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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA FONACYT-

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA,

FACULTAD DE INGENIERIA

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

EVALUACION DE LA PRODUCCION MICROBIANA DE ACEITES A PARTIR

DE LA GLICERINA O GLICEROL PROVENIENTE DE LA PRODUCCION DE

BIODIESEL

PROYECTO FODECYT 053-2009

Ing. Oscar Armando Maldonado Ordoñez

Investigador Principal

GUATEMALA, MARZO DEL 2013

2

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo

Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de

Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –

CONCYT.

3

Equipo de Trabajo:

Ing. Oscar Armando Maldonado Ordóñez, M.C Investigador Principal

Ingeniero Químico graduado en la Universidad de San Carlos de Guatemala con una

Maestría en Ingeniería Química del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de

Monterrey, Nuevo León, México.

Ing. Gamaliel Zambrano Ruano, M. Sc Investigador Asociado

Ingeniero Químico graduado de la Universidad del Valle de Guatemala con una Maestría

en Ciencias Farmacéuticas (Gestión y Liderazgo Estratégico) de la Universidad del Valle

de Guatemala

Lic. Luis Roberto de León Fajardo, M.Sc. Investigador Asociado

Químico Biólogo graduad en la Universidad de San Carlos de Guatemala con una Maestría

en de la Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin

Ing. José Andrés Hernández Gaitán. Asistente

Ingeniero Químico graduado de la Universidad del Valle de Guatemala

Ing. Carlos Rólz Asturias, M.Sc. Consultor ad honorem

Ingeniero Químico graduado en la Universidad de San Carlos de Guatemala, con Maestría

en Ingeniería Química de la Universidad de California.

4

INDICE

PARTE I

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………….. 15

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………….…... 17

Justificación del trabajo de investigación………………….…………. 18

III. OBJETIVOS…………………………………………………………. 19

A. General……………………………………………………………. 19

B. Específicos………………………………………………………… 19

IV. METODOLOGIA……………………………………………………. 20

A. Localización…….. ………………………………………………. 20

B. Las Variables…………………………………………………….. 20

C. Estrategia metodológica…………………………………….…… 22

D. Población y muestra……………………………………………… 22

E. El método…………………………………..……………………. 22

F. La Técnica Estadística……………………………………………. 26

1. Prueba o Test Q…………………………….………………… 26

2. Pruebas en frasco de cultivo………………………………… 29

3. Pruebas en reactor……………………………………………. 30

4. Costos………………………………………………………… 30

PARTE II

A. Glicerina como subproducto de la producción de biodiesel………………….. 32

B. Características y propiedades de la glicerina…………………………………. 33

C. Alternativas del glicerol o glicerina………………………………..………….. 34

D. Tratamiento de la glicerina proveniente de la producción de biodiesel……… 36

E. Levadura para la producción de aceite………………………………………… 36

F. Medios de cultivo……………………………………………………………… 38

G. Proceso de fermentación………………………………………………………. 40

H. Tipo de fermentadores………………………………………………………… 44

I. Rendimiento de un procesos microbiológico………………………………....... 45

J. Fuentes de aceite para producción de biodiesel……………………………….. 46

K. Perspectiva de los aceites microbianos para la producción de biodiesel…….. 47

L. Extracción de aceite (Método Soxhlet)……………………………………..... 48

PARTE III (Resultados y Discusión)

3.1 RESULTADOS……………………………………………………..…. 51

3.1.1 Prueba No.1……………………………………………………… 61

3.1.2 Prueba No.2……………………………………………………… 67

3.1.2.1 Extracción de aceites con solventes……………………. 77

3.1.2.2 Resultados de peso seco y glucosa…………………..… 86

3.1.2.3 Actividades sobre inhibición crecimiento de levadura…. 95

5

3.1.2.4 Inhibición del crecimiento de levadura…………….. 96

3.1.2.5 Fermentación 1…………………………………….. 98

3.1.2.6 Fermentación 2……………………………………… 101

3.2 DISCUSION……………………………………………………….. 104

A. Cultivo de cuatro cepas de levadura (LS, YL, RG y RT) en caldo.

Sabouraud 2%...................................................................................... 104

B. Cultivo de dos levaduras (LS yRT) en caldo Sabouraud 2% y medio

simulado GUSP……………………………………………………… 104

C. Crecimineto de dos levaduras (LS y YL en caldo Sabouraud 2%.... 105

D. Gráficas de dispersión de los resultados obtenidos de los crecimientosen

frascos utilizando caldo Sabouraud 2%................................................ 105

E. Diagramas de cajas de los resultado obtenidos de los crecimientosen

frascos utilizando caldo Sabouraud 2%................................................. 107

F. Crecimiento de Lipomyces Starkeyi en un reactor de 5 L………. … 108

G. Crecimiento de LS en caldos simulados /GUSP y GBIO)……...... 109

H. Balance de masa y energía………………………………………... 110

PARTE IV

4.1 Conclusiones………………………………………………………………..... 112

4.2 Recomendaciones…………………………………..………………..…… 114

4.3 Bibliografía…………………………………..…………………………… 115

4.4 Anexos…………………………………………………………………… 116

6

Indice de Tablas

Tabla No1: Caracterización de las cepas de levadura (CBS y NCYC)…………… 21

Tabla No.2: Valores críticos para el cociente de rechazo, Qcrit……………..…… 26

Tabla No.3: Especificación del equipo utilizada en pruebas a nivel laboratorio… 27

Tabla No.4: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)………… 29

Tabla No.5: Datos generales de la glicerina comercial……..……………………. 34

Tabla No.6: Propiedades físicas de la glicerina comercial….…………………… 34

Tabla No.7: Producción de aceites de diferentes levaduras……………….…….. 37

Tabla No.8: Rendimiento de aceite y biomasa de diferentes levaduras………… 37

Tabla No.9: Parámetros de crecimiento y contenido de lípidos de Lipomyces

Starkei utilizando glucosa en frascos agitados……............................................... 37

Tabla No.10: Composición de ácidos grasos producidos por diferentes levaduras. 38

Tabla No.11: Composición del medio de caldo Sabouraud……………………… 40

Tabla No.12: Principales materias primas para la elaboración de biodiesel……… 47

Tabla No.13: Abreviaturas de nombre de cepas de levaduras y medios de cultivo. 51

Tabla No.14: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica

(YL), Rhodotorula glutinis (RG) y Rhodosporidium toruloides (RS) en caldo

Sabouraud 2%.…………………………………………………………………….. 55

Tabla No.15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Rhodosporidium

toruloides (RT) en caldo Sabouraud “% y glicerina USP……….……………….. 55

Tabla No.16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia lipolytica (YL)

en caldo Sabouraud 2% …………………………………………………………. 56

Tabla No.17: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L

utilizando caldo Sabouraud 2%.............................................................................. 61

Tabla No.18: Costo total de la producción de aceites microbianos con Lipomuces

starkeyi en un fermentador de 5 L utilizando Caldo Sabouraud como medio de

cultivo…………………………………………………………………………… 64

Tabla No.19: Código de equipo presentado de balance de masa y energía………. 65

Tabla No.20: Rendimiento biomasa/substrato (Y s/x) en el crecimiento de cuatro

tipos de levaduras en caldo Sabouraud………………………………………… 67

Tabla No.21: Valores promedio de los resultados anteriores…………………… 68

Tabla No.22: Rendimiento de aceite microbiano de cuatro levaduras con

crecimiento en caldo de agar Sabouraud………………....................................... 68

Tabla No.23: Rendimiento de biomasa/substrato de las levaduras Lipomyces

starkeyi y Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina

USP ……………………………………………………………………………… 70

Tabla No.24: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces starkeyi y

Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina USP…… 71

Tabla No.25: Rendimiento biomasa/substrato (Y x/s) para las levaduras Lipomyces

starkeyi y Yarrowia Lipolytica en caldo Sabouraud……………………………… 73

Tabla No.26: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces starkeyi y Yarrowia

lipolytica en caldo Sabouraud………………………………………………… 73

Tabla No.27: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador

utilizando caldo Sabouraud 2%………………………………………………… 87

Tabla No.28: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en medio

simulado con glicerina USP………….……………………………………….…. 92

7

Tabla No.29: Resultados del cultivo de la levadura Lipomyces starkeyi en medio

simulado con glicerina proveniente de la producción de dibodiesel……………… 92

Tabla No. 30: Diseño experimental de las pruebas de acondicionamiento en

frascos agitados de la levadura Lipomyces starkeyi……………………………… 95

Tabla No. 31: Peso seco y Biomasa total obtenida……………………………...... 99


utilizando caldo Sabouraud 2%………………………………………………… 103

8

Índice de Diagramas

Diagrama No.1: Procedimiento experimental…………..………………………… 23

Diagrama No.2: Procedimiento de siembra de levadura en frascos de cultivo…… 24

Diagrama No. 3: Procedimiento de siembra de levadura en fermentador 5 litros… 25

9

Índice de Fotografías

Fotografía No. 1: Levadura Yarrowia Lipolytica………………………………… 52

Fotografía No. 2: Levadura Rhodoturula glutinis……………………………… 53

Fotografía No. 3: Cultivo de Lipomyces starkeyi y Rodosporidium toruloides a

144 horas de incubación………………………………………………………… 69

Fotografía No. 4: Molienda y extracción de aceite de las levaduras Yarrowia

lipolytica y Lipomyces starkeyi………………………………………………… 72

Fotografía No. 5: Levadura Yarrowia lipolytica……………………………….. 74

Fotografía No. 6: Germinación levadura Yarrowia lipolytica…………………. 74

Fotografía No. 7: Crecimiento de hifas en Yarrowia Lypolitca………………… 75

Fotografía No. 8: Sistema de extracción por solvente Soxhlet………………… 77

Fotografía No. 9: Aceite microbiano de levadura……………………………… 78

Fotografía No. 10: Vista del aceite microbiano recuperado…………………… 78

Fotografía No. 11: Crecimineto de biomasa para la levadura Lipomyces starkeyi.. 79

Fotografía No. 12: Yarrowia lipolytica crecimiento de masa…………………… 79

Fotografía No. 13: Rodosporidium torulaides (RT)…………………………….. 80

Fotografía No. 14: Rhodotorula glutinis………………………………………… 80

Fotografía No. 15: Crecimiento de Yarrowia Lipolytica bueno en ambos medios.. 81

Fotografía No. 16: Crecimiento para Lipomyces starkeyi fue notable en ambos

Medios…………………………………………………………………………… 81

Fotografía No. 17: Cultivo de Lipomyces starkeyi muestra contaminación en el

medio de glicerina………………………………………………………………. 82

Fotografía No.18: Crecimiento de Rodotorula glutinis es bajo en ambos medios.. 82

Fotografía No.19: Crecimiento de ambos medios fue bueno para Yarrowia

lipolytica…………………………………………………………………………. 83

Fotografía No.20: Crecimiento para Rodotorula glutinis es moderada en ambos.. 83

Fotografía No. 21: Crecimiento de Rhodosporidium toruloides es bajo

en ambos medios………………………………………………………………….. 84

Fotografía No. 22: Crecimiento de Lipomyces starkeyi es moderado en ambos

Medos……………………………………………………………………………. 84

Fotografía No. 23: Cultivo de Rodotorula glutinis mostró contaminación en

Sabouraud………………………………………………………………………... 85

Fotografía No. 24: Crecimiento de Yarrowia lipolytica es bueno en ambos

medios…………………………………………………………………………… 85

Fotografía No. 25: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador

de 5 L con caldo Sabouraud al 2% glucosa……………………………………… 91

Fotografía No. 26: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces starkeyi

utilizando en el medio glicerina USP……………………………………………. 93

Fotografía No. 27: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces starkeyi

utilizando en el medio glicerina proveniente de la producción de biodiesel…… 94

Fotografía No. 28: Medio de cultivo y agua destilada para esterilizar el

Autoclave………………………………………………………………………. 98

Fotografía No. 29: Fermentador de 5 L para esterilización del medio de cultivo

............................................................................................................................. 99

Fotografía No. 30: Biomasa obtenida de la F1 después de 24 horas de

secado a 40 °C…………………………………………………………………..… 100

10

Fotografía No. 31: Transesterificación in situ de la biomasa resultante de la F1… 100

Fotografía No. 32: Extracción de aceite del solvente (hexano) agregando la

biomasa en el balón junto con el solvente……………………………………… 101

Fotografía No. 33: Filtración de solución……………………………………… 102

Fotografía No. 34: Líquido extraído de biomasa……………………………….. 102

Índice de Figuras

Figura No. 1: Reacción de transesterificación para la producción de biodiesel.… 32

Figura No. 2: Estructura del glicerol……………………………………………… 33

Figura No. 3: Esquema general de un proceso de fermentación………………… 43

Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y energía de la

producción de aceite microbianos a escala laboratorio………………………….. 66

11

Índice de Gráficas

Gráfica No.1: Dispersión de biomasa (g/L) del crecimiento en frascos de levadura

YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%………………… 56

Gráfica No.2: Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL (1),

LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%…………………………. 57

Gráfica No.3: Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en

frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud

2%………………………………………………………………………………… 57

Gráfica No. 4: Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa

levadura) del crecimiento en frascos de la levadura YL (1), LS (2), RT (3) y

RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%......……………………………………… 58

Gráfica No. 5:Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa glucosa) del

crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando

caldo Sabouraud 2%. ……………………………………………….…………….. 58

Gráfica No.6: Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo

utilizando caldo Sabouraud…..…………………………………………………… 59

Imagen No.7: Porcentaje de rendimiento de lípidos (masa lípidos/masa levadura)

obtenido del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud

2%………………………………………………………………………………… 59

Gráfica No.8: Porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa glucosa) obtenidos del .

crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud 2%………………. 60

Gráfica No.9: Crecimiento celular del Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un

fermentador………………………………………………………………………. 62

Gráfica No.10: porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el

crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L

en caldo Sabouraud 2%.......................................................................................... 62

Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el

crecimientoen un fermentador de 5 L durante 144 horas en caldo Sabouraud… 63

Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces

starkeyi durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo

Sabouraud2%......................................................................................................... 63

Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces stakeyi durante 144

horas en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%.......................................... 64

Gráfica No. 14: Cultivo de Yarrowia Lupolitica………………………………… 76

Gráfica No. 15: Crecimiento celular de levadura Lipomyces starkeyi en un

fermentador de 5 L……………………………………………………………….. 88

Gráfica No. 16: Rendimiento de biomasa obtenida durante el cultivo de

levaduras Lipomyces starkeyi en un fermentador del 5L en caldo sabouraud 2%.. 88

Gráfica No. 17: Concentración de glucosa durante el cultivo de levadura

Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 L Sabouraud……………………… 89

Gráfica No. 18: pH durante el cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un

Reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%........................................................... 90

12

PARTE I

13

RESUMEN

El siguiente informe presenta los resultados y conclusiones obtenidos, a partir de la

investigación realizada en el proyecto “Evaluación de la Producción Microbiana de Aceite

a partir de la Glicerina o Glicerol proveniente de la Producción de Biodiesel” FODECYT

053-2009. El objetivo principal del proyecto fue desarrollar tecnología local para producción

de aceites de origen microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción

de biodiesel, vía fermentación.

Se seleccionaron diferentes microorganismos (levaduras) que presentaran altos contenidos

de aceite. Las cepas seleccionadas fueron cuatro: Yarrowia lypolytica, Rhodosporidium

toruloides, Rhodotorula glutinis var glutinis y Lipomyces Starkey obtenidas de el

Centraalbureau voor Schimmelcultures de Holanda.

Las cepas se transportaron en viales sellados al vacío por lo cual fue necesario su re-

hidratación con una solución salina y posteriormente fueron traspasadas a un medio de

cultivo con agar PDA é incubadas a 30°C durante 24-48 horas para estudiar su capacidad

de adaptación a las nuevas condiciones de cultivo. Una vez adaptadas se almacenaron para

análisis y pruebas posteriores.

Se realizó la reproducción de todas las cepas en medio de cultivo con agar PDA en frascos

agitados de 250 mL, a la vez se modificaron los medios por glicerina ultrapura y glicerina

cruda obtenida de la producción de biodiesel. Cabe mencionar que después de diferentes

pruebas con glicerina se decidió realizar una adaptación previa de la levadura a la glicerina,

haciéndolas crecer en diferentes porcentajes de glicerina. De menor % de glicerina a mayor

%. Se realizaron pruebas piloto en un fermentador de 5L marca New Brunswick utilizando

las cepas de Yarrowia lypolytica debido a su alta producción de biomasa hasta un 37.8 % y

Lipomyces Starkey por haber presentado los rendimientos de aceite más altos, 29.64 % en

las pruebas de laboratorio.

14

ABSTRACT

The following report presents the results and conclusions obtained from the research in the

project "Evaluation of Microbial Oil Production from Glycerin or Glycerol from Biodiesel

Production" FODECYT 053-2009. The main objective of the project was to develop local

technology to produce microbial oil from glycerin (glycerol), obtained from biodiesel

production, via fermentation.

Different microorganisms (yeast) were selected, based on its content of oil. The four

selected strains were: Yarrowia lypolytica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula

glutinis var glutinis and Lipomyces Starkey obtained from the Centraalbureau voor

Schimmelcultures Netherlands.

The strains were transported in sealed vials under vacuum which create the need of

adapting the different yeasts before further tests or analysis. Once in Guatemala they were

transferred into a PDA agar media and incubated at 30 °C for 24-48 hours in order to study

their adaptation to Guatemala conditions. Once adapted stored for subsequent analysis and

testing.

Reproduction of all strains was performed in different medias. PDA agar, ultrapure glycerol

and raw glycerol were used as media to grow the different strains. 250 mL shake flasks

where used while the media were modified by ultrapure glycerol and crude glycerol

obtained from the biodiesel production. It is noteworthy that after various tests with

glycerin was decided to t pre-adaptation of yeast to glycerin, by growing in different

percentages of glycerol. Low% glycerin at higher%. Pilot tests were conducted in a New

Brunswick 5L fermenter using Lipomyces Starkey yeast due to its higher oil yields, 29.64%

in laboratory fermentation.

15

I. INTRODUCCIÓN

Actualmente la problemática de contaminación ambiental asociada al uso de los

derivados del petróleo aumenta; por lo tanto, en los últimos años se ha intensificado la

búsqueda y desarrollo de nuevas fuentes de combustibles de tipo renovable que permitan

reemplazarlos de manera gradual y dar cumplimiento a regulaciones ambientales que

aplican en la mayoría de países del mundo.

Uno de los biocombustible más utilizados actualmente es el biodiesel, se puede obtener

partiendo de materias primas como aceites vegetales, grasas animales o aceites y grasas de

frituras recicladas. La producción de biodiesel genera un nuevo problema: se obtiene

glicerina como subproducto. La glicerina obtenida como subproducto de la producción de

biodiesel, resulta ser un desecho contaminante si no se trata adecuadamente. Está puede

contener trazas de metanol, hidróxido de sodio o potasio o aceite que pudo no haber

reaccionado. De la producción de biodiesel se genera entre un 10% a 20 % en peso del

biodiesel elaborado. La glicerina obtenida de este proceso puede ser refinada para obtener

un producto con valor agregado, sin embargo aún no es económicamente viable lograr

obtener la glicerina comercializable, debido a los elevados costos del proceso, lo cual afecta

directamente los costos del biodiesel.

Una de las opciones de tratamiento de glicerina investigada en el siguiente proyecto de

investigación fue la conversión biológica de la misma, por medio de microorganismo

lipolíticos, en un “aceite microbiano” que tiene características similares a los aceites

vegetales, para usar posteriormente este aceite como materia prima en la producción de

biodiesel.

El objetivo general de esta investigación fue desarrollar tecnología local para producción

de aceites de origen microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción

de biodiesel, vía fermentación. Encontrando de esta manera una alternativa a la disposición

final de la glicerina.

Para realizar las fermentaciones a escala laboratorio, se utilizaron frascos agitados de

250 mL y una incubadora a una temperatura de 30 °C. Se utilizó un fermentador marca

New Brunswick con un recipiente de 5 L. El fermentador cuenta con un sistema de

enfriamiento el cual mantiene la temperatura a 30 °C, se introdujo un flujo de 5 L/min de

aire filtrado y se cuenta con un sistema de agitación, manteniéndose a 180

revoluciones/min (rpm).

Se seleccionaron cuatro diferentes cepas de levaduras: Yarrowia lypolytica,

Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis var glutinis y Lipomyces Starkey

obtenidas de el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Holanda.

16

Se utilizaron diferentes sustratos para el crecimiento de las mismas y de esta forma

poder analizar su crecimiento en los mismos. Los sustratos utilizados fueron: glucosa,

glicerina ultra pura y glicerina cruda proveniente de la producción de biodiesel. Se pudo

observar que las levaduras con mayor contenido de biomasa y mayor adaptabilidad fueron

las cepas Yarrowia lypolytica y Lipomyces Starkey por lo que se realizaron fermentaciones

de mayor escala con estas cepas.

A la vez se realizó un acondicionamiento de las dos cepas seleccionadas donde se

inicio con una proporción de 80 % Sabouraud 2% y 20 % glicerina ultra pura

incrementando en 20 % la glicerina ultra pura hasta llegar a un 100 % y disminuyendo el

Sabouraud 2 % hasta llegar a 0 %. Este acondicionamiento permitió a las cepas una mejor

adaptación al sustrato de glicerina.

Por último se procedió a realizar la extracción del aceite de las cepas seleccionadas a

través de extracción por solventes de la biomasa producida de las fermentaciones

realizadas. Es importante mencionar que para poder realizar las extracciones era necesario

una cantidad mínima de biomasa, al menos 5 gramos de biomasa seca lo cual era difícil de

obtener en las fermentaciones de 250 mL. La mayoría de las extracciones se realizaron de

las fermentaciones de 5 L ya que se obtenía una cantidad de biomasa suficiente para las

extracciones. Se pudo observar que la cepa con mayor cantidad de aceite fue la Lipomyces

Starkey con un 29.64 % de rendimiento de aceite.

17

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)

Se ha iniciado la producción de biocombustibles en Guatemala, especialmente de

los denominados de primera generación, o sea biocombustibles líquidos tales como:

Bioetanol, proveniente de la fermentación de derivados de la caña de azúcar y

principalmente de las melazas producidas en los ingenios azucareros.

Otro de los biocombustibles producidos es el biodiesel, el cual es una mezcla de

ésteres etílicos o metílicos derivados de la reacción entre tri-glicéridos y un alcohol (etílico

o metílico) con ayuda de un catalítico como hidróxido de sodio (soda cáustica) o de potasio

(potasa cáustica).

Aunque no existe una ley que regule la producción y consumo de dichos

biocombustibles, la iniciativa privada produce actualmente bioetanol que es un combustible

líquido al cual se le ha eliminado completamente el agua y por consiguiente puede

mezclarse con gasolina como aditivo oxigenante de la misma en proporciones de 5% (E5) y

sustituyendo a otros aditivos oxigenantes como el MTBE y otros éteres que se ha

demostrado su toxicidad para el organismo humano.

La producción de bioetanol no se consume localmente y todo el combustible

producido en 4 plantas se exporta principalmente a Europa.

El biodiesel se ha producido en varias plantas basado en la producción agrícola de

aceites vegetales y principalmente de la denominada Jatropha curcas o piñón. La

producción de biodiesel de ésta planta no compite con la producción de alimentos como la

palma africana, soya y otras semillas oleoginosas.

El problema principal ha sido el dominio del sistema de producción agrícola el cual

hasta el momento no se ha logrado exitosamente, teniendo que reducir la capacidad de

producción de las plantas o menos de 4,000 galones de biodiesel/día.

Una alternativa a este problema es el reciclado de aceites vegetales y algunas de las

plantas de producción de biodiesel en Guatemala están utilizando aceites vegetales

reciclados de cafeterías y restaurantes. Lo anterior asegura un abastecimiento constante

pero de pequeñas cantidades.

El biodiesel se ha utilizado a nivel de mezclas con aceite diesel No. 2 derivado del

petróleo en proporciones principalmente de 20% en vehículos tipo pick-up así como en

calderas de vapor y equipo agrícola a nivel de finca.

No se ha utilizado la glicerina, subproducto de las transesterificación de los ácidos

grasos porque no se ha encontrado un buen uso. Algunas empresas “queman” la glicerina

18

en sus calderas con el consiguiente riesgo de producir mayores contaminantes para la

atmósfera y disminuir el valor calorífico de su combustible.

Justificación del trabajo de investigación

Debido a la problemática del cambio climático, investigadores de todo el mundo se han

preocupado por generar combustibles alternativos, que al ser comparados con los

combustibles fósiles, contaminan en menor proporción.

Uno de estos combustibles es el biodiesel, que posee las mismas propiedades del

combustible diesel. El biodiesel se puede producir partiendo de materias primas agrícolas,

aceites o grasas de fritura usados y metanol o etanol. Su producción ha aumentado cada

año; por lo tanto, también la generación de sus subproductos. El subproducto que se genera

en mayor cantidad es la glicerina. La glicerina o glicerol es un compuesto químico que en

su estado de purificación adecuado tiene varios usos en la industria química, alimenticia,

cosmética, farmacia, entre otras. Pero en el caso de la glicerina proveniente de la

producción de biodiesel, ésta no cuenta con las características establecidas para ser

utilizada en las industrias antes mencionadas. El costo de purificación es alto; por lo tanto,

en los últimos años se han buscado opciones para su uso, como generación de otros

compuestos orgánicos con mayor beneficio económico. El esfuerzo por aprovechar al

máximo los subproductos del proceso es para aumentar la viabilidad de la producción de

biodiesel.

La producción de aceites microbianos a partir de levaduras, cuyo medio de crecimiento

contenga glicerina proveniente de la producción de biodiesel como fuente de carbono y

energía, puede ser una alternativa más para su uso. Además, el aceite microbiano puede ser

un complemento de las distintas alternativas que hoy se presentan en el mercado debido a

su parecido, por su porcentaje y composición de ácidos grasos, a muchos aceites vegetales.

19

III. OBJETIVOS

A. General

1. Evaluar la producción microbiana de aceites a partir de la glicerina o glicerol

proveniente de la producción de biodiesel.

B. Específicos

1. Desarrollar y evaluar tecnología local para producción de aceites de origen

microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción de

biodiesel, vía fermentación.

2. Evaluar la bioconversión de la glicerina o glicerol como fuente principal de

carbono en cultivo sumergido de levadura y bacterias (Candida Lipolytica,

Yarrowia Lipolytica, Rodotorula), a nivel de laboratorio.

3. Evaluar y escalar a nivel de planta piloto los resultados de laboratorio

obtenidos y caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los mismos.

4. Realizar la evaluación económica financiera del proces.

20

IV. METODOLOGIA

A. Localización

Todo el trabajo experimental se realizó en el Campus Central de la Universidad del

Valle de Guatemala y principalmente en los Laboratorios de Ingeniería Bioquímica del

Instituto de Investigaciones, Edificio II-1, Laboratorio de Análisis Avanzado Edificio II-1 y

del Laboratorio de Operaciones Unitarias, Edificio E.

Las coordenadas geográficas del Laboratorio de Operaciones Unitarias son

N 14° 36’ 15.85” & W 90° 29’ 22.56”

Las coordenadas geográficas del Laboratorio de Ingeniería Bioquímica son

N 14° 36’ 13.49” & W 90° 29’ 20.78”

B. Las Variables

A continuación se listan las principales variables tanto dependientes como

independientes consideradas en el desarrollo del trabajo experimental

1. Variables dependientes

Las variables dependientes del trabajo experimental son principalmente:

Rendimiento o conversión de biomasa

Rendimiento o conversión de aceite microbiano

Composición de aceite microbiano

2. Variables independientes:

Las variables independientes del trabajo experimental son principalmente:

Cepa de levadura seleccionada teniendo cuatro posibilidades: Yarrowia

Lipolytica, Lipomyces starkeyi, Rodothorula glutinis var glutinis,

Rhodosporidium toruloides

pH del medio de cultivo.

Temperatura de fermentación

Composición del medio de cultivo

21

Tabla No. 1: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)

Nombre Rhodosporidium

toruloides

Rhodotorula

glutinis

Lipomyces

starkeyi

Yarrowia

lipolytica

Estado Rhodotorula

glutinis

var.rufusa

--- ---

Estado asexual --- --- --- Candida lipolytica

var. lipolytica

Sinónimos Mycotorula

rubescens,

Rhodotorula

glutinis

var.rubescens,

Rhodoturula

gracilis,

Rhodotorula

koishikawensis,

Rhodotorula

longissima,

Rhodoturula

rubescens,

Torula

koishikawensis,

Blastodendrion

aereus,

Cryptococcus

bronchialis,

Cryptococcus

glutinis,

Mycotorula

roseo-corallina,

Rhodotorula

bronchialis,

Rhodotorula

Glutinis var.

Lusitánica,

torulopsis saitoi,

Torulopsis

roseus

--- Azymoprocandida

lipolytica, candida

deformans,

Candida lipolytica

var.

Thermotolerans,

Candida olea,

Candida oleophila,

Candida

paralipolytica,

Candidad

petrophilum,

Candida

Pseudolipolytica,

Endomycopsis

lipolytica,

Número CBS CBS14 CBS20,

CBS108

CBS1807 CBS 2076

Número NCYC NCYC021 NCYC2666 NCYC2710 NCYC025

Equivalente a otra

colección

ATCC10788,

ATCC15385,

CCRC20306,

DBVPG6740,

IAM13469,

IFO0559

ATCC2527,

CCRC21418,

DBVPG6081,

IAM14113,

IFO1125,

VKMY332

ATCC58680,

CRRC21522,

DBVPG6193,

DBVPG6776,

DSM70295

DBVPG6207

Tipo de célula Células en

ciernes

Células en

ciernes

Células en ciernes filamentos

Medio de cultivo Base

nitrogenada +

25nM-D-

glucosa

Base

nitrogenada +

25nM-D-

glucosa

Base nitrogenada

+ 25nM-D-

glucosa

Agar papa glucosa

Condiciones de

crecimiento

--- 20h a

A640=1.05

~20h a A640=0.51 9 días

Temperatura de

incubación

25ºC 25ºC 25ºC 20ºC

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del

Valle de Guatemala

22

3. Indicadores

Los principales indicadores de un buen trabajo experimental son

Contaminación del medio de cultivo, es decir, que no haya crecimiento

de bacterias y levaduras indeseables además del inoculo

Variaciones del pH del medio hacia valores de basicidad ( lo cual indica

contaminación bacteriana)

C. Estrategia metodológica

La estrategia metodológica consistió principalmente en la obtención de

muestras en todos los pasos intermedios desde el traspaso en tubos de agar

hasta el fermentador piloto.

Estas muestras serán observadas al microscopio así como visualmente para

determinar los cambios que puedan resultar del proceso de fermentación.

Las muestras para determinaciones físico-químicas serán obtenidas del

medio de cultivo en diferentes tiempos tomados en consideración desde el

inicio de la fermentación.

D. Población y muestra

La población principal en la experimentación son las levaduras en los tubos

de agar, cajas de petri, frascos agitados y fermentador piloto durante todo el

proceso de traspaso de un medio a otro.

La muestra definida en cada uno de los pasos es para observación

microscópica y para determinaciones físico-químicas principalmente de pH,

azúcares totales y reductores, glicerina o glicerol, aceites microbianos en

general.

E. El método

A. Pruebas en frascos de cultivo

Tiene como objetivo seleccionar la levadura que produce la mayor cantidad de

aceite. Inicialmente se realizaron pruebas de crecimiento en caldo Sabouraud para

obtener la cantidad de aceite formado de cada levadura. A continuación se

seleccionaron dos levaduras para realizar crecimientos en caldo Sabouraud 2% de

glucosa y un medio simulado formado por peptona, triptona y glicerina USP. Por último

se realizó crecimiento de la levadura que mayor cantidad de aceite formaba en caldo

simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de la producción de biodiesel.

23

Las cepas utilizadas fueron: Rhodosporidium toruloides (CBS14), Rhodotorula

glutinis var glutinis (CBS322), Lipomyces Starkeyi (CBS1807) y Yarrowia lipolytica

(CBS2075).

A continuación se presenta la caracterización de las cepas de levaduras utilizadas;

información proporcionada por el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) y el

National Collection of Yeast Cultures (NCYC).

Condiciones de

crecimiento

--- 20h a

A640=1.05

~20h a A640=0.51 9 días

Temperatura de

incubación


Diagrama No. 1: Procedimiento experimental

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,

Universidad del Valle de Guatemala

Costo a nivel laboratorio fermentación 5 L

Fermentación Extracción de aceite

Balance de masa y energía del sistema

Fermentación Extracción de aceite

Fermentación

Crecimiento de levadura mayor productora de aceite

Crecimiento levadura mayor productora de aceite

Caldo simulado con glicerina USP Caldo simulado con glicerina proveniente de la

producción de biodiesel

Crecimiento levaduras mayor productoras de aceite

Caldo Sabouraud Caldo simulado con glicerina USP

Selección de levadura Siembra en frascos con caldo Sabouraud 2% glucosa

Yarrowia Lipolytica Rhodotorula glutinis

Rhodosporidium toruloides Lipomyces Starkeyi

INICIO

Preparar caldo de cultivo

• Sabouraud:

• 30g/L

• Simulación:

• 5g/L peptona de carne

• 5 g/L peptona de caseína (triptona)

• 20 g/L glicerina USP o proveniente de biodiesel

Llenado

•Volumen: 125mL

Autoclave

•Temperatura: 115ºC

•Tiempo: 15 min

Incubación


•Tiempo: 144 horas

Final de incubación

•Peso seco

•Prueba de azúcares

• pH

Centrifugación

•Velocidad: 5000 rpm


•Tiempo: 5 min

Secado


•Tiempo: 48 horas

Extracción de aceite por solventes

•Volumen solvente: 200 mL

•Solvente: hexano


Recuperación solvente


FIN

Diagrama No. 2: Procedimiento de siembra de levadura en frascos de cultivo.

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad

del Valle de Guatemala

25

INICIO

Preparación de inóculo

•Volumen: 10% volumen total

•Tiempo: 48 horas

Preparar caldo de cultivo

•Sabouraud 2% glucosa

• 5g/L peptona de carne

• 5 g/L peptona de caseína

• 20 g/L proveniente de biodiesel

Vertir en fermentador

Esterilización en autoclave


•Tiempo: 15 min

Fermentación

•Duración :144 horas

•Aire: 1.2 L/min

Final de fermentación

•Peso seco

•Prueba de azúcares (HPLC)

• pH

Centrifugación

•Velocidad: 5000 rpm


•Tiempo: 5 min

Secado


•Tiempo: 48 horas

Extracción de aceite por solventes

•Volumen solvente: 200 mL

•Solvente: hexano


Recuperación solvente


FIN

Diagrama No. 3: Procedimiento de siembra de levadura en fermentador 5 litros



26

F. La Técnica Estadística

1. Prueba o Test Q

La prueba Q es una prueba sencilla y muy utilizada en la estadística para decidir si

se conserva o rechaza un resultado discordante. En esta prueba se divide el valor

absoluto de la diferencia del resultado discordante xq y el valor más cercano a él, xn,

entre la dispersión, w, de todo el conjunto para obtener la cantidad Q (Skoog,

Douglas, et al. 2005: 170-171).

Después, se compara este cociente con los valores críticos Qcrit que se muestran en

el Cuadro No.9. Si Q es mayor que Qcrit, el resultado discordante puede rechazarse

con el grado de confianza indicado (Skoog, Douglas, et al. 2005: 170-171).

Tabla No. 2: Valores críticos para el cociente de rechazo, Q

Qcrit (rechazar si Q>Qcrit

No. observaciones Confianza de

90%

Confianza de

95%

Confianza de

99%

3 0.941 0.970 0.994

4 0.765 0.829 0.926

5 0.642 0.710 0.821

6 0.560 0.625 0.740

7 0.507 0.568 0.680

8 0.468 0.526 0.634

9 0.437 0.493 0.598

10 0.412 0.466 0.568



27

Tabla No. 3: Especificación del equipo utilizada en pruebas a nivel laboratorio

Nombre del equipo Especificaciones

Incubadora Marca: Fisher Scientific

Modelo: Isotemp

Frecuenci

a:

60 Hz

Voltaje: 120 V

Corriente: 2.2 A

Potencia: 260 W

Autoclave Marca: Napco

Modelo: 8000-DSE

Frecuenci

a:

60 Hz

Potencia: 1750 W W

Incubadora con

agitación

Marca: New Brunswick

Scientific

Modelo: G-25

Frecuenci

a:

50/60 Hz

Voltaje: 120 V

Corriente: 10 A

Potencia: 1200 W

Fermentador Marca: New Brunswick

Scientific

Modelo: Bioflo 2000

Frecuenci

a:

50/60 Hz

Voltaje: 120 V

Corriente: 10 A

Potencia: 1200 W

Baño de enfriamiento Marca: Thermo Scientific

Frecuenci

a:

60 Hz

Voltaje: 115 V

Corriente: 10 A

Potencia: 1150 W

Centrífuga Marca: Eppendorf AG

Modelo: 5804R

28

Frecuenci

a:

60 Hz

Voltaje: 120 V

Corriente: 12 A

Potencia: 1300 W

Energía

cinética

27450 Nm

Presión de

operación:

45 bar

Refrigeran

te

R134 A

Equipo Especificación

Caldera Marca: Cleaver

Brookes,Inc.

Tipo: Pirotubular

Modelo: M200 x30

Presión de

vapor:

150 lb/pulg^

2

Balanza Marca: Ohaus

Modelo: Pionner

Capacidad: 110 g

Incertidumbre ±0.0001 g

Voltaje: 20 V

Corriente: 5 A

Potencia: 4 W

Manta de

calentamiento

Voltaje: 115 V

Potencia: 80 W

Compresor Marca: American Forge

Modelo: Pro

Potencia: 5.5 HP

Potencia: 4103 W



29

2. Pruebas en frascos de cultivo

Tuvo como objetivo seleccionar la levadura que acumulara mayor cantidad de

aceite. Inicialmente se realizaron pruebas de crecimiento en caldo Sabouraud para

obtener la cantidad de aceite formado de cada levadura. A continuación se

seleccionaron dos levaduras para realizar crecimientos en caldo Sabouraud 2% de

glucosa y un medio simulado formado por peptona, triptona y glicerina USP. Por

último se realizó crecimiento de la levadura que mayor cantidad de aceite formaba en

caldo simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de la producción de

biodiesel.

Las cepas utilizadas fueron: Rhodosporidium toruloides (CBS14), Rhodotorula

glutinis var glutinis (CBS322), Lipomyces Starkeyi (CBS1807) y Yarrowia lipolytica

(CBS2075).

A continuación se presenta la caracterización de las cepas de levaduras utilizadas;

información proporcionada por el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) y el

National Collection of Yeast Cultures (NCYC).

Tabla No. 4: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)

Nombre Rhodosporidium

toruloides

Rhodotorula

glutinis

Lipomyces

starkeyi

Yarrowia

lipolytica

Estado Rhodotorula

glutinis

var.rufusa

--- ---

Estado asexual --- --- --- Candida lipolytica

var. lipolytica

Sinónimos Mycotorula

rubescens,

Rhodotorula

glutinis

var.rubescens,

Rhodoturula

gracilis,

Rhodotorula

koishikawensis,

Rhodotorula

longissima,

Rhodoturula

rubescens,

Torula

koishikawensis,

Blastodendrion

aereus,

Cryptococcus

bronchialis,

Cryptococcus

glutinis,

Mycotorula

roseo-corallina,

Rhodotorula

bronchialis,

Rhodotorula

Glutinis var.

Lusitánica,

torulopsis saitoi,

Torulopsis

roseus

--- Azymoprocandida

lipolytica, candida

deformans,

Candida lipolytica

var.

Thermotolerans,

Candida olea,

Candida oleophila,

Candida

paralipolytica,

Candidad

petrophilum,

Candida

Pseudolipolytica,

Endomycopsis

lipolytica,

Número CBS CBS14 CBS20,

CBS108

CBS1807 CBS 2076

Número NCYC NCYC021 NCYC2666 NCYC2710 NCYC025

30

Equivalente a otra

colección

ATCC10788,

ATCC15385,

CCRC20306,

DBVPG6740,

IAM13469,

IFO0559

ATCC2527,

CCRC21418,

DBVPG6081,

IAM14113,

IFO1125,

VKMY332

ATCC58680,

CRRC21522,

DBVPG6193,

DBVPG6776,

DSM70295

DBVPG6207

Tipo de célula Células en

ciernes

Células en

ciernes

Células en ciernes filamentos

Medio de cultivo Base

nitrogenada +

25nM-D-

glucosa

Base

nitrogenada +

25nM-D-

glucosa

Base nitrogenada

+ 25nM-D-

glucosa

Agar papa glucosa

Condiciones de

crecimiento

--- 20h a

A640=1.05

~20h a A640=0.51 9 días

Temperatura de

incubación




3. Pruebas en reactor

Después de haber seleccionado la levadura que generó mayor cantidad de aceite en

las pruebas a nivel frascos, se realizó un crecimiento en un reactor de 5 litros para

visualizar el comportamiento del sistema y obtener el balance de masa y energía.

4. Costos

Con base a los datos obtenidos en la prueba de crecimiento en el reactor en cuanto

a los suministros y a otros factores necesarios se calcularon los costos de producción

de aceites microbianos a nivel laboratorio.

31

PARTE II

MARCO TEÓRICO

32

A. Glicerina como subproducto de la producción de biodiesel

Debido a que el costo final de un producto es fundamental para los fines de poder

determinar la viabilidad de su proceso de producción, el aprovechamiento de los

subproductos es muy importante debido a que permite reducirlo. En el caso de la

producción de biodiesel, que son ésteres metílicos o etílicos obtenidos por

transesterificación de grasa y aceite con metanol o etanol; en dicho proceso, como se

puede observar en la Figura No. 1, la glicerina es el principal subproducto. La calidad

de la glicerina obtenida es fundamental para plantear procesos con el fin de su

aprovechamiento (Aimeretti, 2008:138).

Figura No. 1: Reacción de transesterificación para la producción de biodiesel.

Fuente: Knothe G., et al. 2009. AOCS PRESS. Illinois. The Biodiesel Handbook.

Luego de la reacción de transesterificación, la glicerina debe ser removida de los

metilésteres o etilésteres debido a que si se encuentran libres en el combustible en

cantidades superiores a las exigidas por la norma, podrían causar inconveniente en los

filtros de combustible y en la combustión (Aimeretti, 2008:138).

Debido a que la glicerina tiene baja solubilidad en los metilésteres, la separación es

rápida y puede llevarse a cabo por diferentes métodos, como decantación o

centrifugación (Aimeretti, 2008:138).

Después de la separación, la mayor cantidad de glicerina se encuentra en la fase

inferior debido a su mayor densidad, puede alcanzar una concentración del 50 a 70%.

Los demás componentes de esta misma fase son: metanol sin reaccionar, parte del

catalizador utilizado y jabones formados por la reacción entre los ácidos grasos libres y

el hidróxido de sodio. Debido a esto, el valor comercial de la glicerina en este estado es

bajo y la eliminación de sus contaminantes es dificultosa. Además, el contenido de

metanol ó etanol hace que esta glicerina sea considerada como desecho peligroso

(Aimeretti, 2008:138).

El primer paso para purificar la glicerina es la eliminación de los jabones utilizando

un ácido mineral obteniendo ácidos grasos libres y sus sales, luego se remueve el

metanol mediante un proceso de destilación flash al vacío u otro tipo de evaporación.

33

De esta forma se obtiene glicerina con una pureza aproximada del 85% que puede ser

vendida a refinerías. Si se requiere un producto de mayor pureza, se lo puede obtener

mediante un proceso del destilación por alto vacío o intercambio iónico, logrando una

concentración que puede alcanzar el 99.7% (grado alimenticio) (Aimeretti, 2008:139).

B. Características y propiedades de la glicerina

El compuesto glicerol corresponde al compuesto químico 1,2,3 propanotriol, dicha

molécula está compuesta por tres átomos de carbono, ocho de hidrógeno y tres de

oxígeno unidos mediante enlaces simples (Aimeretti, 2008:140)

Figura No.2: Estructura del glicerol



Entre sus propiedades físicas y químicas se puede mencionar que se trata de un

compuesto orgánico, líquido, viscoso, incoloro, de sabor dulce. Sus propiedades

solventes son similares a las del agua o alcoholes alifáticos simples, es insoluble en

hidrocarburos, alcoholes de cadenas largas, grasas y solventes halogenados; la

solubilidad de gases u otros líquidos en glicerol dependen de la temperatura y la presión

(Aimeretti, 2008:140).

En condiciones neutras o alcalinas se puede calentar hasta 275°C sin formar gases

tóxicos como la acroleína, pero en presencia de un ácido fuerte, ésta se forma a 160°C.

A temperatura ambiente es muy higroscópica y al superar los 180°C el glicerol

comienza a deshidratarse formando poligliceroles (Aimeretti, 2008:140).

Dadas estas propiedades, la glicerina de alta calidad posee diversos y numerosos

usos, entre los cuales se pueden destacar: la elaboración de resinas alquílicas, productos

de limpieza, medicinas, explosivos, etc. También se utiliza como plastificante para

celofán, humidificante para productos alimenticios o derivados del tabaco, lubricante

para las máquinas procesadoras de alientos, entre otros (Aimeretti, 2008:140).

A continuación se presentan los datos generales y propiedades físicas de la glicerina

comercializada actualmente en el mercado (Productos químicos Monterrey, 1998:1)

CH2O

H

CHOH

CH2O

H

34

Tabla No. 5: Datos generales de la glicerina comercial

Datos generales

Nombre comercial Glicerina

Nombre Químico Glicerol

Sinónimos 1,2,3 propanotriol, Trehihidroxipropano,

alcohol glicol

Familia química Alcoholes

Peso molecular 92.09 g/mol

Fórmula estructural C3H8O3



Tabla No. 6: Propiedades físicas de la glicerina comercial

Propiedades físicas

Temperatura de fusión 18°C

Temperatura de

ebullición

291°C

Presión de vapor @

50°C

0.0025 mmHg

Densidad relativa 1.269@20°C (agua=1)

Densidad de vapor 3.17 (aire =1)

Solubilidad en agua

(g/mL)

Miscible

Reactividad en agua Ninguno

Estado físico, color y

olor

Liquido almibarado claro, incoloro e

inodoro

Velocidad de

evaporación

Muy bajo (butil acetato =1)

Punto de inflamación 199°C

Temperatura de auto

ignición

370°C



C. Usos alternativos del glicerol o glicerina

Debido a que la producción de biodiesel aumenta, el exceso de oferta de

glicerina también. Además, como se mencionó anteriormente la glicerina obtenida

de dicho procesos tiene baja calidad; por lo tanto, no puede ser utilizada para

productos alimenticios, farmacéuticos o cosméticos (Naresh, 2006:2).

35

Por lo tanto, para resolver dicha problemática, investigadores de todo el mundo

han estado evaluando diversas alternativas; algunas de ellas se mencionan a

continuación:

1. Combustible en calderas

Utilizando mezclas con diesel u otro combustible y quemarlas dentro

de la caldera. El uso de glicerina cruda como combustible primario

tiene el riesgo, debido a su descomposición, de formar gases tóxicos

como la acroleína, que es un carcinógeno fuerte. Debido a esto, es

necesario que se mezcle con otros combustibles para obtener una

temperatura de llama más alta, desapareciendo así la posibilidad de

formación de dicho componente carcinógeno (Aimeretti, 2008:140).

2. Fertilizante para suelos

En este caso es necesario utilizar hidróxido de potasio (KOH) como

catalizador de la reacción de transesterificación de modo que al realizar

el tratamiento para eliminar jabones se obtenga sulfato de potasio

(K2SO4) o fosfato dipotásico (PO4HK2) según se utilice ácido sulfúrico

(H2SO4 ) o ácido fosfórico (H3PO4) como ácidos minerales de

neutralización. Ésta opción es mucho más simple, pero es importante

un control adecuado del pH para no afectar el desarrollo bacteriano en

el suelo (Aimeretti, 2008:140).

3. Suplemento en la producción de alimentos balanceados

Para este fin el catalizador que se debe usar es hidróxido de sodio

(NaOH) y se debe neutralizar con ácido clorhídrico (HCl) para obtener

cloruro de sodio (NaCl). El consenso general, debido a que no existe

reglamentación, es que el glicerol en bruto puede ser de hasta un 15 %

en una dieta de rumiantes. En el caso particular de las vacas lecheras, se

ha observado un aumento en la producción de leche y en su contenido

de proteína (Aimeretti, 2008:141).

4. Otras alternativas

Algunas alternativas estudiadas son la producción de propilenglicol,

producción de ácidos grasos omega 3, producción de bioetanol,

producción de aditivos oxigenados, uso como medio dieléctrico,

conversión de glicerol en productos útiles como 1,3-propanodiol, 1,2

propanodiol, dihidroxiacetonas, hidrógeno, poligliceroles, ácido

succínico, poliésteres, entre otros (Aimeretti, 2008:140),(Naresh,

2006:2).

36

D. Tratamiento de la glicerina proveniente de la producción de

biodiesel

La glicerina proveniente de la producción de biodiesel contiene alcohol sin

reaccionar, residuos de catalizador, jabones y otros contaminantes. Por lo tanto, el

tratamiento previo dependerá del uso que se le dará. Debido a que uno de los

objetivos de este trabajo es su uso para fermentación, el tratamiento que se

encontró en la literatura es el siguiente (Cameron Douglas y J. Koutsky, 1994:9):

1. Ajustar el pH a 6 ó 7 con H2SO4 concentrado.

2. Someter la glicerina a 240°C durante 20 minutos en una autoclave (esto da

lugar a la formación de una gran cantidad de precipitado y una pequeña

capa de éster metílico).

3. Remover por decantación la capa de éster que se formó.

4. Centrifugar el material restante por 10 minutos a 12,000 revoluciones por

minuto (rpm).

El material resultante puede oscilar entre 50-65% de glicerol. Este

pretratamiento puede ser innecesario para la fermentación comercial (Cameron

Douglas y J. Koutsky, 1994:9).

E. Levaduras para la producción de aceite

Existen muchas especies de levaduras tales como Cryptococcus albidus,

Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides,

Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica , que son

capaces de acumular aceite bajo ciertas condiciones de cultivo y se reporta que

cada especie pueden acumular diferentes cantidades de aceite. En la tabla No. 1

se puede observar el rendimiento y coeficiente de lípidos obtenidos de cada

especie, reportado por diferentes autores (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:

752-754)

37

Tabla No. 7: Producción de aceite de diferentes levaduras

Especie Rendimiento de

lípidos (g/L)

Coeficiente de

lípidos (%)

Referencia*

R.

toruloides

13.8 22.7 Li et al. (2006)

L. starkeyi 5.9 20.4 Liu et al. (2000)

L. starkeyi 9.99 14 Kong et al (2007)

L. starkeyi 6.89 11 Kong et al (2007)

R. glutinis 7.19 13 Shi et al. (2006)

T.

fermentans

5.32 8.42 Kazuyoshi et al.

(2006)

C. curvatus 37.1 - Mainul et al. (1996)

Fuente: *ver la columna de referencia en la tabla

Tabla No. 8: Rendimiento de aceite y biomasa de diferentes levaduras.

Especie Fermentación Biomasa

(g/L)

Contenido

de lípidos

% (p/p)

Rendimiento

de lípidos

(g/L)

Referencia *

R.

toruloides

Frasco 18.2 76.1 13.9 Li et al. (2006)

R.

toruloides

Fermentador

agitado

106.5 67.5 71.89 Li et al. (2007)

L. starkeyi Frasco 19.0 52.6 9.99 Kong et al.

(2007)

Fuente: *ver la columna de referencia en la tabla.

Tabla No. 9: Parámetros de crecimiento y contenido de lípidos de Lipomyces

Starkeyi utilizando glucosa en frascos agitado.

Relación

C:N

Rendimiento

celular

m celular/m

glucosa

(g/g)

Contenido de

lípidos

(%)

Rendimiento de lípidos

m(lípidos)/m(glucosa)

(g/g)

19.8 0.44 19.4 0.09

39.7 0.38 22.1 0.09

61.2 0.29 20.0 0.10



38

Los principales ácidos grasos presentes en los aceites de levaduras son ácido

mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoléico y ácido

linolénico. Según la literatura los aceites de levadura se pueden utilizar como

materia prima para la producción de biodiesel con catálisis ya sea con lipasa o

catálisis química (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-754).

Tabla No. 10: Composición de ácidos grasos producidos por diferentes

levaduras

Especie

Ácido

palmítico

(C16:0)

Ácido

palmitoléico

(C16:1)

Ácido

esteárico

(C18:0)

Ácido

oleico

(C18:1)

Ácido

Linoléico

(C18:2)

Ácido

linolénico

(C18:3)

L.

starkeyi

33.0 4.8 4.7 55.1 1.6 n.d.

R.

toruloides

24.3 1.1 7.7 54.6 2.1 n.d.

R.

glutinis

18 1 6 60 12 2

Y.

lipolytica

11 6 1 28 51 1

n.d. No determinado



F. Medios de cultivo

El microrganismo requiere para su crecimiento de una fuente de energía y de

fuentes de materia, en la mayoría de las fermentaciones industriales la fuente de

energía y la de materia son la misma (glucosa), pero es necesario que la fuente de

materia contenga todos los elementos constitutivos de la masa celular en las

proporciones requeridas por la composición interna del organismo (Quintero,

1981:27).

1. Condiciones de cultivo para levaduras productoras de aceite

Las condiciones de cultivo como la relación de carbono (C)/nitrógeno (N),

los recursos de nitrógeno, temperatura, pH, oxígeno y concentración de sales

inorgánicas tienen influencia en la variación de la acumulación de aceite.

Generalmente mientras más componentes de nitrógeno existan en el medio,

las células contendrán menor cantidad de aceite. Según estudios realizados, se

informa que cuando la relación C/N se incrementó desde 25 a 70, el contenido

de aceite aumentó de 18% a 46%. Además, se dice que las diferentes fuentes

de nitrógeno, orgánicas e inorgánicas, pueden ser utilizadas para el cultivo de

39

levaduras, pero ambas fuentes tienen influencia en la acumulación de aceite.

Según Huang, las fuentes de nitrógeno inorgánico fueron buenas para el

crecimiento celular pero no para la producción de aceite, mientras que las

fuentes orgánicas como caldo de peptona eran buenas para la producción de

aceite pero no para el crecimiento celular (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:

752-754).

Otro estudio presenta que la biomasa y contenido de aceite se puede

mejorar significativamente mediante la optimización de concentración de

Mg2+

, Zn2+

, Mn2+

, Cu2+

y Ca2+

. Además, se presenta que la concentración de

oxígeno disuelto en el medio de cultivo es la correlación positiva con la

acumulación de aceites en la biomasa (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:

752-754).

2. Fuente de carbono alternativas para el crecimiento de levaduras

Buscar otras fuentes de carbono en lugar de la glucosa es muy importante

para reducir el costo de los aceites microbianos, especialmente si son aceites

que se utilizarán para la producción de biodiesel. Entre algunas fuentes de

carbono alternativa para el crecimiento de levaduras con acumulación de

aceite se menciona la xilosa, arabinosa, manosa, glicerol, otros productos

agrícolas y algunos desechos industriales (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:

752-754).

Como se ha mencionado anteriormente, durante el proceso de producción

de biodiesel, el principal subproducto es la glicerina; según estudios realizados

se informa que algunos microrganismos tienen la capacidad de utilizar el

glicerol como fuente de carbono para la acumulación de aceite (Li, Qiang; D.

Wei y L Dehua, 2008: 752-754).

Con el desarrollo a gran escala de biodiesel, en el futuro, se producirán

mayores cantidades de glicerol; por lo tanto, la utilización de glicerol bruto

para la producción de aceite de levaduras puede ser otra una investigación

interesante y con una amplia perspectiva a la reducción de costo de dichos

aceites. Además del glicerol, recientemente se ha tomado en cuenta la

utilización de celulosa hidrolizada como fuente de carbono para la producción

de aceites microbianos, pero este compuesto contiene algunos componentes

tóxicos como ácido acético, ácido fórmico y otros, que pueden influenciar

negativamente sobre el crecimiento celular. Por lo tanto, antes de utilizar esta

fuente de carbono baratas para la producción de aceites, la desintoxicación es

necesaria (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-754).

El uso de fuentes de carbono baratas para la producción de levaduras que

acumulan aceite, abre un nuevo camino para la reducción del costo del aceite

microbiano, lo cual es muy importante para el aceite que se utilizará para la

producción de biodiesel en el futuro ya que esto disminuye el costo del mismo

40

y la factibilidad de su producción (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-

754).

3. Caldo Sabouraud

El caldo Sabouraud, conocido también como medio de antibióticos N° 13,

se usa para el aislamiento y cultivo de hongos y levaduras (Laboratorios

Britania, s.f:1)

Tabla No. 11: Composición del medio de caldo Sabouraud.



Las peptonas de carne y caseína suministran las fuentes de nitrógeno y

carbono necesarios para el crecimiento de bacterias y hongos. La glucosa es la

fuente de energía para aquellos organismos capaces de fermentarla. La

preparación consiste en suspender 30 g del polvo en un litro de agua destilada.

Mezclar vigorosamente. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121 °C durante

15 minutos (Laboratorios Britania, s.f:1)

La siembra del organismo dependerá del tipo de organismo. El crecimiento

se evidencia por la aparición de turbidez (Laboratorios Britania, s.f:1).

G. Proceso de fermentación

Las industrias de procesos bioquímicos se encargan del aprovechamiento, bajo

condiciones controladas, de materiales biológicos tales como microrganismos, tejidos

celular animal, productos microbianos y enzimas. Los procesos asociados con la

producción de microrganismo y de algunos productos específicos son importantes

comercialmente (Quintero, 1981:17).

A continuación se muestran las características en que se ha basado la utilización de

los microrganismos como productores de fermentación.

Compuestos Cantidad (g/L)

Triptona 5.0

Peptona de carne 5.0

Glucosa 20.0

41

Microorganismos Elementos

Nutrientes

Parámetros

[

]

+

[

]

+ [

]

Esto quiere decir que para que una fermentación se realice son necesarios los

siguientes requisitos: tener un microrganismo de características idóneas para el

procesos o producto de interés, proveer un medio de cultivo adecuado (que

contenga los nutrientes esenciales en las proporciones y cantidades óptimas de

producción) y por último, establecer y controlar las condiciones fisicoquímicas

necesarias para el desarrollo de la fermentación (Quintero, 1981:18).

Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a

cabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el

cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados

por acción microbiana en metabolitos y biomasa. El microrganismo va

aumentando en su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo

que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia

de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos crecimiento y

formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso

simultáneamente o no según los casos (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C.

Mignone, 1994:8)

La fermentación puede ser aeróbica (cuando se provee al sistema de oxígeno

molecular) ó anaeróbica (cuando el oxígeno molecular está ausente) (Quintero,

1981:17).

El comportamiento de un microrganismo en crecimiento es el resultado de la

interacción que se produce entre el microrganismo y el medio ambiente en el

reactor, y que en rigor es el resultado de los llamados efectores intra y extra

celulares (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:8)

Los efectores internos están representados por la dotación genética intrínseca

del organismo considerado y por sus mecanismos de regulación metabólica

(Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:8).

Fermentación Microorganismos + O2 + Productos (intra y extracelulares)

42

El comportamiento o expresión fenotípica, o sea lo que realmente se observa

como respuesta del microrganismo al medio ambiente en el reactor es, además, el

resultado de la influencia de las variables de naturaleza física y química que

constituyen los efectores externos (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,

1994:9).

Los efectores externos de naturaleza física están vinculados con las

condiciones de operación que se utilizan en los reactores y son por ejemplo la

temperatura, la agitación, aireación, etc.; es decir, están constituidos por las

variables de manipulación física que se fijan o se programan en el curso del

proceso de producción (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:9).

Los efectores externos de naturaleza química están representados por la

presencia de los componentes de los medios de fermentación, además del 02 que

puede considerarse un nutriente más. Los componentes de los medios deben

cumplir con todos los requerimientos nutricionales y además con los

requerimientos específicos que son indispensables para la formación de productos

(Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone, 1994:9).

En un proceso de fermentación existen 4 etapas definidas, las cuales son:

1. Propagación de cultivos

Se realiza en el laboratorio y comienza generalmente en un tubo de

ensayo que contiene un repique reciente del microrganismo o un tubo

liofilizado donde se conserva la cepa de interés o colonia de

microrganismos previamente seleccionados. Este material microbiológico

se utilizará para aumenta la cantidad del mismo mediante crecimiento en

frascos que se agitan dentro de una cámara de cultivo.

2. Fermentación

El material obtenido anteriormente se siembra el tanque de inoculo que

puede tener un volumen de 50, 500 ó 1000 litros, el tamaño dependerá de

la industria en que se esté trabajando. Del tanque de inoculo se pasa

posteriormente al fermentador industrial cuyo volumen dependerá del

producto que se quiere obtener y la concentración que se busca. Algo muy

importante del proceso es la preparación y esterilización de los medios que

se lleva a cabo previamente a la inoculación, esto se puede realizar en el

tanque de inoculo o en el reactor industrial.

43

3. Operaciones y proceso de separación y purificación de los

productos

Estas etapas se dividen en:

a. Separación de insolubles por filtración, centrifugación o

decantación.

b. Separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción y

ultrafiltración.

c. Purificación por extracción líquido-líquido, extracción a dos fases

acuosas ó cromatografía de afinidad.

d. Aislamiento del producto

4. Tratamiento de efluentes

Esta etapa es imprescindible porque es fundamental controlar la calidad

del efluente que sale de la fábrica y que es enviada normalmente a ríos,

mares o cualquier extensión hídrica.

Figura No. 3: Esquema general de un proceso de fermentación



Propagación de

los cultivos

Fermentación

Procesos y operaciones de

separación y purificación

Tratamiento de

efluentes

Esterilización

Preparación de

medio

Materias

primas

Separación

Purificación

Producto

Efluentes

Tratamiento

44

H. Tipo de fermentadores

1. Fermentación discontinua (Batch)

Una fermentación discontinua puede ser considerada como un "sistema

cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de

nutrientes y se inocula con el microrganismo, permitiendo que se lleve a cabo

la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la

fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente

antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH (si lo requiere el

microrganismo). La composición del medio de cultivo, la concentración de la

biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como

resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas

de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de

muerte (Mateos, sf: 3).

En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe

al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience

la fase de muerte (metabolitos secundarios) (Mateos, sf: 3).

2. Fermentación alimentada (fed-batch)

Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada

que se utiliza en la producción de sustancias como la penicilina. En los

procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que

progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios

está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta razón en el

método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se

añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y

continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción

(Mateos, sf: 3).

3. Fermentación continua

En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución

nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad

equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microrganismos, se

saca simultáneamente del sistema (Mateos, sf: 3).

El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar

costos e incrementar los rendimientos. Esto puede alcanzarse si se desarrolla

el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular. Si bien los

procesos de fermentación continua no se utilizan de forma general en la

industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene

en el crecimiento de células en fermentación discontinua, el coste de

45

producción de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior

al de cultivo discontinuo (Mateos, sf: 3).

Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos

funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han

resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones (Mateos, sf: 3).

I. Rendimiento de un proceso microbiológico

El rendimiento (Y) de un proceso microbiológico es la razón entre la cantidad de

células producidas o productos celulares y el sustrato consumido, éste es muy

importante tanto en el diseño como para conocer la variabilidad económica del

proceso. Entre los rendimientos que más interesan al que diseña u opera un

fermentador son (Quintero, 1981:223):

1. Rendimiento o conversión del sustrato en células ( )

Éste depende del microrganismo, de las condiciones de crecimiento (pH,

temperatura, concentración de oxígeno, entre otras) y del tipo de cultivo (bach

o continuo). En el diseño de un medio de cultivo se considera que el valor del

rendimiento es constante, pero una vez que se establece la fermentación debe

confirmarse. Aunque no se puede predecir teóricamente cuál es el rendimiento

de un sustrato, sí se puede indicar cuáles son los rangos de operación más

comunes (Quintero, 1981: 223).

Ecuación No. 1

a. Fuente de carbono

Los para carbono ( presentan una variación muy grande por lo

tanto se debe revisar la literatura para casos particulares.

b. Fuente de nitrógeno

El método más común para medir la proteína, es determinar el

nitrógeno total y multiplicarlo por 6.25, obteniéndose lo que se

denomina proteína cruda (%N x 6.25 = % proteína celular), contenido

proteico mayor que el real. Los rendimientos de nitrógeno están dados

por, gramos de células/ gramo de nitrógeno alimentado.

46

c. Fuente de otros nutrientes

El contenido celular de fósforo, azufre, magnesio, sodio, calcio, hierro,

entre otros, varía de acuerdo con las condiciones de operación de la

fermentación y del producto que se desea obtener.

2. Rendimiento de oxígeno ( )

Ecuación No. 2

3. Rendimiento calorífico (

Ecuación No. 3

J. Fuentes de aceite para producción de biodiesel

Se puede decir que la producción de biodiesel tiende a provenir mayoritariamente

de los aceites extraídos de plantas oleaginosas, especialmente girasol, soja y colza.

Sin embargo, cualquier materia que contenga triglicéridos puede utilizarse para la

producción de biodiesel (girasol, colza, soja, aceites de fritura usado, sebo de vaca,

grasa de pollo, pescado y otros) (Biodisol, sf:1).

47

Tabla No. 12: Principales materias primas para la elaboración de biodiesel

Tipo de aceite Fuentes

Aceites vegetales

convencionales

Aceite de girasol

Aceite de colza

Aceite de soja

Aceite de coco

Aceite de palma

Aceites vegetales

alternativos

Aceite de Brassica carinata

Aceite de Cynara curdunculus

Aceite de Camelina sativa

Aceite de Crambe abyssinica

Aceite de Pogianus

Aceite de Jatropha curcas

Aceites de semillas

modificadas

Genéticamente

Aceite de girasol de alto oleico

Grasas animales

Sebo de vaca

Sebo de búfalo

Grasa de pollo

Grasa de pescado

Aceites de otras fuentes

Aceites de producciones

microbianas

Aceites de microalgas



K. Perspectiva de los aceites microbianos para la producción de biodiesel

Entre todos los microrganismos heterótrofos, las levaduras (según fuentes de la

literatura) muestran ventajas en términos de su tasa de crecimiento rápido y alto

contenido de aceite. Además, la optimización y la mejora de las capacidades de

levadura de utilizar fuentes de carbono baratas para la acumulación de aceite es muy

importante para la producción de biodiesel en el futuro (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua,

2008: 752-754).

Generalmente, los aceites microbianos podría convertirse en una de las materias

primas potenciales para la producción de biodiesel en el futuro, ya que tiene las

siguientes ventajas: es renovable, la tasa de crecimiento es rápida, y no utilizan las

tierras para su cultivo. Otras modificaciones a través de ingeniería genética y la

ingeniería metabólica tienen mucho potencial para la mejora del rendimiento de los

48

microrganismos productores de aceites (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-

754).

L. Extracción de aceite (Método Soxhlet)

La extracción es el proceso de separación de una o más sustancias; por medio de

esta técnica se pueden separar componentes que se hallan presentes en mezclas

sólidas, líquidas y otras (Núñez, 2008: 2).

La extracción con Soxhlet consiste básicamente en el lavado sucesivo de una

mezcla sólida con un determinado solvente que va extrayendo de la mezcla, los

componentes más solubles en él. Mediante el lavado sucesivo de una mezcla, se

pueden extraer componentes cuya solubilidad en el solvente extractante es muy baja,

debido al efecto acumulado de las múltiples extracciones. Un equipo especialmente

diseñado para realizar extracciones a partir de mezclas sólidas diversas es el Soxhlet

(Núñez, 2008: 2)

Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta:

1. Selección del solvente

Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el

mejor balance de varias características deseables como alto límite de

saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para

producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente,

estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja

presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión

superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente de extracto y

bajo costo (Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).

El solvente más utilizado para extraer aceites comestibles de las plantas es

el hexano. El hexano tiene un rango en el punto de ebullición bastante

estrecho, de aproximadamente 63-69 0C y es un excelente solvente de los

aceites en lo que se refiere a su solubilidad y facilidad de recuperación. Sin

embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexano comercial, está

ubicado como el número uno en la lista de los 189 contaminantes del aire más

riesgosos por la Agencia Americana de Protección del ambiente (Velasco

Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).

El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol,

hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del

medioambiente, la salud y preocupaciones de seguridad (Velasco Reinaldo; H.

Villada y J. Carrera, 2007:57-58).

Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos

recuperación debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el

49

soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces

se agrega un solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además,

se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para

aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Velasco Reinaldo; H.

Villada y J. Carrera, 2007:57-58).

2. Características de la matriz

La extracción con Soxhlet depende fuertemente de las características de la

matriz y de las dimensiones de las partículas puesto que la difusión interna

puede ser el paso limitante durante la extracción. Para la extracción total de

las grasas de las semillas oleaginosas, según la literatura, para partículas de

0.4 mm la extracción es de 2 horas obteniendo 99% de rendimiento; para

partículas de 2.0 mm la extracción puede durar 12 horas para obtener

eficiencia similar a la mencionada (Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera,

2007:57-58)

3. Condiciones de operación

Durante la extracción con Soxhlet, el solvente se recupera normalmente por

evaporación. Las temperaturas de extracción y evaporación tienen un efecto

significativo en la calidad final de los productos. Las altas temperatura de

ebullición para la recuperación del solvente pueden disminuirse usando

evaporación flash o separación por membrana para recuperar el solvente

(Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).

50

PARTE III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

51

3.1 RESULTADOS

Se realizó la búsqueda de cepas de levadura en diferentes instituciones tales como el

American Type Culture Collection – ATCC-, el National Collection of Yeast Culture –

NCYC-, y el Centraalbureau voor Schimmelcutures –CBS-.

De la búsqueda de cepas se identificaron 4 que fueron adquiridas mediante gestiones del

Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle a través del Ing. Carlos Rolz,

Denaco del Instituto de Investigaciones.

Se adquirieron las levaduras: CBS14-Rhodosporidium toruloides, CBS1807- Lipomyces

Starkey, CBS2075- Yarrowia lipolytica y CBS322 Rhodotorula glutivinis var. Glutinis.

Tabla No. 13: Abreviaturas de nombre de cepas de levaduras y medios de cultivo

Cepas de levadura

Abreviatura Nombre

LS Lipomyces starkeyi

YL Yarrowia Lipolytica

RG Rhodotorula Glutinis

RT Rhodosporidium Toruloides

Medios de cultivo

CS Caldo Sabouraud 2%

GUSP Caldo simulado: peptona de carne, triptona de

caseína y glicerina USP

GBIO Caldo simulado: peptona de carne, triptona de

caseína y glicerina proveniente de la

producción de biodiesel



52

Fotografía No.1: Levadura Yarrowia Lipolytica

Yeast Name: Yarrowia lipolytica

Asexual

State: Candida lipolytica var. lipolytica

Other names given to this

strain:

Azymoprocandida lipolytica, Candida deformans, Candida lipolytica var.

deformans, Candida lipolytica var. thermotolerans, Candida olea, Candida

oleophila, Candida paralipolytica, Candida petrophilum, Candida pseudolipolytica,

Endomycopsis lipolytica, Monilia cornealis, Mycotorula lipolytica, Proteomyces

cornealis, Pseudomonilia deformans, Saccharomycopsis lipolytica,

Saccharomycopsis pseudolipolytica, Torula lipolytica, Torulopsis petrophilum

CBS Number: CBS2076

NCYC Number:

NCYC925

Other

Collection Equivalent:

DBVPG6207

Cell type: Filaments

Growth

Medium Potato glucose agar

Growth Conditions:

9 days

Incubation

temperature: 20 oC

Optics: Phase contrast

Other information:

53

Photograph:

Magnification: bar scale is equivalent to 10 micrometres



Fotografía No. 2: Levadura Rhodoturula glutinis

Yeast Name: Rhodotorula glutinis

Asexual

State:

Other names given to this

strain:

Blastodendrion aereus, Cryptococcus bronchialis, Cryptococcus glutinis,

Mycotorula roseo-corallina, Rhodotorula bronchialis, Rhodotorula glutinis var.

lusitanica, Rhodotorula glutinis var. rufula, Rhodotorula glutinis var. saitoi,

Rhodotorula rubra, Rhodotorula rufula, Rhodotorula suganii, Rhodotorula terrea,

Saccharomyces fresenii, Saccharomyces glutinis, Saccharomyces roseus, Torula

glutinis, Torula miniata, Torula rubra, Torula rufula, Torula suganii, Torulopsis

bronchialis, Torulopsis glutinis, Torulopsis

minuta var. americana, Torulopsis roseus,

54

Torulopsis rufula, Torulopsis saitoi

CBS Number: CBS20, CBS108

NCYC Number:

NCYC2666

Other

Collection Equivalent:

ATCC2527, CCRC21418, DBVPG6081,

IAM14113, IFO1125, IGC4177, JCM8208, MUCL30253, NRRLY2502, UCD68255,

VKMY332

Cell type: Budding cells

Growth

Medium Yeast Nitrogen Base + 25 mM-D-glucose

Growth Conditions:

~ 20 h, to A640 = 1.05.

Incubation

temperature: 25 oC

Optics: DIC

Other information:

Photograph:

Magnification: bar scale is equivalent to 10 micrometres



55

Se iniciaron los primeros ensayos con 2 de las cepas de levaduras adquiridas así:

CBS1807 Lipomyces Starkey, CBS2075 Yarrowia lipolytica CBS322

De los resultados preliminares, la Yarrowia lipolytica es la que mejor se adaptó al

medio inicial de cultivo basado en glucosa. Posteriormente se traspasaron las otras

dos levaduras y se inició una experimentación para observar el crecimiento de las

cuatro (4) levaduras seleccionadas, en un caldo de cultivo Sabouraud 2%

habiendo obtenido los siguientes resultados:

Tabla No. 14: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica (YL),

Rhodotorula glutinis (RG) y Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud

2%

Levadura Biomasa

(g/L)

Glucosa

consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimiento

Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mle

v)

Porcentaje

Lípidos_C

(mlípidos/mgluc

osa)

YL 7.26

±

2.61 19.35

±

0.13 8.34

±

0.36 37.58% 4.16% 2.55%

RT 2.65

±

0.52 18.83

±

0.31 6.46

±

3.19 14.07% 24.10% 2.09%

RG 2.73

±

0.52 18.38

±

0.11 8.68

±

0.11 14.85% 2.98% 0.30%

LS 1.35

±

0.78 17.49

±

1.91 4.84

±

0.13 7.52% 29.64% 2.33%



Tabla No. 15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Rhodosporidium toruloides

(RT) en caldo Sabouraud 2% y glicerina USP

Levadur

a Medio

Biomasa

(g/L)

Glucosa

consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimient

o Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mle

v)

Porcentaje

Lípidos_C

(mlípidos/mgl

ucosa)

LS Caldo

Sabouraud

2.97

±

3.39 18.56

±

0.20 6.56± 2.69 16.07% 3.76% 0.29%

Glicerina USP 2.11

±

0.10 17.35

±

0.88 6.17± 0.57 12.17% 2.91% 0.27%

RT Caldo

Sabouraud

2.20

±

2.68 16.97

±

0.98 7.25± 2.06 13.48% 0.51% 0.09%

Glicerina USP 3.62

±

2.09 17.27

±

3.86 6.88± 0.69 20.08% 0.01% 0.00%



56

Tabla No. 16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia lipolytica (YL) en

caldo Sabouraud 2%

Levadur

a

Biomasa

(g/L)

Glucosa

consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimiento

Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mle

v)

Porcentaje

Lípidos_C

(mlípidos/mgluco

sa)

YL 6.52± 0.56 19.50

±

0.02 8.10

±

0.11 33.47% 0.89% 0.18%

LS 0.70± 0.26 18.89

±

0.06 4.83

±

0.16 3.68% 4.61% 0.12%



Gráfica No. 1. Dispersión de biomasa (g/L) del crecimiento en frascos de levadura

YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%



0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

0 1 2 3 4 5

Bio

mas

a (g

/L)

Levadura

57

Gráfica No. 2. Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS

(2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%



Gráfica No. 3. Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en frascos de

levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5

pH

Levadura

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 1 2 3 4 5

Glu

cosa

co

nsu

mid

a (g

/L)

Levadura

58

Gráfica No. 4. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa levadura) del

crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3), RG (4) utilizando Caldo

Sabouraud 2%



Gráfica No. 5. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa glucosa) del


Caldo Sabouraud 2%



0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0 1 2 3 4 5

%Lí

pid

os

(p

lìp

/p le

v)

Levadura

0.00%

0.50%

1.00%

1.50%

2.00%

2.50%

3.00%

0 1 2 3 4 5

%Lí

pid

os

(m

lìp

ido

s/m

glu

cosa

)

Levadura

59

Gráfica No. 6. Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo

utilizando Caldo Sabouraud



Gráfica No. 7. Porcentaje de rendimiento de lípidos (masa lípidos/ masa levadura)

obtenidos del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud 2%



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

YL LS RT RT

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

35.00%

YL LS RT

60

Gráfica No. 8. Diagrama de cajas del porcentaje de lípidos (masa lípidos/ masa

glucosa) obtenidos del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud

2%



0.00%

0.50%

1.00%

1.50%

2.00%

2.50%

3.00%

YL LS RT

61

3.1.1 PRUEBAS No. 1

OBJETIVO:

Fermentación a nivel de 5 L

METODOLOGIA

En vista de los problemas encontrados en la parte experimental reportada anteriormente

por las cantidades tan pequeñas de biomasa obtenidas en frascos agitados y la carencia

de técnicas micro para estos casos, se decidió realizar una prueba con el medio de cultivo

y la levadura que mejores características ha presentado.

Para el efecto, se planificó la fermentación en un equipo New Brunswick de 5 L

utilizando caldo Sabouraud y la levadura Lipomyces starkeyi habiendo obtenido los

siguientes resultados:

Tabla No. 17: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L

utilizando caldo Sabouraud 2%

Tiempo

(h)

Biomasa

(g/L)

Glucosa

Consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimiento

Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mlev)

Porcentaje

Lípidos_C

(mlípidos/mglucosa)

0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0

0.69% 0.18%

48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-

02

5.50± 0.01 21.7%

72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-

03

5.34± 0.01 27.2%

144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-

03

7.98± 0.05 23.5%



62

Gráfica No. 9: Crecimiento celular de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un

fermentador de 5L.



Gráfica No. 10: Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el

crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en

caldo Sabouraud 2%



0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Bio

mas

a (g

/L)

Tiempo (h)

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Re

nd

imie

nto

Tiempo (h)

63

Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el crecimiento

en un fermentador de 5L durante 144 horas en caldo Sabouraud.



Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi

durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo Sabouraud

2%



-5.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Glu

cosa

no

co

nsu

mid

a (g

/L)

Tiempo (h)

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Co

cen

trac

ión

de

glu

cosa

(g/

L)

Tiempo (h)

64

Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas

en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%



Tabla No. 18: Costo total de la producción de aceites microbianos con Lipomyces

Starkeyi en un fermentador de 5 L utilizando Caldo Sabouraud como medio de

cultivo.

Descripción Consum

o

Costo

Caja petri (unidad) 1.0 Q1.30

Agar Patata Dextrosa

(g)

1.0 Q1.62

Caldo Sabouraud (g) 135.0 Q318.60

Agua (L) 4.5 Q4.29

Hexano (L) 0.2 Q37.04

Energía eléctrica

(kW-h)

562.5 Q540.04

Vapor (m^3) 0.004 Q0.80

Mano de obra (hH) 12.0 Q135.00

Total

--- Q1,038.6

8



0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

pH

Tiempo (h)

65

Tabla No. 19: Código de equipo presentado de balance de masa y energía

Código Nombre

E-01 Cepa

E-02 Caja petri

E-03 Caldo de cultivo

E-04 Autoclave

E-05 Incubadora con agitación

E-06 Fermentador: caldo de cultivo

E-07 Autoclave

E-08 Fermentador en funcionamiento

E-09 Baño de enfriamiento

E-10 Centrífuga

E-11 Compresor

E-12 Secado

E-13 Trituración

E-14 Soxhlet

E-15 Destilación

E-16 Hexano recuperado

E-17 Aceite extraído

E-18 Caldera

E-19 Incubadora



Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y energía de la producción de aceites microbianos a escala laboratorio.

E-15

E-11

E-07

E-01 E-02 E-03

T=120ºC

t= 30 min

P=1.75 kW

T=30ºC

t= 72h

P=1.2 kW

200 rpm

Vagua=4.05L

Caldo Sabouraud=121.5g

Q= 2707kJ/kg

T= 121ºC

p=110.3kPa

t=30min

E-18

E-12

E-08

Aire: 5.4L/minAgua: 5.4L/min

P=1.15 kW

E-10

E-14

E-16

V= 0.45L

T=30ºC

Conc. glucosa=20g/L

T=30ºC

pH=5.8

Q=507kJ/kg

P=1.2 kW

t=144 h

200rpm

T

T=30ºC

Conc. Glucosa= 0.4g/L

Consumo glucosa= 19.6g/L

Biomasa= 4.59g/L

Biomasa Tot= 20.66g

%Rendimiento (Ys)= 23.42%

% Pérdida de agua=15.00%

Volumen=3.8L

pH= 5.34

V=0.7L

t=144 h

%Rendimiento=90.03%

Biomasa =18.68g

T=20ºC

t=50min

5000rpm

Biomasa=1.97g

Volumendesecho =3.8L

T=50ºC

t=48h

P=0.26 kW

E-13

Biomasa=18.68g%Rendimiento=87.31

Biomasa=16.31g

Biomasa=2.37gVhexano=0.2L

Vhexano=0.01L

Vhexano=0.19L

Vhexano=0.18L

Vhexano=0.01L

Mlípidos=0.11g

%Lípidos_m=0.69%

%Lípidos_V=2.50%

%Lípidos_C=0.18%

Vaceite=1.25E-04L

P= 1.3 kW P=4.1 kW

t=144 h

E-04E-05

E-06

E-09

E-17

E-19

T=30ºC

t=48h

P=0.26 kW

Siembra de

levaduras

V= 0.45L

Caldo Sabouraud= 13.5g

P=0.08kW

t=2.3h

P=0.08kW

t=0.3h

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del Valle de Guatemala

67

3.1.2 PRUEBA No.2

OBJETIVO:

Determinar cuál cepa es la mejor productora de aceite en un medio de cultivo

con agar Sabouraud

METODOLOGIA

Prueba de fermentación con 4 levaduras en agar, con duplicados

Se preparó un litro de medio de caldo Sabouraud, el peso utilizado fue de

30.0033± 0.0001 g. Se agregó 125mL de medio en cada frasco, obteniendo

ocho frascos. Dichos frascos se esterilizaron durante 15 minutos, en el

autoclave. Luego del proceso de esterilización se procedió a sembrar en

duplicado cada levadura.

Se incubó durante 144 horas a 30°C.

Al terminar el período de incubación se separó las células por medio de

centrifugación, y luego se realizaron los análisis de peso seco celular y

consumo de azúcares (método de ácido dinitrosalisílico).

Luego de extraer las muestras para las pruebas, se recuperó todo la biomasa

por medio de centrifugación, de los dos frascos sembrados. La biomasa

recuperada se secó durante 48 horas aproximadamente, luego se procedió a

extraer el aceite utilizando el método de soxhlet. Se utilizó hexano como

solvente, el cual se recirculó ocho veces por la muestra durante el proceso.

Tabla No. 20: Rendimiento biomasa/substrato (Y x/s) en el crecimiento de cuatro

tipos de levaduras en caldo Sabouraud

Levadura Muestra pH Peso seco

biomasa (g/L)

Substrato Glucosa

consumida S (g/L)

Rendimiento

Y x/s (% peso)

Yarrowia Lipolytica

1 8.08 9.11 19.6320 46.40

2 8.59 5.42 19.7225 27.48

Rhodosporidium

toruloides

1 8.71 3.01 19.3055 15.59

2 4.2 2.28 19.5252 11.68

Rhodotorula glutinis

1 8.6 2.36 19.1497 12.32

2 8.76 3.10 19.2284 16.12

Lipomyces Starkeyi

1 4.75* 1.90 19.4198 9.78

2 4.93 0.80 18.0724 4.43

*Presencia de nata y bolitas. Posible contaminación



68

Tabla No. 21: Valores promedio de los resultados anteriores

Levadura pH

Peso seco

biomasa X

(g/L)

Substrato

Glucosa

consumida S(g/L)

Rendimiento

Y x/s (%)

Yarrowia Lipolytica 8.34 7.26 19.6773 36.94

Rhodosporidium

toruloides 6.46 2.65 19.4153 13.63

Rhodotorula glutinis 8.68 2.73 19.1890 14.22

Lipomyces Starkeyi 4.84 1.35 18.7461 7.11



Como puede observarse, el crecimiento celular en biomasa es muy alto para Yarrowia

en comparación con las otras cepas de levadura. El menor crecimiento se obtuvo para

Lipomyces.

En todos los casos, el consumo de substrato reportado como glucosa fue bastante

similar, aunque el rendimiento de biomasa/substrato Y x/s fue también mucho mayor

para Yarrowia que para el resto de levaduras, con valores bastante bajos para

Lipomyces.

De acuerdo a observaciones macro y microscópicas de los frascos agitados

correspondientes a Lipomyces, se tuvo un crecimiento anormal en forma de pelotitas y

una posible contaminación bacteriana. Esto se corrobora por el descenso drástico del

pH hasta valores cercanos a 5.

Tabla No. 22: Rendimiento de aceite microbiano de cuatro levaduras con

crecimiento en caldo de agar Sabouraud.

Levadura

Aceite

extraído

(g)

g Aceite/g

levadura

Rendimiento

Yp/x(%)

Yarrowia Lipolytica 0.1234 0.0416 4.1632

Rhodosporidium toruloides 0.0982 0.2410 24.0982

Rhodotorula glutinis 0.0140 0.0298 2.9825

Lipomyces Starkeyi 0.1020 0.2964 29.6425



Como se puede observar en el cuadro anterior, las levaduras que presentaron mayor

rendimiento de aceite en función de la biomasa son la Lipomyces Starkeyi con un

Yp/x=29.64 y Rhodosporidium toruloides con 24.09.

69

A causa a que las cantidades de biomasa obtenidas en los experimentos con frascos

agitados son pequeñas, las extracciones de aceite microbiano se realizan a microescala;

por lo que cualquier factor puede afectar los datos obtenidos, resultados que inclinan la

selección de las cepas hacia estas dos mencionadas.

Con el objeto de corroborar los datos obtenidos y tener mayor certeza en la

experimentación, se realizó nuevamente la prueba de crecimiento de las dos levaduras

antes mencionadas en caldo Sabouraud y medio con Glicerina USP, en duplicado.

Fotografía No.3 :Cultivo de Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium toruloides a 144

horas de incubación:

Lipomyces Starkeyi Rhodosporidium toruloides

Medio: Sabouraud Medio: Sabouradu

Muestra 1 y 2 Muestra 1 y 2

Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium

toruloides

Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium

toruloides

Medio: Glicerina Medio: Glicerina

Muestra 1 Muestra 2



70

El cultivo de Lipomyces en agar sabouraud produjo resultados bajos y el de

Rhodosporidium en la muestra duplicado no se logró.

Se observa un mejor crecimiento en los medios de glicerina para ambas levaduras.

Tabla No.23: Rendimiento del biomasa/substrato de las levaduras Lipomyces

Starkeyi y Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina

USP

Levadura Medio Muestra pH

Peso seco

celular

(g/L)

Glucosa

consumida (g/L)

Rendimiento

Yx/s (%)

Lipomyces Starkeyi Caldo

Sabouraud

1 4.66 0.57 19.3530 2.95

2 8.46 5.36 19.2106 27.90

Lipomyces Starkeyi Glicerina USP 1 6.57 2.04 16.7210 12.20

2 5.77 2.18 17.9690 12.13

Rhodosporidium

toruloides

Caldo

Sabouraud

1 5.79 0.31 18.8307 1.65

2 7.36 4.10 18.1362 22.61

Rhodosporidium

toruloides Glicerina USP

1 6.39 2.14 14.5480 14.71

2 7.36 5.09 20.0000 25.45



Como puede observarse, los mayores rendimientos de biomasa se dan para Lipomyces

con valores de Yx/s= 27.9 en caldo sabouraud y Rhodosporidium en medio con

glicerina con valores de 25.45.

Esta prueba no coincide con la anterior reportada en tabla 2 donde los rendimientos

Yx/s fueron mucho menores.

Sin embargo, esta prueba se considera haberla realizado en mejor forma y por

consiguiente, los valores obtenidos tienen mayor aceptabilidad desde el punto de vista

experimental.

71

Tabla No.24: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces Starkeyi y

Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina USP

Levadura Medio

Aceite

extraído

(g)

g Aceite/g

levadura

Rendimiento

Yp/x(%)

Lipomyces Starkeyi

Caldo

Sabouraud 0.0133 0.0376 3.7645

Lipomyces Starkeyi

Glicerina

USP 0.0116 0.0291 2.9102

Rhodosporidium

toruloides

Caldo

Sabouraud 0.0020 0.0051 0.5061

Rhodosporidium

toruloides

Glicerina

USP 0.0001 0.0001 0.0144



Debido a que los porcentajes de rendimiento de aceite de las dos levaduras no

coincidieron con los presentados anteriormente, se decidió repetir nuevamente el

experimento.

Cada levadura se sembró en una caja petri en agar patata dextrosa (PDA) para

identificar las colonias y así asegurar que se estaba sembrando la suficiente cantidad de

microorganismos en cada frasco.

Las levaduras que crecieron en dichas cajas fueron la Yarrowia Lipolytica y

Lipomyces Starkeyi. Las levaduras Rhodosporidium toruloides y Rhodotorula

glutinis no crecieron, por lo que se procedió a sembrar en agar malta y en caldo

Sabouraud. Pero no se tuvo éxito; por lo tanto, se supone que no se lograron reproducir

y murieron.

Se trabajó con Yarrowia Lipolytica y Lipomyces Starkeyi, utilizando caldo Sabouraud

como medio de cultivo. Cada levadura se sembró en cuatro frascos (4) de 125 mL

cada uno, para obtener la mayor cantidad de biomasa posible. Se utilizaron dos frascos

para extracción de muestras. Luego se procedió a recuperar la biomasa por medio de

centrifugación, se secó y se hizo posteriormente la extracción de aceite.

Antes de introducir la mezcla al equipo de extracción soxhlet se utilizó un mortero de

porcelana para moler la levadura y así obtener un tamaño de partícula homogéneo.

Debido a que se obtuvo poca biomasa de la levadura Lipomyces Starkeyi, ésta no se

pudo moler bien; la biomasa obtenida de Yarrowia Lipolytica era mayor por lo que sí

se logró homogenizar la muestra.

72

Fotografía No.4 : Molienda y extracción de aceite de las levaduras Yarrowia

Lipolytica y Lipomyces Starkeyi

Lipomyces Starkeyi Yarrowia Lipolytica

Muestra dentro del soxhlet Sistema Soxhlet



73

Tabla No.25: Rendimiento biomasa/substrato (Yx/s) para las levaduras

Lipomyces Starkeyi y Yarrowia Lipolytica en caldo sabouraud.

Levadura Muestra pH Peso seco

celular (g/L)

Glucosa

consumida (g/L)

Rendimiento

(%)

Yarrowia

Lipolytica

1 8.17 6.13 19.7418 31.05%

2 8.02 6.92 19.7528 35.03%

Lipomyces

Starkeyi

1 4.71 0.51 19.4228 2.63%

2 4.94 0.88 19.4639 4.52%



Los resultados indican nuevamente un buen crecimiento de biomasa para Yarrowia

mientras que la biomasa producida por Lipomyces es muy poca

Tabla No. 26: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces Starkeyi y Yarrowia

Lipolytica en caldo sabouraud.

Levadura

Aceite

extraído

(g)

g Aceite/g

levadura

Rendimiento

Yp/x(%)

Lipomyces

Starkeyi 0.0116 0.0487 4.8658

Yarrowia

Lipolytica 0.0165 0.0086 0.8566



Los rendimientos de aceite son bajos para Lipomyces y Yarrowia y no coinciden con

los presentados en el experimento anterior.

En vista de las variaciones tan grandes observadas tanto en el crecimiento de biomasa

como en la producción de aceite microbiano, nuevamente se inició el crecimiento de

levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 litros para contar con una

cantidad adecuada de biomasa y realizar mejores análisis de la producción de aceite

microbiano.

OBSERVACION MICROSCOPICA DE CULTIVOS DE LEVADURAS

En vista de los resultados obtenidos en las pruebas a nivel de frascos agitados, se han

realizado observaciones al microscopio en fresco, de los diferentes cultivos habiendo

observado lo siguiente:

74

Levadura Yarrowia lypolitica en medio de cultivo de glicerina grado USP:

El crecimiento de esta levadura en un medio de cultivo “puro” es decir, sin la

contaminación proveniente del procesamiento del biodiesel, presenta una

formación celular normal de cualquier levadura como puede observarse a

continuación:

Fotografía No. 5: Levadura Yarrowia Lypoliyica

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad


En la siguiente fotografía se observa el inicio del proceso de gemación de la levadura

Yarrowia lypolitica :

Fotografía No. 6: Germinación levadura Yarrowia Lypoliyica



75

En un medio de cultivo que contiene glicerina proveniente de la producción de

biodiesel a partir de aceites reciclados se obtuvo la siguiente fotografía que indica un

crecimiento celular en forma de micelio, parecido a una hifa de hongo.

Estos signos no son normales y entonces se tuvo que investigar desde el banco de

cepas de levaduras donde fue obtenida la Yarrowia lypolitica.

Fotografía No. 7 Crecimiento de hifas en Yarrowia Lypolitica



Este resultado de la investigación realizada coincide con la fotografía tomada con un

microscopio de alta resolución donde muestra las mismas características de las células

de la levadura Yarrowia lypolitica creciendo como una hifa de un hongo en un medio

de cultivo de papa dextrosa agar PDA a 9 días de incubación a una temperatura de

20°C.

Lo anterior indica que en realidad, la Yarrowia o Candida lipolytica crece como un

hongo filamentoso por lo cual nos permitió continuar con la experimentación

DISEÑO EXPERIMENTAL

Con el objeto de optimizar las condiciones de prueba a nivel de frascos agitados, se

realizó una investigación bibliográfica que nos llevó a la conclusión acerca de lo

siguiente:

La levadura Yarrowia lypolitica que es una de las mejores productoras de

aceite a partir de glicerina o glicerol proveniente de la producción de biodiesel.

Dicha levadura produce también ácido cítrico y manitol con un pico máximo de

producción a las 80-90 horas de iniciado el cultivo, como resultado de su

metabolismo de glicerina.

76

En determinada etapa de su vida la Yarrowia lypolitica produce cantidades

apreciables de ácido cítrico y manitol ( 15-22 g/L) que posteriormente los

vuelve a metabolizar para producir finalmente aceite microbiano. Todo esto

ocurre mientras se ha llegado a la etapa de crecimiento estable y cuando aún

hay en el medio 10 g/L de glicerina, lo cual le permite producir cantidades

apreciables de aceites microbianos hasta las 150 horas aproximadamente. Lo

anterior puede observarse en gráfica adjunta:

Grafica No. 14: Cultivo de Yarrowia Lypolitica

En cuanto al período de crecimiento en etapa logarítmica, éste se desarrolla

hasta las 60-65 horas de incubación; a partir de entonces se entra en una fase

estacionaria con un contenido de biomasa de aproximadamente 8 g/L.

En vista de los anteriores resultados obtenidos por otros investigadores sobre la misma

cepa, se cambiaron las condiciones de cultivo en frascos agitados y se incrementó el

número de determinaciones analíticas según el siguiente diseño experimental.

El diseño experimental consistió en cultivar las cuatro (4) levaduras en un medio de

agar Sabouraud con glicerina durante 156 horas (6.5 días), ya que según la información

de literatura anterior, este es el tiempo en el cual se obtiene el consumo completo de la

glicerina en el medio de cultivo.

Fuente: Axel André (2009) et al: “Biotechnological conversions of bio-

diesel-derivedCrude glycerol by Yarrowia lipolytica strains”. Eng. Life Sci.

2009, 9, No. 6, 468-478

77

3.1.2.1 EXTRACCION DE ACEITES CON SOLVENTES SOXHLET

PROCEDIMIENTO

El aparato de Soxhlet está diseñado para extraer aceites de una muestra por medio de

solventes orgánicos como hexano, benceno, éter de petróleo.

El solvente se deposita en el balón del fondo el cual es calentado por medio de una

hornilla eléctrica. El solvente que se evapora pasa por el brazo de vidrio y llega hasta

la base del condensador donde por medio de enfriamiento con agua, condensa y las

gotas del condensado caen sobre la muestra y extraen el aceite en caliente.

Cuando el volumen del extractor llega a su nivel, rebalsa en el brazo lateral y cae

nuevamente en el balón donde se inicia otro ciclo.

Después de varios ciclos de extracción, el solvente se separa del aceite por medio de

una destilación. Siendo el aceite más pesado, se queda en el fondo del balón y el

solvente se recupera por medio de destilación y condensación.

Fotografía No.8: Sistema de extracción por solventes Soxhlet



78

Como se indicó anteriormente, el aceite extraído en este caso de las células de levadura

Yarrowia Lypolitica con solvente hexano, después de la operación de destilación y

recuperación del solvente, queda en el fondo del balón.

Aunque actualmente las pruebas son cualitativas, ya se obtuvo resultados alentadores

del proyecto pues la levadura Yarrowia lypolitica si produce aceites a partir de la

fermentación de la glicerina.

Fotografía No.9: Aceite microbiano de levadura



Fotografía No. 10: Vista del aceite microbiano recuperado



Aceite microbiano de levadura

Yarrowia lypolitica

Aceite microbiano

79

RESULTADOS OBTENIDO A LAS 24 horas

Lipomyces starkeyi (LS) Yarrowia lipolytica (YL)

No hubo crecimiento en medio con

glicerina

Se observó buen crecimiento a este

tiempo

En general, en un período de 24 horas no hubo crecimiento de biomasa para la

levadura Lypomices starkeyi en medio de glicerina, solamente se observó un

ligero crecimiento en medio de Sabourau

Fotografía No 11: Crecimiento de biomasa para la levadura Lypomices

starkeyi



Para Yarrowia lipolytica hubo crecimiento tanto en medio de Sabourau

como en medio de glicerina

Fotografía No 12: Yarrowia lipolytica crecimiento de masa



80

24 horas

Rodosporidium toruloides (RT) Rhodotorula glutinis

No hay crecimiento en Sabourau

Fotografía No 13: Rodosporidium toruloides (RT)



Fotografía No 14: Rhodotorula glutinis



81

48 horas

Yarrowia lipolytica (YL) Lypomyces Starkeyi (LS)

Fotografía No. 15: Crecimiento de Yarrowia lipolytica bueno en ambos

medios



Fotografía No. 16: Crecimiento para Lipomyces starkeyi fue notable en

ambos medios



82

72 horas

Lipomyces starkeyi (LS) Yarrowia lipolytica (YL)

Rhodosporidium toruloides

(RT)

Rhodotorula glutinis (RG)

Fotografía No. 17: Cultivo de Lipomyces starkeyi muestra contaminación

en el medio de glicerina



Fotografía No18: Crecimiento de Rodotorula glutinis es bajo en ambos

medios



83

Fotografía No.19: Crecimiento en ambos medios fue bueno para Yarrowia

lipolytica



Fotografía No 20: Crecimiento para Rodotorula glutinis es moderado en

ambos



84

156 horas

Rhodosporidium toruloides (RT) Rhodotorula glutinis (RG)

• Lypomices Starkeyi • Yarrowia lipolytica

Fotografía No. 21: Crecimiento de Rhodosporidium toruloides es bajo en

ambos medios



Fotografía No.22: Crecimiento de Lipomyces starkeyi es moderado en

ambos medios



85

Fotografía No.23: Cultivo de Rodotorula glutinis mostró contaminación en

sabourau



Fotografía no. 24: Crecimiento de Yarrowia lipolytica es bueno en ambos

medios



86

3.1.2.2 RESULTADOS DE PESO SECO Y GLUCOSA

CONSUMIDA EN 156 HORAS

Levadura

Peso seco (±

0.0001g)

Absorbancia

(±0.001 nm)

LS 0.0886

0.514

RG 0.8213

0.107

YL 0.0936

0.373

RT

0.0412 0.530

Blanco ----- 0.034

Como puede observarse, las 4 levaduras presentan un consumo de

aproximadamente el 100% de glucosa después de 156 horas de proceso

Levadura Peso seco celular (g/L)

Glucosa consumida

(g/L)

LS 8.86±0.05

19.85053

RG 82.13±0.41

19.97321

YL 9.36±0.05

19.89303

RT 4.12±0.02

19.84571

Glucosa analizada por el método del ácido dinitrosalicílico

87

A. Cultivo de Lipomyces starkeyi en un reactor de 5L

Basándose en los resultados anteriores del crecimiento de Lipomyces Starkeyi

y Yarrowia Lipolytica en medio Sabouraud 2% de glucosa; la levadura que produjo

mayor contenido de lípidos fue la Lipomyces Starkeyi. Por lo tanto, para

corroborar los resultados obtenidos a nivel frascos agitados se procedió a realizar el

cultivo de ésta en un fermentador de 5 L.

El experimento duró 144 horas y se utilizó como medio de cultivo caldo

Sabouraud 2% de glucosa. Se tomaron muestras cada cierto tiempo para dar el

seguimiento a la fermentación. Se obtuvieron los siguientes resultados.

TablaNo.27: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L


Tiempo

(h)

Biomasa

(g/L)

Glucosa

Consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimiento

Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mlev)

Porcentaje

Lípidos_C


0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0

0.69% 0.18%

48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-

02

5.50± 0.01 21.7%

72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-

03

5.34± 0.01 27.2%

144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-

03

7.98± 0.05 23.5%



mlípidos: masa de lípidos

mlev: masa de biomasa de levadura

mglucosa: masa de glucosa

En el cuadro anterior se observa que el consumo de glucosa se alcanza casi totalmente

a las 48 horas. Para poder visualizar mejor los datos obtenidos se presentan a

continuación las gráficas con los parámetros más importantes.

88

Gráfica No. 15:Crecimiento celular de levadura Lipomyces starkeyi en un

fermentador de 5L



En la gráfica anterior, se observa el crecimiento en la etapa logarítmica normal

y luego a partir de las 72 horas se presenta la fase estacionaria y posteriormente la

fase de decaimiento de la biomasa producida.

Gráfica No. 16:14 Rendimiento de biomasa obtenida durante el cultivo de

levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 L en caldo Sabouraud 2%



0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Bio

mas

a (g

/L)

Tiempo (h)

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Re

nd

imie

nto

Tiempo (h)

89

En la gráfica anterior se observa la misma tendencia que en la Gráfica No. 10:

Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el crecimiento de

Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en caldo

Sabouraud 2%

Gráfica No.17 :Concentración de glucosa durante el cultivo de levadura

Lipomyces Starkeyi en un fermentador de 5L Sabouraud



En la información presentada se observa un acelerado ritmo de consumo de

glucosa la cual en un término de 48 horas ha sido agotada completamente por la

levadura.

-5.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Glu

cosa

no

co

nsu

mid

a (g

/L)

Tiempo (h)

90

Gráfica No. 18:15pH durante el cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un

reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%



El pH del medio de cultivo no fue ajustado sino que se utilizó el que produjo la

mezcla de los ingredientes del caldo de cultivo posterior a la esterilización del

medio; se observa que existe un aumento de pH a partir de las 72 horas. Lo cual

indica que se está formando alguna base que puede perjudicar en la recuperación

del aceite microbiano.

A partir de las 72 horas se inicia un aumento en el valor del pH hasta llegar un

pH de 8 que es muy alcalino y que posiblemente se daba a formación de algún

compuesto básico.

La biomasa final obtenida, del crecimiento de LS en caldo Sabouraud 2% fue

de 4.59±0.01 g/L, se consumió 19.55±2.10E-03 g/L de glucosa, el pH final fue de

7.98±0.05, el porcentaje de rendimiento de biomasa fue de 23.5%, el porcentaje de

lípidos_m fue de 0.69% y el porcentaje de lípidos_C fue de 0.18%. Estos dos

últimos porcentajes fueron muy bajos. El porcentaje de lípidos_m presentado es

bajo, esto podría derivarse a que por el exceso de tiempo de fermentación se puede

dar lugar al crecimiento de otros microrganismos que se alimentan de dicho aceite

o que las mismas levaduras lo empiezan a consumir; además, se pueden formar

otros compuestos químicos que inhiban la formación de aceite y/o hasta lo

destruyan. Por otro lado, debido a que se utilizó oxígeno no enriquecido puede dar

lugar al crecimiento de otros microrganismos como esporas y hongos que inhiban

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

pH

Tiempo (h)

91

el crecimiento de la levadura y disminuya la cantidad de aceite formado en ellas.

Además, se debe tomar en cuenta que el reactor que se utilizó tenía un problema de

agitación ya que se observó que la parte de abajo estaba muerta debido a que las

aspas de agitación no estaban colocadas de forma adecuada para cubrir el área total

del fermentador. Esto pudo influir en el crecimiento de biomasa y en la formación

de hongos o material muerto debido al estancamiento de material.

Fotografia No. 25: Cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en un fermentador de

5L con Caldo Sabouraud al 2% glucosa.

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad del

Valle de Guatemala

Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en caldo simulado formado con glicerina USP

y glicerina proveniente de la producción de biodiesel.

Posterior a las pruebas experimentales realizadas en un fermentador de planta

piloto de 5 litros, se decidió seguir trabajando con la levadura Lypomices starkeyi

con medios de cultivo que incluyan glicerina tanto grado USP como glicerina

proveniente de la producción de biodiesel, a causa de que dicha cepa fue la que

produjo - a nivel frascos agitados- la mayor cantidad de aceite.

Por lo tanto, se procedió a preparar caldos de cultivos ricos en glicerina grado

USP y en glicerina proveniente de la producción de biodiesel esto a nivel de

laboratorio en frascos agitados.

Para esto hubo una etapa previa, que fue el pre-tratamiento de glicerina

proveniente de la producción de biodiesel con aceite de soya, principalmente en

filtración, lavado y ajuste de pH ya que normalmente el sub-producto obtenido de

92

la reacción de trans-esterificación de ácidos grasos tiene aún gran cantidad de

hidróxidos que producen un pH elevado en el rango básico.

El experimento se planificó para realizarlo en 144 horas, al término de dicho

período se procedería a sacar peso seco, glicerina consumida (HPLC), extracción

de aceite de toda la biomasa obtenida, observación microscópica para detectar

crecimiento de levaduras. Se obtuvieron las siguientes observaciones

Tabla No. 28: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en medio

simulado con glicerina USP.

Muestra Medio Apariencia Descripción vista

microscopio

pH

1 Glicerina

USP

Color amarillo,

pastoso

Esporas 6.02

2 Glicerina

USP

Presencia de

bolitas y nata

Mezcla de una especie de

hongo y levadura

4.75

3 Glicerina

USP

Opaca Presencia de bacterias 5.42

4 Glicerina

USP

Opaca Presencia de pocas

levaduras

6.47

Inicial 6.87



El valor inicial de pH en este experimento es aproximadamente neutro y en dos casos

tendió a bajar en el rango ácido y principalmente en la muestra No. 2 que presenta una

mezcla de hongos y levaduras con un pH de 4.75.

Cuadro No. 29: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en medio

simulado con glicerina proveniente de la producción de biodiesel.

Muestra Medio Aparienci

a

Descripción vista

microscopio

pH

1 Glicerina

Biodiesel

Opaca No hay presencia de

levadura

8.17

2 Glicerina

Biodiesel


levadura

8.19

3 Glicerina

Biodiesel


levadura

8.23

4 Glicerina

Biodiesel


levadura

8.16

Inicial 8.07



93

Al observar en el microscopio las muestras de crecimiento en frascos utilizando

caldo simulado con glicerina USP; se observaron algunas células en uno de los

frascos pero en cantidades muy pequeñas. En el caso de glicerina proveniente de la

producción de biodiesel no se observó ningún crecimiento.

Los anteriores resultados pueden derivarse a que el pH inicial de los medios de

cultivo estaba en un nivel alto (8.07) debido a que por el almacenamiento de la

glicerina el pH subió; posiblemente se formó un buffer que hizo que no se

mantuviera el pH neutro, al que se había llegado con ácido sulfúrico durante el pre-

tratamiento.

Otra posibilidad es que la Lipomyces starkeyi necesita más de 144 horas para

adaptarse al medio e iniciar con el consumo de glicerina proveniente de la

producción de biodiesel. Lo cual indica que se necesita más tiempo para que las

levaduras crezcan en glicerina.

También es necesario considerar la presencia de algún agente inhibidor en los

medios de cultivo que pueda afectar el crecimiento normal de las levaduras con

efecto potenciador del pH neutro-básico.

Fotografía No. 26: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces Starkeyi utilizando

en el medio glicerina USP



94

Fotografía No. 27: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces Starkeyi utilizando

en el medio glicerina proveniente de la producción de biodiesel



Acondicionamiento de las levaduras en un medio con glicerina

Debido a que el crecimiento de biomasa fue bajo -o nulo en algunos casos-

utilizando medio de cultivo simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de

la producción de biodiesel. Se procedió a diseñar unas pruebas de

acondicionamiento de las levaduras exponiéndolas gradualmente a diferentes

concentraciones de glicerina; se iniciará con un porcentaje de 80% de caldo

sabouraud y 20% de medio simulado con glicerina USP.

Después del tiempo de fermentación (aproximadamente 144 horas), el

producto del primer experimento se utilizará como inóculo para el crecimiento

posterior hasta llegar a un medio de cultivo simulado completo con glicerina USP.

Se trabajará en duplicado y se tendrán muestras control de crecimiento utilizando

caldo sabouraud y medio simulado con glicerina USP.

Se seleccionó la cepa de levadura Lipomyces starkeyi por los mejores

resultados obtenidos hasta la fecha tanto en producción de biomasa como en

contenido de aceite microbiano en las pruebas de extracción con solvente por el

sistema de extracción soxhlet.

95

Tabla No. 30 : Diseño experimental de las pruebas de acondicionamiento en

frascos agitados de la levadura Lipomyces Starkeyi.

Prueba Medio de cultivo Porcentaje

(vol)

Tiempo

(h)

1 Sabouraud 2% 80% 68

Simulado glicerina

USP

20%


Simulado glicerina

USP

40%


Simulado glicerina

USP

60%


Simulado glicerina

USP

80%


Simulado glicerina

USP

100%



3.1.2.3 ACTIVIDADES SOBRE INHIBICION DEL CRECIMIENTO DE

LEVADURAS

En vista de los resultados negativos obtenidos en gran parte de la experimentación

realizada y reportada en el último trimestre (Informe No. 4) , lo cual no permitió

concluir en tiempo el presente proyecto, se plantearon varias alternativas para tratar de

encontrar el problema en la reproducción de las levaduras lipolíticas así:.

En primer lugar, se hizo una revisión bibliográfica exhaustiva sobre el tema

de inhibición en el crecimiento de levaduras en general y lipolíticas en

específico.

Experimentos de “aclimatación” de levaduras en medios de glicerina en un

rango de 5-20 gL de glicerina como fuente de carbono

Prueba cero (0) para verificación de todos los pasos seguidos durante la

experimentación y detección de alguna anomalía específica

96

3.1.2.4 INHIBICION DEL CRECIMIENTO DE LEVADURAS

La revisión de bibliografía se hizo en varias etapas, principiando con la parte general:

Inhibición del crecimiento de levaduras por etanol+ácidos orgánicos

De acuerdo a la bibliografía consultada, el crecimiento de levaduras se ve inhibido

principalmente por la producción de alcohol, aún en levaduras del género

Sacharomyces cerevisiae se ha observado una inhibición por producto cuando el

producto deseado es alcohol etílico o etanol.

Antoce et al reportan estudios de inhibición del crecimiento de levaduras en

presencia de la concentración de alcoholes normales (C1-C4) y ácidos orgánicos

saturados (C2, C4, C6, C8 y C10) habiendo notado cambios en los termográmas de

crecimiento cuando se incrementa la concentración del inhibidor llegando a valores

de 50 y 100% de inhibición en presencia de dichos alcoholes y ácidos.

Se pudo determinar también que hay un efecto sinergístico aditivo de inhibición

del crecimiento de las levaduras cuando se encuentran presentes ácidos y alcoholes

conjuntamente.

Inhibición del crecimiento de levaduras por antimicóticos

Reporta el estudio de inhibición del crecimiento de biomasa de candida albicans y

candida tropicalis (entre otros microrganismos) en presencia de antimicóticos

comerciales tales como “miconozole”, s-fluorocysteine y amphotericin B.

Los resultados encontrados indican que tanto el miconozole como el s-

fluorocysteine tienen un efecto inhibidor del crecimiento de las levaduras ya

cuando está en fase estacionaria o saliendo de la fase logarítmica de crecimiento.

Sin embargo, la amphoreticin B tiene un efecto muy drástico en el crecimiento de

las levaduras desde el período de “lag” lo cual indica que es un potente inhibidor.

Inhibición del crecimiento de levaduras por L-ethionine y S-ethyl-L-

cysteine

Se ha estudiado el efecto de la inhibición del crecimiento de levadura de cerveza y

otras levaduras por L-ethionine y S-ethyl-L-cysteine.

También se ha incorporado en los caldos de cultivo S-methyl-L-cisteine, DL-

methionine sulphoxide, DL-a-amino-n-butyric acid que han demostrado ser

inhibidores moderados del crecimiento de levaduras.

97

S-ethyl-L-cysteine bajo ciertas condiciones de cultivo actúa como un inhibidor del

crecimiento, mientras que el L-methionine anula el efecto de inhibición del

crecimiento.

Inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido

succinamico

El ácido succinamico proveniente de la condensación del ácido succínico (que es

un producto de la fermentación de las levaduras lipolíticas) ha sido utilizado junto

con algunas aminas para producir alrededor de 480 compuestos algunos de los

cuales han mostrado actividad de inhibición del crecimiento de levaduras

Sacharomyces cerevisiae.

Inhibición del crecimiento de levaduras por acetaldehyde

Stanley et al han estudiado el efecto de inhibición del crecimiento de biomasa de

Zymmomonas mobilis y Sacharomyces cerevisiae llegando a la conclusión que

dicho compuesto en concentraciones mayores de 0.3 g/l ejerce un efecto inhibitorio

del crecimiento.

En la fermentación alcohólica a concentraciones bajas, el acetaldehyde reduce la

fase de “lag” y se le encuentra intracelularmente en Sacharomyces cerevisiae.

Inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido

succinamico|

La inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido succinamico

A causa de los resultados negativos obtenidos con el crecimiento de levaduras

lipolíticas en diferentes medios de cultivo, se realizó un seguimiento de todas las

actividades involucradas en la preparación del inoculo hasta el final de un período de

fermentación, no habiendo encontrado inconsistencias con la metodología.

El único problema encontrado el cual ya fue solucionado es el de la técnica de

esterilización del fermentador de 5 litros donde teníamos un problema de

aseguramiento de todas las entradas y salidas del fermentador donde pudo haber

existido contaminación.

Después de haber revisado niveles de pH, formulación del medio de cultivo, y

otros detalles, se procedió a continuar la experimentación con la levadura Yarrowia

lipolytica que ha sido la de mejor respuesta en cuanto a producción de biomasa en

diferentes medios de cultivo.

Se realizaron dos fermentaciones de 5 Litros con caldo de cultivo Sabouraou,

utilizando la levadura Yarrowia Lipolytica.

- Fermentación 1: F1

- Fermentación 2: F2

98

Se preparan 4.5 Litros de medio de cultivo agregando 135 gramos de medio de cultivo

Sabouraou, este se debe esterilizar en el autoclave para eliminar cualquier

microorganismo ajeno a la levadura Yarrowia y de esta forma asegurarnos que

solamente crecerá la levadura.

3.1.2.5.1 FERMENTACION 1

La fermentación No. 1 tuvo como objetivo volver a producir biomasa de levadura y

en vista de la dificultad de extraer los aceites microbianos producidos, ensayar una

reacción extractiva de biodiesel empleando hidróxido de potasio y metanol in situ,

es decir agregando los reactivos dentro de la misma biomasa recuperada.

Lo anterior permite eliminar un paso en el proceso y es precisamente el de

extracción mecánica o por solventes ya que en este es donde se ha tenido mucho

problema en la recuperación de los aceites microbianos producidos.

Fotografía No. 28: Medio de cultivo y agua destilada para esterilizar en

autoclave



99

Fotografía No.29: Fermentador de 5 L para esterilización del medio de cultivo

Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad del

Valle de Guatemala

Después del proceso de esterilización, se inoculó con frascos agitados con alta

densidad de biomasa de Yarrowia lipolytica preparados previamente y se siguió el

proceso durante un período de 96 horas (4 días).

El fermentador cuenta con un sistema de enfriamiento el cual mantiene la temperatura

a 30 °C, se introduce un flujo de 5 L/min de aire filtrado y se cuenta con un sistema de

agitación, manteniéndose a 180 revoluciones/min (rpm).

Una vez terminada la fermentación se procedió a centrifugar el medio para separar el

líquido de la biomasa producida. Los resultados pueden verse en cuadro adjunto.

Tabla No.31: Peso seco y Biomasa total obtenida

F1 F2

Peso Seco (g/mL)

0.0028 ±

0.0004243

0.006051 ±

0.000083

Biomasa Total Seca Teórica (g) 14.0 30.25

Biomasa Total Seca Real (g) 8.5 13.6

Porcentaje de Pérdidas de

Biomasa 39.3 % 55.0 %



100

Fotografía No. 30: Biomasa obtenida de la F1 después de 24 horas de secado a 40

°C



Para la F1 se realizó una transesterificación in situ lo que significa que se agregaron

los reactivos para la transesterificación (KOH y Metanol) junto con la levadura, sin

extraer previamente el aceite.

Fotografía No.31: Transesterificación in situ de la biomasa resultante de la F1



101

No se logro visualizar las capas separadas de biodiesel y glicerina, sin embargo las

cantidades de líquido son muy pequeñas como para poder observarse a simple vista,

siendo estas no mayores a 5 mL. La muestra se almacenó en refrigeración y se

procedió a analizarse en un cromatógrafo de gases.

3.1.2.6 FERMENTACION 2

Para la fermentación 2 se realizó una extracción por solventes. Se utilizó hexano y el

equipo de extracción soxleth.

Se modificó la metodología para la extracción así:

En lugar de colocar la biomasa recuperada del proceso de fermentación en una

bolsa de papel filtro, se agregó la biomasa directamente dentro del balón

conteniendo el solvente, utilizando el equipo soxleth para recuperar el hexano.

Fotografía No. 32: Extracción de aceite por solvente (hexano) agregando la

biomasa en el balón junto con el solvente



Con este procedimiento se logró extraer una solución que contenía biomasa

pulverizada y aceite, por lo que se procedió a filtrarlo.

102

Fotografía No.33: Filtración de solución



Una vez filtrada la solución se procedió a la evaporación del solvente y se obtuvo un

líquido de color entre anaranjado y amarillo. Este presenta un estado sólido a

temperatura ambiente. La apariencia del líquido es de una cera o un aceite de bajo

punto de fusión.

LÍQUIDO EXTRAÍDO DE BIOMASA

Líquido 0.3199 g

Rendimiento (Líquido/Biomasa Total) 2.35 %

Fotografía No.34: Líquido extraído de Biomasa



103



Tiempo

(h)

Biomasa

(g/L)

Glucosa

Consumida

(g/L)

pH

Porcentaje

Rendimiento

Biomasa

Porcentaje

Lípidos_m

(mlípidos/mlev)

Porcentaje

Lípidos_C


0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0

0.69% 0.18%

48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-

02

5.50± 0.01 21.7%

72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-

03

5.34± 0.01 27.2%

144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-

03

7.98± 0.05 23.5%



104

3.2 DISCUSIÓN

A. Cultivo de cuatro cepas de levadura (LS, YL, RG y RT) en caldo Sabouraud

2%.

En la sección de resultados en la Tabla No. 14: Crecimiento de Lipomyces

starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica (YL), Rhodotorula glutinis (RG) y

Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud 2%, se observa que en la

primera fase experimental la levadura que presentó mayor crecimiento de biomasa

y consumo de glucosa fue la YL, presentó un rendimiento de 37.58% y la que

presentó menor crecimiento de biomasa y consumo de glucosa fue la LS, con un

rendimiento de 7.52%. Al comparar el porcentaje de lípidos (mlípidos/mlev) ó

porcentaje de lípidos_m se observa que la levadura LS y RT presentaron los

porcentajes más grandes. La levadura RT tuvo un 24.10% y la LS un 29.64%. Al

comparar los porcentajes de lípidos por cantidad de glucosa (mlípidos/mglucosa) ó

porcentaje de lípidos_C se obtuvo que la YL presenta el mayor porcentaje el cual

es de 2.55%, la LS presentó un 2.33%, la RT 2.09% y la RG de 0.30%. A pesar

que la YL tiene mayor crecimiento de biomasa, ésta acumula menor cantidad de

aceite; y como el objetivo del presente trabajo se centraba en la cantidad de aceite

producido ésta no se tomó en cuenta para la siguiente fase.

B. Cultivo de dos levaduras (LS y RT) en caldo Sabouraud 2% y medio simulado

GUSP

La segunda fase consistió en el crecimiento de LS y RT en caldo Sabouraud y

un medio simulado GUSP. Los resultados de ésta fase se encuentran en la sección

de resultados Tabla No. 15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y

Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud 2% y glicerina USP. La

levadura LS tuvo un rendimiento de biomasa de 16.07% utilizando CS como medio

de cultivo y la RT de 13.48%. El rendimiento aumentó en el caso de la LS y fue

similar en el caso de la RT al comparar con los datos de la primera fase

experimental. Respecto a la cantidad de aceite se obtuvo para la LS un porcentaje

de lípidos_m se obtuvo un 3.75% y la RT de 0.51%; al comparar dichos

porcentajes con la primera fase experimental, se nota que los porcentajes no

coincidieron, esto pudo originarse a que el método de extracción era a microescala

por lo que cualquier error pudo afectar los resultados.

Al comparar los crecimientos con el medio simulado GUSP se observa, en el

caso de LS, que el rendimiento de biomasa fue de 12.17% y para la RT fue de

20.08%; en el caso de la LS bajó el rendimiento de biomasa pero en el caso de la

RT subió lo cual si nos vamos a la columna de biomasa (g/L) se nota que la

desviación estándar es alto lo cual se pudo derivar a que se realizó en duplicado y

los resultados en cada frasco no fueron homogéneos. El porcentaje de lípidos_m

105

fue mayor en el caso del uso de glucosa que el de glicerina USP como fuente de

carbono aunque no es significativamente diferente en el caso de LS.

C. Crecimiento de dos levaduras (LS y YL) en caldo Sabouraud 2%

Debido a que los datos obtenidos no coincidieron a los de la primera fase se

pretendía repetir un crecimiento de las cuatro levaduras para corroborar si la LS

persistía en ser la mayor productora de aceite. Debido a que los resultados en los

frascos no fueron homogéneos, se decidió sembrar en placas las cuatro cepas de

levadura, para que al momento de sembrar se tuviera la certeza que se estaban

agregando células dentro del medio. Se procedió a sembrar las cuatro cepas en

placas, pero únicamente crecieron dos la YL y la LS. La RT y la RG se sembraron

en diversos medios y no crecieron; por lo que se concluyó que la cepa había

muerto, lo cual no permitió que se siguieran tomando en cuenta en el presente

estudio. Por lo tanto, se realizó un crecimiento con caldo Sabouraud con YL y LS

únicamente.

En la Tabla No. 16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia

lipolytica (YL) en caldo Sabouraud 2%, se observa que el rendimiento de biomasa

fue mayor en la YL con un 33.47% y la LS tuvo 3.68%; el porcentaje lípidos_m fue

de 0.89% con YL y de 4.61% con LS. Esto nos muestra que la LS nos

proporciona mayor cantidad de lípidos por masa de levaduras. Aunque al comparar

los porcentajes de lípidos_C es mayor el porcentaje en YL el cual fue de 0.18% y

en LS fue de 0.12%. Dichos porcentajes son muy importantes porque muestran la

bioconversión que hay de glicerina en lípidos; aunque el porcentaje es muy bajo.

D. Gráficas de dispersión de los resultados obtenidos de los crecimientos en

frascos utilizando caldo Sabouraud 2%

Con los datos obtenidos de todos los crecimientos en frascos utilizando caldo

Sabouraud 2% se trazaron gráficas de dispersión para conocer el comportamiento

de los resultados. En la Gráfica No. 1. Dispersión de biomasa (g/L) del


Caldo Sabouraud 2% se presentan los datos de biomasa (g/L), se observa que la YL

tuvo mayor crecimiento ya que se encuentra entre 5.2 y 9 g/L de biomasa, en

comparación a las demás que se encuentran debajo de 5.2 g/L. Además, los datos

obtenidos en cada crecimiento fueron variantes lo que se puede observar en dicha

gráfica.

En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,


106

Gráfica No. 2. Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL

(1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%, se observa que el pH

en cada levadura varió en cada réplica, los datos que coincidieron más fueron el pH

final de la YL que está entre 8 y 8.6 lo cual es discutible ya que puede deberse a

que por el largo tiempo de incubación se formen bases que provocan que el pH

suba. El pH de la LS se observa que se mantiene entre 4.6 y 5, existe un dato fuera

de dicho rango que es aproximadamente de 8.4 lo cual puede ser que se deba a lo

anteriormente mencionado.

Las cantidades de glucosa consumida se pueden observar en la Fuente:

FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del

Valle de Guatemala

Gráfica No. 3. Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en

frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud

2%, en ésta se puede determinar que en los frascos de YL el consumo fue similar

en cada réplica. En el caso de la LS varió entre 16 y 18 g/L. Con la RT varió en

casi todas las réplicas en un rango similar al anterior, con la diferencia que hubo

menor precisión; y con la RG, debido a su baja experimentación con dicha cepa,

los datos están entre 19g/L de consumo.



Gráfica No. 4. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa levadura)

del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3), RG (4) utilizando

Caldo Sabouraud 2% en ésta se muestran los porcentajes de lípidos (m lípidos/ m

levaduras); se puede observar que los datos para cada levadura fueron variantes, en

el caso de la LS los resultados fueron mayores en comparación a las otras

levaduras.



Gráfica No. 5. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa glucosa)

del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando

Caldo Sabouraud 2%, se observa que la YL cuenta con un punto más alto que la

LS, pero se debe tener en cuenta que también tiene un punto bajo, por lo que el

rango es muy amplio para concluir que con la YL se tiene mayor conversión de

glucosa a aceite. La LS cuenta con dos puntos bajos y uno alto cercano al de la YL.

La RG y la RT cuentan con puntos más bajos que las dos anteriores.

107

E. Diagramas de cajas de los resultados obtenidos de los crecimientos en frascos


Además, para conocer el comportamiento del conjunto de datos se realizaron

diagramas de cajas de los datos obtenidos en crecimiento en frascos utilizando

caldo Sabouraud 2%.



Gráfica No. 6. Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo

utilizando Caldo Sabouraud, se observa que la biomasa (g/L) de levadura YL y

RT cuentan con mayores puntos extremos. En el caso de la LS se obtuvieron datos

bajos pero en un rango similar y en el caso de la RG no se contó con muchos datos

por lo que se obtuvo un rango pequeño.



Gráfica No. 7 se observa que el porcentaje de lípidos_m (m lípidos/m

levadura) son bajos para la YL, los de la LS son más altos pero con la diferencia

que existen puntos atípicos y los porcentajes de la RT son más simétricos y soy

mayores a los YL.



Gráfica No. 8 se presentan los porcentajes de lípidos (m lípidos/m glucosa), se

observa que el diagrama de la YL tiene mayor simetría y los porcentajes son

mayores en comparación a los de la LS y RT. En el caso de la LS se observa que

hay una distorsión en la simetría que hala los datos hacia rendimientos bajos.

Respecto a la RT se obtuvo mejor simetría aunque los porcentajes fueron bastante

bajos, menores a los de la YL.

Los resultados obtenidos en crecimiento en frascos utilizando caldo Sabouraud

al 2% de glucosa nos arrojaban medianas con desviaciones estándar muy altas,

debido a que en ocasiones las muestras trabajadas en duplicado no dieron

resultados similares; por lo tanto, para obtener datos más confiables se decidió

aplicar la prueba Q para obtener promedios con mayor confiabilidad y además se

sacó la mediana de los datos para obtener una idea más certera de los resultados

obtenidos en los crecimientos en frascos de las cuatro levaduras trabajadas. En el se

presentan los resultados finales en promedios. Aunque dichos datos aún no son

concluyentes debido a su amplia diferencia en cada corrida.

Debido a que no se obtuvo resultados que afirmaran con alta confiabilidad que

la LS fuera la mayor productora de aceite se procedió a realizar un crecimiento con

ésta levadura en un reactor de cinco litros para conocer y corroborar los datos que

se habían obtenido hasta el momento.

108

F. Crecimiento de Lipomyces starkeyi en un reactor de 5L

El crecimiento duró 144 horas. Tabla No. 17: Crecimiento de Lipomyces

starkeyi (LS) en fermentador de 5 L utilizando caldo Sabouraud 2%, se

observa que el consumo de glucosa se alcanza casi totalmente a las 48 horas.

En la Gráfica No. 9: Crecimiento celular de Lipomyces starkeyi durante 144

horas en un fermentador de 5L., se observa una baja a partir de las 72horas, lo cual

se puede derivar a que durante el crecimiento aparezcan otros microrganismos que

se alimenten de la biomasa formada y a partir de dicho tiempo empiece a disminuir.

Por lo que se recomendaría que el crecimiento en caldo Sabouraud tenga una

duración de 48 horas como mínimo y como máximo 72 horas debido a que el

rendimiento máximo de biomasa se alcanza entre esos tiempos.

En la Gráfica No. 10: Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el

crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en

caldo Sabouraud 2%, se observa que el rendimiento baja al igual que la biomasa

obtenida.

En la Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el

crecimiento en un fermentador de 5L durante 144 horas en caldo Sabouraud., se

observa que ésta disminuye considerablemente en el inicio y las 48 horas, después

de este tiempo permanece constante.

En la Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces

starkeyi durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo

Sabouraud 2%, se presenta una tendencia lineal a partir del tiempo 0 a las 48 horas,

luego aparece un pequeño salto el cual puede derivarse de algún error de muestreo;

aunque la tendencia después de las 48 horas se mantiene constante.

En la Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi durante

144 horas en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%, se observa que existe

un aumento de pH a partir de las 72 horas. Lo cual indica que se está formando

alguna base que puede perjudicar en la recuperación del aceite microbiano.

La biomasa final obtenida, del crecimiento de LS en caldo Sabouraud 2% fue

de 4.59±0.01 g/L, se consumió 19.55±2.10E-03 g/L de glucosa, el pH final fue de

7.98±0.05, el porcentaje de rendimiento de biomasa fue de 23.5%, el porcentaje de

lípidos_m fue de 0.69% y el porcentaje de lípidos_C fue de 0.18%. Estos dos

últimos porcentajes fueron muy bajos. El porcentaje de lípidos_m fue bajo esto

podría derivarse a que por el exceso de tiempo de fermentación puede dar lugar al

crecimiento de otros microrganismos que se alimentan de dicho aceite o que las

109

mismas levaduras lo empiezan a consumir; además, se pueden formar otros

compuestos químicos que inhiban la formación de aceite y/o hasta lo destruyan.

Por otro lado, debido a que se utilizó oxígeno no enriquecido puede dar lugar al

crecimiento de otros microrganismos como esporas y hongos que inhiban el

crecimiento de la levadura y disminuya la cantidad de aceite formado en ellas.

Además, se debe tomar en cuenta que el reactor que se utilizó tenía un

problema de agitación ya que se observó que la parte de abajo estaba muerta debido

a que las aspas de agitación no estaban colocadas de forma adecuada para cubrir el

área total del fermentador. Esto pudo influir en el crecimiento de biomasa y en la

formación de hongos o material muerto debido al estancamiento de material.

G. Crecimiento de LS en caldos simulados (GUSP y GBIO)

Luego de los crecimientos en frascos y fermentador se decidió seguir

trabajando con Lypomices starkeyi debido a que fue la levadura que proporcionaba

a nivel frascos la mayor cantidad de aceite. Por lo tanto, se procedió a pasar a la

fase final del proyecto que era sembrar en glicerina USP y en glicerina proveniente

de la producción de biodiesel. Para esto hubo una etapa previa, que fue el pre-

tratamiento de glicerina proveniente de la producción de biodiesel con aceite de

soya.

El crecimiento duró 144 horas, al término de dicho período se procedería a

sacar peso seco, glicerina consumida (HPLC), extracción de aceite de toda la

biomasa obtenida; pero antes se procedió a observar en el microscopio si había

crecimiento de levaduras. Lamentablemente, al observar en el microscopio en

varios de los frascos con caldo simulado GUSP se observó algunas células pero en

cantidades muy pequeñas. En el caso de glicerina proveniente de la producción de

biodiesel no se observó ningún crecimiento. Esto pudo derivarse a que el pH inicial

estaba entre 8 y 8.5 debido a que por el almacenamiento de la glicerina el pH subió;

posiblemente se formó un buffer que hizo que no se mantuviera el pH neutro, al

que se había llegado con ácido sulfúrico. Otra posibilidad es que la Lipomyces

starkeyi necesita más de 144 horas para adaptarse al medio e iniciar con el

consumo de glicerina proveniente de la producción de biodiesel. Lo cual indica que

se necesita más tiempo para que las levaduras crezcan en glicerina.

110

H. Balance de masa y energía

El balance de masa y energía se obtuvo con el crecimiento en el reactor de 5 L,

éste se puede observar en la Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y

energía de la producción de aceites microbianos a escala laboratorio., en donde se

encuentran condiciones de operación, rendimientos y porcentajes de pérdidas.

Además, se observa el proceso de producción a nivel laboratorio el cual

consiste en siembra de inóculo, incubación por 72 horas, traspaso del inóculo al

fermentador con capacidad de 5 L ( fermentador previamente esterilizado);

fermentación durante 144 horas; recuperación de la biomasa por centrifugación;

secado de la biomasa por 48 horas; trituración de biomasa seca para obtener una

muestra homogénea; extracción se aceite por soxhlet utilizando hexano como

solvente; recuperación del hexano por destilación; peso de aceite obtenido.

Uno de los puntos críticos del proceso es la siembra del inóculo, ya que se debe

realizar de forma rápida y precisa para evitar cualquier contaminación dentro del

frasco y garantizar que existen células para que permitan el crecimiento dentro del

medio. Se observa que el punto que presenta mayor pérdida de biomasa es después

de la centrifugación y de la trituración de la biomasa seca. La pérdidas del solvente

fueron mínimas las cuales ocurrían por evaporación durante su adición al balón,

extracción y recuperación del mismo.

Como subproductos se obtiene el caldo de cultivo luego de la centrifugación y

torta después de la extracción. El primer subproducto se deberá estudiar para

conocer si es apto para riego o se puede utilizar para alguna otra actividad. La torta

se puede utilizar como aditivo de alimento de animales, abonos, entre otros,

también se debe realizar investigación para tener otras alternativas.

El costo total de la producción de aceite microbiano con Lypomices starkeyi

fue de Q1,038.68; de éste crecimiento se obtuvo 0.1258 g de aceite.

111

PARTE IV

112

4.1 Conclusiones

Evaluación de la producción microbiana de aceites a partir de la glicerina o

glicerol proveniente de la producción de biodiesel

A nivel laboratorio, la levadura con mayor producción de aceite por gramo de biomasa

fue la cepa Lipomyces Starkeyi, obteniendo un 4.31 % p/p promedio con medio de

cultivo caldo de agar Sabouraud al 2% y 2.90 % p/p con medio de cultivo de glicerina

USP.

La levadura con mayor rendimiento de biomasa por gramo consumido de glucosa

(46.40 % p/p) fue la Yarrowia Lipolytica, utilizando como medio de cultivo caldo de

agar Sabouraud al 2%.

El rango de porcentaje de rendimiento de biomasa de levadura Lipomyces

Starkey estuvo entre 3.68 % a 16.07 % en las pruebas en frascos agitados utilizando

como medio de cultivo caldo Sabouraud y en el medio simulado de glicerina ultra pura

se obtuvo un rendimiento de 12.17 %.

El porcentaje de lípidos_m (mlípidos/mlev) producidos por la levadura Lipomyces

Starkey en pruebas a nivel laboratorio, en frascos agitados con caldo Sabouraud, estuvo

entre 3.76 % a 29.64 % y en caldo con medio simulado de glicerina ultra pura de 2.91

%.

Desarrollar y evaluar tecnología local para la producción de aceites de origen

microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción de

biodiesel, vía fermentación

Debido a las pequeñas cantidades de aceite obtenidas, se decidió realizar una

transesterificación in situ. Se observó la formación de dos fases sin embargo no se

logró separar la fase de biodiesel para su posterior análisis ya que era mucho menor a

un mililitro.

Evaluar la bioconversión de la glicerina o glicerol como fuente principal de

carbono en cultivo sumergido de levaduras y bacterias a nivel laboratorio

La utilización de glicerina como fuente de carbono en la fermentación provoco una

disminución tanto de biomasa generada como de aceite producido en las cuatro

diferentes levaduras estudiadas.

Se observó la inhibición en el crecimiento de todas las levaduras al utilizar la glicerina

cruda no tratada ya que la glicerina contenía trazas de metanol e hidróxido de sodio

113

Evaluar y escalar a nivel de planta piloto los resultados de laboratorio obtenidos

empleando con las mejoras de cultivo y cepas seleccionadas de microorganismos

Se utilizó un fermentador de 5 litros para realizar una fermentación de Lipomyces

Starkeyi a escala de planta piloto, utilizando como medio de cultivo caldo Sabouraud

2%, obteniendo un rendimiento de biomasa de 23.5 % (gramos de biomasa/gramos de

glucosa) y un rendimiento de aceite de 0.69 % (gramos de aceite/gramos de biomasa).

Determinar y evaluar la producción de biodiesel con los aceites de origen

microbiano obtenidos y caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los mismos

El costo de extracción de 0.10 gramos de aceite, de 21.7 gramos de biomasa de

Lypomices Starkeyi es de Q. 1038.68

En base a los datos obtenidos de rendimientos de biomasa y aceite y el consumo de

nutrientes, es necesario utilizar economías de escala para evitar que los costos fijos de

operación se vuelvan considerables. Sin embargo no se tiene suficiente información

para poder concluir con exactitud el tamaño de la planta necesaria.

114

4.2 Recomendaciones

- Continuar con la experimentación en el proyecto, reduciendo la investigación a

las cepas de levaduras más prometedoras tanto en cantidad de biomasa

producida, adaptación a los medios de cultivo, producción de aceite

microbiano, tales como Lipomyces Starkeyi y Yarrowia Lipolytica.

- Realizar pruebas en una escala mayor (una opción es el fermentador del centro

de investigación de 14 litros) para obtener datos que permitan escalar con

mayor facilidad los datos a un planta y se pueda hacer un estimado de los

costos.

- Ensayar nuevas técnicas de manejo micro para poder realizar estudios en

frascos agitados con certeza de los resultados analíticos y disminuir así la

variabilidad de los datos.

- Ensayar diferentes métodos de extracción como ondas ultrasónicas o

microondas, para romper la pared celular de la biomasa y obtener mayores

rendimientos de aceites microbianos.

.

115

4.3 Bibliografía

1. Axel, A. (2009) Eng. Life. Ci: “Biotechnological conversions of bio-diesel-

derived crude glicerol by Yarrowia lipolytca strains” No. 6, 468-478.

2. Bezergianni, S. (2010) Bioresource Technology: “Hydrotreating of waste

cooking oil for biodiesel production. Part II: Effect of temperature on

hydrocarbon composition”, Elsevier Ltda.

3. Charoenchaitrakooll, M., “Statistical optimization for biodiesel production from

jatropha curcas oil using two-step catalyzed process”, Department of Chemical

Engineering, Faculty of Engineering, Kasetsart University, Bangkok, Thailand.

4. Haas, Michael J. (2006) Bioresource Technology: “A process model to estimate

biodiesel production cost”, 97, 671-678.

5. Lee, S.: “Simulation of supercritical biodiesel production process and its

economic evaluation” University of British Columbia, Dep. Chemical and

Biological Engineering. Vancourver, B.C, Canada

6. Papanikolaou, S. (2002) Microbiol. Biotechnol: “Single cell oil production by

Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch

cultures” Appl 58: 308-312.

7. Plesu, V., “New issues in biodiesel synthesis-project TINOCIP, University

Politechnica of Bucharest, Centre for Technology Transfer in Process Industries

(CTTPI).

8. Purba, E. “CO2 reduction using microalgae Nnochloropsis oculata and

production of oil algae”, Center for Cleaner and Greener Products and

Technologies. The Department of Chemical Engineering. The University of

Lampung, Indonesia.

9. Van Kasteren, J.M.N. (2007) Resources, conservation and recycling: “A

process model to estimate the cost of industrial scale biodiesel production from

waste cooking oil by supercritical transesterification”, Volume 50, Issue 4, June

2007 pages 442-458.

10. Zapata, C. (2007) Dyna rev.fac.nac.minas: “Producción de biodiesel a partir de

aceite crudo de palma: 2. Evaluación económica” Vol. 74, No. 151 Medellín

Jan/Apr.

11. Knothe G., J. Van Gerpen, J. Krahl, (2009) AOCS PRESS: The Biodiesel

Handbook, Champaign, Illinois.

116

4.4 Anexos

PROTOCOLO DE INVESTIGACION PARA COMPARACIÓN DE

CRECIMIENTO DE VARIAS CEPAS DE LEVADURAS

FRA-01-2010

Materiales:

• Frascos de cultivo 250 mL

• Asas de dicromo

• Probeta de 100mL

• Beaker 600Ml

• Agitador magnético

• Estufa con agitación

• Agua destilada

• Mechero de bunsen

• Tubos de centrifugación

Equipo:

• Autoclave

• Incubadora

• Centrífuga

• Horno

Reactivos:

• Medio de cultivo Sabouroad

• Glicerina USP

• Peptona de carne

• Peptona de caseína

Las levaduras que se sembraron fueron las siguientes:

• Lipomyces starkeyi (LS)

• Yarrowia lipolytica (YL)

• Rhodosporidium toruloides (RT)

• Rhodotorula glutinis (RG)

Se preparó 500mL de medio de Sabouraud y 500 mL de medio sustituyendo la

fuente de carbono con glicerina USP. Los pesos utilizados para cada medio

fueron:

Componente ± 0.0001 g

117

Sabouraud 15.0010

Peptona de carne 2.5120

Peptona de caseína 2.5143

Glicerina 10.0001

• Se agregó 125mL de medio en cada frasco, obteniendo cuatro con medio de

Sabouraud (Medio No. 1) y cuatro con el medio formado por peptona de carne,

caseína y glicerina USP (Medio No. 2).

• Luego se introdujeron a la autoclave para esterilizar antes de sembrar la

levadura.

• Para finalizar se procedió a esterilizar el asa de dicromo y sembrar cada

levadura en un medio de sabouraud y en el otro que contenía glicerina USP.

• Se colocaron los frascos en la incubadora durante 156 horas; se llevó el

historial de crecimiento de las levaduras por medio de fotos diarias.

consejo nacional de ciencia y tecnologia concyt ...glifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt...

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