construcción del gel: la polimerización

SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida | 1

Version 2. Febrero 2019. C Menor-Salvan.

La técnica de la electroforesis en gel de acrilamida es una de las técnicas básicas mas importantes enel laboratorio de Biología Molecular. Permite la separación de una mezcla de proteínas según su pesomolecular y es la técnica de entrada para la realización del Western-Blot, purificación de proteínaspara su análisis por espectrometría de masas, estimación de peso molecular o identificación devariaciones en la expresión o estructura de proteínas. Su fundamento físico tiene cierta complejidad,por lo que aquí mostraremos una versión mas simplificada, de interés para los biólogos. Vamos acentrarnos en los fundamentos de la técnica mas que en la práctica, sobre la cual hay numerososturoriales en video.

Vamos a elaborar la electroforesis según el método desarrollado y refinado por Ulrich Laemmli en losaños 1960-70. La idea básica de la electroforesis esla separación de proteínas en un campo eléctrico. Para ello necesitamos dos fuerzas opuestas:el campo eléctrico que va a provocar la movilidad de la proteína en base a su carga, y un soportesólido que va a retener la proteína en base a su interacción debido al tamaño. La base de la técnicaSDS-PAGE es hacer que el movimiento de la proteína en el soporte sólido (gel) por accióndel campo eléctrico sea exclusivamente proporcional a su peso molecular.

Construcción del gel: la polimerización

La electroforesis en gel de poliacrilamida requiere la construcción de un hidrogel (gran cantidad deagua retenida en un soporte molecular altamente poroso y reticulado, resultando un material viscoso,semisólido o un sólido blando). El hidrogel de polímero de acrilamida es el soporte donde tiene lugarla separación de proteínas, gracias a la fricción de las moléculas de proteína con la estructura del gel.Actualmente se puede obtener ya preparado (precast gel), pero sigue siendo usual que se prepare in-situ en el momento de su uso. La preparación del gel se basa en la siguiente reacción:


Reacción de polimerización de la acrilamida. Utilizando la amina TEMED como iniciador, la acrilamidaforma largas cadenas de poliacrilamida, entrecruzadas con la bisacrilamida, que aporta reticulación alpolímero, regulando su rigidez y porosidad.

Estructura molecular del gel de poliacrilamida. Fuente: Biomodel UAH

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm


Los componentes implicados en la reacción son:

1- Acrilamida. El monómero fundamental que va a formar el gel. La acrilamida es un compuestovinílico y, como tal, es susceptible de polimerización por via radicálida. La acrilamida es soluble enagua, no es un compuesto con gran toxicidad aguda, pero en una exposición laboral o exposicióncontinua tiene un efecto acumulativo, es cancerígena (en especial puede inducir cáncer de piel),teratógena y es un neurotóxico. Por ello debe manejarse con precaución. Una vez polimerizada, lapoliacrilamida resultante es inocua, ya que ha perdido los grupos vinilo altamente reactivos. Dehecho, numerosos cosméticos, como geles fijadores de pelo, llevan polímeros acrílicos similares.

La toxicidad de la acrilamida se debe en parte a la formación de su epóxido, la glicidamida, quereacciona con bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos y proteínas, alterando su función oinduciendo mutaciones.

Alteración de purinas de los ácidos nucleicos inducida por glicidamina, generada por oxidación porcitocromo, uno de los mecanismos de defensa celulares contra tóxicos.

2- TEMED y persulfato. Son la clave del mecanismo de polimerización via radicales libres.

Mecanismo radicálico de formación de poliacrilamida. Imagen tomada dehttps://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2004.06.004

El TEMED y el persulfato generan los radicales necesarios para iniciar la reacción, que prosigue encadena hasta formar el hidrogel.

3- N,N’-metilenbisacrilamida: Agente responsable del entrecruzamiento de las cadenas depoliacrilamida y la reticulación del gel. Es esencial para regular las propiedades mecánicas y la

https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2004.06.004


capacidad de separación del gel.

Cómo el gel de poliacrilamida puede separar las proteínas.

El gel, una vez preparado en su soporte, nos permite separar una mezcla de proteínas en forma debandas según su peso molecular: la electroforesis. El proceso global de separación se observa en ésteestupendo video, preparado por María Jarabo Arranz (Estudiante, en ese momento, de BiologíaSanitaria UAH). En el video vemos un gel preparado en su montaje, dentro de unacubeta electroforética donde se establece el campo eléctrico que induce el movimiento de lasproteínas en el gel.

Los componentes implicados en el proceso del video son:

1- El propio gel, que consta de dos partes: gel concentrador y gel separador. Nos aporta lafuerza de retención, que va a frenar más las proteínas de mayor peso molecular2- Los electrodos en la cubeta, que establecen el campo eléctrico que aportará la movilidadelectroforética3- El tampón de electroforesis, que permite la conducción eléctrica y contiene componentesfundamentales en la separación: la glicina y el Tris-HCl4- La propia muestra, que se prepara utilizando otro componente fundamental: eltampón de carga o de ruptura que a su vez contiene cuatro componentes fundamentales:SDS, mercaptoetanol, glicerol y azul de bromofenol

Lista de reactivos utilizados (Biomodel UAH)

Vamos a ver detalladamente que ha ocurrido en el video:

Gel concentrador y gel separador. Papel del SDS

La electroforesis SDS-PAGE se diseña de modo que podamosseparar las proteínas según su peso molecular. Para ello debemos utilizar una serie decomponentes que se incorporan a los tampones utilizados, tanto en la preparación del gel como en lapropia electroforesis y en la preparación de la muestra. El más relevante es el SDS.

SDS (lauril sulfato sódico o dodecil sulfato sódico)

Es un detergente muy utilizado, tanto en el laboratorio como en la vida diaria. Lo podemos encontraren champús y geles o jabones líquidos.

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm


Su papel es la desnaturalización y el establecimiento de una relación carga-tamaño constante enla proteína, de modo que la movilidad de la proteína durante la electroforesis sea exclusivamenteproporcional a su peso molecular. En condiciones nativas, la proteína está plegada según suestructura terciaria y tiene una carga global (positiva, neutra o negativa) que va en función de lacomposición de aminoácidos, el punto isoeléctrico de la proteína y el pH del tampón en el que seencuentra. Si hiciéramos la electroforesis sin SDS, la proteína tendría una carga global quedependería del pH y el punto isoeléctrico. Al añadir SDS, tiene lugar la siguiente reacción:

Papel del SDS en la preparación de la proteína para la electroforesis (imagen tomada de aquí)

Como resultado, la proteína adquiere una carga global negativa y directamente proporcional a sutamaño, de modo que la cantidad de SDS que interacciona con la proteína es constante y de unos 1.4gramos de SDS por cada gramo de proteína. Esto nos garantiza una separación proporcional al pesomolecular de la proteína. Como ésta se encuentra desnaturalizada, la interacción con el polímero deacrilamida será mayor cuanto mayor sea el peso molecular. El resultado global es quela velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamenteproporcional al peso molecular.

Gel separador y concentrador

La separación tiene lugar en el gel separador. Éste gel realiza la separación a un pH 8.8. Antes de quelas proteínas entren en el gel separador, pasan por un gel concentrador, a pH 6.8, que evita que lasproteínas se dispersen en el gel y provoca que todas las proteínas de las muestras se alineen en unafina banda que entra al mismo tiempo y a la misma velocidad en el gel concentrador.

Separación electroforética. El gel concentrador (stacking) alinea la proteínas en una fina banda queentra al mismo tiempo y velocidad en el gel separador, donde se separan según su peso molecular.Sin gel concentrador, las proteínas formarían un «smear» (un «frenazo» si me lo permitís) en lugar deuna banda, perdiéndose la resolución de la separación.

https://nfsc4500101groupa.weebly.com/sds-page-for-protein-resolution.html


En la separación juega un papel fundamental la glicina y los iones Cl- del tampón, que van entrandoen el gel durante la electroforesis. Para entender el papel de la glicina hay que conocer el puntoisoeléctrico y los pK de la glicina:

pI=6pK1=2.34pK2=9.6

Esto significa que a pH 6, la glicina se encuentra en forma de zwitterion. A pH mayor de 9.6, la glicinaestá cargada negativamente y a pH por debajo de 2.34 está cargada positivamente. En los pHintermedios, hay carga negativa y positiva, pero a pH<6 la carga neta es positiva y a pH>6 esnegativa.

Distribución de cargas en la glicina

En el gel concentrador, la glicina se encuentra mayoritariamente en forma de zwitterion, aunqueprevalece la carga negativa, con lo que la glicina forma una banda que se desplaza lentamente. Por elcontrario, los aniones Cl- se desplazan rápidamente, formando una banda gruesa por debajo. Lasproteínas se alinean, atrapadas entre la zona rica en glicina y la zona rica en Cl-, debido a laformación de un gradiente electroquímico, en cuya zona central se acumulan las proteínas. El menorporcentaje de acrilamida ayuda en el proceso, ya que se produce menor fricción de las proteínas en elgel.

Papel de la glicina en el proceso. En el gel concentrador, la glicina y el cloruro generan un gradientede potencial que focaliza las proteínas, colocándolas en una banda fina. Tras alcanzar el gel


separador, el pH se aleja del pI de la glicina, que se acumula formando una banda en el frente.

Una vez que alcanzan el gel separador, las proteínas quedan libres del gradiente entre glicina ycloruro que las «atrapa», debido a que al pH del gel concentrador la glicina tiene principalmentecarga negativa (aunque mantiene carga positiva) y ambas (glicina y cloruro) se desplazanrápidamente hacia el ánodo. Las proteínas «liberadas» del «campo de fuerza» o el «rayo tractor»interaccionan con el gel, realizándose la separación.

«¡Capitán, estamos atrapados en un rayo tractor!- Tranquilos, rumbo a la nebulosa poliacrilamida 8.8,donde el rayo no puede actuar»

La glicina sigue jugando un papel importante durante la separación. En el gel separador, el pH estápor debajo del pK2 de la glicina, lo que asegura que parte de la población molecular de glicina sigueteniendo cargas positivas. Esto hace que la glicina no desaparezca a toda velocidad, sino que formeuna banda que actúa como «barrera», formando el frente de la electroforesis.


Electroforesis SDS-PAGE de albúmina, preparada por alumnos de 2º de Biología Sanitaria de la UAH.Si el pH del gel separador superase el pK2 de la glicina, ésta se movería a demasiada velocidad, elfrente de la electroforesis desaparecería y se perdería la resolución de la separación.

La electroforesis: movilidad electroforética y pesomolecular.

La velocidad a la que se mueve una proteína en el gel se define como:

v=µ E

donde v es la velocidad de desplazamiento y E es el campo eléctrico. El parámetro µ se denominamovilidad electroforética

En términos de voltaje, podemos convertir la ecuación en:

v=µ V/D

donde V es el voltaje al que se realiza la electroforesis y D es la longitud del gel separador.

Durante la electroforesis, la partícula proteica está sometida a tres fuerzas principales: la debida al


campo eléctrico aplicado (que tira de la proteína hacia el ánodo), la fuerza de retención electrostática,creada debido a la capa de Stern, capa de iones unidos por atracción electrostática a la superficie dela partícula, y la fuerza de fricción de la partícula en el polímero del gel. En el formalismo clásico deHückel, la movilidad electroforética considera el efecto contrapuesto de la fuerza inducida por elcampo eléctrico que «tira» de la partícula y la fuerza debida a la fricción de Stokes, que «retiene» lapartícula en el medio viscoso del gel,

Q E=f v; f = 1/ 6 πhR

Donde Q es la carga de la partícula, E el campo eléctrico, f la fricción de Stokes (fricción de unapartícula de radio R que se desplaza en un medio viscoso de viscosidad h) y v la velocidad.

y puede definirse entonces la movilidad como:

µ=Q/6 πhR

donde Q es la carga neta, h la viscosidad del medio y R el radio de la partícula proteica que sedesplaza. Según esta ecuación, la movilidad depende de la carga neta (a mayor carga, mayormovilidad) y de la fricción de Stokes de la partícula en el gel (a mayor tamaño de la partícula, mayorfricción y menor movilidad y a mayor viscosidad del gel, mayor fricción y menor movilidad).

La teoría de Smoluchowski explica mucho mas detalladamente el fenómeno. Según ésta, podemosdefinir la movilidad relativa de la partícula como la suma de dos contribuciones:

µF Fext + µE E

µE es la movilidad electrocinética y µF la movilidad no eléctrocinética, que se aproxima a la movilidadde una partícula en un medio viscoso según Stokes: 1/6πhR

La movilidad eléctrocinética fue definida por Smoluchowski como el cociente entre el potencial zeta, opotencial electrocinético, y la constante dieléctrica del medio (e), dividido entre la viscosidad del gel(h).

µE = e Z/h

Es decir, a mayor potencial zeta, mayor movilidad electroforética. El potencial eléctrico de superficiede la partícula en sí mismo se denomina potencial de Nernst. El potencial zeta es el potencial en ellímite de la capa de Stern con la zona de fricción de la partícula en el medio. La teoría deSmoluchowski ya nos dice que la movilidad eléctrica no va a depender exactamente de la carga netade la partícula, sino de su densidad de carga superficial que generará un potencial zeta determinado.Aquí está el meollo: el SDS provoca que el potencial zeta de las partículas proteicas sea el mismo,debido a que genera una densidad de carga superficial constante para todas la proteínas. Por tanto,la movilidad relativa va a depender únicamente de la fuerza de fricción, y, por tanto del


tamaño de partícula y su peso molecular y de la viscosidad (o porcentaje de acrilamida)del gel. Viendo la movilidad de Stokes anterior, a mayor peso molecular o mayor viscosidad del gel,menor movilidad relativa.

Equilibrio de fuerzas en una partícula proteica que se desplaza en una electroforesis. El potencialeléctrico en la frontera entre la partícula y la capa de iones unidos electrostáticamente es el potencialde Nernst. En la frontera de la capa de Stern y la zona de fricción se denomina potencial zeta. Lamovilidad electroforética depende del potencial zeta.

Estimando el peso molecular con la movilidad relativa omigración

En cada electroforesis se incorpora una mezcla de proteínas de peso molecular conocido que sirvencomo patrón. Este patrón nos permite hacer una estimación de nuestras proteínas de interés. Paraello medimos la movilidad relativa o la migración de la banda de la proteína como:

Rf = distancia migrada por la proteína / distancia migrada por el frente.


Cómo medir la migración o movilidad relativa de la banda de proteína

Una vez que hemos determinado los Rf los patrones, podemos representar gráficamente el logaritmodel peso molecular frente al Rf, obteniéndose una recta. Interpolando en la recta el valor de Rf de laproteína que se está analizando, podemos determinar su peso molecular.


Determinación del peso molecular de una proteína por interpolación de su Rf en la recta patrónobtenida con los marcadores de peso molecular.Problemas resueltos en Biomodel (ir a problema 4)

Visualizando las proteínas: colorantes

Tras terminar la electroforesis (ver video anterior) no vemos las proteínas de nuestras muestras. Tansólo los marcadores de peso molecular, que están pre-teñidos. Es el momento de visualizar elresultado. Para ello, uno de los métodos mas sencillos y comunes es la tinción con el colorante azulCoomassie. Este colorante nos permite detectar entre 0.1 y 0.5 µg de proteína en el gel.

El azul Coomassie, formalmente azul brillante Coomassie R-250 o G-250, es un colorante desarrolladoen el siglo XIX por la compañía británica Levinstein Ltd. para la tinción textil, específicamente de lana(que está formada por proteína). El nombre de azul Coomassie se debe a que pocos meses antes, losbritánicos conquistaron la capital del reino Ashanti, en la actual Ghana, llamada Coomassie. El reinoAshanti era uno de los más poderosos de Africa y el único capaz de ofrecer resistencia contra elimperio británico, en una guerra que duró décadas, llamadas las guerras anglo-ashanti. La síntesis delazul de Coomassie coincidió con el final de las guerras y recibió su nombre como conmemoración dela victoria colonial británica.

Azul Coomassie. Pertenece a la familia de colorantes derivados del trifenilmetano.

En el año 1963, el microbiólogo hungaro-australiano Stephen Fazekas de St. Groth utilizó el azulCoomassie para la tinción de proteínas en electroforesis por primera vez. Desde entonces, se haconvertido en un método de rutina en el laboratorio de Biología Molecular.

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/problemas.htm


El azul de Coomassie se une fuertemente a la proteína por una combinación de atracciónelectrostática a aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina) e interacciones hidrofóbicas entrefenilalanina y los grupos fenilo del colorante.

Interacción del azul Coomassie con la proteína

Como resultado, si todo ha salido bien, obtenemos unas bonitas bandas de color azul intenso en lossitios del gel donde se encuentra la proteína, lo cual produce una gran satisfacción, pues es unarecompensa a muchas horas de trabajo.

Otro colorante importante en su uso en el análisis de proteínas es el Rojo Ponceau S.

Rojo Ponceau S

Es un colorante azoico que tiñe reversiblemente las proteínas y no afecta a la aplicación de métodosposteriores, como el inmunoblot, por lo que es muy útil para verificar que la transferencia deproteínas del gel de electroforesis a una membrana para inmunoblot ha salido bien.

Referencias

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