso de que podamos introducirla solución fijadora en la arteria principal queirriga dicho órgano. La perfusión no siemprees posible en algunos casos como en muchasbiopsias o en los tejidos vegetale.

El método de fijación por perfusión esmucho más efectivo que el de inmersión yaque la solución fijadora llega rápidamente aescasa distancia de todas las células de laestructura perfundida. Por tanto, la velocidadde penetración del fijador no es unacondición limitante.

Antes de introducir el fijador en el sistemade vasos sanguíneos hay que eliminarpreviamente la sangre con una solución delavado oxigenada, de otra manera su interaccióncon el fijador produce trombos que impedirían lafijación de determinadas zonas del animal o delórgano. Respecto a las precauciones mencionadasanteriormente en el método de inmersióndebemos cuidar aquí también la osmolaridad, elpH y el tiempo de fijación.

Este método de fijación por perfusión requiereconocer la presión a la que se va a introducir lasolución fijadora en el animal o estructura, la cual

debe ser similar a la que posee la presiónsanguínea normal en estado vivo. La presión queejercerá la solución fijadora se puede regularmediante bombas peristálticas (ver figura) o porgravedad, es decir, variando la altura a la cual secoloca la solución fijadora respecto a la delanimal. Esto es importante porque una presiónmuy baja prodría impedir que la solución fijadoraalcanzara todas las partes de la estructura y unpresión muy alta podría provocar roturas de losvasos sanguíneos y de la propia estructura tisular.

Fijación por perfusión de un órgano. Mediante perfusión

se consigue que la solución fi jadora llegue a todas las

células del órgano a través del sistema sanguíneo.

Mediante una bomba peristáltica se introduce la solución

fi jadora a través de la arteria que irriga el órgano. Se

obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen

al órgano.

Fijación por perfusión de un organismo completo. Mediante este tipo de perfusión se introduce la solución

fi jadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la presión suficiente para permitir al fi jador entrar

a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto

por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar la solución fi jadora pasa a los vasos venosos que terminan

por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la

solución fi jadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo derecho.

Técnicas histológicas. Métodos de fi jación

Existen multitud de fijadores en los manualesde técnicas histológicas. Aquí sólo trataremosaquellos que consideramos de uso más comúnpara la observación de tejidos al microscopio, esdecir, aquellos que mejor preserven la estructuracelular. Los fijadores químicos son los másfrecuentemente empleados, bien compuestos porun solo tipo de sustancia fijadora o con mezclasde varias de ellas.

Los fijadores se pueden clasificar en dosgrandes grupos según su acción sobre el tejido:los desnaturalizantes y los que establecen enlacescruzados. Los primeros, al extraer agua de lostejidos producen desnaturalización de lasproteínas produciendo coagulación proteica,mientras que los segundos establecen enlacesquímicos entre moléculas del tejido. Los fijadoresque tienen como base al alcohol sondesnaturalizantes, tales como el Bouin o elCarnoy, mientras que el formaldehído o elglutaraldehído establecen enlaces.

¡Atención! La mayoría de las sustanciasfijadoras son tóxicas por inhalación o porcontacto, algunas de ellas cancerígenas. Hay queseguir las indicaciones de seguridad para sumanejo y utilización.

Fijadores simples

Alcohol etílico. Fija por deshidratación y se usaentre el 70 y 90 %. Es un buen fijador parapreservar proteínas, como enzimas, glucógeno,pigmentos y es útil para fijar las extensionescitológicas. Debido a que deshidrata, a la vez quefija, se puede usar también como un conservantede las muestras. Tiene algunos inconvenientescomo producir endurecimiento y la retracción delos tejidos. Carece de efecto mordiente.

Ácido acético. Su proceso de fijación consisteen cambiar el estado coloidal de las proteínas. Seutiliza a una concentración que varía entre el 1 yel 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos ynucleoproteínas. Como inconvenientes cabedestacar la destrucción de las mitocondrias ymala fijación de membranas y citoplasma. Sesuele usar en combinación con otros fijadores.Ejemplos: BOUIN, FFA

Ácido pícrico. La fijación la produce porquelas sales del tipo picrato coagulan las proteínas delos tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de unasolución saturada de ácido pícrico. Preserva bienla estructura celular, no produce retraccionescuando el tiempo de fijación es óptimo, preservabien glucógeno y lípidos. Es un buen fijador paratinciones generales puesto que tiene efectomordiente y favorece la unión de los colorantes.Hay que eliminarlo completamente antes deproceder a la inclusión en ceras como la parafinapuesto que dificulta la penetración de la parafina.Se suele usar combinado con otros fijadores.Ejemplos: BOUIN

Tipos de fi jadores

Etanol: CH3CH2OH

Ácido acético: CH3COOH

Ácido pícrico: C6H2OH(NO2)3

10Técnicas histológicas. Ftipos de fi jadores.


Formaldehído. Actúa mediante la formaciónde puentes entre las moléculas tisulares. Se utilizaa concentraciones próximas al 4 %. Es un fijadorampliamente usado por la buena preservación deltejido, actúa como conservante, produce pocaretracción tisular, es un buen fijador para lípidos,es compatible con la mayoría de las tincioneshistológicas, incluidas las de inmunocitoquímicae hibridación de ácidos ribonucleicos.Normalmente se usa en solución tamponada eisotónica. Actualmente se prepara a partir deparaformaldehído, sustancia sólida. Ejemplos:BOUIN, FFA , PLP.

Glutaraldehído. Forma puentes entre lasmoléculas de los tejidos. Se usa a una proporciónde entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidadpara preservar la estructura celular, por lo que esel fijador de referencia para observación deultraestructuras celulares con el microscopioelectrónico. Pero hay que tener cuidado con subaja penetración tisular y puede producirretracciones. Se usa en soluciones tamponadasisotónicas.

Tetróxido de osmio. Forma puentes entremoléculas. Se emplea al 1 % en solucionestamponadas. Es buen fijador de la ultraestructurade la célula por lo que se emplea habitualmentepara las observaciones con el microscopioelectrónico. Es un buen fijador para grasas ymembranas celulares. Por su fuerte carácteroxidante no se usa para tinciones convencionales,excepto para las impregnaciones argénticas comoel método de Golgi.

Mezclas fijadoras

La mayor parte de los procesos de fijación usanvarias sustancias fijadoras, bien mezcladas en lasolución acuosa inicial o utilizadas sucesivamenteen el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajasde cada una de ellas y se pueden contrarrestar susdesventajas. Hay multitud de formas de usar losdiferentes fijadores, tanto en sus componentescomo en las proporciones de éstos, dependiendode las necesidades posteriores, es decir, qué tipode tejido queremos fijar y qué queremos ver dedicho tejido. A continuación vamos a mencionaralgunas combinaciones usadas frecuentementeporque tienen unas propiedades de fijación quelas hace apropiadas para las observación de unagran variedad de tejidos y para el uso diversas detécnicas de tinción.

Líquido de Bouin. Está formado por ácidopícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Esuna solución muy utilizada para el procesamientode tejidos que se incluirán en parafina (vercapítulo de inclusión) y a cuyas secciones se lepueden aplicar un amplio espectro de tinciones.

Formaldehído: CH2=O.

Glutaraldehído.

Tetróxido de osmio. OsO4.

Técnicas histológicas. Ftipos de fi jadores. 11


Es muy útil para tejidos blandos y embriones, ypreserva bien el núcleo y el glucógeno. Hay quetener cuidado con el tiempo de fijación, que nodebe exceder de 48 h en el caso de fijaciones porinmersión. Tras la fijación las muestras de tejidose pueden conservar en alcohol de 70°. No estárecomendado para el riñón ni para el estudio demitocondrias. Antes de la inclusión en parafina esconveniente eliminar el ácido pícrico mediantelavados en alcohol de 70° porque impedir unabuena inclusión o que las tinciones no seanadecuadas.

Carnoy. Es un buen fijador para el glucógeno,para los hidratos de carbono simples y para lasproteínas fibrosas. Es bueno para visualizar losácidos nucleicos, aunque no la morfologíanuclear, y para los grumos de Nissl del sistemanervioso. Puede producir retracciones tisulares.Está formado por etanol absoluto 60 %,cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehído. El formaldehído esquizá el fijador más usado hoy en día, tanto paratécnicas histológicas rutinarias como para otrascomo la inmunocitoquímica o la hibridación deácidos nucleicos. Lo más frecuente es utilizarloen solución al 4 % junto con otros fijadores. Sesuele disolver en soluciones tamponadas quetienen una osmolaridad similar a la del tejido que

se pretende fijar. Para fijaciones de tejidosdestinados a microscopía electrónica se suelenutilizar soluciones fijadoras que contienenformaldehído y glutaraldehído. La función delformaldehído es iniciar una fijación rápida, porsu mayo capacidad de penetración, mientras queel glutaraldehído realizará una fijación máspoderosa, pero más lenta que no afectará a laestructura tisular puesto que el formaldehído yaha realizado una fijación previa.

Glutaraldehído-tetróxido de osmio. Losfijadores en combinación no tienennecesariamente que usarse al mismo tiempo. Eshabitual que los tejidos destinados a microscopíaelectrónica sean inicialmente fijados englutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2al 4 %), para posteriormente ser postfijados entetróxido de osmio al 1 % en solucióntamponada. Este último es un buen preservadorde la ultraestructura celular, sobre todomembranas, en cooperación con los aldheídos.Esto es importante porque el proceso paramicroscopía electrónica supone incubar el tejidoen solventes orgánicos y polimerización deresinas a 60 °C, durante las cuales el tejido debeser preservado.

Técnicas histológicas. Ftipos de fi jadores. 12


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