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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACY T-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT- MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA Y ASISTENCIA SOCIAL

LABORATORIO NACIONAL DE SALUD

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNOSTICO TEMPRAN O, DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONOSTICO DEL VIRUS DEN GUE

PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓ GICA Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD

FODECYT No. 41-2008

Licda. Leticia Castillo Signor Investigadora Principal

GUATEMALA, ENERO 2012

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AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y tecnología –CONCYT-.

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Agradecimientos al personal del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social, que hizo posible esta investigación: EQUIPO DE TRABAJO: Licda. Yolanda Mencos Técnica Silvia López Lic. Sergio Meneses Licda. Sheilee Díaz Dr. Guillermo Villatoro Personal que contribuyo a la realización del presente proyecto: Licda. Leslie Anton Dr. Carlos Merino, DNA, Genotek, Canadá Dr. Chaim, Universidad de Otowa, Canadá Funcionarios del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social Lic. Juan Pablo Álvarez Licda. Jackeline Olivet Dr. Estuardo Tercero Muxi Dr. Carlos Mejía Agradecimiento al personal del laboratorio de virología y del Centro Colaborador de la OPS/OMS para estudios del Dengue y su vector, Instituto Pedro Kouri, La Habana, Cuba: Dra. Guadalupe Guzmán Dra. Delfina Rosario Dra. Rosmary Roche

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RESUMEN

La fiebre del dengue, la fiebre hemorrágica de dengue y el síndrome de choque por dengue, es la enfermedad viral, más importante transmitida por artrópodos, que afecta a los humanos, constituyéndose un grave problema de salud pública en las regiones tropicales y subtropicales. El virus del dengue esta compuesto por cuatro serotipos antigénicamente diferentes: dengue 1 (Den-1), dengue 2 (Den-2), dengue 3 (Den-3) y dengue 4 (Den-4) que son transmitidos por la picadura de la hembra del mosquito Aedes aegypti. El dengue es hoy la arbovirosis, más importante por su gran carga de enfermedad e implicaciones sociales. El mosquito Aedes aegypti, su principal transmisor convive con el hombre en su hábitat domestico y peridoméstico. El cuadro clínico es de fiebre, cefalea, dolor retroocular, dolores corporales, exantema y mucho decaimiento. El enfermo puede empeorar súbitamente y presentar choque por dengue, con grandes hemorragias digestivas y elevada mortalidad. No existe droga antiviral, pero la muerte puede evitarse mediante la infusión intravenosa precoz de soluciones cristaloides. Algunos candidatos vacúnales están actualmente en ensayo clínico. La prevención depende del control del vector, mediante educación sanitaria y reordenamiento ambiental.

El dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica (Guzmán et al., 2004; Kindhauser, 2003) que tiene diversas formas de expresión clínica: desde fiebre indiferenciada (frecuente en niños) y fiebre con cefalea, gran malestar general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que – habiendo comenzado con lo anterior – presenta choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones. También el dengue es capaz de expresarse mediante las llamadas formas "atípicas" que son relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras (Martínez, 1995; Martínez, 1997).

En Guatemala en los últimos 10 años se ha venido incrementando el número de casos de dengue y de las formas severas de la enfermedad, así como fallecidos por esta causa, desde el año 1998 hasta el 2011, se han presentado un promedio de 7000 casos anuales, con tasas de letalidad que van desde 10 hasta 50 %. En el año 2008 por vigilancia virológica y serológica se analizaron 4,484 muestras con un 7 % de positividad, en el 2009 por vigilancia virológica y serológica 5,372 muestras con un 17 % de positividad, y con la circulación viral de dengue 1, dengue 2 y dengue 4, en el 2010 por vigilancia virológica y serológica 5,761 muestras con un 24 % de positividad, y con la circulación viral de dengue 1, dengue 2, dengue 3 y dengue 4, en el 2011 por vigilancia virológica y serológica 1,741 muestras con un 29 % de positividad, y con la circulación viral de dengue 1, dengue 2 y dengue 4.

La infección por virus dengue es usualmente confirmada mediante la detección del virus por el aislamiento viral en cultivo celular, del genoma a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y por la detección de anticuerpos tipo IgM e IgG específicos contra

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dengue, empleando para ello muestras de suero o plasma. Existen escasos reportes del uso de otros tipos de muestras clínicas (orina y saliva) que pudieran ser útiles para la detección de anticuerpos contra virus dengue y solo un reporte que demuestra la presencia del genoma viral en este tipo de muestras en un caso clínico (Mizuno y col, 2007, Balmaceda y col., 2003, Vázquez….). Teniendo en cuenta la tendencia al sangramiento que propicia la fisopatogénia de la enfermedad, los hallazgos encontrados en el presente estudio permite valorar la utilidad de este tipo de muestras no invasivas, para el diagnóstico de dengue. Por otra parte, la detección de antígenos virales ha sido objetivo de numerosos estudios procurando encontrar un método de diagnóstico rápido y temprano de la infección. En el presente estudio evaluamos la detección de la proteína NS1 en un formato de ELISA cuyos resultados son los más prometedores en cuanto a detección de antígenos de dengue con fines de diagnóstico, habiendo evaluado la sensibilidad en comparación con el cultivo viral y con la PCR (Alcon, S., 2002 y Lindegre, 2005). Teniendo en cuenta las condiciones epidemiológicas del dengue en Guatemala y la carga económica y social que constituye esta enfermedad para el país y lo que representa la enfermedad para un hogar con un enfermo con dengue (Castillo L y col.) es imprescindible el fortalecimiento del diagnóstico, el cual ha quedado fortalecido con los resultados del presente proyecto de investigación. El presente proyecto permitió evaluar la utilidad de muestras no invasivas para el diagnóstico de la infección por virus dengue, como la saliva y la orina, además se amplió las posibilidades de diagnóstico y el fortalecimiento de la vigilancia con la incorporación de métodos para la detección de antígeno viral, así como evaluar la presencia de la NS1 como un posible marcador de pronóstico del desarrollo de la forma severa de la enfermedad, detección del genoma y realización de PCR restricción Enzimática. Adicionalmente se introdujeron protocolos nuevos para detectar flavivirus, como fiebre amarilla y virus del Nilo occidental, esto con el propósito de aumentar la capacidad de diagnostica del área de dengue del laboratorio nacional de salud y que redundara en un mejor servicio a la población guatemalteca.

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Summary

Dengue fever, dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome, is the most important arthropod-borne viral disease affecting humans, constituting a serious public health problem in tropical and subtropical regions. Dengue virus comprises four serotypes unhygienic different dengue 1 (Den-1), dengue 2 (Den-2), dengue 3 (DEN-3) and dengue 4 (DEN-4) that are transmitted by the bite of the female Aedes mosquito dengue aegypti. Dengue is today the most important arbovirus because of the huge burden of disease and social implications. The mosquito Aedes aegypti, its main transmitter coexists with men in domestic and per domestic habitat. The clinical picture includes fever, headache, retro orbital pain, body aches, rash and malaise. The patient presented a sudden worsening dengue shock syndrome, with major gastrointestinal bleeding and high mortality. There is no antiviral drug, but death can be prevented by early intravenous infusion of crystalloid solutions. Some vaccine candidates are currently in clinical trial. Prevention depends on vector control through health education and environmental reorganization.

Dengue is a viral disease endemic-epidemic transmitted by Aedes mosquitoes, primarily Aedes aegypti, which is now the most important arbovirus diseases worldwide in terms of morbidity, mortality and economic impact (Guzmán et al. 2004; Kindhauser, 2003) that has various forms of clinical expression, from undifferentiated fever (common in children) and fever with headache, malaise great pains osteomyoarticular, with or without rash, leucopenia, and some kind of bleeding to severe forms that - having started with the above - has hypovolemic shock due to extravasations of plasma, with moderate to severe thrombocytopenia and large hemorrhages in the digestive tract and other locations. Dengue is also able to speak through so-called "atypical" forms that are relatively rare and result from a particularly intense involvement of an organ or system: encephalopathy, cardiomyopathy or liver disease dengue, among others (Martinez 1995, Martinez, 1997).

In Guatemala in the last 10 years has been increasing the number of cases of dengue and severe forms of the disease and deaths from this cause, from 1998 to 2007, there have been a yearly average of 7000 cases with mortality rates ranging from 10 to 50%. In 2008, by virological and serological samples were analyzed 4.484 with 7% of positivity, in 2009, by virological and serological samples 5.372 with 17% positive, and viral circulation of dengue 1, dengue 2 and dengue 4, 2010 by virological and serological samples 5.761 with 24% positive, and viral circulation of dengue 1, dengue 2, dengue 3 and dengue 4, 2011, by virological and serological samples with 29 1.741 % positive, and the circulation of dengue 1 virus, dengue 2 and dengue 4.

Dengue virus infection is usually confirmed by detection of virus by virus isolation in cell culture, the genome through the chain reaction (PCR) and by detection of IgM and IgG antibodies specific for dengue, for it using serum or plasma. There are few reports of the use of other types of clinical specimens (urine and saliva) that may be useful for the detection of antibodies against dengue virus and only one report demonstrating the presence of viral genome in these samples in a clinical case (Mizuno et al, 2007, Balmaceda et al., 2003, Vazquez). Given the trend that favors physiopathogenic bleeding of the disease, the possibility is very attractive to a prospective study designed to assess the usefulness of such non-invasive samples for diagnosis of dengue.

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Moreover, the detection of viral antigens has been the subject of numerous studies attempting to find a method of rapid and early diagnosis of infection. In recent years there has been evaluating the detection of NS1 protein in an ELISA format and the results are the most promise for detecting dengue antigens for diagnosis, which still requires evaluations in sensitivity compared with viral culture and PCR (Alcon, S., 2002, and Lindegren, 2005). Taking into account the epidemiological conditions for dengue in Guatemala and the social and economic burden of this disease in the country and representing the disease for a household with a patient with dengue (Castillo L, et al.) is essential to strengthen the diagnosis that currently has the National Reference Laboratory that supports the monitoring of dengue nationwide, benefiting above the national dengue program, managers and general health of the Guatemalan people to go in preventing this disease, of such an impact in Guatemala. Studies that we intend to carry out, make it possible to assess the usefulness of noninvasive samples for diagnosis of dengue virus infection and contribute to widening the possibilities for strengthening diagnosis and surveillance with the incorporation of methods for detection of viral antigen and assess the presence of NS1 as a potential prognostic marker for the development of severe form of the disease, detection of the genome and carrying out restriction enzyme PCR. Additionally we will delve into the features of dengue in the population of our country.

INDICE PORTADA Agradecimientos al CONCYT i RESUMEN iii SUMARY v

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3 1.2.1 Antecedentes en Guatemala 4

1.2.2 Justificación del trabajo de investigación 7

I.3 OBJETIVOS I.3.1 Objetivos 8 I.3.1.1 General I.3.1.2 Específicos

I.4 METODOLOGIA 9 I.4.1 Localización 9 I.4.2 Reclutamiento 9 I.4.3 Recolección de muestras 9 I.4.4 Número de muestras 10 I.4.5 Análisis de laboratorio 10 I.4.6 Ficha epidemiológica 10 I.4.7 Análisis de datos 10 I.4.8 Materiales y métodos 11 I.4.8.1 Prueba de ELISA MAC-Dengue 11 I.4.8.2 Aislamiento Viral, en cultivos de células 13 I.4.8.3 Procedimiento de reacción en cadena

de la polimerasa convencional 19 I.4.8.4 Procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real 25 PARTE II II.1 MARCO TEÓRICO 29 II.1.1 Dengue 29

II.1.1.1 Definición de Dengue 29 II.1.1.2 Etiología 29 II.1.1.3 Epidemiología 30 II.1.1.4 Carga de la enfermedad 31 II.1.1.5 Fisiopatología 31 II.1.1.6 Cuadro clínico 34 II.1.1.7 Exámenes de Laboratorio clínico 35 II.1.1.8 Clasificación del Dengue 38 II.1.1.9 Datos clave para el tratamiento 40 II.1.1.10 Plan de acción 41 II.1.1.11 Prevención 42

II.1.1.12 Diagnóstico de laboratorio 43 PARTE III III. RESULTADOS 45 PARTE IV. IV.1 CONCLUSIONES 52 IV.2 RECOMENDACIONES 53 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54 IV.4 ANEXOS 58 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO 68

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PARTE I 1.1 INTRODUCCION: La fiebre del dengue, la fiebre hemorrágica de dengue y el síndrome de choque por dengue, es la enfermedad viral, más importante transmitida por artrópodos, que afecta a los humanos, constituyéndose un grave problema de salud pública en las regiones tropicales y subtropicales. El virus del dengue está compuesto por cuatro serotipos antigénicamente diferentes: dengue 1 (Den-1), dengue 2 (Den-2), dengue 3 (Den-3) y dengue 4 (Den-4) que son transmitidos por la picadura de la hembra del mosquito Aedes aegypti. El dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica (Guzmán et al., 2004; Kindhauser, 2003) que tiene diversas formas de expresión clínica: desde fiebre indiferenciada (frecuente en niños) y fiebre con cefalea, gran malestar general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que – habiendo comenzado con lo anterior – presenta choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones. También el dengue es capaz de expresarse mediante las llamadas formas "atípicas" que son relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras (Martínez, 1995; Martínez, 1997). El complejo dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (Dengue 1, 2, 3 y 4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos. Los virus de dengue están constituidos por partículas esféricas de 40 a 50 nm de diámetro que constan de las proteínas estructurales de la envoltura (E), membrana (M) y cápside (C), así como un genoma de acido ribonucleico (ARN), Tiene siete proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5-3. Las proteínas son sintetizadas como una poliproteina de cerca de 3,000 aminoácidos que son procesadas co-traslacionalmente y pos-trasnacionalmente por proteasas virales y del huésped. Los virus del dengue pertenecen al género Flavivirus de la familia Flaviviridae (Gubler, 1998). La inmunidad que deja la infección por cada serotipo viral es duradera, probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras semanas o meses después de la infección (Martínez, 1998). Sin embargo, cuando una persona tiene Ac sub neutralizantes contra uno de los virus del dengue y es infectado por otro serotipo viral se produce una respuesta infrecuente, casi exclusiva de la infección por dengue: una amplificación dependiente de anticuerpos (ADA) que se traduce en una elevada replicación viral y aumento de la viremia, lo cual condiciona y favorece el desarrollo de la forma grave de la enfermedad (Guzmán et al., 1992; Halstead, 2002).

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Otros factores han sido postulados ser importantes en la patogénesis del cuadro de Dengue hemorrágico, incluyendo la virulencia del virus (Gubler et. al 1976; Rosen, L.1977), la genética del hospedador (Bravo et al. 1987), la activación de las células T (Green, S. et al 1999), la carga viral (Vaughn,D.W. et al 2000). La infección por dengue puede ser clínicamente inaparente y puede causar una enfermedad de variada intensidad que incluye desde formas febriles con dolores en el cuerpo y con mayor o menor afectación del organismo hasta cuadros graves de choque y grandes hemorragias. Hasta ahora se ha aceptado que la diferencia principal entre el dengue clásico o fiebre del dengue (FD) y la fiebre hemorrágica dengue (FHD) no son precisamente los sangramientos sino la extravasación de plasma, en particular cuando tiene expresión y repercusión clínica porque se expresa en aumento significativo del hematocrito y por colección de líquido en cavidades serosas, tales como derrame pleural, ascitis y derrame pericárdico. El espectro clínico del dengue tan variado nos explica la diversidad de cuadros clínicos que podemos encontrar en una misma familia o población durante un brote epidémico, pues algunos pacientes (quizás la mayoría) estarán sólo ligeramente afectados y – erróneamente – ni siquiera procuraran los servicios médicos, otros tendrán síntomas escasos (oligosintomáticos) y otros estarán muy afectados, con gran postración y quizás con una evolución desfavorable, deterioro clínico y muerte, a veces en pocas horas. Cada uno de los cuatro virus del dengue puede producir cualquier cuadro clínico del referido espectro. También existen las formas clínicas que por no ser tan frecuentes se les llama "atípicas" que resultan de la afectación especialmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, así como la afectación renal con insuficiencia renal aguda y otras que también se asocian a mortalidad (Martínez, 2005). El dengue es una enfermedad muy dinámica, a pesar de ser de corta duración (no más de una semana en casi el 90% de las veces). Su expresión puede modificarse con el paso de los días y puede también agravar de manera súbita, por lo cual el enfermo necesita que el médico lo atienda de modo repetido, preferentemente todos los días. El curso de la enfermedad del dengue pasa por tres etapas clínicas: la etapa febril – la única para la inmensa mayoría de los enfermos –, la etapa crítica y la etapa de recuperación. Casi la mitad de la población mundial está en riesgo de sufrir esta infección por habitar en áreas tropicales y subtropicales, así como más de 400 millones de viajeros de Europa y Norteamérica que cada año cruzan las fronteras y regresan a sus países procedentes de Asia, África y América Latina (Wichmann et al., 2007; Pinazo et al., 2008). La prevalencia mundial del dengue se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Se calculan 50 millones de infecciones por año, medio millón de hospitalizados y más de 25 000 muertes. Alrededor de 100 países han reportado, casos de dengue y/o dengue hemorrágico y más de 60 lo hacen regularmente todos los años (WHO, 1997; Jacobs, 2000), por lo cual la Organización Mundial de la Salud (OMS) lo considera uno de los principales problemas de salud de la humanidad, además de que produce gran afectación social y económica). En la región de las Américas se ha producido un incremento progresivo de casos de dengue durante las tres últimas décadas (Kouri, 2006), habiéndose extendido la enfermedad casi a la totalidad de los países

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En Guatemala en los últimos 10 años se ha venido incrementando el número de casos de dengue y de las formas severas de la enfermedad, así como fallecidos por esta causa, desde el año 1998 hasta el 2007, se han presentado un promedio de 7000 casos anuales, con tasas de letalidad que van desde 10 hasta 50 %. El presente estudio nos permitió conocer y aportar conocimientos nuevos sobre los virus del dengue, como lo es, la excreción del virus de dengue en la saliva y orina, lo cual nos permite valorar su utilidad en el diagnóstico. Así mismo se evaluó la detección de la proteína NS1 en un ensayo inmuno-enzimático tipo ELISA como una alternativa para el diagnostico rápido y oportuno, así como su posible valor como marcador de pronóstico del desarrollo de las formas severas de la enfermedad, todo lo cual puede contribuir al fortalecimiento de la vigilancia y el diagnóstico de dengue. La detección del genoma tanto por PCR tiempo real y convencional, la implementación de PCR restricción Enzimática, y la implementación de otros protocolos de PCR, como: RT-PCR/nPCR para la detección del virus del género Flavivirus (entre los que se incluye los Virus del Nilo Occidental y Fiebre amarilla, como diagnósticos diferenciales de dengue nos permitió a través del presente proyecto, fortalecer el diagnostico y la vigilancia de dengue a nivel del Laboratorio Nacional de Salud. 1.1.1 Palabras Claves:

• Virus del Dengue • Fiebre de dengue • Dengue Hemorrágico • Serotipos Virales • Casos confirmados de Dengue • Diagnostico mediante PCR • Proteína NS1

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1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA Guatemala es un país tropical con una población total de 12,700,612 habitantes, dividido en 6,210,557 hombres y 6,490,055 mujeres, referencia año 2,005, la población es mayoritariamente joven (cerca del 65% de la población es menor de 25 años) y altamente rural (54%). Tiene una extensión territorial de 108,889 Kms. cuadrados, ocupa el puesto 22 entre los 25 países con mayor biodiversidad en el mundo. Guatemala es un territorio altamente diverso en términos étnicos y culturales. Es el segundo país latinoamericano con mayor población indígena en términos relativos (más del 40%), compuesto mayoritariamente por 22 comunidades étnico-lingüísticas de origen maya y en menor proporción xinca y garífuna. El dengue en Guatemala ha sido una enfermedad priorizada por las autoridades de salud debido al impacto que tiene dentro de la salud pública y por el impacto político y social que tiene dentro de la población. En el año 1998, se presentaron un total de 4,583 casos de dengue clásico con 2 casos de dengue hemorrágico, sin ninguna defunción, tasa de letalidad 0%, para el año 1999, se presentaron 3,617 casos de dengue clásico con 2 casos de dengue hemorrágico, con 1 defunción, tasa de letalidad 50%, para el año 2000, se presentaron 10,083 casos de dengue clásico con 42 casos de dengue hemorrágico y 9 defunciones, teniendo una tasa de letalidad de 21.4 %, para el 2001 se presentaron 5,005 casos con 4 casos de dengue hemorrágico, 2 defunciones, con una tasa de letalidad de 50%, para el año 2002, se presentaron 7605 casos con 48 casos de dengue hemorrágico con 5 defunciones, con una tasa de letalidad de 10.4 %, para el año 2003 se presentaron 6.873 casos de dengue clásico, con 22 casos de dengue hemorrágico, 3 defunciones, con una tasa de 13.6 %, para el año 2004 se presentaron un total de 6,489 casos de dengue clásico con 46 Dengues hemorrágicos con 3 defunciones, con una tasa de letalidad de 6.5 %, para el año 2005 se presentaron 7142 casos de dengue clásico, 31 casos de dengue hemorrágico, con 3 defunciones haciendo una tasa de letalidad de 9.6 %, para el año 2006 se presentaron un total de 3,518 caos de dengue con 4 casos de dengue hemorrágico con una defunción haciendo una tasa de 255, para el año 2007 se presentaron 5,886 casos de dengue clásico con 21 casos de dengue hemorrágico con 6 defunciones con una tasa de letalidad del 28%. (Ver Anexo 1) En el laboratorio central de referencia del país, Laboratorio Nacional de Salud, durante el año 1996 al año 2,006 se han recibido un promedio de 6,000 muestras anuales tanto para vigilancia virológica como serológica, la positividad en la serologia de dengue varía entre 40 y 50% anualmente y durante estos 10 años han circulado los 4 serotipos de dengue, variando la circulación año con año, la mayoría de años han circulado 3 o 4 serotipos conjuntamente. En el laboratorio central de referencia del país, actualmente Laboratorio Nacional de Salud, durante el año 1996 se confirmó un total de 1760 casos de 3,936 muestras recibidas para vigilancia serológica (medición de anticuerpos anti-IgM), (45%) y se reportaron 3 de los 4 serotipos de dengue. En 1997, se reportaron 2,155 casos positivos de 4,530 muestras analizadas (48%) y se reportaron los siguientes serotipos Dengue 1,

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2 y 3 como serotipos circulantes, predominando el serotipo 3. En 1998 en vigilancia serológica de dengue se recibieron 3,842 muestras obteniendo 1277 positivas (33.23%), el serotipo de dengue predominante fue el dengue 3, en 1999 se detectaron 926 muestras positivas de 2,755 (33.61%) predominando el serotipo 3, en el año 2000 se reportaron 2,550 muestras positivas de 5,867 (49.1%), el serotipo que predomino fue el dengue 2. En el año 2001 de 4,114 muestras que ingresaron al laboratorio para vigilancia serológica 971 fueron positivas dando un 24 % de positividad, habiéndose detectado los serotipos Dengue 2, 3 y 4 en la vigilancia virológica, en el año 2002 ingresaron un total de 4505 muestras para vigilancia serológica, teniendo un porcentaje de positividad de 15.32% habiéndose detectado los serotipos de Dengue 2, 3 y 4 con predominancia del serotipo dengue 2, en el año 2003 ingresaron para vigilancia serológica 2793 muestras habiendo obtenido 24 % de positividad se detectaron los 4 serotipos de dengue, con predominancia del dengue 2, en el año 2004 ingresaron 1894 muestras con una positividad de 23.9 %, con la circulación de los 4 serotipos de dengue, con predominancia del dengue 1, en el año 2005 se recibieron 3359 muestras para serología con un porcentaje de positividad de 37.9 % con la circulación de 4 serotipos con predominancia dengue 1, para el año 2006 se recibieron para vigilancia serológica 2300 muestras con porcentaje de positividad de 38.7% con la circulación de Dengue 1, Dengue 2 y Dengue 4 con predominancia del serotipo 1, para el año 2007 se recibieron 3,424 muestras con un porcentaje de 34.6 % positividad con la circulación de dengue 1, dengue 2 y dengue 4 con predominancia de dengue 1. Al analizar la enfermedad de dengue en Guatemala durante 10 años, se puede afirmar que el año 2000 marca un viraje del dengue, ya que es el año donde aparece la severidad de la enfermedad y mayor número de fallecidos con respecto a los años anteriores, en el año 2000 se presentan 10,063 casos, de esos 42 son dengue hemorrágico con 9 fallecidos, en el laboratorio central de referencia se recibieron ese año, 7,824 muestras de las cuales se confirmaron 2,650 muestras incluyendo virología y serología. En ese mismo año se realizo un estudio de 5 sitios centinelas que incluían Zacapa, Coatepeque, La Democracia y Tiquizate, Escuintla y el Centro de Salud el Milagro, Guatemala Central, en dicho estudio se concluye que el 71 % de los casos habían estado expuestos previamente a otro serotipo, es decir eran dengues secundarios, las edades más afectadas fue entre 0 a9 años, el análisis con IgG demuestra que el 40% de los menores de 9 años ya habían estado en contacto con algún serotipo de dengue. De los pacientes fallecidos con diagnostico de DH el 40% fue dengue secundario y se concluye que el 70% del dengue severo fue hospitalizado, llama significativamente la atención que en el mismo año la proporción de las epidemias en El Salvador y en Honduras, países fronterizos, con Guatemala, fue diez veces mayor que Guatemala, ya que la incidencia de los casos de dengue hemorrágico fue 42 con una tasa de incidencia de 0.37 para Guatemala y para El Salvador fue 411 casos de DH con una tasa de incidencia de 6.55 y para Honduras con 314 de DH con una incidencia de 4.84, En el estudio de investigación (Castillo et. Al 2001) Las edades contempladas estaban comprendidas de la siguiente manera: el 63% son menores de 15 años y el 37 % mayores de 15 años, entre los menores de 15 años tenemos 3 con dengue secundario, ya que tuvieron una IgG arriba de 1:40 y 5 adultos todos dengue secundarios, el cuadro clínico de las cepas es fiebre de dengue con el 89 % de fiebre, 100% dolor de cabeza, 95% dolor de ojos, 95% dolor de cuerpo, 89% dolor de articulaciones y escalofríos, 63% nauseas, 36% vómitos, 32% diarrea, 11% erupción cutánea, 5% vómitos con sangre, 5% hemorragia en encía.

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En la actualidad no se cuenta con otros medios para el control del dengue y de su forma más grave, el DH, que el control de su vector. La OMS y la OPS han llamado a todos los países a adoptar las medidas necesarias que contribuyan a disminuir la carga de la enfermedad y su impacto médico y socioeconómico. Se espera que una respuesta internacional coordinada y eficaz y el desarrollo de investigaciones epidemiológicas, clínicas y virológicas en las que se conjuguen los más avanzados métodos y técnicas permitan revertir la tendencia epidemiológica ascendente del dengue y coadyuven a su control

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1.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN En Guatemala en los últimos 10 años se ha venido incrementando el número de casos de dengue y de las formas severas de la enfermedad, así como fallecidos por esta causa, desde el año 1998 hasta el 2007, se han presentado un promedio de 7000 casos anuales, con tasas de letalidad que van desde 10 hasta 50 %. El vector ha ido colonizando un mayor número de localidades y en la actualidad solo un departamento parece estar libre del vector y no ha reportado casos, como es el Departamento de Totonicapán e incluso las partes altas, del departamento Quetzaltenango A partir del año 2000 se observa un incremento del reporte de las formas severas de la enfermedad, en el año 2009 y 2010 han sido los años de epidemias severas de dengue en nuestro país. El laboratorio central de referencia a través de la vigilancia virológica y serológica ha procesado entre 3000 a 4000 muestras anuales, de todo el país, confirmando la circulación de dos o más serotipos en una misma región. Está situación se produce en un contexto donde los programas de control vectorial están debilitados, los recursos disponibles tienen que ser compartidos con los dedicados a otras enfermedades prioritarias en el país, mientras que el crecimiento de la población, favorece el hacinamiento en determinadas áreas como lo es los municipios de la capital y la capital misma que trae consigo el insuficiente abastecimiento de agua potable y de la disposición final de desechos sólidos, aunado a los cambios climáticos que estamos experimentando, lo anterior son factores claves para la proliferación del vector y explican el creciente problema de salud que constituye el dengue hoy en día en el país. Por todo esto se hace necesario hacer estudios que profundicen en el conocimiento de la enfermedad en nuestro país, el presente proyecto constituye uno de ellos. El presente estudio permitió conocer y aportar conocimientos nuevos sobre los virus del dengue, como lo es, existencia del virus de dengue en la saliva y orina, lo cual demuestra su utilidad en el diagnóstico. Así mismo se evaluó la detección de la proteína NS1 en un ensayo inmuno-enzimático tipo ELISA como una alternativa para el diagnostico rápido y oportuno y su valor como marcador de pronóstico del desarrollo de las formas severas de la enfermedad. En el marco del presente proyecto se implemento la técnica de PCR en tiempo real para dengue, así mismo se fortaleció la parte de la detección del genoma por PCR convencional y realización de PCR restricción Enzimática, se implementó otros protocolos de PCR, como: RT-PCR/nPCR para la detección del virus del género Flavivirus (entre los que se incluye los Virus del Nilo Occidental y Fiebre amarilla, como diagnósticos diferenciales de dengue. Adicionalmente nos permitió profundizar en las características del dengue en la población de nuestro país.

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1.3 OBJETIVOS 1.3.1 Objetivo General 1.3.1.1 Evaluar metodologías diagnosticas que permitan fortalecer la vigilancia,

diagnostico y pronostico temprano de la enfermedad de Dengue Clásico y Dengue Hemorrágico.

1.3.2 Objetivos Específicos 1.3.2.1 Evaluar la NS1 como marcador de diagnóstico temprano comparado con el

aislamiento viral de dengue. 1.3.2.2 Evaluar la proteína NS1, como posible marcador pronostico del desarrollo del

Dengue Hemorrágico. 1.3.2.3 Estudiar la presencia del virus de dengue en saliva y en orina en la fase aguda

de la enfermedad mediante la PCR y el aislamiento viral. 1.3.2.4 Caracterizar Molecularmente los aislamientos de virus dengue obtenido,

mediante PCR-Restricción Enzimática. 1.3.2.5 Evaluar otros protocolos de PCR que ampliaran la capacidad de diagnóstico y

respuesta ante enfermedades eventualmente emergentes, como: RT-PCR/nPCR para la detección del virus del género Flavivirus, entre los que se incluye los Virus del Nilo Occidental y Fiebre amarilla.

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1.4 METODOLOGIA 1.4.1 LOCALIZACIÓN La investigación se realizó en el Laboratorio Nacional de Salud que se encuentra ubicado en el Kilómetro 22 carretera al Pacífico en Bárcena del Municipio de villa Nueva. Su ubicación con respecto a los meridianos y los trópicos corresponde a una Latitud de Latitud 14º31’32’’ Norte, Longitud 90º35’15’’ Oeste del meridiano de Greenwich. Con un Clima templado de 15 grados Mínimo y 28 grados máximo con un promedio de 21º C. 1.4.2 RECLUTAMIENTO: En el estudio se incluyeron en forma consecutiva, todos los casos sospechosos de dengue que asistieron a las unidades de salud, seleccionadas, Hospital Roosevelt y Hospital Infantil Elisa Martínez, de Puerto Barrios, con el síntoma predominante de fiebre y otros síntomas, como cefalea, mialgia, artralgia, rash y otros, sin signos de focalización, en pacientes de cualquier edad, sexo y característica étnica, incluyendo ancianos y mujeres embarazadas. La inclusión de los pacientes que cumplieron con las características anteriores previo a la firma de un consentimiento informado por el mismo o su representante adulto, en el caso de los niños. Se garantizó, que por la inclusión en el estudio, no se interfiriera en el manejo clínico del paciente. Se realizó la entrevista que normalmente se utiliza con los pacientes, en el momento en que el médico detectara un paciente sospechoso, entonces la persona encargada de hacer la entrevista (enfermera, epidemiólogo, profesional de laboratorio), se le lleno una encuesta al paciente, se le explico sobre la importancia del estudio y luego se le solicito que el paciente firmara una carta de consentimiento donde autorizara participar en el estudio, esto último en el nivel comunitario, en el Hospital Roosevelt, el epidemiólogo del hospital, realizo todo el proceso, le extrajo una muestra de sangre, le solicito una muestra de orina y una de saliva, las almacenó y las envió al laboratorio nacional de salud, en temperatura de 4-8 C en condiciones de bioseguridad, (se utilizo la normativa que existe en el Manual de Toma, Manejo, Conservación y Transporte de Muestras, del Laboratorio Nacional de Salud, última versión año 2008), se le dio seguimiento al paciente dentro del hospital. 1.4.3 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS: La recolección de las muestras se realizó durante los meses de Enero a Diciembre 2009 en los hospitales seleccionados. Después de un proceso de consentimiento individual, se procedió a llenar la encuesta, el cual contiene preguntas demográficas, clínicas, aspectos relacionados con la enfermedad.

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1.4.4 NUMERO DE MUESTRAS El estudio entrevisto a 190 pacientes sospechosos de dengue, y se recolecto, un total de 372 muestras, divididas en 117 muestras de orina, 117 muestras de saliva y 138 muestras de suero. Provenientes del Hospital Roosevelt y Hospital Infantil Elisa Martínez de Puerto Barrios. 1.4.5 ANÁLISIS DE LABORATORIO : Para el dengue, la definición de caso es crítica, y debe ser confirmado el caso por una prueba de laboratorio, debido a que los síntomas que produce, son compatibles con varios síndromes febriles, llevando en muchos casos a diagnósticos erróneos. En este estudio se tomaron muestras pareadas, en algunos casos, una durante la etapa aguda o a la llegada del paciente al hospital y otra 7-10 días después de la primera aparición de síntomas, en los cuales se pudo establecer un diagnóstico más preciso de la infección. Las primeras muestras que se recolectaron fueron suero, saliva y orina, tomadas durante los primeros 5 días, de la infección, fueron sometidas a técnicas de aislamiento viral en cultivo celular y/o dependiendo el caso a pruebas de RT-PCR (biología molecular), la segunda muestra (que en algunos casos fue la única muestras) se realizo una prueba de IgM para dengue. Se evaluó un estuche comercial de toma de muestras para saliva y orina (anexo 2) para después de un procedimiento, el cual se adjunta, se le realizo pruebas de biología molecular. Así, mismo se monto las pruebas de restricción Enzimática, como una herramienta de diagnostico para poder diferenciar entre un mismo serotipo de dengue, que circulen en el mismo año de una epidemia, además se realizó la implementación de un protocolo de biología molecular para flavivirus que incluye virus del Nilo y Fiebre Amarilla, dichos protocolos de PCR han ampliado la capacidad de diagnóstico y respuesta ante enfermedades eventualmente emergentes y reemergentes, dando así respuesta al Reglamento Sanitario Internacional. 1.4.6 FICHA EPIDEMIOLOGICA (INSTRUMENTO RECOLEC CION DE

DATOS (ver anexo 3): Para la recolección de la información se utilizó la ficha epidemiológica nacional, se llevó una base de datos en programa Excel. 1.4.7 ANÁLISIS DE DATOS: Para la recolección de la información se utilizo la ficha epidemiológica de vigilancia y una encuesta donde se preguntaran todos los datos del paciente. El método de análisis estadístico que se utilizo fue univariado, utilizando medidas de tendencia central y dispersión que es la desviación estándar e índice de kapa.

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1.4.8 MATERIALES Y METODOS: 1.4.8.1 PRUEBA DE ELISA MAC-DENGUE:

Principio del método: El Mac-Elisa es un ensayo de diagnóstico in vitro para la detección de inmunoglobulinas IgM en suero humano específicos contra el virus de Dengue. Esta prueba es un ensayo inmunoenzimático de doble sandwich con captura de los anticuerpos IgM del suero en la fase sólida (microplacas recubiertas con anticuerpos de cabra anti IgM humana.). Una solución de pool de antígenos de Dengue es luego incubado y un anticuerpo monoclonal anti virus dengue (6B6C-1) conjugado con enzima peroxidasa (HRP) es utilizado. Como substrato se utiliza ABTS (azinodiethylbenzthiazoline sulfonate). El cambio de color es proporcional a la cantidad de IgM específica al virus Dengue determinado en el suero. La lectura de la placa es a 405 nm. Y se realiza en un lector de ELISA. Aplicabilidad de la determinación:

� Muestras involucradas: � Muestras de suero de pacientes sospechoso de dengue tomada en el 6° y 15° día

de iniciados los síntomas.

� Rango de trabajo: � Valores de Densidad Óptica < de 2.0

� Sensibilidad: 90% a partir del 6to día de iniciados los síntomas.

� Precisión:

� Exactitud:

REACTIVOS:

� Buffer de Fosfato Salino PBS pH 7.4 � Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 � Albúmina Bovina al 4% en PBS 7.4 � Albúmina Bovina al 0.5% en PBS pH 7.4 � Suero Humano Normal (NHS) al 20% , extraído en acetona. � Anticuerpo de Captura anti-IgM humana, diluido 1:200 en Buffer Carbonato. � Pool de Antígenos virales (D1,D2,D3,D4) diluidos en PBS conteniendo SNH al

20% extraído en acetona. � Solución de Conjugado (anticuerpo monoclonal contra virus dengue 6B6C-1

producido en cabra, conjugado con enzima peroxidasa (HRP). � Solución Substrato ABTS (azinodiethylbenzthiazoline sulfonato). � Microplacas Fondo Plano. � Suero Control positivo bajo � Suero Control positivo alta � Suero Control Negativo � Agua desmineralizada

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MATERIALES E INSTRUMENTOS:

� Lector de Elisa EL 312 e. Bio-tek Instruments, Biokinetics reader. � Vortex Fisher Genie 2, Cat. 12-812 Fischer Scientific. � Lavador Manual. � Bomba de Succión Gast. Mol. Dol-181-aa � Timer Programable Modelo 151, Fischer Scientific. � pH meter 15. Fischer Scientific. � Baño de María Precisión, Modelo 184 � Lavador Automático para Microplacas marca Biotek Instrument � Centrifuga de 24 tubos, hasta 9,000 RPM marca Fischer Scientific. � Pipeta automática de 1- 20 µl � Pipeta automática de 10 - 50µl � Pipeta automática de 50 – 200 µl � Pipeta multicanal de 50 a 200 µl � Tubos de reacción de l.5 ml � Gradillas � Probetas de 100 ml � Puntas de pipeta de 1- 200µl � Puntas de pipeta de 200 a 1000 µl � Tubos de ensayo de vidrio de 13 x 100 mm

METODOLOGÍA:

1. Preparación de la placa: a. Rotule la placa haciendo un cuadrado de 10 x 6.

2. Sensibilización.

a. A cada pozo añada 100 µl de anticuerpo de captura (α IgM humana diluida 1:200 en buffer Carbonato.

3. Incube 4 horas a temperatura ambiente ó a 4°C hasta el momento de usarlo (guardar en caja húmeda). Puede guardar por dos o tres semanas, pero no debe secarse.

DIA DE LA PRUEBA

4. Lavar la placa tres veces con PBS, pH 7.4.

5. Bloqueo a. Llenar los pozos hasta el borde con 4% Albúmina bovina en PBS. 6. Incube de 15 minutos a 37ºC.. 7. Lavar la placa 5 veces con PBS. 8. Muestra de Suero y/o Papel filtro

a. Diluya el suero 1:40 en PBS conteniendo 0.5% de albúmina bovina.

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Papel filtro: se coloca la muestra cortada en cuadritos en el tubo correspondiente, se le agrega 1 ml de PBS-BSA 0.5% y se deja toda la noche. (Nota: Se hace un día antes de la prueba)

b. Añada 50µl de cada muestra en un pozo. No utilice los pozos de las orillas. c. Incube por 2 horas a 37ºC

9. Lave las placas 5 veces con PBS. 10. Antígeno:

El antígeno se diluye en PBS conteniendo SHN al 20% extraído en acetona. Añada 50 µl de antígeno a cada pozo e incube toda la noche a 4ºC.

11. Lavar las placas 5 veces con PBS. 12. Conjugado.

Diluir el conjugado en PBS conteniendo SHN al 20% y añadir 25µl de conjugado a cada pozo e incubar 1 hora a 37ºC.

13. Lavar las placas 7 veces con PBS. 14. Substrato.

Añada 100µl de substrato a cada pozo e incubar 30 minutos a 37ºC y 1 hora a temperatura ambiente.

15. Leer la placa a 405 nm, blanqueando con un control Negativo. 1.4.8.2 Aislamiento Viral: Principio del Método: Las células C6/36 son generalmente cultivadas en botellas para propósitos de aislamiento y propagación, de las botellas se pasan a tubos de tapa de rosca donde la muestra de suero es inoculada a la más baja dilución que no produzca toxicidad no especifica en las células. Los cultivos son incubados por 5 a 7 días, dependiendo de la línea celular. La presencia del virus es determinada por el uso de fluorescencia directa (DFA). Un Anticuerpo policlonal es conjugado a fluoresceína y utilizado para detectar el flavivirus. La identificación del serotipo es hecha utilizando anticuerpos monoclonales serotipo-especifico en un test de inmunofluorescencia indirecta (IFA).

Aplicabilidad de la determinación

1. Muestras involucradas: Muestras de suero recolectadas en los primeros 3 días de iniciados los síntomas, mantenidas en cadena de frío hasta su análisis.

2. Sensibilidad:

Del 50% dependiendo de la muestra.

3. Exactitud: 100% cuando se logra el aislamiento.

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Reactivos:

a) Listado � PBS para DFA/IFA/diluciones � Medio EMEM � Alcohol al 70% � Cloro al 10% � Suero Bovino Fetal � Acetona fría a –20ºC � Conjugado (Inmunoglobulina anti-ratón con fluoresceina) � Conjugado para IFA Directa � Glycerol o glicerina al 90% � Anticuerpos Monoclonales específicos anti D1, D2, D3 y D4.

b) Preparación de reactivos:

� Serotipos de dengue � Conjugado � PBS

� NaHP04 1.2 gm � NaH2P04 0.2 gm � NaCl 8.5 gm � Agua destilada csp 1000 ml

� EMEM – para células C636-

� 10X EMEM 100 ml � FCS 100 ml � Bicarbonato Na 5 ml � 1X Glutamina 10 ml � 1X MEM Vitaminas 10 ml � 1X Amino acidos 10 ml

no esenciales � Dimetilsulfoxido � Agua estéril destilada 1000 ml

� Poly-Lysina- para cubrir láminas FA- (ES OPCIONAL)

� Poly-Lysina 5 mg � Agua destilada csp 1 litro

c) Material y Equipo:

� Centrifuga refrigerada IEC PR 7000 � Campanas Clase II Tipo A Envirco EACIBio Hazard Cabinet � Microscopio Invertido Marca Olimpus CK2 � Microscopio de Fluorescencia Olimpus BH2-RFCA � Incubadora NAPCO Modelo 6300 de dos cámaras � Congelador de –20ºC y –70ºC. � Auxiliar de pipeteo eléctrico � Policías de hules estériles � Pipetas serológicas de 1ml, 5ml,10 ml, 25 ml estériles

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� Beackers estériles � Frascos de cultivos de 25 cm2 � Frascos de cultivos 75 cm2 � Tubos de vidrio para cultivo celular de tapón de rosca � Guantes desechables � Vasos de Koplin � Equipo de filtración � Eppendorf � Pipetas de 0.5–10 ul, 10-50 ul y de 100-1000 ul

� Tipos amarillos, azules y blancos � Laminillas � Cubreobjetos

Procedimiento:

Cultivo celular: Las células C6/36 son cultivadas en botellas las cuales deben revisarse diariamente para observar su crecimiento hasta su punto óptimo. Una botella con óptimo crecimiento se puede utilizar para hacer tubos para el cultivo viral y diagnóstico de dengue, o se hacen pases para obtener nuevas botellas con células para su continuo crecimiento.

Los pases: Tome una botella con crecimiento abundante de células, decante todo el medio, vuelva a tapar, agregue medio al 10% en la botella y tápela ( colocar unos 5ml por cada pase que se haga de una botella); palmee la botella para bajar las células y luego pipetee de arriba hacia abajo varias veces o con la ayuda de una varilla de hule(policía) para romper los conglomerados; al despegar las células se pipetean 5 ml para cada botella nueva y se añade de 20 a 25 ml de medio al 10%. Haga esto semanalmente. Utilizando técnicas estériles. Tubos para cultivo: De una botella se puede sacar de 20-25 tubos. Se toma una botella y se decanta todo el medio, luego se le coloca de 40 a 50 ml de medio al 10% a la botella (dependiendo del número de tubos, ya que por cada tubo son 2 ml de medio) y se bajan las células como se describió anteriormente o con la ayuda de una varilla de hule (policía), pipetéelas al medio y mezcle. Utilizando una pipeta de 10 ml, añada de 2 ml de células/medio a cada tubo, etiquete la gradilla con TC-VISO e incube 1 o 2 días, revisando su crecimiento a diario, hasta el día de su inoculación. Utilice técnica estéril

Procedimiento de Aislamiento Viral en cultivo de células C636 de Aedes albopictus Preparar el gabinete de seguridad / campana de flujo laminar, limpiándolo con cloro al 10% y etanol al 70%.

1. Prepare la lista de muestras para el aislamiento (muestras en la fase aguda que

sean de 0 a 3 días de empezado los síntomas u hospitalizados), mantenerlas sobre hielo.

2. Coloque sueros Control Positivo (sueros positivos anteriores) y Control de Células (tubos sin muestra).

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3. Coloque la gradilla de tubos con células en la campana (previamente chequee la

monocapa confluente), etiquete los tubos con los controles y el número de las muestras. Decante el medio de los tubos en lado contrario a la monocapa. Inocule los tubos con 20 µl de muestra (en el lado de la monocapa de células), luego se agrega de 1½ a 2 ml de medio al 5% a cada tubo y se tapan bien los tubos. Se pone en la gradilla la fecha de inoculación, luego se coloca la gradilla acostada de manera que la monocapa quede cubierta con el medio/muestra y se incuba por 6 a 7 días a 33ºC (EN LA INCUBADORA PARA CULTIVOS INFECTADOS) Utilice técnica estéril.

Preparación de células para prueba de inmunofluorescencia directa: Al 6to día de incubación, remueva la gradilla de tubos del incubador y baje las células de las paredes del tubo, golpeando el tubo contra la palma de la mano. Centrifugue los tubos a 1500 rpm por 10 minutos en centrifuga refrigerada (4ºC). Numere las láminas de acuerdo a la hoja del protocolo. Después de centrifugar, decante el fluido en eppendorf identificados y coloque PBS en una cantidad equivalente al tamaño del botón. Homogenice con una pipeta pasteur y coloque 1 gota de la suspensión en cada pozo de la lámina. Las muestras son colocadas en duplicado de manera horizontal: (ver figura 1) FIGURA No. 1 Posición de las muestras en la lámina de inmunofluorescencia 1

A

A

B

B

C

C

D

D

E

E

F

F

Fuente: Manual de procedimientos de operación estándar del área de virología, 2007

Cuando todas las muestras han sido dispensadas, coloque la gradilla de tubos en el refrigerador hasta que la DFA se ha hecho y las muestras positivas se han encontrado.

Coloque las láminas en la campana y déjelas secar. Cuando estén secas colóquelas en una canasta de láminas y fije las células por inmersión en acetona fría (mantenida a –20ºC) por 15 minutos mínimo. Remueva las láminas de la acetona y por último déjelas secar. DFA (Ensayo de Inmunofluorescencia Directa) Utilizada para detectar muestras positivas. Después de fijar las láminas, remuevas de la canasta y déjelas secar al aire. Saque el vial de conjugado DFA del refrigerador y diluya de acuerdo al protocolo. Coloque las láminas en una bandeja húmeda; luego coloque 10 µl de conjugado a cada muestra e incube a 37ºC por 30 minutos.

Encienda el Microscopio de Fluorescencia. Remueva la bandeja de la incubadora, remueva el conjugado sacudiendo las láminas y lave 2 veces con PBS cada lámina por separado. Quite el exceso y deje secar. Cuando estén secas añádales una gota o dos de glicerol al 90% a cada muestra, y colóqueles un cubreobjetos, asegurándose que el glicerol cubra toda la lámina.

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Figura 2 Lectura de Fluorescencia Directa:

- 1+ 2+ 3+

Las láminas pueden ser leídas en el microscopio Fluorescente. El grado de acuerdo al porcentaje de células que muestra fluorescencia: (ver figura 2)

Ninguna célula fluorescente = (-) Menos del 30% de Fluorescencia = (+) 30 – 75% de Fluorescencia = (++) Más del 75% de Fluorescencia = (+++) Anote los resultados en la hoja de protocolo.

Preparación de muestras para IFA (Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecta) Las muestras positivas obtenidas de la lectura de DFA deberán ser ensayadas para IFA. Identifique las láminas a utilizar para las muestras positivas y una lámina para el control positivo. Busque los tubos de muestras utilizadas para la DFA y separe los tubos positivos. Dispense cada muestra en una lámina utilizando 4 pozos. Ver figura 3 Figura 3 Posición de los anticuerpos monoclonales en el ensayo de IFA

Deje secar, fije en acetona fría (15 minutos), deje secar otra vez. Si las IFA se van a realizar al día siguiente, coloque las láminas en un libro de láminas en el congelador a –20ºC.

IFA para Identificación de Serotipo de Dengue. Ponga a secar las láminas, y saque los viales de los monoclonales de la refrigeradora. Prepare la dilución de trabajo. Agregue cada monoclonal en el pozo correspondiente, (10µl). Tenga mucho cuidado de que las gotas no se mezclen, evitando contacto con los pozos adyacentes. Retorne los reactivos al refrigerador. Ponga las láminas en una cámara húmeda, e incube por 30 minutos a 37ºC. Sáquelas de la incubadora y remueva el reactivo. Luego lávelas dos veces con PBS. Remueva el PBS y deje secar. Cuando estén secas, coloque el conjugado IFA, incube en cámara húmeda por 30 minutos a 37ºC. Sáquelas de la incubadora y remueva el conjugado.

2 -

+

D1

D2

D3

D4

-

+

D1

D2

D3

D4

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Lávelas dos veces con PBS, descarte el PBS y déjelas secar en la campana agregue una o dos gotas de glicerol al 90%, coloque un cubre objetos, y observe en microscopio fluorescente. El control negativo deberá no presentar fluorescencia, el control positivo deberá ser fluorescente, y, de los cuatro monoclonales, el que muestre fluorescencia, identifica el serotipo de la muestra. Los resultados se anotan en la hoja de protocolo, además del control de calidad.

Preparación de Láminas Control. Infecte 4 botellas de 25 cm2 de células C6/36 (que tengan de 3-4 días de capa confluente) con cada serotipo de Dengue, un serotipo por botella, decante el medio e inocule con 0.1 ml virus semilla. Absorba por 1 hora, ladee la botella cada 15 minutos para mantener la monocapa húmeda; después de 1hora añada 5 mililitros de medio fresco e incube a 33ºC por 3 a 5 días. Realice un DFA en el día 4; si las células muestran > 75% positividad, mezcle con células no infectadas en una proporción de 1:4 y elabore las láminas con la suspensión. Deje secar al aire y fije en acetona fría por 5 minutos. Seque otra vez y almacene en el congelador.

Preparación de láminas para adhesión de células. Láminas de 12 pozos son preparadas para el test de FA de la siguiente manera: Coloque en un rack de 20 láminas en una jara de tinción, llene la jarra con una solución de 5 mg/L de Poli-lisina/agua destilada, suficiente para cubrir las láminas más de 1 cm. Sumerja por 20 minutos, remueva el rack, elimine el exceso de solución en una toalla de papel, y deje secar en campana. Cuando estén secas, coloque las láminas en una libro de láminas y almacene a –20ºC hasta su uso.

Congelación de Células C6/36

1. Adicionar 4 ml de medio MEM y 1 ml de Suero bovino Fetal (SBF) en un frasco de 10 ml rotulado como No. 1 Colocarlo en un baño de hielo.

2. Adicionar 4 ml de medio MEM y 1 ml de dimetilsulfoxido en otro frasco rotulado como No. 2 Colocarlo en una baño de hielo.

3. Decantar el medio de un frasco de 150 cm2 con células C6/36 (monocapa confluente)

4. Extraer los 5 ml del frasco No. 1 y añadirlo al frasco con células. 5. Desprender las células y adicionar la suspensión celular en el frasco No. 1 6. Adicionar con una pipeta de 5 ml el medio del frasco No. 2 al frasco No. 1,

añadirlo gota a gota y agitando, siempre en baño de hielo. 7. Colocar 1 ml de la suspensión celular en los tubos de congelación y mantenerlos

en el baño de hielo. Dejar 0.1 ml para prueba de esterilidad. 8. Guardar los tubos de congelación a –20ºC durante 1 hora. 9. Guardar los tubos de congelación a –70 durante toda la noche. 10. Pasar los tubos de congelación a nitrógeno líquido.

Descongelación de células:

1. Sacar el tubo de congelación del nitrógeno líquido y pasarlo directamente a un recipiente con agua a 37ºC. Hasta que se descongele su contenido.

2. Extraer el contenido del tubo con una pipeta de 1 ml y adicionarlo a un frasco de 25 cm2 que contenga 4.9 ml de medio MEM. Incubar a 28ºC

3. Cambiar el medio de crecimiento a las 24 horas por medio MEM fresco. 4. Cuando la monocapa este confluente pasar las células en un split de 1:5.

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1.4.8.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PUNTO FINAL Purificación del ARN viral RT-PCR

AREA GRIS

A. EQUIPOS � Microcentrífuga � Calentador o microondas � Pipetas ajustables 20 µl, 200µl, 1000µl

B. MATERIALES

� Tubos de 1.5 ml libres de ARNasas y DNAsas � Puntas de 1 a 200 ul con filtro � Puntas de 200 a 1000 ul con filtro � Tubos plásticos de 15 ml � Beaker con cloro diluido para desechos � Marcador permanente � Cinta de color � Gradillas para tubos de microcentrifugas � Guantes sin talco.

C. REACTIVOS � Cloro � Buffer de Extracción � Acetato de Sodio 2M pH 4.0 para Biología Molecular � Fenol saturado pH 4.7 para Biología Molecular � Cloroformo � Isopropanol � Etanol al 75% ( preparado con agua bidestilada libre de ARNasa) � Agua bidestilada estéril, libre de ARNasa ( comercial o tratada con DEPC).

1. Buffer de Extracción 2. Isotiocianato de Guanidinium 4 M 3. Citrato de Na 25 mM pH 7.0 4. Sarkorsyl 0.5% 5. Transfer ARN 10 ug/100ul 6. B- mercaptoetanol 100 mM

PROCEDIMIENTO:

1. Calcular la cantidad de cada reactivo necesario para el número de muestras que serán procesadas. Agregar un 105 extra del volumen, y hacer alicuotas con la cantidad apropiada de cada reactivo en tubos de polipropileno o en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml.

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2. Adicionar 100 µl de sobrenadante de cultivo de células infectado o suero humano a tubos de microcentrífuga estériles. Como control negativo, usar 100 µl de agua destilada o suero negativo. Mantener las muestras en hielo.

3. Adicionar a cada muestra 100 µl de buffer de extracción, mezclar bien y mantener las mismas en hielo.

4. Adicionar secuencialmente a cada muestra los siguientes reactivos, mezclar en vortex después de añadir cada uno: � 20 µl Acetato de sodio 2 M, pH 4.0 � 200 µl fenol equilibrado con agua, mezclar en vortex por 10 segundos � 40 µl de cloroformo, mezclar en vortex por 10 segundos

5. Centrifugar a 14 000 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente.

6. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo ( previamente rotulado) y colocarlo sobre hielo. Cambiar la punta de la barra de la pipeta entre cada una de las muestras. Descartar la fase orgánica en un depósito para desechos orgánicos.

7. Agregar un volumen igual de isopropanol (aproximadamente 400 µl) y mezclar por vortex. Permita la precipitación mínimo 2 horas en hielo o toda la noche a –20C.

8. Centrifugar a 14000 rpm por 20 minutos a 4º C.

9. Remueva el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el sedimento. Primero utilizar una punta de 1000 µl para remover la mayoría del sobrenadante y luego una punta de 1 a 200 µl para el resto.

10. Adicionar 500 µl de Etanol al 75%, mezcle gentilmente Cuidado, el precipitado puede perderse en este punto.

11. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos a 4º C.

12. Descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el sedimento, el cual puede despegarse de las paredes del tubo.

13. Dejar secar el sedimento al aire en una posición horizontal por 10 minutos. O seque por 5 minutos en centrifuga de vacío. Si la muestra no esta seca después de 5 minutos, un segundo lavado de etanol es necesario.

14. Resuspender el sedimento en 30 µl de agua estéril libre de ARNasa.

15. Guardar el ARN a - 20 ó – 70º C hasta su uso.

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PREPARACION DE LA MEZCLA (Master Mix) PARA RT-PCR

AREA BLANCA

EQUIPOS

� Termociclador � Microcentrífuga � Pipetas ajustables 20 µl, 200µl, 1000µl.

MATERIALES

� Tubos de 1.5 ml estériles y libres de nucleasas � Tubos de 0.6 ml estériles y libres de nucleasas � Puntas de 200 µl a 1000 µl estériles y con filtro � Puntas de 1 µl a 200 µl estériles y con filtro � Marcador permanente � Gradillas para tubos de microcentrífuga � Beackers con cloro diluido � Recipiente con hielo � Guantes sin talcos

REACTIVOS

� Buffer de reacción 10x * � Concentración final,

� KCl 50 mM

� Tris- HCl 10 mM pH 8.5

� MgCl2 1.5 mM

� Gelatina 0.01%

� Preparar 10X y alicuotar. Almacenar a –20ºC.

� Nucleótidos. Preparar soluciones 100mM de los cuatro nucleótidos. Solución Stock: 25 µl de cada nucleótido + 900 µl agua libre de nucleasas. Concentración final de 200µM. Alicuotar y almacenar a –20ºC.

� Primers. La concentración de los primers está ajustada a 100µM (100pM/µl). Concentración final en la reacción de 13 pM por 50µl reacción. Almacenar a –20ºC. Secuencia de los primers:

D1: 5’- TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G

D2: 5′- TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT TCA GGT TC

TS1: 5’- CGT CTC AGT GAT CCG GGG G

TS2: 5’- CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG

TS3: 5’- TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C

TS4: 5’- CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A

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� Dithiothreotol (DTT). 1 M DTT es preparado disolviendo 1.54 gramos de DTT en 10 ml de agua libre de nucleasas. Almacenar –20ºC � RNAse Inhibidor. Se utiliza a una concentración en la reacción de 0.5 unidades/µl � Agua bidestilada libre de ARNasa � Taq polimerasa (2.5 unidades/reacción) � Transcriptasa reversa rav-2 Concentración final de 2.25 unidades/reacción � Aceite mineral � Control positivo ARN viral ( de los 4 serotipos

PREPARACIÓN DE LAS MEZCLAS MAESTRAS: (MASTER MIX)

1. Calcular la cantidad de la mezcla de PCR necesaria para el número deseado de reacciones, cada una conteniendo 45 µl de mezcla. Para cada 10 reacciones, agregar un volumen extra de mezcla, para compensar el volumen perdido durante el pipeteo.

2. Llenar la hoja de trabajo de PCR de acuerdo con la Tabla No. 1

Tabla No. 1 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS MASTER MIX

REACTIVOS Primera reacción Segunda reacción

Agua 39.5 µl 39.2 µl Buffer 10X 5.5 5.5 DNTPs 4.0 4.0 DTT 0.25 Primer D1 0.13 0.13 Primer D2 0.13 Ts 1 – 4 0.25 cada uno RNAsin 0.25 TAQ 0.25 0.25 RT 0.063 Total 50.073 50.08 Fuente: Manual de procedimientos operativo estándar de Dengue, Virología, LNS, 2007.

Nota: Mantener siempre los ingredientes y tubos sobre hielo

3. Marcar los tubos adecuados para el Termociclador (tubos de 0.5 ml). 4. Descongelar las alícuotas de cada reactivo. Mezclar bien cada solución con vortex y

baje líquidos con un golpe de centrífuga (Mantener siempre los ingredientes y tubos sobre hielo).

5. En el área blanca utilizando pipetas de ese área, preparar la mezcla de PCR con todos los ingredientes excepto la Taq polimerasa y la reverso transcriptaza rav-2. Tachar cada ingrediente después de agregarlo a la mezcla. Mezclar bien usando un vortex

6. Agregar 5 ul de agua bidestilada al primer tubo para preparar el control negativo del área blanca.

7. Dispense 5 µl de muestra a cada tubo 8. Agregar 1 gota de aceite mineral (si el Termociclador es de tapa caliente este reactivo

no se utiliza). 9. Encienda el termociclador, permita que el bloque llegue a la temperatura de reacción. 10. Agregar las enzimas a la primera master mix y mezclar bien. Tener cuidado de no

producir burbujas.

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11. Distribuir 45 µl de la primera master mix a cada muestra bajo el aceite, transfiéralos tubos en bloque caliente inmediatamente.

12. Almacene la segunda master mix a 4ºC

AMPLIFICACION DE LA MUESTRA

AREA NEGRA

EQUIPOS

� Termociclador � Microcentrífuga

PROGRAMA DE AMPLIFICACION:

A. Primer Ciclo: 1. Reacción RT 42C, 65minutos 2. Amplificación 94C, 30 segundos; 55C, 1 minuto; 72C, 2 minutos; 28 ciclos 3. Extensión 72C, 10 minutos

SEGUNDO CICLO

1. Añada la TAQ a la segunda master mix y dispense 45 µl a los tubos. 2. Añada 50 µl de aceite mineral. 3. Trabaje en un lugar separado y utilice un est de pipetas marcadas segundo ciclo.

Tenga mucho cuidado de no contaminar el área de trabajo con productos de reacción de PCR.

4. Diluya los blancos y los productos de la primera reacción 1:100. 5. Añada 5µl de muestra diluida a los tubos correspondientes que contienen la

segunda master mix bajo el aceite. 6. Empiece el segundo ciclo de amplificación.

B. Segundo Ciclo 94C, 30 segundos; 55C, 1 minuto; 72C, 2 minutos; 18 ciclos

ANALISIS DEL PRODUCTO

CUARTO NEGRO

EQUIPOS

� Microcentrífuga � Balanza � Balanza analítica � Microondas � Fuente de poder � Transiluminador de LUV � Cámara polaroid con filtro naranja y campana � Vortex � Pipetas ajustables 20 µl, 200 µl.

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MATERIALES

� Molde para gel � Cámara de electroforesis � Peine de la cámara para la cámara de electroforesis � Tubo de 1.5 ml estériles � Frasco Erlenmeyer de 250 ml � Probetas de 100 ml, 250 ml, 1000 ml. � Papel para pesar � Cinta adhesiva de color � Puntas de pipetas 1 a 200 µl � Beaker con cloro diluido � Marcador Permanentes � Gradilla para tubos de microcentrífuga � Guantes � Papel parafilms � Lentes protectores contra LUV

REACTIVOS

� TBE 1X (Buffer de corrida Tris, Borato, EDTA) � Agarosa � Dye mix (6X) (Azul de Bromofenol 0.25%, Glicerol al 30%) � Marcador de ADN. � Bromuro de etidium ( 10 mg/ml) ò Gel Red � Película polaroid 667

Nota: Utilice guantes todo el tiempo que maneje el carcinógeno bromuro de etidium

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROS A:

1. Para cada gel, preparar una solución de 3% de agarosa en TBE 1X y calentar hasta disolver la agarosa

2. Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55º C. Agregar bromuro de etidium (10 mg/ml) a una dilución de 1/40000 (Concentración final 0.2 µg/ml).

3. Preparar el gel vertiendo la solución en el molde con cuidado de no hacer burbujas. 4. Preparar buffer de TBE 1X para el gel con bromuro de etidium a una concentración

final de 0.5 µg/ml. 5. Preparar un esquema mostrando el orden de las muestras en el gel.

Nota: Descartar las puntas en un beaker con cloro.

6. Cubrir una gradilla para tubos de microcentrífuga con un pedazo de parafilms. Hacer depresiones en el parafilms sobre los hoyos. Marque el número de las reacciones sobre el parafilms en el orden predeterminado.

7. Preparar las muestra para el gel en el orden estipulado: 15 µl del producto

3 µl de colorante 8. Preparar el marcador de PM de ADN: 9. Poner el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TBE 1X. 10. Adicionar las muestras en el gel según el orden predeterminado.

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Correr el gel aproximadamente 100 voltio hasta que el azul de bromofenol haya migrado aproximadamente 70 a 80% a lo largo del gel. Tomar fotografía utilizando el transiluminador y la cámara con película polaroid 667.

Tamaño de los productos

482 pares de base (Dengue 1: D1- TS1)




1.1.8.4 PRUEBA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMER ASA EN

TIEMPO REAL, (PCR EN TIEMPO REAL) Equipo, material y reactivos

� Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml con velocidad ≥10.000 rpm � Tubos de colección de 2ml � Tubos de centrífuga de 1.5 ml � Gradillas para tubos de 1.5 ml � Pipetas de volumen ajustable de 10 a 1000 µl � Tips o punteras con filtro para pipetas � Marcador permanente � Kit de extracción de ARN (Qiagen) � Etanol 100% grado biología molecular � Agua libre de DNasa/RNasa � Termociclador ABI 7500 y 7500 FAST � Guantes sin talco. � Placas y tapaderas ópticas � Bloques congelantes para placas y tubos

PROCEDIMIENTO RT-PCR TIEMPO REAL PARA SEROTIPIFIC ACION DEL VIRUS DENGUE

1. Propósito: Detectar la presencia de ARN del virus Dengue por medio de RT-

PCR en tiempo real. 2. Aplicación: El ensayo puede ser utilizado en la detección de ARN viral en

muestras de material infectado, tejido macerado de zancudos, muestras de suero, sangre completa y liquido cefalorraquídeo (LCR), órganos de muestras humanas y animales (aves, equinos, etc.).

3. Principio: La prueba utiliza oligonucleótidos (primers) y sondas fluorescentes específicos para cada serotipo del virus Dengue. El ensayo consiste en un paso de reacción de la transcriptasa reversa, en la que se sintetiza ADNc a partir de la plantilla de ARN, seguido por la reacción de PCR que se basa en la actividad enzimática 5’ exonucleasa de la polimerasa y el uso de

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una sonda fluorescente de ADN (TaqMan) para la detección de la amplificación del genoma viral en tiempo real a través de una señal de fluorescencia.

4. Referencias: - Johnson, B.W., et al. (2005) Serotype-Specific Detection of Dengue Viruses a Fourplex Real Time Reverse Transcriptase PCR assay. J. Clin. Microbiol. 43, 4977-4983.

5. Seguridad: Utilizar bata de manga larga (de color blanco para el cuarto de preparación de reactivos, gris para el area de extracción de acidos nucleicos, negra en el cuarto de termocicladores) y guantes sin talco durante todo el proceso.

6. Materiales, reactivos y equipo: iScript One-Step kit for Probes (BIO-RAD), además Primers y Sondas TaqMan. Ver tabla No. 1

TABLA No. 1 Secuencia de Primer y Sondas para PCR en tiempo real

Serotipo Secuencia Posición del Genoma

Fluoroforo

DEN-1 F

DEN-1 C

DEN-1 Probe

5’- CAAAAGGAAGTCGTGCAATA-3’

5’-CTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC-3’

CATGTGGTTGGGAGCACGC

8973

9084

8998

FAM/BQH-1

DEN-2 F

DEN-2 C

DEN-2 Probe

5’-CAGGTTATGGCACTGTCACGAT-3’

5’-CCATCTGCAGCAACACCATCTC-3’

CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACCTTCAA

1605

1583

1008

HEX/BQH-1

FAM/BQH-1

DEN-3 F

DEN-3 C

DEN-3 Probe

5’-GGACTGGACACACGCACTCA-3’

5’-CATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT-3’

ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG

740

813

762

TR/BHQ-2

DEN-4 F

DEN-4 C

DEN-4 Probe

5’-TTGTCCTAATGATGCTGGTCG-3’

5’-TCCACCTGAGACTCCTTCCA-3’

TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG

904

992

960

Cy5/BHQ-3

Fuente: Manual de procedimientos operativo estándar de Dengue, Virología, LNS, 2010.

Control positivo de ARN de cada serotipo de Dengue, placas para sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 y 7500 fast (Applied Biosystems) y puntas bloqueadas.

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7. Procedimientos: A. Preparación de las muestras

a. Fluidos (sangre, suero, LCR): extraer el ARN de 140 µl de muestra con el kit de extracción de Quiagen para ARN, si el volumen de la muestra es menor a 140ul, llevar la muestra a éste volumen agregando PBS.

B. Preparación de materiales b. Desinfectar el área de trabajo con etanol al 70%, antes de iniciar el trabajo c. Desinfectar la campana de PCR y encender la luz UV por 10 minutos d. Descongelar las muestras de ARN y el control positivo sobre hielo e. Encender el termociclador Applied Biosystems 7500 o 7500 fast

C. Procedimiento del PCR: f. Preparar el Master Mix dentro de la campana de PCR del cuarto blanco, en

suficiente cantidad para el número de muestras a procesar (para el cálculo de volúmenes de Master mix, agregar una reacción adicional por cada 10 muestras) incluir en el cálculo el control positivo y el control negativo

TABLA No. 2 Protocolo de trabajo del Master Mix de PCR en tiempo real, por reacción

Reactivo Volumen por Reacción (µl)

Concentración final

RT Master Mix (2X) 12.50 1X

Primer Forward (100 µl) 0.125 25 pmol

Primer Reverse (100 µl) 0.125 25 pmol

RT Mix (enzima) 0.25 40 U

Sonda (25 µM) 0.18 9 pmol

H2O DEPC 9.32

Master Mix por reacción 22.50

Templado RNA 2.5

Total 25.0

Fuente. Manual de procedimientos operativo estándar de Dengue, Virología, LNS, 2010.

Este cálculo es solo para una reacción simplex (un serotipo). Si se desea trabajar con los cuatro serotipos al unísono, se debe agregar 0.125 de cada primer (0.5 µl en total por reacción) y 0.18 de cada sonda (0.72 µl por reacción) y solo 8.53 µl de agua. g. Agregar primero agua, luego RT Master Mix, Primers, sonda y por último la

enzima

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h. Mezclar bien, centrifugar brevemente para remover las gotas de la tapadera y agregar 22.50 µl de Master mix a cada pozo de la placa

i. Colocar la placa de PCR j. Guardar los reactivos a -20 oC k. En la campana de PCR, del cuarto de templado, agregar 2.5 µl de templado

de ARN. Tapar la placa y colocarla en el termociclador, para iniciar el programa de amplificación. Ver Tabla No. 3

TABLA No. 3

Fase Número de

ciclos Paso Temperatura Tiempo

Transcripción Reversa

1 Transcripción reversa

50º C 10 min.

1 Activación de la polimerasa

95º C 5 Min.

Desnaturalización RNA-DNA

45 Desnaturalización 95º C 15 seg.

Annealing/extensión 60º C 1 Min.

Fuente: Manual de procedimientos operativo estándar de Dengue, Virología, LNS, 2010.

D. Almacenamiento y manejo de muestras

l. Almacenar nuevamente los templados de ARN a -70 oC Limpieza y desinfección de materiales y área de trabajo Desinfectar el área de trabajo con etanos al 70%, descartar puntas y placas utilizadas en la bolsa de desecho peligroso.

E. Interpretación de resultados

m. Para asegurarse que la reacción se ejecuto de forma correcta, verificar que ha habido amplificación en el control positivo y NINGUNA amplificación en el control negativo (ej. Señal de fluorescencia no específica o no esperada)

n. Los resultados se obtienen en el valor de umbral de ciclo (Ct Cycle threshold). Este valor representa el numero de ciclo del PCR al que la señal de fluorescencia comenzó a incrementar de manera exponencial (y por lo tanto la cantidad de ADN) y sobrepasa la línea base de detección (nivel o señal de ruido)

o. El valor de Ct para considerar una muestra positiva de dengue 1 debe de ser ≤ 30. El valor de Ct para considerar una muestra positiva de dengue 2 debe ser ≤ de 25. El valor de Ct para considerar una muestra positiva de dengue 3 y 4 debe ser ≤ de 29.

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PARTE II 2. MARCO TEORICO II.1 DENGUE: El dengue es hoy la arbovirosis más importante, por su gran carga de enfermedad e implicaciones sociales. El mosquito Aedes aegypti, su principal transmisor convive con el hombre en su hábitat domestico y peri doméstico. El cuadro clínico es de fiebre, cefalea, dolor retro ocular, dolores corporales, exantema y mucho decaimiento. El enfermo puede empeorar súbitamente y presentar choque por dengue, con grandes hemorragias digestivas y elevada mortalidad. No existe droga antiviral, pero la muerte puede evitarse mediante la infusión intravenosa precoz de soluciones cristaloides. Algunos candidatos vacunales están actualmente en ensayo clínico. La prevención depende del control del vector, mediante educación sanitaria y reordenamiento ambiental. Palabras-clave: Dengue, Dengue severo, Choque por dengue, Control de vectores, Educación sanitaria, Reordenamiento ambiental. II.1.1 Definición de Dengue El dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica (Guzmán et al., 2004; Kindhauser, 2003) que tiene diversas formas de expresión clínica: desde fiebre indiferenciada (frecuente en niños) y fiebre con cefalea, gran malestar general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que – habiendo comenzado con lo anterior – presenta choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones. También el dengue es capaz de expresarse mediante las llamadas formas "atípicas" que son relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras (Martínez, 1995; Martínez, 1997). II.1.2 Etiología El complejo dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (Dengue 1, 2, 3 y 4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos. Son virus constituidos por partículas esféricas de 40 a 50 nm de diámetro que constan de las proteínas estructurales de la envoltura (E), membrana (M) y cápside (C), así como un genoma de acido ribonucleico (ARN), También tienen otras proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5-3. Los virus del dengue pertenecen al género Flavivirus de la familia Flaviviridae (Gubler, 1998). Los virus del dengue y la respuesta del huésped La inmunidad que deja la infección por cada serotipo viral es duradera, probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras semanas o meses después de la infección (Martínez, 1998). Sin embargo, cuando una persona tiene Ac subneutralizantes contra uno de los virus del dengue y es infectado por

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otro serotipo viral se produce una respuesta infrecuente, casi exclusiva de la infección por dengue: una amplificación dependiente de anticuerpos (ADA) que se traduce en una elevada replicación viral y aumento de la viremia, lo cual condiciona y favorece el desarrollo la forma grave de la enfermedad (Guzmán et al., 1992; Halstead, 2002). II.1.3 Epidemiologia Casi la mitad de la población mundial está en riesgo de sufrir esta infección por habitar en áreas tropicales y subtropicales, así como más de 400 millones de viajeros de Europa y Norteamérica que cada año cruzan las fronteras y regresan a sus países procedentes de Asia, África y América Latina (Wichmann et al., 2007; Pinazo et al., 2008). La prevalencia mundial del dengue se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Se calculan 50 millones de infecciones por año, medio millón de hospitalizados y más de 25 000 muertes. Alrededor de 100 países han reportado, casos de dengue y/o dengue hemorrágico y más de 60 lo hacen regularmente todos los años (WHO, 1997; Jacobs, 2000), por lo cual la Organización Mundial de la Salud (OMS) lo considera uno de principales problemas de salud de la humanidad, además de que produce gran afectación social y económica). En la región de las Américas se ha producido un incremento progresivo de casos de dengue durante las tres últimas décadas (Kouri, 2006), habiéndose extendido la enfermedad casi a la totalidad de los países. Ver figura No. 4

Figura No. 4– Evolución de la situación del dengue y la FHD en las Américas, 1980-2007

Fuente: OPS/OMS, 2008

Para que en una ciudad, región o país se produzca transmisión de la enfermedad tienen que estar presente de forma simultánea: el virus, el vector y el huésped susceptible. El huésped cuando está infectado y se encuentra en fase de viremia (de cinco a siete días) constituye el reservorio de la enfermedad. Todos los vectores conocidos que puedan transmitir los cuatro serotipos del virus del dengue pertenecen al género Aedes, de los cuales el Aedes aegypti es el más importante. Esta especie acompaña al ser humano dentro de la vivienda y en sus alrededores, pues la hembra prefiere la sangre humana y pica principalmente durante el día a una o varias personas para procurar cada puesta de huevecillos, lo cual realiza en depósitos naturales o artificiales de agua, hasta que se convierten en larvas, pupas y mosquitos adultos. La otra especie de importancia

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epidemiológica es el Aedes albopictus, importado desde Asia en neumáticos traídos a Estados Unidos y actualmente presente en la mayoría de los países de la Región de las Américas. Los virus del dengue solamente son capaces de infectar al hombre y primates superiores si son introducidos por la picada del mosquito-vector. Esta es la única vía de importancia clínico-epidemiológica, pues el dengue no se transmite por vía oral, respiratoria ni sexual, como otros virus. No obstante, existe la infrecuente y aun poco documentada transmisión vertical (Maroun et al., 2008) y la recientemente notificada vía transfusional, muy rara, al parecer (Blanco, 2008; Tambyah et al., 2008). ¿Por qué es una enfermedad re-emergente a nivel mundial? Por el incremento inusitado del vector en las últimas décadas (Calisher, 2005). El Aedes aegypti es un mosquito domestico o peri doméstico cuya hembra precisa de la sangre humana para mantener su reproducción; que pone sus huevos en depósitos de agua limpia o semi-limpia. Los huevos se convierten en larvas y posteriormente en pupas hasta emerger en forma adulta. La hembra infectante puede vivir hasta dos meses y picar varias veces al día. Otros mosquitos también han demostrado su competencia vectorial, como el Aedes albopictus llamado "el tigre asiático" que fue llevado a América hace dos décadas y actualmente infecta varios países en Europa. Existen los llamados factores macro determinantes para explicar este incremento del dengue a escala mundial: de tipo climáticos – calentamiento global – y de tipo social, como el aumento de la población mundial, la tendencia a la urbanización desordenada, los viajes internacionales y la pobreza expresada en problemas de vivienda, educación, abasto de agua, recolección de desechos sólidos y otros, así como la falta de programas nacionales e internacionales efectivos contra esta enfermedad y su vector (Gubler, 2005). Actualmente el control del vector constituye la única estrategia para la prevención del dengue. II.1.4 Carga de enfermedad La carga de enfermedad expresada en años perdidos por discapacidad (DALYs) es de 0.42 x 1000 habitantes lo cual es semejante a la meningitis, el doble de hepatitis y un tercio de HIV/Sida. En el Sudeste Asiático y Pacífico Occidental las tasas de ataque llegan a 6 400 x 100 000 habitantes y allí – durante décadas – los niños constituyeron hasta el 95% de los casos, lo cual ahora ha cambiado y existe un discreto predominio de adultos, tal como estaba ocurriendo en Brasil y otros países suramericanos. En fecha reciente, sin embargo, se ha producido un cambio en la edad con la cual se enferma y agrava de dengue, habiendo aumentado su frecuencia en la edad pediátrica (Teixeira et al., 2008). Los efectos negativos a la economía están dados por el elevado costo del control de epidemias, el ausentismo laboral y escolar y afectaciones indirectas a algunos países cuyos ingresos dependen del turismo, entre otros. II.1.5 Fisiopatología Existen diversas teorías patogénicas para explicar las formas graves del dengue. Según la teoría secuencial, una segunda infección producida por otro serotipo produce una amplificación de la infección mediada por anticuerpos o inmunoamplificación con una gran replicación viral y aumento de la viremia, lo cual determina la gravedad de la enfermedad (Cummings et al., 2005). Otras teorías consideran que las diferencias en la patogenicidad de las cepas virales explican las formas graves del dengue (Anantapreecha et al., 2005). En la práctica, en una misma epidemia de dengue

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coexisten factores del huésped y factores del virus, así como factores epidemiológicos o ambientales. Cuando el virus es introducido en la piel, la primera célula diana es la célula dendrítica presente en la epidermis (Palucka, 2000; Kwan et al., 2005), principalmente las células de Langerhans, que se activan y presentan el virus al linfocito T. De igual manera, los virus que invadieron la sangre son identificados por los monocitos y células endoteliales, que también cumplen la función presentadora. Los primeros linfocitos en activarse son los CD4 y posteriormente los CD8, con liberación de citoquinas (Cardier et al., 2005). La respuesta inmunológica del huésped puede ser protectora (y conducir a la curación) o patogénica expresada por una "desregulación" que se caracteriza por una producción excesiva de citoquinas, así como cambio de la respuesta tipo TH1 a TH2 (Mabalirajan et al., 2005) e inversión del índice CD4 / CD8. El derrame excesivo de citoquinas produce un aumento de la permeabilidad vascular que se traduce en una extravasación de plasma, que es la alteración fisiopatológica fundamental del dengue, mediante la cual se escapa agua y proteínas hacia el espacio extravascular y se produce la hemoconcentración y – a veces – choque hipovolémico (Basu, 2008). La infección viral induce apoptosis de linfocitos T en los primeros días de la infección que de acuerdo a su intensidad puede influir favorablemente en la desaparición del virus o puede provocar la lisis de grandes cantidades de esas células y disminuir transitoriamente la competencia inmunológica del paciente, así como provocar daños en otras células y tejidos del huésped, tales como los endotelios, hepatocitos, miocardiocitos, neuronas, células tubulares renales, y otras, lo cual podría explicar la afectación de muchos órganos durante esta infección (Limonta et al., 2007). La trombocitopenia se produce por destrucción de plaquetas en sangre periférica por un mecanismo inmuno-mediado. Los sangramientos durante el dengue no están en relación directa con la intensidad de la trombocitopenia (Gomber et al., s. d.), pues se producen por un conjunto de factores (Schexneider & Reedy, 2005). Las causas de los sangramientos en el dengue son múltiples (Srichaikul & Nimmannitya, 2000) incluidos los vasculares y algunas alteraciones de la coagulación por acción cruzada de algunos anticuerpos antivirales contra el plasminógeno y otras proteínas, así como un desbalance entre los mecanismos de la coagulación y los de la fibrinólisis. Dengue es una sola enfermedad La infección por dengue puede ser clínicamente inaparente y puede causar una enfermedad de variada intensidad que incluye desde formas febriles con dolores en el cuerpo y con mayor o menor afectación del organismo hasta cuadros graves de choque y grandes hemorragias. Hasta ahora se ha aceptado que la diferencia principal entre el dengue clásico o fiebre del dengue (FD) y la fiebre hemorrágica dengue (FHD) no son precisamente los sangramientos sino la extravasación de plasma, en particular cuando tiene expresión y repercusión clínica porque se expresa en aumento significativo del hematocrito y por colección de líquido en cavidades serosas, tales como derrame pleural, ascitis y derrame pericárdico. El espectro clínico del dengue tan variado nos explica la diversidad de cuadros clínicos que podemos encontrar en una misma familia o población durante un brote epidémico, pues algunos pacientes (quizás la mayoría) estarán sólo ligeramente afectados y – erróneamente – ni siquiera procuraran los servicios médicos, otros tendrán síntomas escasos (oligosintomáticos) y otros estarán muy afectados, con gran postración y quizás

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con una evolución desfavorable, deterioro clínico y muerte, a veces en pocas horas. Cada uno de los cuatro virus del dengue puede producir cualquier cuadro clínico del referido espectro. También existen las formas clínicas que por no ser tan frecuentes se les llama "atípicas" que resultan de la afectación especialmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, así como la afectación renal con insuficiencia renal aguda y otras que también se asocian a mortalidad (Martínez, 2005). El dengue es una enfermedad muy dinámica, a pesar de ser de corta duración (no más de una semana en casi el 90% de las veces). Su expresión puede modificarse con el paso de los días y puede también agravar de manera súbita, por lo cual el enfermo necesita que el medico lo atienda de modo repetido, preferentemente todos los días. El curso de la enfermedad del dengue pasa por tres etapas clínicas: la etapa febril – la única para la inmensa mayoría de los enfermos –, la etapa crítica y la etapa de recuperación. Figura 5.

FIGURA No. 5 El curso de la enfermedad del Dengue.

Fuente: Elaboración Eric M. Torres, 2008

La etapa febril es variable en su duración y se asocia a la presencia del virus en sangre (viremia). Como en otras enfermedades, la evolución hacia la curación pasa por la caída de la fiebre y durante la misma el enfermo va a tener sudoración, falta de fuerzas o algún decaimiento, todo de tipo transitorio, pero habitualmente el propio paciente se percata que evoluciona hacia la mejoría. Otras veces, la caída de la fiebre se asocia al momento en que el paciente agrava, y la defervescencia anuncia, por tanto, el inicio de la etapa crítica de la enfermedad. Esto es característico del dengue: el primer día afebril es el día de mayor riesgo de presentar complicaciones. La etapa crítica coincide con la extravasación de plasma (escape de líquidos desde el espacio intravascular hacia el extravascular) y su expresión más temida es el choque, con frialdad de los tegumentos, pulso fino, taquicardia e hipotensión. A veces, con grandes hemorragias digestivas asociadas, así como afectación de hígado y quizás de otros órganos. El hematocrito se eleva en esta etapa y las plaquetas – que ya venían descendiendo – alcanzan sus valores más bajos. En la etapa de recuperación generalmente se hace evidente la mejoría del paciente, pero en

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ocasiones existe un estado de sobrecarga líquida, así como alguna infección bacteriana sobreañadida. II.1.6 Cuadro clínico Generalmente la primera manifestación clínica es la fiebre de intensidad variable, aunque puede ser antecedida por diversos pródromos. La fiebre se asocia a cefalea y vómitos, así como dolores en el cuerpo que es el cuadro de "dengue clásico" mejor llamada fiebre dengue (FD). En los niños, es frecuente que la fiebre sea la única manifestación clínica o que la fiebre este asociada a síntomas digestivos bastante inespecíficos. La fiebre puede durar de 2 a 7 días y asociarse a trastornos del gusto bastante característicos. Puede haber enrojecimiento de la faringe aunque otros síntomas y signos del aparato respiratorio no son frecuentes ni importantes. Puede existir dolor abdominal discreto y diarreas, esto último más frecuente en los pacientes menores de dos años y en los adultos. Secuencia de los signos clínicos en el diagnostico de las formas clínicas del dengue Identificar la secuencia de las manifestaciones clínicas y de laboratorio es muy importante para diferenciar el dengue de otra enfermedad que pudiera tener semejantes alteraciones pero en distinto orden de presentación (leptospirosis, meningococemia, influenza, sepsis, abdomen agudo y otras) y, además, constituye la única posibilidad de detectar precozmente cual es el paciente de dengue que puede evolucionar o está ya evolucionando hacia la forma clínica grave de dengue hemorrágico y choque por dengue. En los primeros días aparece exantema en un porcentaje variable de los pacientes; no se ha demostrado que el exantema sea un factor de pronóstico. Las manifestaciones referidas predominan al menos durante las primeras 48 horas de enfermedad y pueden extenderse durante algunos días más en la que pudiéramos considerar como la ETAPA FEBRIL de la enfermedad, durante la cual no es posible conocer si el paciente va a permanecer con síntomas y signos de dengue clásico todo el tiempo y va a evolucionar a la curación espontánea o si es apenas el comienzo de un dengue grave, con choque y grandes sangrados. Entre el 3º y 6º día para los niños, y entre el 4º y 6º día para los adultos (como período más frecuente pero no exclusivo de los enfermos que evolucionan al dengue grave, la fiebre desciende, el dolor abdominal se hace intenso y mantenido, se constata derrame pleural o ascítico, los vómitos aumentan en frecuencia y comienza la ETAPA CRITICA de la enfermedad, por cuanto es el momento de mayor frecuencia de instalación del choque. También en esta etapa se hace evidente la hepatomegalia. La presencia de signos de alarma es muy característico del tránsito a esta etapa y anuncian complicaciones tales como el choque (Rigau & Laufer, 2006). El hematocrito comienza siendo normal y va ascendiendo a la vez que los estudios radiológicos de tórax o la ultrasonografía abdominal muestran ascitis o derrame pleural derecho o bilateral. La máxima elevación del hematocrito coincide con el choque. El recuento plaquetario muestra un descenso progresivo hasta llegar a las cifras más bajas durante el día del choque para después ascender rápidamente y normalizarse en pocos días. El choque se presenta con una frecuencia 4 ó 5 veces mayor en el momento de la caída de la fiebre o en las primeras 24 horas de la desaparición de ésta que durante la etapa febril.

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Existen signos de alarma que anuncian la inminencia del choque, tales como el dolor abdominal intenso y mantenido, los vómitos frecuentes, la somnolencia y/o irritabilidad, así como la caída brusca de la temperatura conducente a hipotermia a veces asociada a lipotimia. Estos signos identifican precozmente la existencia de una pérdida de líquidos hacia el espacio extravascular que – por tener un volumen exagerado y producirse de manera súbita – el paciente difícilmente podrá compensar o no podrá compensar por sí solo. Por tanto, los signos de alarma indican el momento en el cual el paciente puede ser salvado si recibe tratamiento con soluciones hidroelectrolíticas en cantidades suficientes para reponer las pérdidas producidas por la extravasación de plasma, a veces agravada por pérdidas al exterior (sudoración, vómitos, diarreas). No tienen que estar presente, de inicio, todos los signos clínicos de choque. Basta constatar el estrechamiento de la tensión arterial (TA) diferencial o presión del pulso (diferencia de 20 mmHg o menos entre la TA máxima o sistólica y la mínima o diastólica), la cual generalmente ha sido precedido por signos de inestabilidad hemodinámica (taquicardia, frialdad, llenado capilar enlentecido, entre otros). Por tanto, no es necesario esperar la hipotensión para diagnosticar choque (Martínez & Velázquez, 2002). Los signos de choque la mayoría de las veces tienen duración de algunas horas. Cuando el choque se hace prolongado o recurrente, o sea, se prolonga más de 12 ó 24 horas y excepcionalmente más de 48 horas, se aprecian en el pulmón imágenes radiológicas de edema intersticial a veces semejando lesiones neumónicas. Más adelante puede instalarse un síndrome de dificultad respiratoria por edema pulmonar no cardiogénico, con ensombrecimiento del pronóstico. Después de la etapa crítica, el enfermo pasa un tiempo variable en la ETAPA DE RECUPERACIÓN que también requiere de la atención médica pues durante este período es que el paciente debe eliminar fisiológicamente el exceso de líquidos que se había extravasado hasta normalizar todas sus funciones vitales; en el niño y el adulto sano esta diuresis aumentada es bien tolerada, pero hay que vigilar especialmente a cardiópatas, nefrópatas o personas ancianas. Debe vigilarse también una posible coinfección bacteriana, casi siempre pulmonar, así como la aparición del llamado exantema tardío (10 días y después). Algunos pacientes adultos se mantienen muchos días con astenia y algunos refieren bradipsiquia durante semanas. II.1.7 Exámenes de laboratorio clínico y de imágenes Es probable que el médico que atiende un paciente con FD indique un recuento leucocitario en busca de la frecuente leucopenia, la cual puede ser intensa hasta mostrar menos de 1.000 leucocitos x mm cúbico. La fórmula diferencial hará evidente la neutropenia propia de la fase inicial de la enfermedad, algunas células en banda y linfocitos atípicos. El hematocrito y el recuento plaquetario serán los exámenes de laboratorio clínico indispensables en el paciente que se sospeche pueda evolucionar hacia el dengue grave, con extravasación de líquidos, choque y hemorragias, aunque su realización no es estrictamente necesaria durante el seguimiento del caso febril sospechoso de dengue si no hay sangrados espontáneos o –al menos- tenga una prueba del lazo positiva. Los enfermos que requieren hematocritos y recuentos plaquetarios, generalmente los necesitan seriados durante varios días. No obstante, el recuento leucocitario > 6000 células/mm3 ha sido factor asociado a la progresión del enfermo al SCD, al menos en adultos (Harris et al., 2003). En Rio de

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Janeiro, en el año 2002, los resultados de laboratorio demostraron la importancia de la leucocitosis y la hemoconcentración como indicadores pronósticos por la frecuencia de estas alteraciones en los enfermos que luego fallecieron, así como las elevaciones en las transaminasas, principalmente de TGO (Azevedo et al., 2002). El estudio del paciente debe completarse según el cuadro clínico, las posibilidades del lugar y el tipo de atención que esté recibiendo: ambulatoria o con hospitalización, en este segundo caso puede incluir la realización de hematología completo, eritrosedimentación, proteínas totales, ionograma, gasometría, urea, creatinina, transaminasas u otras enzimas en sangre que expresen citólisis hepática (Villar-Centeno et al., 2008), así como medulograma, si fuera necesario. Para el diagnóstico diferencial (Bruce et al., 2005; Wilder-Amith et al., 2004) el médico – en determinados casos – puede requerir del hemocultivo, la gota gruesa, estudio del líquido cefalorraquídeo (citoquímico y bacteriológico) y otras pruebas más específicas. Los estudios radiológicos de tórax y la ultrasonografía abdominal son muy útiles en el dengue hemorrágico, así como el electrocardiograma y el ecocardiograma si se considera una posible afectación miocárdica. Con este último se puede identificar un derrame pericárdico, pero también algo más importante: una contractilidad miocárdica disminuida que sea expresión de miocarditis por dengue. El estudio radiológico de tórax (vistas antero posterior y lateral) permite conocer la presencia de derrame pleural, así como cardiomegalia u otra alteración torácica. En la última década, la utilización de estudios sonográficos ha permitido la identificación temprana de ascitis, derrame pleural y pericárdico, así como el engrosamiento de la pared de la vesícula biliar por edema de la pared, todos los cuales son signos de extravasación de líquidos, así como el diagnostico de acúmulos de liquido en las áreas perirenales que han sido asociadas al choque por dengue y que no tienen otra explicación que la propia fuga capilar, en esta ocasión hacia el espacio retroperitoneal (Setiawan et al., 1998; Venkata et al., 2005). ¿Cómo se confirma la infección por dengue? Se dispone de la posibilidad del cultivo y aislamiento de virus dengue a partir de la sangre de los pacientes durante la etapa febril. Este método sigue siendo la regla de oro pero resulta costoso y trabajoso, por lo cual no es aplicable a la mayoría de los pacientes. Tampoco abundan los laboratorios de virología con capacidad de cultivo y aislamiento. Más factible resulta la aplicación de técnicas de biología molecular para la detección del genoma viral. Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar el serotipo viral y también la carga viral, en este caso utilizando el llamado PCR en tiempo real (Guzmán & Kourí, 2004). Hasta aquí los métodos de mayor confiabilidad, aunque no son los más utilizados Figura 6.

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FIGURA No. 6 Métodos diagnósticos para dengue

Con mucho, las técnicas de diagnostico serológico son las más utilizadas internacionalmente, particularmente aquéllas para determinar la inmunoglobulina M específica de dengue (IgM) y la inmunoglobulina G (IgG) mediante ELISA u otros métodos. El estudio serológico para IgM no debe indicarse antes del 5to día o preferentemente a partir del 6to día. No constituye, por tanto, una ayuda al médico de asistencia para decidir conductas, pues el paciente puede agravar a partir del 3to ó 4to día. No obstante, es importante indicar estos estudios serológicos, pues el resultado de laboratorio completa el trípode diagnóstico junto con la clínica y la epidemiología. Las pruebas de laboratorio para identificar antígenos virales, en particular para identificar alguna de las proteínas no estructurales del virus dengue ya existen (determinación de antígenos NS1) y están en proceso de validación e introducción en la práctica. Son especialmente útiles en los primeros cuatro días de la etapa febril de la enfermedad. Criterios de laboratorio para la confirmación del diagnóstico (WHO, 1997) Los criterios de laboratorio para el diagnóstico son los siguientes (debe estar presente por lo menos uno de ellos):

� Aislamiento del virus del dengue del suero, el plasma, los leucocitos o las muestras de autopsia.

� Comprobación de un aumento al cuádruplo de los títulos recíprocos de anticuerpos IgG o IgM contra uno o varios antígenos del virus del dengue en muestras séricas pareadas.

� Demostración del antígeno del virus del dengue en tejidos de autopsia mediante pruebas de Inmunoquímica o Inmunofluorescencia o en muestras séricas mediante técnicas de inmunoensayo.

� Detección de secuencias genómicas víricas en el tejido de la autopsia, el suero o las muestras de líquido cefalorraquídeo por reacción en cadena de la polimerasa (RCP).

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Aunque no se considera diagnóstico de confirmación, la elevación de IgM específica de dengue, a partir del 6to día de la enfermedad, contribuye al diagnóstico del caso clínico y a la vigilancia epidemiológica. II.1.8 Clasificación del dengue Durante tres décadas, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reconocido y recomendado la clasificación del dengue en: fiebre del dengue (FD), fiebre hemorrágica dengue (FHD) con o sin síndrome de choque por dengue (SCD). Para considerar que un enfermo es un caso de FD (o dengue clásico), el enfermo debe presentar fiebre y dos síntomas de los siguientes: cefalea, dolor retro ocular, dolores osteomioarticulares, exantema, leucopenia y algún sangrado (WHO, 1997). La fiebre hemorrágica del dengue requiere la presencia de los cuatro criterios siguientes: a) fiebre (o haber presentado fiebre en la semana), algún sangramiento espontáneo – casi siempre petequias, u otro – o , por lo menos, tener positiva la prueba del lazo, c) trombocitopenia menor de 100000 por mm cúbico, y d) extravasación de plasma, evidenciada por elevación del 20% del hematocrito, o por la disminución del 20% del hematocrito después de la etapa crítica, o por la demostración de derrame pleural, ascitis o derrame pericárdico mediante estudios de imágenes, casi siempre la Sonografía (Organización Panamericana de la Salud, 1995). En los últimos años se han publicado artículos (Balmaseda et al., 2005; Setiati et al., 2007) que cuestionan la utilidad de esta clasificación, por considerarla rígida, demasiado dependiente de resultados de laboratorio y no inclusiva de enfermos de dengue con otras formas de gravedad, tales como la afectación particular del Sistema Nervioso Central (encefalitis), del corazón (miocarditis) o del hígado (hepatitis grave). Tampoco era útil para el manejo clínico de los enfermos. Por tal razón, el TDR/OMS (Programa de Adiestramiento e Investigación en Enfermedades Transmisibles de la Organización Mundial de la Salud) auspició un estudio internacional, llamado DENCO (Dengue Control), uno de cuyos componentes era de clínica y su objetivo principal era obtener información de un número elevado de enfermos con dengue confirmado, y encontrar una forma mejor de clasificarlos, así como identificar cuáles serían los signos de alarma que fueran útiles para mejorar el protocolo de manejo de casos de dengue. Se obtuvo información clínica de casi 2.000 enfermos con dengue confirmado, procedentes de siete países de dos continentes. El estudio concluyó que de 18 a 40% de los casos no podían ser clasificados mediante la actual Clasificación de la OMS, y más de 15% de casos con choque tampoco podían ser clasificados como casos graves de dengue, porque no cumplían con alguno de los criterios para ser considerado caso de FHD/SCD. El estudio también tuvo otro resultado consistente en la propuesta de una clasificación binaria de la enfermedad: DENGUE y DENGUE SEVERO. Los criterios de DENGUE SEVERO fueron los siguientes: a) Extravasación severa de plasma, expresada en Choque hipovolémico, y/o por dificultad respiratoria debida al exceso de líquidos acumulado en el pulmón. b) Hemorragias severas, según criterio del médico tratante, y c) la afectación de órganos: hepatitis severa por dengue (transaminasas superiores a 1000 unidades), encefalitis por dengue o la afectación grave de otros órganos, como la miocarditis por dengue. Estos criterios de severidad tuvieron 95% de sensibilidad y 97% de especificidad Figura 7.

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FIGURA No. 7 Clasificación Dengue

El estudio DENCO también permitió identificar algunos signos y síntomas que estaban presentes en los enfermos un día antes de agravar. Estos signos de alarma permiten identificar tempranamente el enfermo de dengue que va a evolucionar a Dengue Severo y – sobretodo – permite al médico iniciar de manera precoz el tratamiento con reposición de líquidos por vía intravenosa y, de esa manera, mejorar el pronóstico del enfermo. El dolor abdominal o el dolor referido a la palpación de abdomen fue un factor de riesgo significativo para adultos y niños, así como el sangramiento de mucosas y la trombocitopenia menor de 10.000 x mm cúbico. En el adulto, otros signos de alarma fueron la letargia –entendida como somnolencia-, a veces alternando con irritabilidad, la hipoalbuminemia y el hematocrito elevado. También en adultos resultó significativa la presencia de cualquier condición clínica precedente, o sea, la comorbilidad (Jaenisch T, Wills B. Results from the DENCO study. TDR/WHO Expert Meeting on Dengue Classification and Case Management. Implications of the DENCO study. WHO, Geneve, Sep 30-Oct 1/2008). Esta nueva clasificación tiene un riguroso soporte científico y coincide, a grandes rasgos, con los criterios de los clínicos expertos en dengue en nuestra Región, pero necesita ser validada en la práctica, por lo cual el acuerdo tomado en la sede de la Organización Mundial de la Salud fue aplicarla durante un nuevo período en un número mayor de países para conocer su utilidad y factibilidad en situaciones de endemicidad de dengue y durante epidemias de la enfermedad, tanto en hospitales como en unidades de Atención Primaria de Salud. II.1.9 Datos-clave para el tratamiento de enfermos con dengue Es incorrecto decir que el dengue y dengue severo no tienen tratamiento. La carencia de una droga antiviral u otro medicamento específico puede ser sustituida exitosamente por la aplicación de un conjunto de conocimientos que permite la clasificación de los pacientes según sus síntomas y etapa de la enfermedad, así como el reconocimiento

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precoz de los signos de alarma que anuncian la inminencia del choque y permite al médico "ir por delante" de las complicaciones y decidir las conductas terapéuticas más adecuadas (Martínez, 2006). Todo paciente febril debe ser interrogado con pensamiento clínico y epidemiológico, y precisar la duración de los síntomas, a partir del primer día con fiebre; además, debe hacérsele un examen físico, para diagnosticar otras causas de fiebre que también concurren durante las epidemias de dengue. Son cuatro las preguntas que un médico debe hacerse frente a un paciente sospechoso de dengue: A) ¿tiene dengue?, B) ¿tiene sangramiento, alguna comorbilidad o signos de alarma?, C) ¿está en choque? Las respuestas a esas preguntas permiten clasificar al paciente en uno de cuatro grupos (A, B y C) y decidir conductas: * enviarlo a casa con orientaciones y tratamiento ambulatorio (grupo A), * Hospitalización para una estrecha observación y tratamiento médico (grupo B) * Tratamiento intensivo urgente (grupo C). Grupo A – pacientes que pueden ser enviados a su hogar Son pacientes que pueden tolerar volúmenes adecuados de líquido por la boca, mantienen buena diuresis, no tienen signos de alarma, particularmente durante la defervescencia. A los pacientes ambulatorios se les debe ver todos los días en busca de signos de alarma hasta que se encuentren fuera del período crítico ( al menos dos días después de la caída de la fiebre). Debe orientárseles guardar reposo en cama, ingerir líquidos (Harris et al., 2003) en abundante cantidad (más de cinco vasos de tamaño promedio para adultos o lo correspondiente a niños) de leche, jugos de frutas. El agua sola no es suficiente para reponer las pérdidas de electrolitos asociadas a la sudoración, vómitos u otras pérdidas. Para aliviar los dolores del cuerpo y bajar la fiebre, puede indicarse paracetamol (nunca más de 4 g por día para los adultos y a la dosis de 10-15 mg x Kg de peso x día en niños), así como aplicar agua en la piel con esponjas hasta hacer descender la temperatura. No dar aspirina ni antiinflamatorios no esteroideos. Debe educarse al paciente y a su familia respecto a los signos de alarma que deben ser vigilados para acudir prontamente al médico, particularmente al momento de la caída de a fiebre (Azevedo et al., 2002), tales como dolor abdominal, vómitos frecuentes y somnolencia, así como el sangrado de mucosas, incluido el sangramiento excesivo durante la menstruación. Grupo B – pacientes que deben ser internados en un hospital para mejor observación y tratamiento Son los pacientes con cualquiera de las siguientes manifestaciones: Signos de alarma Condiciones médicas co-existentes -condiciones que pueden hacer más complicado el dengue o su manejo, tales como: estado de gestación, edades extremas de la vida (menores de un año y ancianos, obesidad, diabetes mellitus, enfermedades hemolíticas crónicas y cualquier enfermedad crónica. o pacientes que reciben tratamiento mantenido con anticoagulantes o corticoides, así como circunstancias sociales tales como vivir sólo, o vivir muy distante de la unidad de salud sin medio de transportación confiable. Plan de acción con los pacientes que tienen signos de alarma: Iniciar reposición de líquidos por vía intravenosa (IV) utilizando soluciones cristaloides, como solución salina isotónica al 0.9%, u otra (Dung et al., 1999; Wills et al., 2005). Comenzar por 5-7 ml x Kg x hora y posteriormente mantener la dosis o disminuirla de acuerdo a la respuesta clínica del paciente. Si fuera posible, tomar una muestra de sangre para

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hematocrito antes de iniciar la reposición de líquidos por Bay IV y después repetir el hematocrito periódicamente. Administrar la cantidad mínima necesaria para mantener la adecuada perfusión y una diuresis adecuada (0.5 ml x kg x hora). Habitualmente se necesita continuar esta administración de líquidos por vía IV durante 48 horas. Si hay empeoramiento clínico o elevación del hematocrito, aumentar la dosis de cristaloides IV a 10 ml x kg de peso x hora hasta la estabilización del paciente o hasta su remisión a una unidad de Cuidados Intensivos (UCI). II.1.10 Plan de acción para los pacientes sin signos de alarma Estimularlos a ingerir abundante cantidad de líquidos por la boca, mantener reposo en cama y vigilar la evolución de los síntomas de dengue y de los signos propios de cualquier otra enfermedad que padezca (comorbilidad). Si no puede ingerir líquidos, iniciar tratamiento de reposición de líquido por vía IV utilizando solución salina al 0.9%, con o sin dextrosa, a una dosis de mantenimiento. Debe monitorearse la temperatura, el balance de ingresos y perdidas de líquidos, la diuresis y la aparición de cualquier signo de alarma, así como la elevación progresiva del hematocrito asociada a la disminución progresiva del recuento plaquetario en tiempo relativamente corto. Grupo C – Pacientes que requieren tratamiento de emergencia y cuidados intensivos porque tienen dengue severo El plan de acción consiste en el tratamiento del choque mediante resucitación con aporte por vía IV de soluciones cristaloides a 10-20 ml x kg x hora en la primera hora y re-evaluar la condición del paciente (signos vitales, tiempo de llenado capilar, hematocrito, diuresis) y decidir –en dependencia de a situación- reducir progresivamente la cantidad de líquidos, si es que el paciente evidencia mejoría, o repetir un segundo bolo de cristaloides si los signos vitales son aun inestables – y si el hematocrito se ha elevado –, lo cual sugiere que el choque persiste La cantidad de solución cristaloide ahora transfundida puede ser de 20 ml x kg x hora. Si se obtiene mejoría en el estado del paciente, reducir la cantidad de líquidos progresivamente. De lo contrario, considerar la posibilidad de utilizar una dosis de coloide. Si el hematocrito desciende y el paciente mantiene el estado de choque, pensar en que se ha producido una hemorragia, casi siempre digestiva, e indicar transfusión de glóbulos rojos. Los pacientes con choque por dengue deben ser monitoreadas frecuentemente hasta que el periodo de peligro haya pasado. Debe mantenerse un cuidadoso balance de todos los líquidos que recibe y pierde. Los pacientes con dengue severo deben ser atendidos en un lugar donde reciban cuidados intensivos (Ranjit et al., 2005; Shann, 2005). Complicaciones y formas graves e inusuales de dengue El choque por dengue está presente en la inmensa mayoría de los enfermos que agravan y fallecen, como causa directa de muerte o dando paso a complicaciones tales como: hemorragias masivas, coagulación intravascular diseminada, edema pulmonar no cardiogénico, fallo múltiple de órganos (síndrome de hipoperfusión-reperfusión). Más que complicaciones del dengue se trata de complicaciones del choque prolongado o recurrente. Prevenir el choque o tratarlo precoz y efectivamente significa prevenir las demás complicaciones de la FHD y evitar la muerte. En los enfermos con dengue es frecuente que exista alguna afectación hepática, generalmente recuperable. También puede existir alguna afectación miocárdica – particularmente en adultos –, con poca expresión electrocardiográfica. Con menor frecuencia ocurre la afectación renal y neurológica. No obstante, algunos enfermos de

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dengue pueden manifestar especial afectación de un órgano o sistema por lo que se les han llamado "formas clínicas de dengue a predominio visceral" en ocasiones asociadas a extrema gravedad y muerte. Por su relativa poca frecuencia también se les ha llamado "formas atípicas de dengue", a veces asociadas a una determinada predisposición individual u otra enfermedad previa o coexistente (infecciosa o no infecciosa). Durante una epidemia es posible que se presente alguno de estos casos: hepatitis o hepatopatía, conducente a fallo hepático agudo (Shah, 2008), encefalitis o encefalopatía, expresada frecuentemente en afectación de la conciencia (coma) a veces también con convulsiones, miocarditis o miocardiopatía, manifestada en hipocontractilidad miocárdica con disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y posible fallo cardíaco, así como nefritis o nefropatía que puede ser causa de fallo renal agudo o puede afectar selectivamente a la función de reabsorción propia del túbulo renal distal y de esa manera contribuir al aumento de líquido del espacio extravascular. II.1.11 Prevención Se requiere de educación sanitaria a la población y reordenamiento ambiental, con participación comunitaria y multisectorial (Pérez-Guerra et al., 2005; Sánchez et al., 2008). Las medidas de prevención están relacionadas con el control del vector: evitar los criaderos destruyendo los recipientes de agua inservibles (neumáticos usados, latas, botellas, etc.), así como cubriendo y protegiendo los recipientes de agua para el consumo (tanques y otras vasijas), modificar el cultivo de plantas en recipientes con agua a los cuales puede echárseles arena o tierra, y evitar aguas estancadas peri domiciliares. Pueden utilizarse larvicidas químicos (temephos) o biológicos en tanques y demás recipientes con agua. Los insecticidas contra mosquitos adultos (adulticidas) solamente tienen justificación durante epidemias o para interrumpir la transmisión cuando existen altos niveles de infestación, pero siempre asociadas a las medidas educacionales anteriormente referidas (Espinoza-Gómez et al., 2002). ¿Vacunas contra el dengue? No existe hasta el presente una vacuna contra el dengue que sea eficaz, segura y de bajo costo. La complejidad de su desarrollo ha dependido de que se trata de cuatro diferentes virus, con alguna evidencia de protección cruzada pero… interferencia entre los virus vacúnales cuando son co-administrados, el propio carácter complejo de la enfermedad con amplio rango de severidad, la no existencia de un modelo animal, el insuficiente conocimiento de la enfermedad severa en el individuo previamente infectado y el desconocimiento de los marcadores moleculares de virulencia (Hatch et al., 2008). La vacuna debe ser tetravalente, por lo cual el primer gran problema ha sido identificar cuatro inmunógenos que den una respuesta inmunológica balanceada que resulte protectora contra los cuatro virus simultáneamente. Existe, además, el peligro teórico que una vacuna contra el dengue pudiera potencialmente causar el dengue severo en los vacunados, debido al fenómeno de inmunoamplificación conocido como ADA. A pesar de lo anterior, ha existido progreso significativo en el desarrollo de candidatos vacúnales en los últimos años que constituyen una promesa de que en tiempo relativamente corto se pueda disponer comercialmente de una vacuna. Se trabaja en vacunas con virus vivos atenuados, distintos tipos de virus quiméricos, como fiebre amarilla/dengue (Monath et al., 2002) y dengue/dengue, entre otros, virus completo inactivado, vacunas DNA y vacunas de subunidades. Al menos siete de estos proyectos

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están ya en ensayos clínicos fase II y otros proyectos se encuentran en Fase Preclínica, evaluando candidatos vacúnales en primates. No obstante, se considera que hasta el año 2015 o 2016 no se obtendrá el primer licenciamiento para la utilización de vacunas contra el dengue (Hombach J. Revised dengue classifications: implications for vaccine trials. TDR/WHO Expert Meeting on Dengue Classification and Case Management. Implications of the DENCO study. WHO, Geneve, Sep 30-Oct 1/2008). II.1.12 Diagnostico de laboratorio de la Infección por Fiebre de Dengue: El diagnostico del laboratorio se hace en base a la detección especifica del virus, antígenos virales, detección y secuencia del genoma y anticuerpos (Gubler, D.J. 1998, Guzmán ,M.G., and G. Kouri 1996-2003, Halstead, S.B. 1988, Vorndam, V, and G. Kuno 1997, World Health Organization, 1997), En el presente, los tres métodos basicos usados por la mayoría de la laboratorios para el diagnostico del dengue es el aislamiento viral y su caracterización, detección de la secuencia del genoma por la amplificación de los ácidos nucleicos y detección de los anticuerpos específicos. Después de instalada la enfermedad, los virus son encontrados en suero o plasma, circulando en la sangre y algunos tejidos seleccionados, especialmente los del sistema inmune, por aproximadamente 2-7 días, regularmente correspondiente al periodo de fiebre (World health organization 1997). El diagnostico molecular se basa, en la metodología de la reversa transcriptasa (RT-PCR) tal como un paso o la PCR anidada, secuenciación y amplificación de acidos nucleicos (NASBA) o el PCR tiempo real que ha ido gradualmente reemplazando el método del aislamiento viral como una nueva metodología estándar, para la detección del virus en la fase aguda de la enfermedad. Los patrones de respuesta inmunológica pueden ser observados en pacientes con la infección de virus dengue. La respuesta primaria y secundaria depende del estado inmunológico de los individuos infectados. Una respuesta primaria es observada en individuos quienes no han sido infectados con ningún flavivirus. Una respuesta secundaria es vista en individuos quienes han tenido una infección previa algún flavivirus. Para las anteriores fases de la enfermedad la detección de los anticuerpos basados en la captura de las inmunoglobulinas de tipo IgM e IgG en un ensayo inmunoenzimatico, son fundamentales para poder realizar la diferenciaciones de dengue primarias y secundarias. Esto último es importante, y debe contarse con métodos sensibles y confiables para la detección y diferenciación de las primarias o secundarias infecciones de dengue, lo cual es crítico para el análisis de los datos epidemiológicos, patológicos, clínicos y estudios inmunológicos. Aislamiento del Virus y Caracterización: El aislamiento del virus se hace por medio de cultivo celular y aislamiento en mosquitos es el estándar de oro ha estado siendo reemplazado gradualmente por la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (Rt-PCR) el cual es un método más rápido. Esto es principalmente debido a la baja sensibilidad del cultivo viral y que se lleva mucho tiempo para poder cultivar el virus y requiere de metodología como la fluorescencia directa e indirecta y de anticuerpos monoclonales para su identificación (24,40,99). Sin embargo el método molecular basado en RT-PCR ha sido combinado con el cultivo celular para mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo el tiempo para la identificación del cultivo. (7). El RT-PCR detecta el virus aislado en un día versus 4-5 días aproximadamente con la técnica de la inmunofluorescencia. El aislamiento viral es

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indispensable para laboratorios interesados en estudios de virología básica, epidemiologia molecular y patogénesis del virus dengue. El aislamiento del virus dengue de muestras clínicas puede ser convenientemente llevado a cabo en líneas celulares de mosquito tales como la AP-61, Tra-284, C6/36, AP 64 y CLA-1 células de mamíferos tales como LLCMK”, Vero y BHK21 (35). En el presente, el aislamiento viral en células C6/36 de Aedes albopictus de muestras de la fase aguda en suero o plasma sigue siendo el método de elección de rutina. Diagnóstico Molecular: El campo del diagnostico molecular ha cambiado significativamente en la última década. Previamente un diagnostico rápido no contribuye significativamente al tratamiento clínico, investigación etiológica o control de la infección por dengue..Sin embargo diversos laboratorios han publicado varios protocolos de RT-PCR, para identificación de dengue (35,39,41,53,57,68,79,87) Entre los cuales está de 2 pasos el anidado RT-PCR, reportados por lancioti et. Al y el ultimo modificado por Harris et. Al (39) son bien conocidos. Más recientemente han sido reportados, varias investigaciones, del PCR en tiempo real o RT-PCR incluye rapidez, la habilidad de proveer medidas cuantitativas, baja contaminación de AND o ARN, alta sensibilidad y especificidad y fácil estandarización. Por lo tanto el PCR tiempo real ha ido gradualmente sustituyendo al PCR convencional como un nuevo gold estándar para el diagnostico rápido de la infección por dengue en la fase aguda de la enfermedad. La sensiblidad de cada uno de los primers y sondas disponibles dependen de la homología de la secuencia entre los primers y las sondas, esto ha sido reportado previamente y no es posible detectar todos los virus de dengue y el gen que tenga como target gene secuenciado en particular del virus analizado.. por lo tanto es siempre una buena práctica usar múltiples primers y sondas de diferentes regiones del gen en orden de evitar resultados falsos negativos causados en las variaciones de las secuencias entre diferentes sepas y potenciales mutantes. Diagnostico serológico

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PARTE III III. RESULTADOS: Uno de los objetivos específicos de la presente investigación era: evaluar la proteína no estructural del virus de Dengue (NS1), como marcador de diagnostico temprano, comparado con el aislamiento viral de dengue, para poder llegar a cumplir dicho objetivo, seleccionamos 98 muestras de suero que se cultivaron en células de mosquito de Aedes albopictus clone C6/36 y luego se tipificaron con anticuerpos monoclonales y obtuvimos muestras con Dengue serotipo 1 y serotipo 2, posteriormente en dichas muestras se evaluaron varios estuches comerciales, quedándonos con el que tuvo una sensibilidad más alta, habiendo obtenido los siguientes resultados: Cuadro No. 1 y 2

CUADRO No. 1

Evaluación de la Proteína No estructural del Virus de Dengue (NS1) con respecto a metodología de Aislamiento Viral de Dengue

No. Aislamiento Viral NS1 No. Aislamiento Viral NS1 1 Dengue 1 Positivo 50 Dengue 2 Positivo

2 Dengue 1 Positivo 51 Dengue 2 Negativo 3 Dengue 1 Positivo 52 Dengue 2 Positivo 4 Dengue 1 Positivo 53 Dengue 2 Positivo

5 Dengue 1 Positivo 54 Dengue 2 Negativo 6 Dengue 1 Positivo 55 Dengue 2 Negativo 7 Dengue 1 Negativo 56 Dengue 2 Positivo 8 Dengue 1 Positivo 57 Dengue 2 Negativo 9 Dengue 1 Positivo 58 Dengue 2 Positivo 10 Dengue 1 Negativo 59 Dengue 2 Positivo 11 Dengue 1 Positivo 60 Dengue 2 Positivo 12 Dengue 1 Positivo 61 Dengue 2 Positivo 13 Dengue 1 Positivo 62 Dengue 2 Negativo 14 Dengue 1 Positivo 63 Dengue 2 Positivo 15 Dengue 1 Negativo 64 Dengue 2 Positivo 16 Dengue 1 Positivo 65 No se aisló virus Negativo 17 Dengue 1 Positivo 66 No se aisló virus Positivo 18 Dengue 1 Positivo 67 No se aisló virus Positivo 19 Dengue 1 Positivo 68 No se aisló virus Positivo 20 Dengue 2 Positivo 69 No se aisló virus Positivo 21 Dengue 2 Positivo 70 No se aisló virus Positivo 22 Dengue 2 Positivo 71 No se aisló virus Negativo 23 Dengue 2 Positivo 72 No se aisló virus Positivo 24 Dengue 2 Positivo 73 No se aisló virus Negativo 25 Dengue 2 Positivo 74 No se aisló virus Negativo 26 Dengue 2 Positivo 75 No se aisló virus Negativo 27 Dengue 2 Negativo 76 No se aisló virus Negativo 28 Dengue 2 Positivo 77 No se aisló virus Positivo 29 Dengue 2 Positivo 78 No se aisló virus Positivo 30 Dengue 2 Positivo 79 No se aisló virus Negativo 31 Dengue 2 Negativo 80 No se aisló virus Positivo 32 Dengue 2 Negativo 81 No se aisló virus Negativo 33 Dengue 2 Negativo 82 No se aisló virus Negativo

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34 Dengue 2 Positivo 83 No se aisló virus Negativo 35 Dengue 2 Positivo 84 No se aisló virus Negativo 36 Dengue 2 Positivo 85 No se aisló virus Positivo 37 Dengue 2 Negativo 86 No se aisló virus Negativo 38 Dengue 2 Positivo 87 No se aisló virus Negativo 39 Dengue 2 Positivo 88 No se aisló virus Negativo 40 Dengue 2 Negativo 89 No se aisló virus Negativo 41 Dengue 2 Negativo 90 No se aisló virus Negativo 42 Dengue 2 Positivo 91 No se aisló virus Negativo 43 Dengue 2 Negativo 92 No se aisló virus Negativo 44 Dengue 2 Negativo 93 No se aisló virus Positivo 45 Dengue 2 Negativo 94 No se aisló virus Negativo 46 Dengue 2 Negativo 95 No se aisló virus Negativo 47 Dengue 2 Positivo 96 No se aisló virus Negativo 48 Dengue 2 Negativo 97 No se aisló virus Negativo

49 Dengue 2 Positivo 98 No se aisló virus Negativo

Fuente: FODECYT 41-2008

CUADRO No. 2 Tabla 2 X 2

Aislamiento Viral

NS1 Dengue 1 Dengue 2 No se aisló virus Total Positivo 16 28 11 55 Negativo 3 17 23 43

Total 19 45 34 98 Fuente: FODECYT 41-2008

Aislamiento Viral

NS1 + - + 34 11 45

- 20 23 43 54 34 88 5/5+13*100= 62.96% SENSIBILIDAD 25/25+0*100= 68% ESPECIFICIDAD 5+25/5+0+13+25*100= 64.77% CONCORDANCIA

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Como se puede observar en el resultado anterior el nivel de concordancia de la detección de la proteína no estructural NS1 del virus dengue con respecto al aislamiento viral de dengue tiene una concordancia del 64.77 %, la cual es baja, lo ideal debería ser 90%, pero hay que tener en cuenta que la comparación la realizamos con el estándar de oro que es el cultivo viral de dengue, por lo tanto para fines de utilizar la prueba en campo y como un marcador temprano de la enfermedad, es útil, y debe de seguir estudiándose con diferentes parámetros que no eran objeto del presente estudio. Habiendo concluido la primera etapa del proyecto de investigación, procedimos a realizar un estudio prospectivo de recolección de muestras de suero, donde se certificara a los pacientes como Dengues hemorrágicos (dengue severo en la nueva clasificación de la Organización Mundial de la Salud), habiéndose obtenido los siguientes resultados.

Base de Dengue Hemorrágico Para la base de Dengue Hemorrágico se utilizó un total de 78 casos, descartándose para el análisis 5 casos por no contar fecha de inicio de síntomas (4/5) o por no cumplir con definición de caso de dengue hemorrágico según protocolo de vigilancia 2010 (1/5). El porcentaje de positividad más alto fue para el RT-PCR con un 71.4% (25/35).

Tabla No. 4 Porcentaje de positividad general en casos de Dengue Hemorrágico,

LNS, Guatemala 2009-2010

Prueba N % Positividad IC95% IgM 68 35.3 24.1 47.8 NS1 78 34.6 24.2 46.2 RT-PCR 35 71.4 53.7 85.4

Fuente: base de datos generada por investigación de dengue hemorrágico, 2010

Al desglosar por días transcurridos desde fecha de inicio de síntomas y fecha de toma muestra se observa que el IgM tiene mayor porcentaje de positividad (56.5%) entre el 4º. y 5º. Día y el NS1 (40.8%) hasta el 3er. día. El RT-PCR tiene un porcentaje de positividad mayor al 50% en los tres períodos: de 0-3 días del 75%, de 4 a 5 días del 50% y del 6º día en adelante el 100%. Es interesante observar el 100% de positividad de las 3 muestras que fueron analizadas por RT-PCR aunque el tiempo de inicio de síntomas y toma de muestra es mayor a 6 días (es necesario evaluar mayor cantidad de muestras).

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TABLA No. 5 Porcentaje de positividad general en casos de Dengue Hemorrágico según días transcurridos entre inicio de síntomas y toma de muestra, LNS,

Guatemala 2009-2010 Prueba 0 a 3 días 4 a 5 días 6 días en adelante

N % Positividad IC95% N % Positividad IC95% N % Positividad IC95%

IgM 41 24.4 12.4 40.3 23 56.5 34.5 76.8 4 25 0.6 80.6

NS1 49 40.8 27 55.8 25 28.0 12.1 49.4 4 0.0 0 60.2

RT-PCR

24 75.0 53.3 90.2 8 50.0 15.7 84.3 3 100 100 100

Fuente: base de datos generada por investigación de dengue hemorrágico

Según las metodologías realizadas, la comparable con NS1 es RT-PCR ya que ambas detectan el virus (proteína NS-1 y secuencia específica del virus, respectivamente). Por lo anterior se comparó el desempeño de 32 muestras con NS1 contra el RT-PCR, dando los siguientes resultados:

Tabla No. 6 Resultado comparativo entre NS1 y RT-PCR, LNS,

Guatemala 2009-2010

RT-PCR

NSI Positivo Negativo Total

Positivo 12 1 13 Negativo 10 9 19 Total 22 10 32 Concordancia general

65.6 IC95% (42.9 - 88.4)

Ajuste por azar

54.5 IC95% (30.4 - 62.6)

Sensibilidad 90.0

IC95% (35.6 - 73.4)

Especificidad 92.3

IC95% (58.8 - 100.0)

VPP 47.4

IC95% (60.3 -100.0)

VPN 47.4

IC95% (31.0 - 63.8) Índice Kappa 0.36 Grado: Bajo


Estos resultados que el NS1 frente al RT-PCR tiene una concordancia general del 65.6% y al descartar el azar la concordancia es del 54.5%. La sensibilidad y especificidad son adecuadas (>90%). El índice Kappa del 0.36 lo que indica un desempeño bajo. Es importante tomar en cuenta que por lo general la PCR tiene mayor sensibilidad que pruebas por ELISA como lo es el NS1. Según los datos, NS1 muestra mayor problema con falsos negativos por lo que se debe corroborar las muestras con resultados negativo. Al desglosar por tiempo de inicio de síntomas, mejoran los valores en el tiempo de 0 a 3 días, incluso el índice Kappa muestra un grado de acuerdo moderado.

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Tabla No. 7 Resultado comparativo entre NS1 y RT-PCR, según tiempo de inicio

de síntomas y toma de muestra, LNS, Guatemala 2009-2010


Con base a lo anterior, se confirma que el NS1 debe utilizarse antes del 4º. día desde la fecha de inicio de síntomas y fecha de toma de muestra. Otro objetivo de la presente investigación era estudiar la presencia del virus de dengue en saliva y en orina en la fase aguda de la enfermedad. Para dar cumplimiento a este objetivo, dentro del mismo grupo de pacientes que se les pidió una muestra de suero, una muestra de saliva y orina conjuntamente, para saber si el virus de dengue se excreta en la saliva y en la orina, siempre acompañado de una ficha epidemiológica, donde se midieron variables demográficas como edad, sexo, procedencia, estado del paciente y signos y síntomas de la enfermedad, su estado ya sea Dengue Clásico y/o Dengue Hemorrágico. El estudio entrevisto a 190 pacientes sospechosos de dengue, y se recolecto, un total de 372 muestras, divididas en 117 muestras de orina, 117 muestras de saliva y 138 muestras de suero. Provenientes del Hospital Roosevelt y Hospital Infantil Elisa Martínez de Puerto Barrios La mayoría de las muestras son provenientes del brote que afecto al país en el 2009. La detección del virus de dengue en suero, saliva y orina fue por metodología de reacción en cadena de la polimerasa RT-PCR por tiempo real, y RT-PCR convencional, ver anexos No. 4 para ver las bandas de ADN. A continuación se desarrolla el análisis de los resultados: Evaluación de saliva y orina como muestras útiles para el diagnóstico de la infección por virus Dengue. Se desarrolló un protocolo de investigación para evaluar la utilidad de muestras de suero y orina para el diagnóstico detección por virus dengue en pacientes con cuadro clínico sugestivo de esta enfermedad. De los 190 pacientes después de depurar la información y las muestras no quedamos con un total de 89 pacientes con sospecha clínica de dengue, de los cuales se tomaron muestras de suero, saliva y orina muestras provenientes principalmente de Izabal, Puerto Barrios, Villa Nueva, San Miguel Petapa, estos últimos pacientes atendidos en el Hospital Roosevelt. Se emplearon métodos convencionales en la detección y confirmación de la infección por virus dengue, a partir de la muestra de suero: Aislamiento viral en la línea de células

Variable 0 a 3 días 4 a 5 días

N % IC95% N % IC95% Concordancia general

23

73.9 43.7 104.1

7

57.1 14.8 99.5 Ajuste por azar 49.0 29.0 69.0 53.1 13.8 92.4 Sensibilidad 64.7 38.3 91.1 33.3 8.6 58.0 Especificidad 100.0 59.1 140.9 75.0 19.4 100.0 VPP 100.0 59.1 140.9 50.0 13.0 87.0 VPN 50.0 29.6 70.4 60.0 15.6 100.0 Valor Grado de acuerdo Valor Grado de acuerdo Indice Kappa 0.49 Moderado 0.09 Insignificante

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C6/36 (Guzmán, M. G. & Kouri, G. 2004), ELISA para la detección de NS1 (Cat. No. E-DEN2P, panbio, Australia), ELISA para la detección de IgM (CDC, Puerto Rico 2000, Vázquez et al., 1998), PCR en tiempo real (Johnson B et al., 2005). Las muestras evaluadas de saliva y orina fueron estudiadas por la PCR en tiempo real (Johnson B et al., 2005). Las muestras de 78 de los 89 pacientes fueron colectadas en el estuche comercial Sample Collection and Stabilization Kit for DNA Genotek Inc (Canada) usando las instrucciones del fabricante, sistema en evaluación para la colecta y preservación de muestras clínicas para detección de genoma viral. Las restantes muestras de saliva y orina de 11 pacientes fueron colectadas en frascos estériles y enviadas al laboratorio en refrigeración, donde fueron preservadas a – 70oC, hasta el momento de su estudio, para el transporte de estas muestras hacia el laboratorio nacional de salud se emplearon tres sistemas: a) Se realizaron 2 comisiones para recolectar muestras en el lugar, al inicio del brote, y en medio del brote. B) el área de salud enviaba las muestras y c) se utilizo un trasporte privado (cargo express) para el envío de las muestras. Todas las muestras procesadas por RT-PCR en tiempo real, fueron procesadas previamente para la extracción del ARN viral empleado el QIA Ampli mini Kit (QIAGEN), según el protocolo propuesto por el fabricante. Resultados obtenidos: El análisis de los resultados del estudio por PCR en tiempo real de las muestras de saliva mostró que de las 89 muestras estudiadas, 33 fueron positivas, para un 37% de positividad (27 colectadas y preservadas en el estuche de Genotek Inc (Canadá), y solo 6 preservadas a – 70oC) 18 de las 33 salivas positivas fueron casos confirmados como dengue por al menos 1 de las pruebas confirmatorias, la mayor coincidencia fue con la PCR en tiempo real de suero (54,5%) y además 13 fueron IgM positivas (39,39%).Ver Tabla 8 y 9 . Tabla 8. Positividad de las PCR en tiempo real en muestras de saliva, según el modo de

preservación de la muestra


Tabla 9. Muestras Positivas por métodos de diagnóstico


De 89 muestras de orina procesadas de igual número de pacientes, 10 fueron positivas por la PCR en tiempo real, todas fueron colectadas y preservadas en el estuche de Genotek Inc (Canadá).

Modo de preservación positividad Porciento -70o C 11/6 + 54% Estuche 78/27 + 35%

Método diagnóstico Positividad NS1 (+) 12 Aislamiento Viral (+) 5 PCR Suero (+) 18 IgM (+) 13

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Tabla 10. Muestras Positivas de orina por métodos de diagnóstico

Método diagnóstico Positividad NS1 (+) 6 Aislamiento Viral (+) 1 PCR Suero (+) 5 IgM (+) 6


Se obtuvieron resultados positivos coincidentes en muestras de saliva y orina en 4 pacientes. Todos ellos fueron confirmados por algunos de los métodos de referencia para la confirmación de infección por dengue, tres por la PCR a partir del suero y una con IgM positiva. De acuerdo con la situación epidemiológica del área donde se captaron los casos para la investigación, se confirmaron con infección por Den-1, 1 paciente por saliva que fue confirmado por la PCR del suero y con infección por Den-2, 32 pacientes, de los cuales, en solo 9 no tuvieron confirmación de infección por otro método.. De las muestras de saliva estudiadas con resultados positivos, las mismas fueron tomadas entre 1ro y 8vo día del inicio de los síntomas (DIS). De 10 muestras de orina positivas, 2 de ellas fueron infecciones por Den-1 y el resto por Den-2, de estos últimos, en un caso se conoció el serotipo solo por la PCR de la orina y en 5 pacientes fueron confirmados por el serotipo Dengue 2, mediante aislamiento viral y/o PCR de suero. En las 10 muestras de orina positivos, las mismas fueron tomadas entre 1ro y 7mo DIS. Los resultados obtenidos en la presente investigación sugieren que la saliva y la orina pueden ser utilizadas como muestras para poder realizar diagnostico de Dengue, sobre todo en los casos donde se dificulta tomar una muestra de sangre como es el caso de niños recién nacidos, pacientes con síndromes hemorrágicos. Las muestras de saliva y orina son muestras relativamente fáciles de tomar, no se utilizan procedimientos invasivos, en el caso de la orina se puede colectar grandes cantidades, sin embargo es sumamente importante, seguir realizando este tipo de estudios para documentar un mayor número de casos. Así mismo se caracterizó molecularmente los aislamientos de virus dengue obtenido, mediante PCR-Restricción Enzimática. Ver anexos para ver las fotografías de las reacciones. En el presente proyecto se evaluaron otros protocolos de PCR que ampliaron la capacidad de diagnóstico y respuesta ante enfermedades eventualmente emergentes, como: RT-PCR/nPCR para la detección del virus del género Flavivirus, (entre los que se incluye los Virus del Nilo Occidental y Fiebre amarilla) Ver anexos Estos resultados y otros en análisis de los mismos, se están procesando en la preparación de una publicación para una revista de alto impacto científico.

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PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES: IV.1.1 Se evaluó la proteína no estructural NS1 del virus de Dengue, comparada

con la prueba estándar de oro como lo fue el cultivo viral de dengue que se realiza en células de mosquito de Aedes albopictus clone C6/36 fue satisfactoria, tomando en cuenta la sensibilidad del cultivo viral es del 50%, tuvo una concordancia del 65%.

IV.1.2 Cuando la evaluación de la proteína no estructural NS1 del virus de Dengue,

se comparó con una prueba más sensible como lo es RT- PCR en tiempo real de Virus Dengue, la sensibilidad y la especificidad fueron arriba del 90%, por lo que la detección de NS1 en una muestra de un paciente sospechoso de dengue, utilizando un estuche comercial, puede ser utilizada en los primeros 3 días de iniciados los síntomas, acompañada de una prueba de detección de anticuerpos de tipo IgM, para dar una diagnóstico completo al paciente.

IV.1.3 Se concluye que los resultados obtenidos en la presente investigación sugieren que la saliva y la orina pueden ser utilizadas como muestras clínicas para poder realizar diagnóstico de Dengue.

IV.1.4 Las muestras de saliva y orina son muestras relativamente fáciles de tomar,

no se utilizan procedimientos invasivos, en el caso de la orina se puede colectar grandes cantidades.

IV.1.5 las muestras de saliva y orina son muestras no invasivas, por lo cual pueden

ser especialmente útiles en el diagnóstico de dengue en niños pequeños y particularmente en casos con manifestaciones de Síndrome de Shock por Dengue, cuadro clínico frecuente en pacientes que desarrollan el dengue severo.

IV.1.6 Se demostró que el estuche de Genotek Inc (Canadá) resulta útil tanto para la

colecta como para la preservación de las muestras de saliva y orina en la detección de virus dengue mediante PCR en tiempo real y convencional.

IV.1.7 Se caracterizó molecularmente los aislamientos de virus dengue mediante la

metodología de PCR- Restricción Enzimática. IV.1.8 Se evaluaron los protocolos de detección del genero flavivirus que incluyeron

Virus del Dengue, Virus del Nilo Occidental y Virus de la Fiebre Amarilla, ampliando así la capacidad de diagnóstico molecular de la sección de virología de la Unidad Central de Referencia para la Vigilancia Epidemiológica del Laboratorio Nacional de Salud.

IV.1.9 El presente proyecto nos orientó a cambiar el algoritmo de trabajo en el

diagnostico y vigilancia laboratorial del virus dengue.

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IV.2 RECOMENDACIONES: IV.2.1 Se debe incorporar a los protocolos de vigilancia epidemiológica nacional la

metodología evaluada en el presente proyecto de investigación. IV.2.2 Cuando evaluamos la proteína no estructural NS1 como posible marcador

pronostico del desarrollo del dengue hemorrágico, recomendamos que debe realizarse un estudio de investigación exclusivo, en este tema, para darles seguimiento a los pacientes dentro de un hospital, e ir midiendo cinéticamente día a día el comportamiento de dicha proteína

IV.2.3 Para poder dar respuesta inmediata, eficaz y oportuna a una emergencia, de una epidemia nacional de dengue, como las que se presentaron en el marco de este proyecto, la vigilancia epidemiológica y laboratorial permanente y el monitoreo constante de la introducción de nuevos serotipos de dengue, sigue siendo una de las medidas más eficaces.

IV.2.5 Se recomienda la creación de Unidad de atención para Enfermedades

Infecciosas Emergentes en Guatemala, tales como Influenza, VIH, Tuberculosis y Dengue

IV.2.6 Es sumamente importante, seguir realizando este tipo de estudio, ya que los

mismos permiten evaluación de nueva metodologías e introducir cambios en el algoritmo de trabajo en el laboratorio, lo que redunda en el fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica de la enfermedad y en la prevención de la misma.

IV.2.7 El presente proyecto nos permito ampliar la capacidad diagnostica, del área de

virología del laboratorio nacional de salud y permitió dar respuesta al cumplimiento con el reglamento sanitario internacional, de la cual Guatemala como país firmo ante las naciones unidas.

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4.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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74. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Dengue Haemorrhagic Fever. Diagnosis, treatment, prevention and control. Geneva, 1997. p.1-84.

- 58 -

4.4 ANEXOS

4.4.1 ANEXO 1 HISTORIAL DE MUESTRAS DE DENGUE

DENGUE REPUBLICA DE GUATEMALA

1998 - 2007

AÑO 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

CASOS DENGUE CLASICO 4583 3617 10083 5005 7605 6873 6489 7142 3518 5886

DENGUE HEMORRAGICO

2 2 42 4 48 22 46 31 4 21

DEFUNCIONES 0 1 9 2 5 3 3 3 1 6

CONFIRMADOS SIGSA 0 0 0 323 283 1128 841 426 278 580

CONFIRMADOS LABORATORIO

2666 1052 993 1167 1018 1665 948 1339

TOTAL SIGSA 3280 7647 7193 6973 7124 3513 6487

- 59 -

4.4.2 ANEXO No. 2 ESTUCHE PARA RECOLECTA DE MUESTRAS DE SALIVA Y ORINA PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE

- 60 -

- 61 -

4.4.3 ANEXO No. 3 FICHA EPIDEMIOLÓGICA DENGUE

- 62 -

- 63 -

4.4.4 ANEXO No. 4

FODECYT 41-2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO

TEMPREANO, DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENGUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANC IA

EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD

Restricción Enzimática

PCR EN MUESTRA DE SALIVA

FODECYT 41-2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO

TEMPREANO, DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENGUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD

- 64 -

4.4.5 ANEXO 5 ARCHIVO FOTOGRÁFICO DE EQUIPO UTILIZA DO Y RESULTADOS DE LA REALIZACIÓN DEL PRESENTE

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN.

FODECYT 41-2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO TEMPREA NO,

DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENG UE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y C ONTROL DE

LA ENFERMEDAD

Fuente FODECYT 41-2008Área de PCR Tiempo Real

Licenciado Sergio Meneses procesando muestras para el diagnóstico de Dengue

FODECYT 41-2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO TEMPREANO,

DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENGUE PAR A EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL D E

LA ENFERMEDAD

Fuente: FODECYT 41-2008Área de cultivo viral

Técnica Silvia López procesando células C/636 para el cultivo de Dengue

- 65 -

FODECYT 41-2008 EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO TEMPREA NO, DETECCIÓN

DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENGUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL DE LA ENF ERMEDAD

FODECYT 41-2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNOSTICO TEMPRAN O,

DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONOSTICO DEL VIRUS DENGUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL

DE LA ENFERMEDAD

Fuente FODECYT 41-2008 -Área de Cultivo Celular

Licenciada Leticia Castillo observando células C/636 para el aislamiento viral de Dengue


Área de InmunodiagnósticoTécnica Amalia García procesando muestras

Para diagnóstico de Dengue Serológico

- 66 -

Fuente: FODECYT 41-2008 Equipo para RT-PCR

-

PCR Haemagglutination inhibition (HI)

FODECYT 41 -2008 EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNOSTICO TEMPRAN O,

DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONOSTICO DEL VIRUS DEN GUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL

DE LA ENFERMEDAD

FODECYT 41 -2008EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNOSTICO TEMPRAN O,

DETECCIÓN DEL GENOMA Y EL PRONOSTICO DEL VIRUS DEN GUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y C ONTROL DE LA

ENFERMEDAD

FODECYT 41-2008 Equipo para PCR en tiempo real

-

- 67 -

FODECYT 41-2008 EVALUACIÓN DE METODOLOGÍAS PARA DIAGNÓSTICO TEMPREA NO, DETECCIÓN

DEL GENOMA Y EL PRONÓSTICO DEL VIRUS DENGUE PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y CONTROL DE LA ENF ERMEDAD

Lecturas del equipo de PCR en tiempo real.


- 68 -

PARTE V 5.1 INFORME FINANCIERO

AD-R-0013

DÉCIMA NOVENA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

Nombre del Proyecto:

Evaluación de metodologías para diagnóstico temprano, detección del genoma y el pronóstico del Virus Dengue para el fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica y control de la enfermedad.

Numero del Proyecto: 41-2008

Investigador Principal: LICDA. LETICIA CASTILLO SIGNOR

Monto Autorizado: Q157,437.50

Plazo en meses 12 MESES

Fecha de Inicio y Finalización: 03/11/2008 al 31/10/2009 PRÓRROGA AL 31/01/2010

Grupo

Renglón Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Menos (-) Mas (+) Ejecutado

Pendiente de Ejecutar

0 Servicios personales

35 Retribuciones a destajo Q 1,212.50 Q 1,212.50 Q -

1 Servicios no personales

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad Q 47,625.00 Q 1,212.50 Q 23,250.00 Q 23,162.50

181

Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) Q 8,000.00 Q 8,000.00

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 5,000.00 Q 3,048.70 Q 1,951.30

131 Viáticos en el exterior Q10,000.00 Q 8,257.40 Q 1,742.60

133 Viáticos en el interior Q 4,000.00 Q 2,880.00 Q 1,120.00

141 Transporte de personas Q 4,500.00 Q 559.50 Q 3,418.22 Q 522.28

142 Fletes Q 312.00 Q 312.00 Q -

185 Servicios de capacitación Q 5,000.00 Q 5,000.00

189 Otros estudios y/o servicios Q 10,000.00 Q10,000.00 Q -

195 Impuestos, derechos y tasas Q 247.50 Q 247.50 Q -

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

241 Papel de escritorio Q 1,000.00 Q 159.50 Q 840.50

244 Productos de artes gráficas Q 288.00 Q 288.00 Q -

245 Libros, revistas y periódicos Q 3,000.00 Q 335.20 Q 2,664.80

261 Elementos y compuestos químicos Q 50,000.00 Q 375.00 Q 13,640.00 Q 35,985.00

262 Combustibles y Lubricantes Q 5,000.00 Q 869.70 Q 4,130.30

266 Productos medicinales y farmacéuticos Q 375.00 Q 375.00 Q -

267 Tintes, pinturas y colorantes Q 706.00 Q 706.00 Q -

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc Q 89.90 Q 89.90 Q -

- 69 -

291 Útiles de oficina Q 800.00 Q 607.40 Q 192.60

295 Útiles menores, médico-quirúrgicos y de laboratorio Q 1,500.00 Q 720.52 Q 779.48

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES Q - Q -

GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q 14,312.50 Q 14,312.50 Q -

Q 157,437.50 Q15,530.90 Q15,530.90 Q 71,346.14 Q 86,091.36

MONTO AUTORIZADO Q 157,437.50 Disponibilidad Q 86,091.36

(-) EJECUTADO Q 71,346.14

SUBTOTAL Q 86,091.36

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR Q 86,091.36

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