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Acta Botánica Cubana No. 213, pp. 5–10 Agosto-Octubre, 2011
Evidencias preliminares del cultivo in vitro de Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae)
Preliminar evidences of Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae) in vitro culture
Miriam Liset PREDE RODRÍGUEZ*, Osniel SÁNCHEZ RIVERA*, Carlos Alberto PINO GONZÁLEZ*,
Claire KEVERS** y Jacques DOMMES**
RESUMEN. Atendiendo a las potencialidades medicinales de Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don sustentadas por el notable nivel de actividad
antioxidante y estrogénica que expresa, se requiere de alternativas de propagación que garanticen la conservación y sostenibilidad del taxón. La
propagación in vitro puede convertirse en herramienta eficaz en este sentido pero no son conocidas referencias al respecto. El presente trabajo
expone los resultados preliminares obtenidos en la propagación in vitro de la especie. Semillas y yemas apicales fueron expuestas a diferentes
tratamientos de desinfección y constituyeron el explante inicial para el establecimiento in vitro del taxón. A partir de hojas obtenidas in vitro se
promovió la formación de brotes adventicios al suprimir el suministro de fitohormonas. Hojas y fragmentos de raíces de plántulas obtenidas in
vitro se dispusieron en 11 tratamientos de cultivo empleando las sales de Murashige y Skoog (1962) como medio basal y combinaciones de
ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) - 6-furfurilaminopurina (KIN) y ácido naftalenacético (ANA) - 6-bencilaminopurina (BAP), con lo que
se indujo la formación de callos en la mayoría de los tratamientos.
PALABRAS CLAVE. Asteraceae, Pluchea carolinensis, cultivo in vitro, micropropagación, callos.
ABSTRACT. Taking into account the medicinal potentialities of Pluchea carolinensis (Jacq.) G. Don (Asteraceae), supported by its remarkable
level of antioxidant and estrogenic activity, propagation alternatives for improving conservation and sustainability of this species are strongly
needed. Therefore, in vitro propagation can become a useful tool although references concerning this subject are lacking. This paper shows
the preliminary results in the in vitro propagation of this taxon during which seeds and apical buds were exposed to various disinfection
treatments and constituted the initial explant. The formation of adventitious sprouts in leaves obtained in vitro was accomplished by suppressing
phytohormone supply. Leaves and root fragments from plantlets obtained in vitro were planted in 11 culture treatments using Murashige &
Skoog salts as basal medium and combinations of 2,4-D - KIN and ANA-BAP. Calli were formed in most treatments.
KEY WORDS. Asteraceae, Pluchea carolinensis, in vitro culture, micropropagation, calli.
Manuscrito recibido: 25 de septiembre de 2010 Manuscrito aprobado: 12 de noviembre de 2010.
*Instituto de Ecología y Sistemática, C. P. 11900, La Habana 19, Cuba.**Universidad de Liège (ULg), Bélgica.
INTRODUCCIÓN
Las ya conocidas propiedades medicinales de Pluchea
carolinensis (Jacq.) G. Don, incorporadas a la tradición
popular cubana (Roig, 1974), se han potenciado recientemente
con la identificación de principios activos responsables de la
actividad antioxidante (Perera, 2010). De tal forma se convier-
te en un recurso atrayente para la industria Médico-
Farmacéutica y por tanto adquiere una dimensión diferente
desde el punto de vista conservacionista, al implicarse
como taxón de riesgo potencial.
Desarrollar la Micropropagación y otras técnicas in vitro
pueden convertirse en vías alternativas que contribuyan con la
conservación y el uso sostenible del taxón, al asegurar la
obtención de una población ex situ semejante a la población
que la originó en la cual se verifique se mantengan la cuantía
de producción a nivel celular de los metabolitos de interés
y los indicadores de actividad estrogénica y capacidad
antioxidante. Al respecto es poco frecuente hallar referencias
en la Bibliografía especializada, motivado quizás por las
bondades en cuanto a la propagación y adaptación de la
especie y por la reciente validación de estas nuevas
propiedades medicinales que posee.
El presente trabajo expone los resultados preliminares
obtenidos en el establecimiento in vitro de P. carolinensis a
partir de semillas y yemas apicales, la multiplicación por
crecimiento adventicio y la inducción de callos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Semillas extraídas de frutos maduros y yemas apicales
recolectadas en plantas jóvenes de P. carolinensis, que crecen
en el banco de germoplasma (BG) en forma de colección de
campo del Instituto de Ecología y Sistemática (I.E.S.), fueron
utilizadas como explante inicial para el establecimiento de los
cultivos asépticos. Con vistas a comprobar la capacidad de
germinabilidad de las semillas la experiencia pudo extenderse
a material colectado en otras localidades de interés, así se
contó con cuatro muestras procedentes de: Alamar (2006,
Pc ´06); La Bajada, Pinar del Río (2007, Pc ´07 A); Sierra del
Rosario, Pinar del Río (2007, Pc ´07 B); área Bolera, I.E.S.
(2007, Pc ´07 C).
Desinfección superficial. Los explantes se expusieron a
múltiples tratamientos de desinfección superficial que
combinaron cinco soluciones desinfectantes, con diferentes
concentraciones y tiempos de exposición (Tabla 1). Previo a
cada tratamiento el material vegetal fue inmerso en agua
destilada estéril con dos a tres gotas de Tween 80 o Teepol.
Luego de cada inmersión en solución detergente o
desinfectante el material se enjuagó (tres a cinco veces) con
agua destilada estéril.
Una vez desinfectados, los explantes se dispusieron en
tubos de ensayo, sobre 15 mL de medio sólido, confeccionado
sólo con agua y agar. En cada tubo se inocularon 0.05 g de
semillas sobre plano inclinado y una yema apical, con cinco y
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diez réplicas por tratamiento, respectivamente.
Los explantes inoculados se mantuvieron en condiciones
de iluminación fluorescente, blanca, continua y temperatura
Establecimiento de los cultivos. Semillas maduras
colectadas en el BG del I.E.S., previamente desinfectadas con
el tratamiento que combinaba etanol (70 %) 1 min. y solución
de HgCl2 (0.1 %) 15 min., fueron inoculadas en tubos de
ensayo (a razón de 0.05 g / tubo) que contenían 15 mL de
medio Murashige y Skoog (1962) (MS), en estado sólido
y plano inclinado, con cinco réplicas en total.
Aproximadamente a los 15 días de inoculadas, las semillas
fueron transferidas a medio fresco contenido en frascos de
vidrio (dos) que contenían 175 mL del propio medio.
Las muestras de semillas procedentes de las cuatro
localidades referidas anteriormente, una vez desinfectadas con
Javel comercial (12° Cl), 15 min. y Benlato (1.0 g/L), 15
min., fueron dispuestas en medio MS, en estado sólido, en
frascos de vidrio que contenían 175 mL del mencionado
medio de cultivo. Se establecieron entre una y tres réplicas.
Yemas apicales colectadas en el BG del I.E.S.,
desinfectadas con solución de HgCl2 (0.1 %) por 30 seg.,
fueron implantadas en número de uno, en 15 mL de cuatro
tratamientos de medio de cultivo sólido, contenidos en tubos
de ensayo. Los tratamientos se conformaron a partir de las
sales de MS que se combinaron con ácido naftalenacético
(ANA) y 6 - bencilaminopurina (BAP) (Tabla 2). Cada
tratamiento contó con diez réplicas.
Tabla 2. Tratamientos de medios de cultivo ensayados en el
establecimiento de yemas apicales de P. carolinensis.
Tratamientos Descripción
I MS
II MS + ANA (1.0 mg/L)
III MS + BAP (1.0 mg/L)
IV MS + ANA (1.0 mg/L) + BAP (1.0 mg/L)
Sacarosa: 30.0 g/L Agar: 8.0 g/L
pH: 5.7
Tabla 1. Tratamientos de desinfección aplicados a semillas y yemas apicales de P. carolinensis.
Tratamiento Agentes desinfectantes Concentración Tiempos de exposición
Semillas
1 Lejía comercial (NaHCl) 5 % 15 min.
2 Etanol (EtOH) - Lejía Comercial (NaHCl) 70 % - 5 % 1 min. - 15 min.
3 Bicloruro de Mercurio (HgCl2) 0.1, 0.5, 1.0 % 1 min.
4 Etanol (EtOH) - Bicloruro de Mercurio (HgCl2) 70 % - 0.1 % 1 min. – 5, 10, 15 min.
5 Javel comercial (Cl) - Benlato 12° - 1.0 g/L 15 min. - 15 min.
Yemas apicales
1 Etanol (EtOH) 70 % 1 min.
2 Lejía comercial (NaHCl)
0.5 %
5 %
10 min.
1, 3, 5, 15 min.
3 Etanol (EtOH) - Lejía Comercial (NaHCl)
70 % - 0.5 %
70 % - 5 %
1 min. - 10 min.
1 min. - 15 min.
4
Bicloruro de Mercurio (HgCl2)
0.1, 0.5, 1.0 %
0.5 %
0.1 %
0.05 %
30 seg.
30 seg., 45 seg., 1 min.
30 seg., 45 seg., 1 min.
1 min.
Tabla 3. Descripción de los tratamientos empleados.
Tratamientos Descripción
I MS
II MS + 2,4-D (1.0 mg/L) + KIN (1.0 mg/L)
III MS + 2,4-D (1.0 mg/L) + KIN (0.5 mg/L)
IV
V
VI
MS + 2,4-D (1.0 mg/L) + KIN (0.1 mg/L)
MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + KIN (1.0 mg/L)
MS + 2,4-D (0.1 mg/L) + KIN (1.0 mg/L)
VII MS + NAA (1.0 mg/L) + BAP (1.0 mg/L)
VIII MS + NAA (1.0 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)
IX
X
XI
MS + NAA (1.0 mg/L) + BAP (0.1 mg/L)
MS + NAA (0.5 mg/L) + BAP (1.0 mg/L)
MS + NAA (0.1 mg/L) + BAP (1.0 mg/L)
Sacarosa: 30.0 g/L Agar: 8.0 g/L
pH: 5.7
de 25 ± 1 °C durante un mes. Se realizaron evaluaciones
diarias en los primeros 15 días y semanales en los restantes,
para el registro de los niveles de contaminación.
Los cultivos establecidos se mantuvieron en condiciones
de iluminación fluorescente, blanca, continua y temperatura
de 25 ± 1 °C durante un mes. Se realizaron evaluaciones con
frecuencia semanal en las que se tuvo en cuenta la respuesta
de iniciación de cada cultivo según su origen.
Multiplicación por crecimiento adventicio. Brotes
adventicios, generados sobre hojas resultantes de la iniciación
in vitro a partir de yemas apicales de P. carolinensis, fueron
desagregados y dispuestos en frascos de vidrio que
contenían 175 mL de una variante de medio MS, con
reducción a ¼ de sus macronutrientes (medio Do), en estado
sólido. El material contó con cuatro réplicas.
Los cultivos se mantuvieron en condiciones de
iluminación fluorescente, blanca, continua y temperatura de
25 ± 1 °C durante un mes. Se realizaron evaluaciones con
frecuencia semanal en las que se tuvo en cuenta la evolución
en el crecimiento de los brotes implantados.
Callogénesis. Hojas y raíces obtenidas de plántulas
con aproximadamente 34 días de cultivo, resultantes de
la germinación in vitro de semillas de P. carolinensis,
previamente desinfectadas e inoculadas en medio MS,
constituyeron el explante inicial.
Los explantes fueron dispuestos en placas de Petri
(Ø : 5.5 cm) con 15 mL de 11 tratamientos de medio MS
(I – XI), que combinaron ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D) - 6-furfurilaminopurina (KIN) y ácido naftalenacético
(ANA)- 6-bencilaminopurina (BAP) (Tabla 3).
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Tabla 4. Comportamiento de la emergencia in vitro de semillas
de P. carolinensis.
Tiempo de cultivo
(días) Respuesta de iniciación
25 Inicio de la emergencia de pequeñas plántulas
Altura: ~ 0 -0.5 cm
49
Plántulas bien establecidas
Altura: ~ 0.5 - 1.0 cm
Hojas emitidas: 6-7
Se colocaron, en los 11 tratamientos de cultivo (I – XI),
dos hojas por placa, con la superficie abaxial sobre el medio
de cultivo y un total entre ocho y doce réplicas por
tratamiento. Los fragmentos de raíces se inocularon en los
tratamientos I – IV y VII – IX , en igual número (dos) en cada
placa y entre cuatro y seis réplicas por tratamiento.
Los cultivos se mantuvieron en condiciones de
iluminación con luz fluorescente, blanca, continua y
temperatura de 25 ± 1 ° C. Luego de 14 días de cultivo se
evaluó la respuesta de inducción de callos, el diámetro
aproximado de crecimiento alcanzado y el color de los
mismos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Desinfección superficial. En los diferentes ensayos, todos
los tratamientos que emplearon etanol (70 %) y lejía
comercial (0.5 % y 5.0 %), solos o combinados, no incidieron
efectivamente en la desinfección superficial de los explantes.
Aproximadamente entre los cuatro y siete días de cultivo
aparecieron infecciones, provocadas por hongos, alrededor de
los explantes.
En contraste, los tratamientos que utilizaron HgCl2
resultaron más efectivos con relación al control preventivo de
las infecciones superficiales. Con su aplicación se verificaron
registros cercanos al 100 % de no contaminación del explante,
pero con inconvenientes para los tejidos de las yemas
apicales, dado su agresivo poder como desinfectante. Se
identificó con relación a los tiempos de exposición a este
agente y sus concentraciones, que breves exposiciones, en el
orden de los 30 segundos a la concentración de 0.1 %,
permitió la continuidad de los eventos morfogenéticos en las
yemas. En el caso de las semillas se amplía la efectividad a
los tres tiempos empleados, a la propia concentración.
Establecimiento de los cultivos a partir de semillas.
Luego de aproximadamente 25 días de cultivo in vitro, con un
subcultivo intermedio a medio fresco (aproximadamente a los
15 días de la inoculación inicial de las semillas), las semillas
comenzaron a formar pequeñas plántulas, hasta 0.5 cm de
altura, resultantes de la germinación de las semillas.
Con aproximadamente 49 días de cultivo, las plántulas
alcanzaron tallas entre los 0.5 – 1.0 cm de altura y emitieron
seis o siete hojas (Tabla 4, Fig. 1).
Fig. 1. Plántulas de P. carolinensis obtenidas a partir de semillas,
con aproximadamente 49 días de cultivo en condiciones in vitro.
Las tres muestras de semillas de P. carolinensis
correspondientes al año 2007 (A, B, C) manifestaron una
excelente respuesta germinativa in vitro (Tabla 5, Fig. 2).
Tabla 5. Comportamiento de la emergencia in vitro de
cuatro muestras de semillas de P. carolinensis colectadas en
localidades de interés.
Tiempo
de
cultivo
(días)
Muestras de semillas
Pc ’06 Pc ’07 A Pc ’07 B Pc ’07
- Detección de la emergencia
7 - 10
~ 100 %
plántulas
Altura:
~ 0 – 0.6 cm
Hojas
cotiledonares: 2
Inicio de la
emergencia
~ 20 %
plántulas
Altura:
~ 0 – 0.2 cm
Hojas
cotiledonares: 2
~ 83.3 %
plántulas
Altura:
~ 0.3 – 0.4 cm
Hojas
cotiledonares: 2
18 - 21 -
Plántulas
Altura:
~ 0.5 – 1.0 cm
Hojas y raíces
~ 100 %
plántulas
Altura:
~ 0.1 – 0.8 cm
Hojas y raíces
~ 100 %
plántulas
Altura:
~ 0.1 – 0.8 cm
Hojas y raíces
21 - 24
- ~ 100 % generaron plántulas,
con crecimiento muy homogéneo
Altura: ~ 0.5 – 1.0 cm , hojas y raíces
Fig. 2. Plántulas de P. carolinensis obtenidas a partir de semillas
procedentes de dos poblaciones naturales y una colección ex situ, con
más de 20 días de cultivo en condiciones in vitro.
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Las semillas colectadas en el 2006 no manifestaron
respuesta de emergencia germinativa debido probablemente
a la pérdida de viabilidad por daños causados por las
condiciones de almacenamiento o por encontrarse en estado
de dormancia. La dilucidación al respecto sería muy favorable
en el aseguramiento de garantías de respuestas de iniciación
de este explante, con vistas a la micropropagación del taxón.
Establecimiento de los cultivos a partir de yemas
apicales. Aproximadamente a los 15 días en cultivo, fue
observada la emisión de órgano aéreo: hojas de color verde
intenso, en los tratamientos I, III y IV. En el tratamiento I con
menor crecimiento y en el IV con mayor desarrollo (Tabla 6).
Tabla 6. Comportamiento de la respuesta de iniciación a partir de
yemas apicales de P. carolinensis.
Tiempo de
cultivo (días)
Tratamientos
I III IV II
15
30
Emisión de órgano aéreo:
hoja de color verde No respuesta
de crecimiento
vegetativo Crecimiento
pobre
Desarrollo
moderado
Mayor
desarrollo
En nuevas experiencias fue posible corroborar la respuesta de
iniciación a través de la emisión de hojas (Fig. 3).
Fig. 3. Emisión de hoja en cultivo in vitro de yema apical de P.
carolinensis.
Con el avance del tiempo en estos cultivos, en las yemas
apicales originales con hojas formadas, tuvieron lugar dos
eventos: la inducción de callos y el crecimiento adventicio,
ambos a partir de las hojas. Las referencias a este último
resultado aparecen en el epígrafe correspondiente.
En el tratamiento de medio de iniciación IV,
aproximadamente 15 días después de ser transplantado a un
nuevo tratamiento de medio: MS sin hormonas, se produjeron
sobre el limbo de la hoja unos pequeños brotes adventicios de
color verde (Fig. 4).
Multiplicación por crecimiento adventicio. Una vez
removidos de la superficie foliar generadora y desagregados,
los brotes adventicios, transferidos a medio Do, continuaron su
desarrollo hacia la formación de plantas (Tabla 7, Fig. 5). Una
evidencia favorable con relación a la multiplicación in vitro
del taxón.
Fig. 4. Emisión de brotes adventicios sobre superficie
foliar de P. carolinensis en condiciones in vitro.
Tabla 7. Comportamiento del crecimiento in vitro de brotes
adventicios desagregados de P. carolinensis.
Tiempo
de
cultivo
(días)
Material replicado
Frasco 1 Frasco 2 Frasco 3 Frasco 4
7 Hojas en crecimiento
Emisión
de nuevas
hojas.
Plántula
completa,
con nuevas
hojas y
raíces.
Masas
de tejido
verde en
crecimiento.
10
Brotes en
crecimiento.
Emisión
de raíces.
Plántulas
independientes.
Hojas: 2.
Emisión
de raíces.
Plántulas
independientes.
Altura:
~ 0.9 –1.5 cm.
Hojas: 3 – 5.
Hoja
definida.
Masa
de tejido
verde en
crecimiento.
Fig. 5. Plántulas de P. carolinensis desarrolladas a partir de
brotes adventicios cultivados in vitro en medio Do, aproximadamente
10 días.
El crecimiento adventicio constituye una de las vías
utilizadas para la multiplicación in vitro de plantas y es
un evento organogenético que no ocurre en todos los
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sistemas biológicos cultivados in vitro, por lo que en
aquellas especies en las que se promueve tal crecimiento
es recomendable emplearlo en la fase de multiplicación de la
Micropropagación.
Callogénesis. El tejido foliar fue inducido a desdiferenciar
en todos los tratamientos de medios de cultivo con excepción
de los medios I y XI (Tabla 8). Esta respuesta, no esperada
para aquellos tratamientos con elevada proporción de
citoquininas / auxinas, pudo estar relacionada con la joven
edad de los tejidos foliares y sus niveles endógenos de
fitohormonas en condiciones in vitro; las interacciones
con algún otro elemento de la composición del medio; la
combinación de varios factores o quizás el registro de
respuesta en un breve tiempo de cultivo, no representativa de
una evolución de crecimiento posterior (no evaluada) de los
incipientes callos formados inicialmente.
Las raíces mostraron signos de desdiferenciación en los
tratamientos evaluados, todos con mayor proporción de
auxinas, a excepción del MS I, en el que también se indujeron
callos.
Tabla 8. Efecto de diferentes tratamientos de medio en la
callogénesis de P. carolinensis luego de 14 días de cultivo.
Trat.: Tratamiento; Brote: Brote adventicio; H: Hojas; R: Raíces.
Trat.
No Total
de Placas
H / R
Explantes
Hojas Raíces
Raíz Brote Callos Callos
MS I 5 / 3 7 2 - 5
MS II 4 / 2 - - 8 4
MS III 5 / 5 - - 10 10
MS IV 6 / 4 - - 10 6
MS V 6 - - 12 -
MS VI 5 - - 10 -
MS VII 6 / 4 - - 12 8
MS VIII 6 / 4 - - 12 8
MS IX 6 / 5 1 1 12 9
MS X 6 - - 12 -
MS XI 6 - - 1 -
La inducción de callos, tanto a partir de hojas como de
raíces, mostró una ligera superioridad en los tratamientos de
medios que combinaban ANA – BAP.
A los 14 días de cultivo, el diámetro de los callos osciló,
para aquellos originados a partir de hojas, entre 0.2 – 0.6 cm y
para aquellos formados a partir de raíces, entre 0.1 – 0.3 cm
(Figs. 6 y 7). Estos callos se caracterizaron por su color
oscuro.
Los resultados antes expuestos aportan un antecedente
importante en el inicio de estudios relacionados con la
propagación in vitro de P. carolinensis, permiten arribar a
determinadas consideraciones y proponer recomendaciones
para la continuidad de experiencias biotecnológicas.
Fig. 6. Callos de P. carolinensis resultantes de la
desdiferenciación de tejido foliar a los 14 días de cultivo.
Fig. 7. Callos de P. carolinensis resultantes de la
desdiferenciación de tejido radical a los 14 días de cultivo.
CONCLUSIONES
El HgCl2 garantiza una desinfección superficial eficiente
en semillas y yemas apicales de P. carolinensis. El
fungicida Benlato resulta efectivo en semillas.
El grado de tolerancia frente a la desinfección con HgCl2
es máxima para las semillas y restringida para las yemas
apicales de P. carolinensis.
Semillas y yemas apicales de P. carolinensis facilitan la
iniciación de cultivos in vitro, aunque las semillas superan
a las yemas en la respuesta de establecimiento.
Hojas de P. carolinensis emitidas in vitro cuentan con la
potencialidad de generar brotes adventicios.
La reducción del suministro de macronutrientes estimula el
desarrollo de brotes adventicios a plántulas en P.
carolinensis.
Las combinaciones de 2,4-D - KIN y ANA – BAP inducen
una respuesta de desdiferenciación en tejidos de hojas y
raíces, de origen in vitro, en P. carolinensis.
RECOMENDACIONES
Rediseñar ensayos de desinfección empleando HgCl2 con
el objetivo de ajustar este método para yemas apicales.
Incorporar un fungicida a las técnicas de desinfección
aplicadas.
Determinar un método de conservación adecuado para las
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Miriam Liset Prede Rodríguez, Osniel Sánchez Rivera, Carlos Alberto Pino González, Claire Kevers y Jacques Dommes
semillas de P. carolinensis.
Evaluar diseños que posibiliten un mejor
aprovechamiento de la respuesta de iniciación alcanzada
con yemas apicales de P. carolinensis.
Realizar estudio que permita evaluar la emisión de brotes
adventicios como vía de multiplicación efectiva en la
micropropagación del taxón. Enfatizar en los medios de
cultivo adecuados para lograr la formación de brotes
adventicios y su desarrollo a plantas completas.
Profundizar sobre la incidencia de la composición de los
medios de cultivo en la inducción de callogénesis en la
especie.
Agradecimientos. Al gobierno Wallon por el apoyo
financiero brindado a través del Proyecto Species of the
Miriam Liset Prede Rodríguez. Inv. Auxiliar. Master en Ciencias Biológicas. Mención Biotecnología Vegetal.
Dpto. Biotecnología. División Botánica y Herbario Nacional. Instituto de Ecología y Sistemática.
Cuban flora interesting for pharmacological industry: extracts
with high antioxidant capacity, para la realización de las
experiencias de laboratorio.
REFERENCIAS
Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant.
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Perera, W.H., J. Tabart, A. Gómez, A. Sipel, A.L. Payo, C. Kevers y
J. Dommes. 2010. Antioxidant capacity of three cuban species
of the genus Pluchea Cass. (Asteraceae). Journal of Food
Biochemistry 34: 249–261.
Roig, J.T. 1974. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de
Cuba. Ciencia y Técnica, Instituto del Libro, La Habana,
708-710.