UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS. FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN. LICENCIATURA EN BIOLOGIA. BIOTECNOLOGA

CULTIVO IN VITRO DE ORQUDEAS EN PELIGRO DE EXTINCIN

TEMA GENERAL: Biotecnologa Vegetal TEMA ESPECFICO: Conservacin de plantas en va de extincin PRCTICA: Cultivo in vitro DIRIGEN: Jhoanna Cifuentes, Pilar Arvalo, Paola Barreto y Luisa Santaf.

INTRODUCCIN La Biotecnologa vegetal puede definirse como el conjunto de manipulaciones biolgicas de clulas u organismos vivos, con fines agronmicos y/o medicinales, entre otros. Tiene dos lneas prioritarias: cultivos de tejidos vegetales in vitro e ingeniera gentica (Pierik, 1987). El cultivo in vitro de materiales vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo (Ordez, 2003). A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta tcnica es de gran utilidad en la produccin de plantas en peligro de extincin, ya permite que la propagacin de grandes volmenes de plantas sea un poco ms rpida y dinmica; para as mismo, obtener una mayor cantidad de material vegetal, que luego podra reinsertarse en las reas donde se ha depredado. En la presente prctica, realizaremos un cultivo in vitro de Epidendrum elongatum Jacq, con el fin de propagar esta especie en peligro, a partir de

semillas cultivadas sobre un medio acuoso nutritivo, esperando obtener una germinacin satisfactoria.

Figura 1. Orqudea: Epidendrum elongatum Jacq

OBJETIVOS Objetivo general Realizar un cultivo in vitro a partir de semillas Epidendrum elongatum Jacq. Objetivos especficos: Conocer el proceso para realizar un cultivo in vitro. Desarrollar las tcnicas de cultivo in vitro de la especie propuesta. Reconocer la importancia de la tcnica de cultivo in vitro en la conservacin de especies de plantas en peligro. MARCO TERICO Cultivo in vitro. Se define como el cultivo en medio nutritivo bajo condiciones estriles, de plantas, semillas, embriones, rganos,

explantos, tejidos, clulas y protoplastos de plantas superiores. (Pierik, 1987). Consiste en tomar una parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo o en un frasco de vidrio sobre un medio acuoso nutritivo. El cultivo in vitro es un mtodo de propagacin de plantas de aplicacin profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones aspticas y con unas instalaciones especiales (Pierik, 1987). Esta tcnica ofrece una serie de ventajas, algunas de las cuales se mencionan a continuacin: El cultivo in vitro es de gran utilidad en la produccin de plantas en peligro de extincin, ya permite que la propagacin de grandes volmenes de plantas sea un poco ms rpida y dinmica. El manejo de la gran cantidad de plantas se puede realizar en espacios reducidos. Reduce los costos en el mantenimiento. Los materiales pueden ser propagados en cualquier poca del ao. Florecimiento temprano Las plantas producidas in vitro estn libres de patgenos. Facilita el movimiento de grandes cantidades de plantas entre distintas zonas geogrficas (Pierik, 1987). Tipos de cultivo y propagacin de plantas. Existen dos maneras bsicas para el cultivo de plantas: a. Mediante el uso de semillas b. Mediante la utilizacin de una parte de una planta ya existente (esqueje, patilla, acodo, etc.) a. Propagacin a partir de semillas: Llamada tambin propagacin sexual, debido a que la semilla contiene la informacin de las cualidades tanto de la planta padre

como de la planta madre. Es un desarrollo ms lento, pero da lugar a plantas ms vigorosas. El tiempo de germinacin, vara de acuerdo a la especie y a las condiciones de temperatura, humedad y dems (Garrido y San Martn, 2010). b. Propagacin a partir de una parte de la planta: Se utiliza para obtener una gran cantidad de plantas sin necesidad de usar las semillas y permite producir muchas plantas de forma rpida y barata (Garrido y San Martn, 2010). Medios de cultivo. Uno de los factores ms importantes que se deben tener en cuenta para lograr la respuesta morfolgica deseada en un cultivo in vitro, es la composicin del medio de cultivo (Badillo et al, 2009). El medio de cultivo est compuesto por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarn a obtener un callo, una planta completa, o un rgano vegetal en particular, a partir del material vegetal elegido y algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), todo esto en condiciones de asepsia (Badillo et al, 2009). METODOLOGA Materiales: Materiales de vidrio: Beaker (vasos de precipitado) Pipetas Buretas Probetas Agitador Frascos de compota Mquinas: Autoclave Mechero bunsen Balanza elctrica de precisin. Cmara de flujo laminar Incubadora Fitotrn

Estufa Instrumentos: Pinzas rectas Bistur Papel indicador de pH Reactivos: Myo inositol (0, 02 gr.) Nutri ponic (5 ml) Sacarosa (6gr) Agua destilada Hidrxido de potasio al 0,6 % Hipoclorito de sodio al 1% Alcohol al 70% Agar (concentracin: 0,6%; peso: 1,2 gr.) Material vegetal: Semillas de Epidendrum elongatum Jacq (8 semillas). Otros materiales: Vinilpel Algodn Servilletas Papel aluminio Papel peridico Alcohol al 70 % 2 velas Encendedor o fsforos Bata blanca (individual) Gorro (individual) Guantes (individual) Tapabocas (individual)

temperatura y humedad ideales que lleven a cabo la germinacin de nuestra semilla (T 25C). Incubadora: Una vez germina la planta es llevada a este cuarto donde se le siguen controlando las condiciones de temperatura, iluminacin y humedad relativa para su ptimo crecimiento

Procedimiento: PRIMERA PARTE. Dirigen: Pilar Arvalo Cifuentes

y

Jhoanna

En un laboratorio de biotecnologa vegetal, trabajaremos en distintos tipos de cuartos, con temperaturas y atmsferas controladas y modificadas para este fin. Se debe contar mnimo con tres cuartos a saber: Cmara de flujo laminar: Donde se prepara el medio de cultivo que asegurar a la semilla una germinacin sana libre de patgenos. Cuarto de transferencia o fitotrn: Este es el cuarto donde la semilla germinar, Este cuarto debe tener las condiciones necesarias de

Esterilizacin de los implementos: Se llevan los gorros, tapabocas, pinzas, bistur y frascos a la autoclave a 20 libras de presin durante 20 minutos. Preparacin de la mezcla: Una vez escogida la formulacin del medio de cultivo, se procede a su preparacin. Compuesto por nutri ponic (5 ml), myo inositol (0,02 gr), sacarosa (6 gr) y agua destilada. Ajuste del pH del medio: Cuando se prepara un medio de cultivo, despus de aadir todos sus componentes, se procede a ajustar el pH final al valor deseado con ayuda de un papel indicador de pH, aadiendo hidrxido de potasio el cual lo estabiliza a un pH de 5,8. Esto ayuda a la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo y a la absorcin de determinados nutrientes por parte de la semilla. Una vez ajustado el pH se procede a adicionar el agar (al 0,6 %; 1,2 gr) Calentamiento del medio: Se calienta la mezcla en la estufa, hasta el punto de ebullicin para lograr que el gelificante acte. Distribucin: Se distribuye el medio en los frascos de compota y luego se cubren con papel aluminio. SEGUNDA PARTE. Dirigen: Paola Barreto y Luisa Santaf.

Predesinfeccin de las semillas: Se sumergen durante 10 min en solucin de detergente, enjuagando con agua destilada durante 5 minutos. Desinfeccin y siembra: Dentro de una cmara de flujo laminar, se sumergen durante 10 min en solucin de 160 ml de H2O destilada y 40 ml de NaHCl al 1 %, en constante agitacin durante 10 min. Posteriormente, se aplica un enjuague de cinco minutos con H2O destilada, para luego sembrar de a dos semillas en cada frasco con caldo nutritivo. Incubacin: Los cultivos se trasladan a una cmara de incubacin a una temperatura de 25 C, y en ausencia de luz. Revisin: Se realizan revisiones un da cada semana para observar cualquier tipo de avance. Variacin. Se realizara una variacin que consiste en sembrar las semillas en tierra. Procedimiento: Se someten las semillas a una desinfeccin sumergindolas en hipoclorito de sodio al 5 %, se siembran en tierra y luego se llevan a la incubadora con las mismas condiciones del cultivo in vitro. RESULTADOS Estudios previos sobre biotecnologa en Amrica Latina

Se han realizado distintos estudios y a su vez diagnsticos que apoyan el papel de la biotecnologa y el papel que juega este en los pases Latinoamericanos. Explique cmo ha influenciado la Biotecnologa en los pases latinoamericanos, de acuerdo a sus recursos y potencialidades, teniendo en cuenta la grfica? En cuanto al cultivo in-vitro, maravilla de la biotecnologa, la asepsia es de vital importancia, para que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se mantengan desinfectadas desde el principio del proceso de germinacin, ya que cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecer ms rpido que las semillas y pronto ocupar su espacio hasta matarlas, por tanto, cules son los mtodos adecuados para llevar a cabo dicho proceso sin ver afectado el cultivo a realizar?

Fuente: McNeely et al, 1999.

Indique dos de los casos ms conspicuos al implementar este tipo de avance tecnolgico en Colombia. Cul es el papel, en general, del mioinositol en la fisiologa de las plantas?

BIBLIOGRAFA Badillo et al. (2009). Manual de laboratorio de cultivo de tejidos. Instituto Politcnico Nacional. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa. Academia de Biotecnologa. Mxico D.F. Garrido, P. y San Martn, N. (2010). Gua de mtodos para la propagacin de plantas con nfasis en especies nativas de la localidad de Name. Proyecto: Juntos por la Conservacin de la Cinaga del Name, una oportunidad para nuestro desarrollo local. Ordez, M.A. (2003). Propagacin in vitro de Mammillaria voburnensis Scheer (Cactaceae). Tesis de grado. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Escuela de Biologa.

Pierik, R. (1990). Cultivo in vitro de las plantas superiores. Mundiprensa. Madrid, Espaa. Pedroza, J. (2009). Efecto del carbn activado, cido indolactico (AIA) y bencil amino purina (BAP) en el desarrollo de protocormos de Epidendrum elongatum Jacq bajo condiciones in vitro. Revista Colombiana de Biotecnologa, Vol 11, No 1 W. Roca (2003). Informe preparado para la Comisin Econmica para Amrica Latina y el Caribe (CEPAL) y la Corporacin Andina de Fomento (CAF). Lima-Per Centro Internacional de la Papa (CIP).