24-08-2009

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Conceptos básicos Definición de enzimas

Fuentes de enzimas

Campos de aplicación enzimas

Clasificación de las enzimas

Cinética enzimática

Sitio activo y actividad enzimática

Parámetros cinéticos

Inhibición enzimática

Enzimas

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Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones

bioquímicas.

Estructura 3aria o 4aria Función biológica

Las enzimas son CATALIZADORES ORGANICOS

Intervienen en una gran cantidad de reacciones del

metabolismo de células, tejidos y órganos

Catalizan reacciones químicas necesarias para la

sobrevivencia celular: metabolismo de los hidratos de

carbono, proteínas, aa, lípidos, ácidos nucleicos, etc.

Las enzimas pueden actuar dentro de la célula, fuera de

ésta y en el tubo de ensayo

Qué son la enzimas

Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía

requerida para pasar de sustrato a producto

REACCION NO CATALIZADA

El agua no es capaz de pasar

sobre la montaña

REACCION CATALIZADA: Las olas

pasan sobre la montaña

ENERGIA DE

ACTIVACIÓN

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3

• La Ea de la hidrólisis de la urea

baja de 30 a 11 kcal/mol con la

acción de las enzimas,

acelerando la reacción 1014 x

• El aumento de temperatura

necesario para producir la

reacción no catalizada seria de

529ºCTiempo de la reacción

E + S

E + P

Sin enzima

Con enzima

Algunos aumentos de actividad producidos

por el uso de enzimas

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Enzima vs Catalizador

Tanto la enzima como el catalizador aceleran la velocidad de una reacción química.

Una enzima puede transformar 1000 moléculas de sustrato/ segundo

Las enzimas tienen 3 propiedades que los catalizadores NO tienen:

Especificidad por el sustrato

Se inactivan por desnaturación

Pueden ser reguladas

FUENTES DE ENZIMAS Las enzimas pueden ser de origen vegetal, animal y

microbiana.

Entre las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las proteasas,

carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azúcares

de carbohidratos superiores, amilasas y -amilasa

Entre las enzimas de tipo animal están las esterasa ( Lipasa se

produce en la mucosa gástrica, el páncreas, fosfotasas: Se

obtiene de tejidos animales óseo, muscular, tripsina y

quimotripsina se produce en el páncreas )

Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias,

arqueas y de hongos.

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Uso industrial de las enzimas

Química fina y farmacéutica

Química de alimentos

Química analítica

Descontaminación

Nuevas fuentes de energía

Enzimas en la industria de alimentos

modificación química, selectiva, especifica

hidrólisis de almidón ---- jarabe de fructosa

hidrólisis de lactosa en leche

producción de quesos (hidrólisis de k-caseína )

hidrólisis de glicosil derivados ( aromas en vinos )

modificación de grasa y aceites ( interesterificacion )

mejora de procesos de extracción ( aceites )

aprovechamiento de residuos agrícolas

producción de aditivos alimentarios

liberación de productos de alto valor añadido ( glicosidasas )

análisis de alimentos - biosensores ( electrodos enzimáticos)

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Clasificación de las enzimas

Comisión de Enzimas (EC) de la IUPAC

Se basa en el tipo de reacción que

catalizan

Comprende cuatro dígitos y un nombre

complejo

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Nombre común (sustrato+”asa”): Hexokinasa

ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

Tipo de reacción catalizada

EC 2.7.1.1

Número EC

Enzyme

ComissionGrupo Subgrupo

EC 1.x Oxidorreductasas

EC 2.x Transferasas

EC 3.x Hidrolasas

EC 4.x Liasas

EC 5.x Isomerasas

EC 6.x Ligasas

Clasificación de enzimas por Grupos

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Grupo 1: Oxidorreductasas

Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que

átomos de oxigeno ó hidrogeno son trasladados entre

moléculas:

En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes a

la vez el aceptor y el dador electrónico.

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

A-X + B A + B-X

Grupo 2: Transferasas

Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó grupo de

átomos entre moléculas:

Dador: Aceptor Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1

Nombre común: hexokinasa

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Grupo 3: Hidrolasas

Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son

las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática:

A-B + H2O A-OH + H-B

No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las hidrolasas.

Muchas de ellas conservan el nombre Primitivo. Ejemplo:

Quimosina EC 3.4.23.4.

Grupo 4: Liasas

Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de

átomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas):

A-B A + B

Ejemplo

Nombre sistemático:

Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3)

Nombre común:

Histidasa

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Grupo 5: Isomerasas

Catalizan reacciones de isomerización moleculares

A B

Ejemplo:

Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

Grupo 6: Ligasas

Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas

de la hidrólisis de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.).

A + B + ATP A-B + ADP + Pi

Ejemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)

Nombre sistémico:

G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase

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Cinética de las reacciones

enzimáticas

Cinética Enzimática

Es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los

factores que intervienen en la actividad enzimática, que se

evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada.

Las variables más importantes son:

• Concentración de enzima, sustratos y productos

(incluyendo inhibidores y/o activadores)

• pH

• Temperatura

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Las enzimas se unen a los

reactivos (sustratos)

Cada enzima tiene una forma

única con un sitio o centro activo

en el que se une al sustrato

Después de la reacción, enzimas

y productos se separan.

Las moléculas enzimáticas no

han cambiado después de

participar en la reacción

Complementariedadgeométrica

Complementariedad de cargas, uniones iónicas

Llave – cerradura.

Encaje inducido

La unión del sustrato es muy

específica:

Modelos:

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Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,

de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Substrato Enzima

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración

en su estructura por el hecho físico de la unión.

Substrato Enzima

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Una enzima puede

unir más de un

sustrato en su sitio

activo

ADP + PEP

ATP + PIRUVATOCOMPLEJO

ENZIMA-SUSTRATO

Enzima + sustratos

Enzima + productos

Baja

concentración

de sustrato

ALTA

concentración

de sustrato

SATURACION

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Medición de la velocidad de reacción enzimática

dt

ds

dt

dpv

EnzimaSustrato(s) Producto(p)

dt

t

s

p[ ]

d[P]v = , t 0

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Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima

para fijar substrato; una vez que están ocupados

todos, por mucho que aumente la concentración

de substrato, la velocidad permanecerá constante

tendiendo a un valor asintótico

Michaelis-Menten y Estado estacionario

Km + sv =

Vmax * s

Concentración de Sustrato [S]

Ve

loc

ida

d d

e l

a r

ea

cc

ión

(v

)

Km

Vmax

Vmax/2

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Significado de la constante Km

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato

(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (s0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentración

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de

enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por

k+2)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

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Concentración de Sustrato [S]

Velo

cid

ad

de l

a r

eacció

n (

v)

Km

Vmax

Vmax/2

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato

A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

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Representación directa

s

0 20 40 60 80 100

v

0

20

40

60

80

100

Km

Vmax

vV s

K smx

m

Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1

v

K

V s Vm

mx mx

-1/Km

1/Vmax

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Métodos de linealización para determinación

parámetros cinéticos

Método Eje Y Eje X Intercepto

Eje Y

Intercepto

Eje x

Pendiente

Lineweaver-

Burke

1/v 1/s 1/V -1/K K/V

Hanes s/v s K/V -K 1/V

Eadie-

Hofstee

v v/s V V/K -K

00

0

tt

tdt

ds

dt

dpva

Actividad Enzimática

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Así esta actividad corresponde al máximo potencial catalítico

que las enzimas poseen para un determinado conjunto de

condiciones ambientales.

Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde la

velocidad inicial de reacción no es representativa del real

potencial catalítico de la enzima.

Se asume que la velocidad inicial de reacción es

proporcional a la concentración de proteína enzimática.

Actividad enzimática: Es el número de moles

de sustrato que reaccionan para formar

producto, por mol de enzima y por unidad de

tiempo. Esto supone que la enzima está

plenamente saturada con sustrato y por tanto la

reacción se efectúa con su máxima rapidez

Índice de recambio: muestra la eficiencia de

la catálisis enzimática

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1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:

- Grupos disociables de la enzima

- Grupos disociables del sustrato

2. Sobre la transformación catalítica del sustrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH

Efecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividad

El pH afecta las interacciones iónicas

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1. Aceleración de la reacción según la ecuación

de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

Efecto de la temperatura

Efecto de la temperatura en la ENZIMA

Cada enzima tiene una temperatura óptima.

Temperatura

15º 40º 75º

Aumento de la

velocidadDesnaturación

por calor

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Coenzimas-Cofactores

Las coenzimas son pequeñas moléculas

orgánicas, que se unen a la enzima.

Las coenzimas colaboran en la reacción

enzimática recibiendo transitoriamente

algún grupo químico: H+ , OH, CH3 .

La enzima sin la coenzima recibe el

nombre de APOENZIMA

El NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato

oxidado

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Algunas enzimas requieren metales

para mejorar su actividad

Isoenzimas o IsozimasSon formas moleculares diferentes de una

misma enzima

Catalizan la misma reacción

Ejemplo: Lactato deshidrogenasa

Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH

Se diferencian por su movilidad electroforética

Usadas en clínica: sueros normales y sueros con

alguna patología

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Inhibición enzimática

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de

interacciones con el centro activo u otros centros específicos

(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a

la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la

molécula, causando un cambio conformacional con

repercusión negativa en la actividad enzimática.

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Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,

con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,

impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo

haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la

fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción

catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato

una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo

se conoce como Inhibición Anticompetitiva

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Inhibidores Competitivos

Compiten con el sustrato por el sitio activo

de la enzima

Se une solo a la enzima libre

V máx no se altera y K M cambia

E ES

EI

I

S

E + P

Inhibición

Competitiva

Las fijaciones de substrato e inhibidor son

mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

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E ES

EI

I

S

E + P

Se define una constante de

equilibrio de disociación del

inhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

vV s

Ki

Ks

mx

m

i

1

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Inhibidor competitivo

Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor

competitivo es desplazado y se forma producto

Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

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31

Características:

• Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente

exclusivas

• A muy altas concentraciones de substrato desaparece la

inhibición

• Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo

químico del substrato.

• El inhibidor es tan específico como el substrato

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la

Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy

altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia

del inhibidor competitivo.

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Inhibidor competitivo

Km

Sin

inhibidor

Km

con

inhibidor

Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo

aumenta la Km

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

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Inhibidor No Competitivo

Se une a un lugar diferente del sitio activo

la enzima

Se une a la enzima libre y también al

complejo enzima-sustrato

Por acción del inhibidor disminuye la Vmáx

pero el valor de KM no se altera

E ES

EI

I

S

E + P

I

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI

ni el complejo ESI son productivos

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Inhibidor NO competitivo

El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un

sitio diferente del sitio activo

Inhibidor Incompetitivo

Se une a un lugar diferente del sitio activo

de la enzima

Se une sólo al complejo enzima-sustrato

Los efectos que tiene: disminuye el valor

de KM y también el de Vmáx

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E ES

S

E + P

I

ESI

Inhibición

Anticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;

el complejo ESI no es productivo

Inhibidores Irreversibles

Producen inactivación permanente de la

actividad enzimática

Se interfiere con el normal desarrollo de

una reacción o vía metabólica

Ejemplos: p-cloromercuribenzoato,

yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

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Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo

químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,

sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación

del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente

tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

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Enzimas Alostéricas

Son enzimas cuya estructura proteica está

formada de varias subunidades

No se rigen por la cinética de M - M

Además del sitio o centro activo tienen sitios

alostéricos o de regulación

Sitio activo/sustratos;

Sitio alostérico/moduladores o reguladores

La relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética

sigmoídea

Enzimas alostéricas

Las enzimas alostéricaspresentan estructuracuaternaria.

Tienen diferentes sitiosactivos, unen mas de unamolécula de sustrato

La unión del sustrato escooperativa

la curva de velocidadpresenta una formasigmoidal

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RESUMEN

Las enzimas son proteínas que catalizan

las reacciones biológicas

Presentan especificidad por su sustrato

Cada enzima presenta dos parámetros

importantes Vmax (saturación de la

enzima) y la Km (medida de la afinidad

por el sustrato)

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La actividad enzimática puede ser

inhibida, por inhibidores competitivos

(similares al sustrato) o por inhibidores no

competitivos.

La temperatura y el pH afectan a la

enzima en su actividad catalítica.

Algunas enzimas requieren de coenzimas

y/o cofactores para su actividad.