clases biotecnología 2016 chia wong

01 Introduccion a la Biotecnologia p2.pptx

02 Cultivo de Tej Veg - fundamento.pptx

03 Reguladores de Crecimiento.pptx

03 respuestas no deseadas.pptx

04 Aclimatacion new.pptx

04 Micropropagacion b.pptx

05 Cultivo de Meristemas.pptx

06 Aclimatación nuevo.ppt

06 Cultivo de anteras (2).pptx

06 germoplasma - crioconservacion (2).pptx

07 Protoplastos.pptx

08 suspension & metab 2nd.pptx

09 Marcadores moleculares 1.2a.pptx

09 Marcadores moleculares.pptx

10 Tecnologia del ADN recombinante 1.2.pptx

10 transgenicos.pptx

11 Biopharming.ppt

01 Introduccion a la Biotecnologia p1.pptx

La Biotecnología Vegetal

Seguridad alimentaria

Tiene tres aspectos fundamentales:

1. La disponibilidad de alimentos.

2. El acceso de las personas a ellos.

3. El aprovechamiento biológico de los mismos.

Productividad de los cultivos

Suelo Clima

Variedad

Manejo poscosecha

FACTORES1. Genotipo.2. Control de plagas y

enfermedades.3. Técnicas de manejo

agronómico4. Mejoramiento del

suelo.5. Manejo de las

condiciones climáticas.

Características deseadas por los fitomejoradores

• Resistencia a enfermedades y plagas.

• Disminuir el costo de producción.

• Incrementar el rendimiento/ha

• Aumentar la calidad organoléptica.

• Mejora del contenido nutricional.

• Tolerancia a stress abióticos (cambio climático, heladas, etc.)

• Precocidad.

• Incrementar la productividad (rendimiento/ingreso)

• Asegurar la inocuidad del alimento.

Diferentes rutas del fitomejoramiento moderno

Recursos Genéticos y Genómicos para la pre-mejora y mejora de los cultivos

Estrategias para obtener variedades mejoradas usando la biotecnologia

MejoramientoDiversidad del

patógenoDiversidad del germoplasma

Desarrollo de marcadores moleculares Nueva

variedad

Genes importantes

EnfermedadesProducciónCalidad

Selección Asistida o transformación genética

Biólogos molecularesFitomejoradores

Fitopatólogos

Tomado de: Uilson Lopes Coord. Biomol SEGEN/CEPEC/CEPLAC

• Cultivo de Tejidos Vegetales.

• Marcadores Moleculares.

• Ingeniería Genética.

Técnicas de la Biotecnología que contribuyen a la mejora vegetal

Tomate silvestre

Tomate cultivado

Domesticación del tomate

Consecuencias de la domesticación

• Las plantas domesticadas se caracterizan por:

- Rasgos que confieren adaptación al ambientehumano.

- Pérdida de capacidad reproductiva, dedispersión de la semilla e inactividad de lasemilla.

- Pérdida de capacidad adaptativa.

Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.

Técnicas más utilizadas en I+D+I (Investigacion, Desarrollo e Innovacion:

Recursos genéticos 21 %

Mejora de productividad 23 %

Protección de plantas 25 %

Otros 19 %

Grandes temas en I+D+i:

Distribución de actividades de la I+D en Biotecnologia en América Latina y el Caribe

Cultivo de tejidos 29%

Marcadores moleculares 27%

Diagnóstico 20%

Ingeniería genética 14%

Cadenas de comercialización de productos agrícolas:

¿Cómo participa la biotecnología vegetal??

BIOFERTILIZANTES

Microorganismos que incrementan el suministro y disponibilidad de nutrientes.

Ejemplo:

Efficient Microorganisms®

BIOPESTICIDAS Bacillus thuringiensis

Es compatible la Agricultura Orgánica con la Biotecnología?

Microalgas: producción masiva

APLICACIONES:

1. Alimento humano y animal.

2. Polisacáridos: alginatos.

3. Propiedades medicinales.

4. Biomasa para biocombustibles.

5. Biofertilizantes.

Género

NicotianaCatharanthus

CinchonaDuboisiaDatura

BetaLippia

ArtemisiaCoreopsis, Bidens

Tagetes

DigitalisCassiaPanax

ChaenactisPodophyllum

LinumLithospermum

Solanum

Metabolito

AlcaloideAlcaloides piridínicosIndoles

Tropano

OtrosBetalainaSesquiterpenos

PoliacetilenosTiofenos

Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos

NaftoquinonasEsteroides

Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Tipos de plantas más utilizadas

Freatófitas

- Plantas de raíces profundas

(álamo, sauce, algodonero).

Pasturas

- Por su tipo de raíz retienen el suelo.

Legumbres

- Permiten enriquecer el suelo en N2.

Acuáticas

- Permiten la degradación de contaminantes

en ciénagas artificiales.

Fitorremediación

Marcadores Moleculares

• ¿Que es un Marcador?

• Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede determinarse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico y/o molecular.

Tumbes LimaTrujillo Chimbote¿?

¿Son el mismo genotipo? ¿tiene parentesco alguno?¿Si son diferentes Cuanta diferencia hay entre ellos?

Método:1. Extracción de ADN2. Amplificación de fragmentos de ADN3. Corrida electroforética4. Teñido y visualización de bandas5. Análisis de la información

Individuo A Individuo B

Identificación de individuos

ICS-6ICS-1

Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS

2

3

4

5

6

7

8

9

101112

0.44 0.52 0.60 0.68 0.76 0.84 0.92 1.00

C42 HTM1 C65 PA150 U1U9 U12 U15 CAT4 U26U54 SCA6 CCN51 C53 U68 U43 U48 SilvHu SeñoA H12 Pand U60 C69 C81 H61C85 P7 ChuC U70UF29 H60 H37 Seño

1

EET400 EET228 EET233 M18.16 EET62 ICS6 ICS78 ICS95 ICS1 ICS39 M1.7 I16.20 UF667 I12.12 IMC67 I14.20 ChuS

0.79

13

Análisis de agrupamiento o “cluster” para medir el grado de diversidad genetica entre los cacao en estudio.

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37

-0.23

-0.08

0.06

0.20

0.34

EET400

EET228EET233

EET62ICS6 ICS78

ICS1ICS95

ICS39

M18.16

M1.7

UF667

U1

CAT4

U9

U12

U15

U26

U43

U48

U54

U60

U68

U70

SCA6C42

C53

C65HTM1

CCN51

IMC67

I12.12

I14.20

I16.20

C69

C81

C85

SilvHu

H12H61

Pand

PA150

P7ChuC

ChuS

SeñoA

Dimensión 1

Dim

en

sió

n 2

PCoA50 OTUs

Análisis de ordenamiento (coordenadas principales) para distinguir grupos entre los cacao en estudio.

Micro-arrays can carry 20,000 genes on a 2 cm2

plate. When arrays are probed with RNAs from, say, stressed and unstressed plants computer enhanced imaging identifies genes that are under-expressed (in red) and over-expressed (in green).

Estudio de la expresion genética con microarreglos o “microchips de ADN”

Ingeniería Genética de Plantas

¿ Cómo combinamos ADN de diferentes organismos?

• Cortando y uniendo trozos de ADN de diferentes organismos para producir una molécula de ADN híbrida.

• Las plantas transgénicas se han construido sobre la base de introducir al sistema genético de la planta receptora información genética adicional proveniente de otro organismo donante.

Ingenieria Genética de Plantas

Transformando plantas

Resistencia a enfermedades

Potenciando al tomate(Lycopersicon esculentum)

Licopeno, carotenoide, antioxidante (relacionado a vitamina A)

Maduración retardada (etileno)

Variedades tolerantes al alto contenido de sales en suelo y agua de riego (acumulación de sales en follaje)

Deficiencia de vitamina A: efecto sobre la capacidad visual, susceptibilidad a diarreas y fallas cardiovasculares

Consumo masivo en Asia

Carece de precursores de vitamina A

Inserción de genes asociados a la síntesis de ß-caroteno, precursor de la vitamina A

El “arroz dorado” y la deficienciade vitamina A

http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/components/7055fig7.html

http://www.filmnebraska.org/gallery/crop.htm

http://www.hockinghills.com/gallery/pg_82.htm

http://www.ba.ars.usda.gov/history/photos/1970_2.html

Soya, maíz y trigo

La soya se usa en el 40-60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, cerveza. Tolerancia a herbicidas (Roundup Ready, liberado en 1996, glifosato).

El maíz es un producto de consumo muy difundido. Genes bt.

En el trigo se estudia la introducción de genes implicados en la síntesis de la glutenina del trigo, relacionados en la elasticidad del gluten, útil para la panificación.

http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC7055.html

Vacunas comestibles de origenvegetal

• Protección contra la hepatitis B (antígeno de superficie HBsAg), el cólera, la diarrea (E. coli, toxina LT-B, CT-B), HIV (gp120), herpes

• Plantas: papa, plátano, tomate, tabaco, otras frutas

• Evaluaciones en laboratorio en estado avanzado. En papa, hasta 0.3% de ab solubles de LT-B en papas hervidas (Tacket et al, 1998)

• Actualmente, fase de prueba en voluntarios• Cornell Univ., Univ. of Loma Linda (California), Maryland, Pennsylvania,

Mississippi

http://home.cwru.edu/~eay3/ESR/vaccine2big.htm

http://www.sciam.com/2000/0900issue/0900langridge.html

Retos de la Biotecnología en el Mejoramiento Genético de Plantas

• Solucionar problemas de contaminación ambiental.

• De erosión de suelos.

• Brecha Político Social Económica.

• Salinidad de los suelos.

• Disminuir la erosión genética.

• Altos costos de producción.

• Pérdida de competitividad.

• Enfrentarse al incremento de plagas y enfermedades.

Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos

vegetales

Cultivo in vitro de plantas consiste en lograr que un “explante” en

un medio nutritivo estéril regenere en una o más plantas

completas. También permite la producción de metabolitos

secundarios.

Introducción

Etapas

Laboratorio

Invernadero

Establecimiento in vitro

Plántulas enraizadas

Aclimatación

Campo

morfogénesis in vitro

Plántulas no enraizadas

Enraizamiento ex vitro

Regeneración

explantes

Cada una de las células de unindividuo vegetal, proporcionandolos estímulos adecuados, posee lacapacidad necesaria como parapermitir el crecimiento y desarrollode un nuevo individuo, sin quemedie ningún tipo de fusión decélulas sexuales o gametos.

Haberlandt (1902)

Totipotencia

Morfogénesis

Embriogénesis cigótica

1. Organogénesis.

2. Embriogénesis.

Tipos de Morfogénesis in vitro

Morfogénesis directa e indirecta (Hicks, 1980)

Una dediferenciación celular

acompañada de crecimiento

celular desorganizado y la

formación de meristemoides

puede generar indirectamente

órganos o embriones.

Respuesta morfogenética

por la cual o se forman

directamente órganos o

embriones.

Organogénesis

Embriogénesis somática

De Klerk et al. 1997:

a. Adquisición de la competencia.

Las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren

esa competencia durante una fase de desdiferenciación.

b. Inducción.

Las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación

directa entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del

crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar.

c. Realización.

La célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano

determinado.

Fases de la Morfogénesis

http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html

Son cuatro los principales:

a. Explante.

b. Genotipo.

c. Condiciones químicas.

d. Condiciones físicas.

Factores que afectan los procesos morfogénicos

Explante

a. Estado fisiológico de la planta madre.

b. Sector del cual se toma el explante.

c. Estado sanitario.

d. Tamaño.

e. Esporofito o gametofito.

f. Época del año.

protoplasto

Radice, Silvia. Morfogénesis in vitro. En: ECHENIQUE, V.; RUBINSTEIN, C. Y MROGINSKI, L.A. (eds.) 2004.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ediciones Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Consejo

Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología. Buenos Aires, Argentina.

a. Factor determinante.

b. No es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo.

c. Variación intravarietal de respuestas regenerativas.

Genotipo

a. Composición salina del medio de cultivo.

b. Composición orgánica + fuente de carbono.

c. Reguladores de crecimiento.

d. Antibióticos.

e. Fenolización.

f. Agar, Gelrite® , Phytagel®

g. Atmósfera gaseosa.

h. pH: 5,4 – 5,8

Condiciones Químicas

Requerimientos nutricionales

a. Temperatura.

b. Humedad relativa.

c. Luz (Fotoperiodo).

Condiciones Físicas

• Micropropagación vegetal (embriogénesis y organogénesis).

• Cultivo de meristemas.• Cultivo de suspensiones de células .• Cultivo de protoplastos.• Cultivo de anteras, óvulos y embriones.• Microinjertos.• Microtuberización.• Producción de metabolitos secundarios.• Etc.

Técnicasdel cultivo de células y tejidos vegetales

Infraestructura

Área de Preparación

Área de Siembra o Transferencia

Cabinas de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril.

Área de Incubación

•Asepsia.•Temperatura: 25-27°C.•HR: 99%.•Fotoperiodo controlable.• Intensidad luminica

controlable.

Invernadero

Reguladores de crecimientovegetales

o fitohormonas

Reguladores de Crecimiento

• Son sustancias que promueven e influencian el crecimiento, desarrollo y la diferenciación de células y tejidos.

• Determinan la formación de flores, brotes, hojas, senescencia, el desarrollo y maduración de los frutos.

• Actúan a bajas concentraciones (0,1 – 1,5 ppm).

• Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas de las diferentes fitohormonas).

• Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

• Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida, pero su concentración fluctúa.

• Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

Papel de diversas fitohormonas como reguladores del crecimiento

Factores que influyen en Auxinas

Factores que influyen en Giberelinas

N

OH

O

Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)

Auxinas

Las Auxinas , descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptilo de las gramíneas.

Se usan como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis.

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión.

• La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

Posibles etapas en la acción de la auxina

Funciones

• Alargamiento y división celular

• Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos

• Formación de raíces adventícias

• Dominancia apical

• Acción herbicida

• Estimulación de la producción de etileno.

(2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acidAcido 2,4,5 tricloro fenoxi acetico (2,4,5 T)

(2,4-dichlorophenoxy) acetic acidAcido 2,4 diclorofenoxi acetico (2,4D)

Acido indol acetico (AIA)β-indoleacetic acid

4-(1H-indol-3-yl)butyric acidAcido indol butirico (AIB)

Acido naftalen acetico (ANA)1-naphthylacetic acid

Descubiertas en 1955 al estudiar las sustancias promotoras de la división celular in vitro.

Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

•Promoción de la Division celular, reguladorde la fase G1.

•Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas).

•Retardo de la senescencia.•Síntesis de clorofila y desarrollo de

cloroplastos.

Citoquininas

En combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas

Precursores de las citoquininas

1. Se pueden obtener como subproductos del ADN sometido a altas Tº

2. Conjugados de ribosidos, riboctidos, glucosidos, conjugados de aminoácidos.

3. Ej: ribosido de zeatina, riboctido de zeatina, adenina, adenosina.

Se producen en el embrión y en el ápice de las raíces.

Su transporte es no polar:

1. A través del xilema, con transportador especifico.

2. Por liberación como ribósido o base nitrogenada.

• Citoquininas endógenas:

• Zeatina (Zea)• Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:

• Kinetina (Kin)• Benziladenina o Bencil amino purina (BAP)

• La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.

Citoquininas - Estructura química

NH CH2 CH C

CH3

CH2OH

Zeatina

NH CH2 CH C

CH3

CH3

Isopenteniladenina(IP)

6-bencilaminopurina

N NH C

H

H

N

N N

N

N

• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, en plantas de arroz infectadas.

• Éstas presentaban marcada clorosis y entrenudos largos.

• El ácido giberélico (AG3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

O

HCH3

H COOHH

HO OH

CH3

C O

Acido giberélico (AG3)

Las Giberelinas

Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

– Favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes nuevos.

– Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos.

– Crecimiento de yemas latentes.– Germinación de semillas en dormición.– Floración.– Movilización de reservas en la semilla.

• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.

• Los tejidos etiolados tienen alta conc. de giberelinas.

• En menor proporción en ápices y en raices.• Ruta de síntesis de la giberelina: ciclo de calvin.• Se estudió su actividad biológica en mutantes

para las enzimas de la síntesis de AG.• Su transporte no es polar.

Ácido absicico (ABA)

• Aislado de frutos jóvenes de algodón, que se secaban y caian(abscisión o caída).

• Se estudio la latencia inducida por fotoperiodo.

• Sesquiterpenoide, acido débil: pH 4,75• ABA natural y sintético.• Regulación de la biosíntesis del ABA por desdoblamiento de las

xantófilas.

• Tiene efectos diferentes en tallo o raíz.

• Déficit hídrico moderado, ABA incrementa el elongamiento de la raíz.

• Déficit hídrico severo, ABA inhibe el desarrollo de la raíz.

Reglas generales para la acción hormonal:

• Auxina : Citokinina = ~1 Callo

• Auxina : Citokinina < 1 Tallo

• Auxina : Citokinina > 1 Raíces

Respuestas no deseadas en cultivo in vitro

Contaminación en el cultivo in vitro de plantas

Principales fuentes de contaminación

• Contaminación de las plantas madres.

– El explante

• Contaminantes microbianos introducidos en el laboratorio.

– El operario(a).

– El ambiente

– Los equipos y el instrumental.

– Los insectos.

Influencia de los microorganismos en el cultivo in vitro

• Los principales microorganismos asociados con lasuperficie de las plantas son: hongos, levaduras,bacterias, spiroplasmas y micoplasmas.

• Las áreas donde se concentran mayor cantidad denutrientes en la superficie de las plantas son:néctar, ceras, tejidos senescentes, etc.

• Las poblaciones de hongos y bacterias puedendesarrollarse en residuos de insectos, además, lashendiduras, pelos densos y superficiesmucilaginosas pueden albergar microorganismos.

Métodos de identificación de contaminantes

• Se emplean los métodos tradicionales auxiliadosde los manuales de clasificacióncorrespondientes, aunque existen modernastécnicas como el análisis de ácidos grasos, PCR,RFLP y AFLP que se incorporan paramicroorganismos específicos de un cultivo.

• Es importante estudiar y determinar la microbiotaespecífica de un laboratorio, biofábrica o paíspara poder diseñar los métodos de detección ycontrol en función de esto.

Contaminación

GRADO DE CONTAMINACIÓN DE EXPLANTES DE CAFÉ

INICIO CONTAMINACIÓN

MEDIA CONTAMINACIÓN

ALTACONTAMINACIÓNN

Fenolización

FENOLIZACIÓN EN EXPLANTES DE CAFÉ

INICIO FENOLIZACIÓN

MEDIA FENOLIZACIÓN

ALTAFENOLIZACIÓN

Cultivo de varas de Phalaenopsis

Vitrificación

• Es el estado de hiperhidricidad (antesconocido como vitrificación)

• Es una malformacion fisiológica que resulta deuna excesiva hidratación, baja lignificación,disfunción estomática y una reducida fuerzamecánica en los tejidos de las vitroplantas.

• La consecuencia es la pobre regeneración detales plantas.

Síntomas y cambios anatómicos

• Apariencia translúcida, debido a unadisminución de la clorofila y un alto contenidode agua.

• Una delgada capa cuticular o su ausencia.

• Reducido número de células en palisada.

• Estomas irregulares.

• Una pared celular poco desarrollada.

• Grandes espacios intracelulares en la capa decélulas del mesófilo.

Causas

• Alta concentración de sales.

• Alta humedad relativa.

• Baja intensidad lumínica.

• Acumulación de gas en el interior del recipiente.

• Duración del tiempo de intervalo entre subcultivos.

• Número de subcultivos.

• Concentración y tipo de agente gelificante.

• Tipo de explantes utilizados.

• La concentraciones de microelementos.

• Inbalances hormonales.

Causas

• La hiperhidricidad es comun en plantascreciendo en cultivo liquido o cuando hay una baja concentracion de agentegelificante.

• La alta concentración de amonio tambiéncontribuye.

Callos hiperhídricos de Nicotiana tabacum

Variación somaclonal

Mecanismos por los que ocurre la variación somaclonal

1. Alteraciones en el cariotipo.

2. Mutaciones puntuales.

3. Recombinación somática.

4. Elementos genéticos transponibles.

5. Metilaciones ADN.

6. Cambios ADN de orgánulos.

7. Prevalencia de tejidos quiméricos.

Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal

1. Genotipo.

2. Nivel de ploidía.

3. Explanto.

4. Vía de regeneración.

5. Condiciones de cultivo.

6. Reguladores del crecimiento.

7. Deficiencia de oxígeno.

8. Edad del cultivo.

9. Deficiencia o exceso de minerales.

Detección de la variación somaclonal

• Morfológicos

• Cariotípicos

• Bioquímicos

• Fisiológicos

• Moleculares

Variación en las hojas de yuca regeneradas in vitro

Estrategias para la

selección de variantes

útiles

Somaclones comerciales

1. Caña de azúcar – Resistentes a stress biótico y abiótico.

2. Patata – Resistencia a hongos y virus.

3. Ornamentales – color: gerbera, clavel y crisantemo, arquitectura floral: geranio.

4. Camote – calidad de raíces.

5. Maíz – contenido en triptófano.

6. Tomate – contenido en materia seca.

7. Apio – Rendimiento.

8. Arroz – resistencia a distintos tipos de stress. Caracteres agronómicos.

9. Mostaza – rendimiento.

10. Cebada – Tolerancia a glifosato.

11. Banana - resistente a Fusarium oxyporum.

12. Tabaco – tolerante a Al y resistente a herbicidas.

13. Trigo – resistente a Helminthosporium.

14. Alfalfa – resistente a Fusarium oxyporum.

Fase 4 de la micropropagación

La AclimataciónEndurecimiento (hardening), Rustificación,

etc.

Aclimatación

• Plantas in vitro deben adaptarse y crecer en condiciones in vivo (ex-vitro) más estresantes.

• La transición requiere Alta Humedad.

• Requiere una intensidad apropiada de luz.

• Requiere 20-25º C (muy variable).

• Requiere un suplemento adecuado de nutrientes.

• Requiere una correcta humedad del suelo.

• Crecimiento Nuevo = ÉXITO.

Aclimatación

• Adaptación de las plántulas de cultivos de tejidos al ambiente externo.

• Medios ambientes extremadamentediferentes – fuera y dentro.

• Puede requerir técnicas especiales para la adaptación o fortalecimiento.

• La mayoría de plantas no pueden sertransferidas directamente de cultivo al invernadero o campo.

• Muchas de las caracteristicas de plantasdesarrolladas in vitro son muy diferentes de las plantas que crecen in situ.

Aclimatación

Ceraepicuticular

• ClavelA. Invernadero

B. Invernadero

C. Cultivo in vitro

D. Cultivo in vitro

Ceraepicuticular

Plantas de clavel in vitro

A. Cultivo in vitro

B. Camara de incubacion

C. Camara de incubacion

D. Anormal

E. Invernadero

F. Anormal

Epicuticular wax on plants

Medios ambientes

• Cultivo de tejidos

– Poca luz

– Alta HR ~98%

– [CO2] - 300 ppm

– Sacarosa presente

– Esterilidad

• Invernadero/Campo

– Alta luz

– HR ~ 30-80%

– [CO2] - bajo

– No sacarosa

– Patógenos presentes

Cambios en las vitroplantas

• Cera epicuticular

• Funcionamiento estomatal

• Anatomia de las hojas

• Funcionamiento de las raices

Vitroplantas “Normales”

• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?

• Muchos sintomas de hiperhidricidad son poco severos

– Cuticula desarrollada pobremente.

– Pueden tener cera epicuticular

– Espacios intracelulares grandes

– Desarrollo minimo de la palisada.

Anatomia foliar

• Cuticula muy delgada

• Grandes espacios de aire intracelular

• Capa de la células en empalizada pobrementedesarrolladas.

Fresa – crecimiento en invernadero

Capas en empalizada

Mesófiloesponjoso

Espacios de aire

Fresa – cultivo in vitro

Grandesespacios de aire

Una capa de células en empalizada

Conductancia estomática en plantas cultivadas in vitro

Pérdida de agua

Deben ocurrir cambios

• Se debe formar la cera epicuticular.

• Los estomas deben responder mas rapidamente.

• La actividad fotosintetica – incrementada.

• Obs: la cantidad de los cambios no es la misma para todas las plantas.

Funcionamiento estomatal

Técnicas para Aclimatación

• Remoción de la sacarosa de las raices• Aumentar HR

– nebulización– Aspersión intermitente

• Luz reducida– Gasa– Malla Saran

Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz

El tipo de enraizamiento preferido es el que se realiza fuera del cultivo in vitro

(ex vitro).

Esta bandeja de brotes ha sido sacado del ambiente estéril, y son cortados y

sumergidos en una solución con hormona enraizante, (auxinas)

… luego estos brotes (aun sin raiz) son plantados en un sustrato estéril,

estableciendo algo asi como un almácigo

Son trasladados a un ambiente con nebulización y poca iluminación,

asemejando las condiciones de cultivo in vitro

En los próximos 10 a 14 dias, la nebulización es reducida y las

coberturas retiradas, hasta que las plantas no necesiten extra

protección (por eje. las plantas de la derecha)

Los brotes ya enraizados son trasladados a recipientes mas grandes, e

incrementarán su tamaño en solo algunas semanas.

Para terminar el proceso de aclimatación, se trasladan a un tinglado al

menos una semana antes de su plantacion. Y después de todo este

trabajo, las plantas están listas para el campo definitivo.

Vitroplantas en invernadero

Sistemas de nebulización paravitroplantas

Micropropagación vegetal

México, Noviembre de 1998

• Indicios de que la industria del agave para tequila (Agave tequilana Weber var. Azul) tenía una gran demanda

• Por ende, se estaban realizando año con año plantaciones cada vez mayores.

• Las estadísticas de siembra indicaban necesidades de hasta 30 millones de plantas al año.

1999

• Se había declarado una fuerte necesidad de material vegetal de siembra sano para esta industria, dado que las enfermedades propias del cultivo estaban acabando con gran parte de las plantaciones.

(a) Selección de las plantas donadoras por su alta productividad

(b) Inducción de la planta madre para selección de tejidos libres de enfermedades

(c) Multiplicación de plantas in vitro por gemación axilar

(d) Plantas enraizadas al salir del laboratorio listas para su aclimatación en invernadero

(e) Plantas adaptadas al salir del invernadero

(f) Plantas micropropagadas de cuatro meses en el campo.

(g) Plantas micropropagadas de ocho meses en el campo.

AGROMOD, una subsidiaria de Savia en México

• El primer año de funcionamiento, se produjeron 400 mil plantas.

• En el año 2002 se lograron dos millones.

• Para el 2003 se proyectó superar los 4,5 millones, tomando en cuenta tres especies: Cordyline, banano y agave.

• Desde el punto de vista económico, no sólo se resolvió el desabastecimiento de material limpio, homogéneo y de calidad, sino que se logra un impacto altamente significativo en los costos de producción de materia prima para tequila.

COMPARACIÓN ENTRE LAPROPAGACION TRADICIONAL Y CULTIVO DE

TEJIDOS DE PLÁTANO

Propagación clonal de Carica papaya var. Maradol y Tainung.

• Propagación vegetativa rápida y a gran escala• Uniformidad seleccionada del material clonado.• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin.• Mayor control sobre la sanidad del material propagado y posibilidad de Certificación.• Introducción rápida de nuevos cultivares• Conservación de germoplasma• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal

Ventajas de la Micropropagación vegetal

• Instalaciones muy especializadas• Trabajadores especializados.• Contaminación.• Diferente protocolo de micropropagación dependiendo de la especie o cultivar.• Tamaño de la plántula, al inicio son muy pequeña.• Estabilidad genética.• Costos.

Desventajas de la micropropagación vegetal

Biofábricas

• Ornamentales:

•Bromeliaceas

•Helechos

•Orquídeas

•Anthurium

• Especies leñosas:

•Araucaria

•Coffea

•Eucalyptus

•Malus

•Rosa

•Vitis

• Otras plantas (hortícolas)

•Allium

•Apium

•Arachis

•Asparagus

•Beta

•Brassica

•Glycine

Ejemplos plantas

micropropagadas

in vitro

http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html

Organogénesis

Definición amplia:

Produccion de órganos a partir de explantes, sea indirectamente a traves del estadío de “callo” o directamente del tejido.

Sistemas de propagación vegetativain vitro

Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta

Material de partida

1. Meristemos caulinares y segmentos de tallos con yemas axilares.

2. Tejidos que formen: tallos adventicios y/o embriones adventicios, directamente o indirectamente.

Micropropagación vegetal:Otros Explantes

•Parte esporofiticade estructuras reproductivas: estaminodios, estambres, pétalos.

•Hojas jóvenes.

- Multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes.

- Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.

- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.

Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes

Cortes Nodales

Las secciones nodales se cortan y se individualizan, usandose como explantes para producir nuevos talluelos.

El seccionamiento de los nodos elimina la dominancia apical .

http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/Chap3898/sld006.htm&h

Corte de secciones nodales

La tasa de multiplicación (t.m.) puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

Ejercicio:

Cuantas vitroplantas se pueden obtener después de un año, con una tasa de multiplicación de 5 brotes por mes, a partir de una única yema inicial.

Mes 0: 1 broteMes 1: 5 brotesMes 2: 5 x 5 brotesMes 3: 25 x 5 brotes

Mes 12: ………………..

Multiplicación de brotes Vacciniummeridionale.

Tasa de multiplicación 15-25 brotes/explante

Callogénesis en la naturaleza

Organogénesis en Callos

+ Callos

++Callos

Embriones iniciados a partir de células que no son el productode la fusión de gametos.

Embrión somático, asexual o adventicio

Son estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexión vascular con el tejido materno, las estructuras bipolares deben ser también capaces de crecer y formar plantas normales.

• La Embriogénesis Somática es laproducción de embriones a partir decélulas somáticas o “no-germinales”.

• Pueden ser producidas por cultivos desuspensión celular.

• Puede involucrar un estadio intermediariode callo (E. indirecta), lo cual resultaría enmayor probabilidad de variaciónsomaclonal entre las plántulas generadas.

Embriogénesis Somática

• Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:– Masas proembriogénicas– Estadío globular– Torpedo– Embrión.


• Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática:

1. Iniciación: callos embriogénicos2. Proliferación: callos embriogénicos, masas

proembriogénicas (PEM)3. Desarrollo y maduración de embriones :

embriones4. Germinación de embriones (Regeneración)


Carrot: Cell suspension-derived Grapevine: Callus-derived

Semilla artificial - antecedentes

• Muchas especies son estériles y no producen semillas.

• Otras especies, en particular algunas tropicales, producen semillas recalcitrantes que no pueden ser secadas.

• Poca efectividad en la conservación del germoplasma y con grandes gastos (actualmente son con plantas vivas en el campo).

• Altos costes para la obtención de pequeñas cantidades de semillas híbridas.

Semillas artificiales

• Llamadas también semillas sintéticas• Producción en masa de semillas genéticamente

mejoradas.• Es la encapsulación de embriones somáticos, con

la finalidad de protección y nutrición, con un material permeable al agua y biodegradable.

Explante

(disco de hoja)Explanto

(células vegetales)

REGENERACIÓN

Suspensión celular

Embriones somáticos

ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN

GERMINACIÓN Semilla

artificial

Callo

Esquema general de producción de semilla artificial

Procedimiento:1. Encapsular en

cápsulas de gel, recubrir con una cubierta adecuada, almacenar.

2. Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.

Semillas artificiales

Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por

encapsulación en alginato

Producción sincronizada y en gran escala de los embriones somáticos

• Es fundamental contar con embriones:

– Simples

– Que no se fusionen entre sí

– Que no se generen embriones secundarios

• Se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automáticos

• Son biorreactores que permiten el control simultáneo de pH, la concentración de oxígeno, temperatura y mezclado entre otras cosas.

Se han obtenido embriones somáticos en especies como:

• Alfalfa (Medicago sativa).

• Soja (Glycine max).

• Apio (Apium graveolens).

• Pasto ovillo (Dactylis glomerata) .

Etapas de la Micropropagación vegetal

A) Iniciación O Establecimiento

- Elección y acondicionamiento de la planta madre.

- Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo.

- Desinfección superficial de los explantes.

- Establecimiento per se del cultivo in vitro.

B) Multiplicación

- Multiplicación del material stock


C) Enraizamiento

Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

D) Aclimatación, Rusticación o Endurecimiento (Hardening)

Pasaje de las plantas crecidas in vitroa las condiciones de maceta o a campo


Planta Madura

Hoja Joven

Antioxidante, retarda

el oscurecimiento

Del tejido

Desinfección con

Hipoclorito de

sodio Sumergido en etanol

Cortar en segmento (descartar

porciones externas)

Placa petri estéril

Insertar segmentos

dentro de medio de

multiplicación

4 a 6 semanas

Primordios

Plantas pequeñas

Crecimiento

Continuo

Dividir en subcultivos

y colocar en medio de

multiplicación fresco

Separar las plántulas

individualmente

Medio de Pre trasplante

Planta joven

en su maceta

Las 4 etapas del cultivo de tejidos de plantas

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Formación de la raíz

Métodos de enraizamiento

Enraizamiento in vitro

Enraizamiento ex vitro

Cultivo de Meristemas

Principales métodos de Micropropagación

MeristemasLos meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta.

Los meristemas determinan el crecimiento de

la planta y dan origen a sus diferentes órganos

Aplicaciones

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Sin embargo, toma más tiempo la producción de brotes.

• Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantespara la criopreservación y conservación de germoplasma.

Domo Meristemático + primer juego de hojasMeristema apical

Primordios foliares

El cultivo de meristemas no incluye los

meristemas laterales. Solo el meristema apical.

Yemas laterales

Tejido para el cultivo de

meristemas

- El domo meristemático no está vascularizado(muchos patógenos se translocan por los tejidosde conducción).

- El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos

Existen varias alternativas complementarias al cultivo de meristemas, para obtener plantas libres de virus:

Limpieza de virus

Termoterapia Quimioterapia

Talluelos in vitro son colocados en una camara de crecimientopor 3-6 semanas a una temperatura de 34-38 oC.Después de la termoterapia, los meristemas se extraen parael cultivo.

Termoterapia

Esta práctica no es efectiva para todos los virus por igual,

depende del virus y del hospedante.

Se ha observado que un mismo virus en distintas especies

se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta práctica

ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y

menos eficiente para virus poliédricos.

En algunos casos las bajas temperaturas (5°C) seguidas del

cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la

eliminación de virus.

Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de

viroides, los cuales se desarrollan bien con altas

temperaturas.

Termoterapia

El uso de antivirales sería la solución definitiva para las

enfermedades virales; sin embargo, hasta ahora no se ha

encontrado un producto que por sí solo cumpla esta

función.

Algunas sustancias químicas ocasionan una disminución

en la concentración de virus existentes en la planta y

atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los virus,

pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la

concentración original.

Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la más

utilizada es el Ribavirin o Virazole.

Quimioterapia

Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad,

que a su vez depende de la dosis empleada y de la

especie de planta utilizada.

El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios

meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral

constituye una dificultad.

También se han obtenido plantas libres de virus a partir de

callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque

esta práctica no ha sido eficiente en todos los casos.

Quimioterapia

Un modo adecuado de emplear los antivirales es

combinándolos con el cultivo de meristemas.

También han sido aplicados directamente a los

meristemas in vitro.

En este caso, el antiviral es colocado en medio del

cultivo en concentraciones variables, que van desde 10

a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las

plantas son mantenidas bajo la acción del antiviral por

largos períodos que incluyen varios subcultivos.

Quimioterapia

Piña

Tamaño del meristemo: 2 mm

Intensidad luminosa: 3000 lux

Fotoperiodo: 12 horas de luz

Temperatura: 28 +/-4°C

Medio de iniciación y establecimiento: (MS)

• BAP : 2.0 mg/l + ANA: 1 mg/l

Medio de enraizamiento: (MS)

• ANA : 2 mg/l

Resultado: Plantas asépticas de piña

Plátano

Tamaño del meristemo: 0.5-0.7 mm



Temperatura: 26-28°C

Medio de iniciación: Murashige & Skoog (MS)• BAP :1.0 mg/l

Medio de multiplicación: (MS)• BAP :3.0 mg/l

Medio de enraizamiento: (MS), sin hormonas

Resultado: Plantas de plátano asépticas.

Manzano

Tratamiento con calor: 37°C x 2 semanas

Tamaño del meristemo: 0.8-1.0 mm



Temperatura: 26°C

Ribavirin: 25 ug. x 2 subcultivos (40 días)

Medio de iniciación: Murashige & Skoog• BAP :1.0 mg/l

Resultado: Plantas de manzano libres de virus.

Casos: limpieza de virus

Cuadro 4. Eficacia de Virazole para

eliminación de virus en papa.

• Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los virus son los responsables de las mayores pérdidas (entre un 20 y 80% de disminución en el peso de los bulbos).

• Las infecciones son causadas por un complejo viral que incluye:– Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe

virus, LYSV);

– Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantentvirus, SLV),

– Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X, GarV -A -B -C- D- E -X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV).

Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)

libre de virus

Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una cámara a 36ºC.

Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 días a 36°C y luego se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron resultaron «libres de virus».

Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)

libre de virus

A: planta en medio de iniciación.

B: micropropagación.

C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos).

D: planta transferida a tierra y mantenida en cámara húmeda.

E: planta adaptada a las condiciones ex vitro.

F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos.

G: multiplicación a gran escala bajo jaula antiáfidos.

H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).

Esquema de producción

Plantas de ajo libres de virus

IFFIVE-INTA,Argentina.

Métodos para detección de fitopatógenos

Métodos SerológicosELISA: Enzyme-linked Inmunosorbent Assay

Ensayo de inmuno absorción ligada a enzima (tipo sandwich)

Ralstonia solanacearum Bv2A (Raza 3)

• Bacilo gram negativo

• 0.5 x 1.5 um

•Presenta flagelo polar ( atípico)

• Aerobia estricta

• Temperatura óptima: 28-30ºC

Marchitez Bacteriana o pudrición parda de la papa

• Segundo factor más importante que limita la producción de papa

• Gran variabilidad del patógeno

• Amplio rango de hospedantes

Amplia distribución geográfica

Peru: Marchitez bacteriana, Seca seca,

bacteriosis, borrachera

Nombres:

Mucilago típico en el tubérculo

Advanced rotting involving secondary infections

Probredumbre parda

Pudrición parda, moco, mokera, papa llorona

RssBact / ml

108

107

106

105

(+E)

Control

(-E)

Muestranegativa

Muestrapositiva

+E = Extracto de suelo sano con enriquecimiento- E = Extracto de suelo sano sin enriquecimiento

Métodos moleculares

Fase 4 de la micropropagación

La Aclimatación

Endurecimiento (hardening), Rustificación,

etc.

Aclimatación

• Adaptación de las plántulas de cultivos de

tejidos al ambiente externo.

• Medios ambientes extremadamente

diferentes – fuera y dentro.

• Puede requerir técnicas especiales para la

adaptación o fortalecimiento.

Aclimatación

• La mayoria de plantas no pueden ser

transferidas directamente de cultivo al

invernadero o campo.

• Muchas de las caracteristicas de plantas

desarrolladas in vitro son muy diferentes de

las plantas que crecen in situ.

Medios ambientes

• Cultivo de tejidos

– Poca luz

– Alta HR ~98%

– [CO2] - 300 ppm

– Sacarosa presente

– Esterilidad

• Invernadero/Campo

– Alta luz

– HR ~ 30-80%

– [CO2] - bajo

– No sacarosa

– Patogenos presentes

Cambios en las vitroplantas

• Cera epicuticular

• Funcionamiento estomatal

• Anatomia de las hojas

• Funcionamiento de las raices

Plantas Hiperhídricas

• Los más extremos – una maladaptación al medio

ambiente externo.

• Vidriosas, apariencia estar llenas de agua.

• Capa de la palisada pobremente desarrollada.

• Reducida lignificación.

• Paredes celulares delgadas.

• Espacios intracelulares grandes.

• Falta de la cera epicuticular.

Causas de la Hiperhidricidad

• Estado fisico del medio

– Liquido

– Agar

– Gelrite

• Citokininas

Vitroplantas “Normales”

• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?

• Muchos sintomas de hiperhidricidad son

poco severos

– Cuticula desarrollada pobremente.

– Pueden tener cera epicuticular

– Espacios intracelulares grandes

– Desarrollo minimo de la palisada.

Pérdida de agua

Deben ocurrir cambios

• Se debe formar la cera epicuticular.

• Los estomas deben responder mas

rapidamente.

• La actividad fotosíntetica – incrementada.

• Obs: la cantidad de los cambios no es la

misma para todas las plantas.

Funcionamiento estomatal

Epicuticular

Wax

• Carnation tc plants

A. Tissue culture

B. Growth chamber

C. Growth chamber

D. Abnormal

E. Greenhouse

F. Abnormal

Epicuticular

Wax

• Carnation

A. Greenhouse

B. Greenhouse

C. Tissue culture

D. Tissue culture

Epicuticular wax on plants

Anatomia foliar

• Cuticula delgada.

• Grandes espacios intracelulares con aire.

• Capa de celulas en empalisada pobremente

desarrollada.

Strawberry - Greenhouse grown

palisade

layers

spongy

mesophyll

air spaces

Strawberry - Tissue culture

large

air

spaces

one layer

of

palisade

cells

Conductancia de vitroplantas

Técnicas para Aclimatación

• Remoción de la sacarosa de las raíces

• Aumentar HR

– nebulización

– Aspersión intermitente

• Luz reducida

– Gasa

– Malla Saran

• Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz

At C&W, as with many commercial labs, rooting in culture (in vitro) is skipped in favor of rooting out of

culture (ex vitro). This tray of unrooted microshoots has now been taken out of the sterile environment.

The microcuttings, as they are called, are trimmed up and soaked in a rooting hormone (auxin) solution...

...then planted in flats much like young bedding plants. At this point they still have

no roots.

Mist Systems for TC Plants

Flats of unrooted microcuttings are transferred to a fog chamber within a

greenhouse. Directly out of culture, the plantlets need high humidity levels and

reduced light (similar to the in vitro environment).

Over the next 10-14 days, fogging is diminished and the tent opened up, until the

plants do not need extra protection (ie. the plantlets on the right). This process is

known as acclimatization or hardening off.

The microcuttings have rooted, transplanted into larger cells, and increased

greatly in size in only a few weeks.

After all that work, the plants are ready for the field. They are moved to a shade

house at least one week before planting to finish the hardening-off process

Cultivo de los gametos de la planta: microsporas u óvulos (células germinales).

Estas son haploides (1 juego de cromosomas).

Las plantas regeneradas son haploides.

Las plantas regeneradas esteriles.

No pueden llevar a cabo la meiosis.

El número de cromosomas necesitan ser duplicado y obtener plantas dihaploides (lasplantas recuperadas son diploides y 100% homocigotas, AABBCCDDEE, AABBCCDDee, aabbccddee, AAbbCCddEE).

Se usan inhibidores de la mitosis: colchicina, fluoralina.

“Fija” los rasgos, disminuyendo el tiempo de mejoramiento.

La mayoría de variedades de Canola son dobles haploides.

P: AABBCCDDEE x AABBCCDDee

F1: AABBCCDDEe x AABBCCDDEe

F2: ¼ AABBCCDDEE, ½ AABBCCDDEe, ¼ AABBCCDDee

F3:

HAPLOIDES: ABCDE, ABCDe

DIHAPLOIDES: AABBCCDDEE, AABBCCDDee

Técnica de micropropagación in vitro, que cultiva

anteras de cultivares elite para regenerar plantas

haploides y diploides (líneas homocigotas), sin

pasar por la endogamia artificial.

Desarrollada por Guha y Maheshwari (1964), en

petunia, hoy se ha extendido a más de 150

especies: arroz, trigo, cebada, maiz, oleginosas,

tabaco, etc.

Las células gametofiticas (microsporas o megasporas) originan

esporofitos haploides por androgenesis y ginogenesis,

respectivamente.

Las anteras inmaduras, son cultivadas en un medio donde se

dividen para formar callo y posteriormente regenerar plantas

haploides.

Los haploides duplicados producen progenie homogénea y

estable .

Lineas completamente homocigotas son producidas en la mitad

del tiempo requerido por el proceso convencional (v.g. arroz)

Recombinant Inbred Lines (RILs)

Fácil de evaluar en cualquier etapa del proceso

Lento desarrollo del mejoramiento genético por

los bajos porcentajes de regeneración.

Limitaciones técnicas:

- Renuencia a la regeneración de plántulas.

- Bajos porcentajes de plantas haploides.

A. Genotipo de las plantas donantes

Variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras,entre especies y dentro de ellas; y suheredabilidad.

Muy evidente en cultivares de ARROZ

La capacidad genotípica de la cebada y trigo, sonrasgos heredados respecto a la formacion decallos y regeneracion de plantulas

B. Ecofisiologia de las plantas donantes

El fotoperiodo

Intensidad luminosa

Temperatura

Nutrición mineral

En tabaco, trigo, cebada y arroz, los granos de polen son morfológica y funcionalmente diferenciados.

.

C. Desarrollo del polen

• Mejor respuesta se tiene cuando se cultiva el polen entre la fase de microspora tardía y de polen temprano

D. Pretratamiento de las anteras

• Temperaturas bajas o altas, con choque osmótico o con otros estimulos – AUMENTA LA PRODUCCION DE PLANTAS A PARTIR DE POLEN

• Anteras o paniculas de arroz a 35oC/10 - 15 min. seguido de 8 dias a

10oC - AUMENTA LA RESPUESTA AL CULTIVO DE ANTERAS

• El tratamiento de frío se relaciona con una disminución del albinismo

de cereales y la estimulación de la mitosis ecuacional de las

microsporas androgenéticas

E. Medio de Cultivo

• Medio liquido: aumenta enormemente el porcentaje de plantasandrogenéticas

• Hay correlación entre el medio de inducción de callos y la tasa deregeneración de plántulas de ARROZ

• Mayor porcentaje de regeneración/numero de anteras plaquedas,hubo en callos inducidos en medio liquido y menos en mediosemisólido

• La adición de extracto de papa al medio de inducción, aumenta la producción de plantas.

• Niveles altos de sacarosa para inducción de callos y bajos niveles para la regeneración.

• Mayor concentración de auxinas para la inducción de embriones y callos.

Protocolo

• Separación y siembra de anteras en medio de cultivo (ejm. mediolíquido N6 de Chu, 1978)

• Formación de callo y posteriormente embrioides (25°C en luz uoscuridad)

• Plántulas haploides regeneradas se someten a luz continua (3000 lux)

• Vitroplántulas de 0.3 cm, se extraen y transfieren a un medio deenraizamiento (12 h. de luz y 6000 lux)

RESUMEN

Se estudió el efecto de la exposición a 4 °C (durante 7, 14 y 21 días) y diferentes concentraciones de fitohormonas sobre la regeneración de plantas a partir de anteras de arroz (Oryza sativa L.), cv. Japónica H2005

Los resultados mostraron que el tratamiento a 4 °C por 7días estimuló la inducción de callos. Las fitohormonas fueron esenciales para esta inducción, lográndose el mayor efecto con una combinación de 2,4-D (1.5 mg L-1) y KIN (1 mg L-1). Se obtuvo también mayor formación de brotes y raíces con la misma auxina y BAP (0.5 mg L-1)

La transferencia a un medio de cultivo sin 2,4-D, permitió obtener 37.5% de conversión a plantas haploides

Figura 2. Regeneración in vitro de plantas de arroz cv H2005 por cultivo de anteras.

A: Anteras

Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras de arroz cv Japónica H2005

B: Inducción de callos


C: Formación de brotes


D: Formación de raíces


E: Regeneración de vitroplántulas


E: Plántula haploide de arroz

Util para aquellas especies de ciclo de crecimiento largo

o para aquellos cultivos de ciclo corto, que se

desarrollan a una tasa de un ciclo por año.

Ejm. La homocigosis del arroz se consigue en 1.5 a 2

años, lo que normalmente se hace en 3 o 6 años

El cultivo de anteras en tabaco es el sistema mas

avanzado para obtener haploides diploidizados

Progreso considerable con algunos cereales: trigo,

cebada y arroz.

El potencial de las anteras depende de la genotipo de las

células madre del polen

Permite seleccionar eficazmente los recombinantes

deseables; asi como, obtener lineas homocigotas

Las lineas homocigotas regeneradas fijan su genotipo y no

sufren segregación adicional

En los haploides duplicados no hay codominancia; i.e.,el

fenotipo = genotipo y aumenta la eficiencia de la selección

AaBbCcDDEeFF -> AABBCCDDEEFF y aabbccddeeff

El tiempo, el espacio y los costos son muy reducidos.

Seguirá siendo el método potencialmente mas eficaz para

obtener plantas haploides

Debe de tenerse en cuenta dos serias limitaciones:

Fuerte dependencia genotipica

Escaso número de plantas regeneradas

Técnicas moleculares dan valiosa información sobre la genética

de caracteres relacionados con el cultivo de anteras

Deberá ser accesible a otras especies cultivadas como: yuca y

maiz

A partir de Microsporas

Re-programación del desarrollo de la microspora para lograr la formacion directa de un embrion.

Embriogenesis de Microsporas

Finalidad

Genera un gran numero de plantulas esporofiticasdihaploides que son equivalentes a las lineashomocigoticas derivadas de retrocruza.

Acorta el ciclo de mejoramiento por 20-40% (un doble haploida F6 de retrocruza)

Expone los rasgos recesivos. Permite un facil tamizado de grandes poblaciones.c

¿Como?

Seleccionar yemas florales con anteras conteniendo predominantemente microsporas en un estadio temprano de desarrollo.

Colapsar las anteras e aislar asepticamente las microsporas.

Realizar un Cultivo en suspension de microsporas a una alta densidad poblacional bajo condiciones determinadas, y usualmente con un tratamiento de ‘shock termico´.

Caso: Canola (Brassica napus). Se regeneraron Plantas Dihaploides con un alto contenido acidos oleico y linoleico reducido y acidos α-linolenico en el aceite de la semilla. Se probaron en el campo por la estabilidad del perfil de acidos grasos y rasgos de rendimiento.

Microsporas uninucleadas en suspension(Brassica napus)

Embriones en estadio temprano}(7-10 dias)

Embriones estadio Medio (10-14 dias)

Embriones estadio tardio(21 days)

Embriones cotiledonarios en estadio tardio

“Germinacion”

Embriones Cotiledonarios transferidos a condiciones de crecimiento con luz y AG3.

Crecimiento de plantulas haploides en cultivode medio semi-solido

Plantula bien-desarrollada haploide lista para transferencia a suelo, o para duplicacion

cromosomica

Plantas Maduras Dihaploides

Conservación de

Germoplasma

1. Recolección de germoplasma (accesos o accesiones).2. Evaluación y caracterización.3. Conservación.4. Programa de mejoramiento:

a. Cruzasb. Selecciónc. Estabilizaciónd. Evaluación regional (ambientes)e. Validación

5. Registro comercial.6. Programa de reproducción de semilla.7. Mercadeo.

Proceso de investigación y desarrollo de una nueva variedad

Qué son los recursos genéticos

• Según la Convención de Diversidad Biológica (1992), los Recursos genéticos son material genético de valor real o potencial, o también son consideradas las variaciones acumuladas por un cultivo durante su proceso evolutivo.

• Pueden definirse como materiales biológicos con valor actual o potencial, que contengan unidades funcionales de herencia o “un acervo de información evolutivamente relevante” .

Valor de los recursos genéticos

• En la naturaleza podemos encontrar que ya se tienen las soluciones a muchos de los problemas que queremos resolver.

• El ser humano las ha aprovechado por mucho tiempo, imitando, seleccionando y mezclando los atributos de los organismos, modificando organismos directamente:– “idea”… por ejemplo: El velcro.– “selección”… variedades de maíz– “técnicas biotecnológicas”… organismos

genéticamente modificados

Velcro


• Los procesos evolutivos han seleccionado una gran diversidad de organismos.

• La sobrevivencia de estos organismos esta basada en un paquete de estrategias de defensa, ataque, alimentación, etc.

• Estas características están codificadas en su información genética.

• Han contribuido y contribuye a la estabilidad presente y futura de:– Agricultura y ganadería– Medicina (etnobotánica)– Procesos industriales

• Aprovechamos los recursos genéticos físicamente:– como material biológico (ej. Barbasco).– como material para mejora genética con

mercados más o menos operantes.


• El avance tecnológico multiplica el valor de los recursos genéticos– Bioensayos farmacéuticos.– Ingeniería genética.

lo cual también hace uso de los recursos genéticos como INFORMACIÓN.

• Estamos en una era basada, no en lo que podemos extraer de la naturaleza, sino en lo que podemos aprender de ella.


Contribución de los RRGG a la economía del pais: desafios y amenazas

Convención de la Diversidad Biológica

1. La conservación de la biodiversidad.

2. El uso sostenible de sus componentes.

3. El disfrute justo y equitativo de los

beneficios obtenidos de la utilización de

los recursos genéticos.

• Importancia: • Seguridad alimentaria.

• Salud.

• Valor espiritual y religioso.

• Agua fresca, combustibles, materiales de

construcción, ropa.

Pérdida de la biodiversidad (influencia antropogenica)

• Urbanización (agua, vivienda, salud, educación, etc.)

• Mayor presión sobre los recursos (erosión suelos, deforestación, sobrepastoreo, salinidad, > uso de energía no renovable, etc.

• Cambio climático (climas extremos, aparición de nuevas plagas y enfermedades), etc.

• Domesticación y selección.

Consecuencias de la domesticación

Las plantas domesticadas se caracterizan por:

- Rasgos que confieren adaptación al ambientehumano.

- Pérdida de capacidad reproductiva, dedispersión de la semilla e inactividad de lasemilla.

- Pérdida de capacidad adaptativa.

Del teosinte al maíz moderno

Erosión genética

1. Disminución de lafrecuencia de un aleloen una población, hastasu extinción

2. Disminución de ladiversidad de la razadentro de la región

3. Extinción odesaparición de la razaen la región

Principales amenazas de la

biodiversidad

• Especies foráneas invasivas.

• Cambio climático.

• Incremento de nutrientes y contaminación.

• Cambio de habitat.

• Sobreexplotación.

Los conductores indirectos que interactuan en formas complejas para

causar cambios en la biodiversidad inducidos por la humanidad. Son

los factores demografico, economico, socio-politico, cultural, religioso,

cientificp y tecnologico

Desafíos

• Población 27 000 000 (doblará en 30-40 años), 40% rural.

• 4,2 millones de Has (3,3 % del territorio peruano).

• 0,16 Has per cápita (uno de los más bajos de los países en desarrollo).

• Cerca de 25 000 sp. de plantas:

– 180 sp. domesticadas

– 1044 sp. de uso medicinal

Tipos de conservación

Conservación «in situ»

Conservación in situ

• Se lleva a cabo en los “laboratorios de la evolución”(campo de agricultores, parques nacionales, reservas naturales).

• Puede tener un componente participativo de las comunidades o agricultores.

• Tiene en cuenta el potencial evolutivo del material ya que los recursos genéticos tiene que hacer frente a factores bióticos y abióticos, así como al flujo de genes.

• Cultivos están sujetos a presión de selección, control del flujo de genes con parientes silvestres, y entre cultivares.

• Material de bancos pueden ser introducidos (repatriados), probados, incrementados y llegar a adaptarse.

• En el tiempo y espacio: selección, migración, deriva y recombinación.

Casos de conservación in-situ

• IPGRI (ahora Bioversity): Fortalecimiento de las bases científicas de la conservación in-situ

• IIAP/INIA/ONGs: Conservación in-situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres

• CONDESAN: Raíces y tuberosas andinas

• EE Andenes, INIA: Rescate de variedades

• Conservación de especies amazónicas

• Selección participativa y producción descentralizada de semilla

Casos de conservación in-situ

Conservación «ex situ»

Conservación «ex situ»

• Bancos de semillas (Cámaras de conservación de semillas)

• Colecciones en campo: plantas perennes, agámicas con semillas recalcitrantes.

• In vitro.

• Jardines botánicos.

• Crio-conservación.

• Conservación de polen.

• Conservación directa de ADN.

Accesión

• También llamada: entrada o acceso

• Unidad de conservación ex situ.

• La semilla se accesa a un banco de germoplasma cuando se conoce su origen, su representatividad y cuando tiene información sobre su origen e identificación.

• Banco de germoplasma: son campos, invernaderos, laboratorios, cámaras frías donde se conservan recursos genéticos.

• Bancos germoplasma en el Mundo: 1460

• N° aproximado de muestras conservadas: 5 400 000

• Limitante: escasos recursos financieros para

– Mantener cámaras frías y conservar viabilidad semillas.

– Regenerar semillas para asegurar su viabilidad

– Caracterización y evaluación

– Documentación para dinamizar su utilización

Bancos de Germoplasma

Germoplasma en los centros del CGIAR (Consultative Group I Agriculture Research)

Centro Especie Número de accesiones

CIAT Frijol común 36,000

Frijol (especies relacionadas) 5,100

Yuca cultivada 4,600

Yuca silvestre 30

Leguminosas forrajeras 18,000

Gramíneas forrajeras 2,500

CIMMYT Maíz 10,500

Trigo 60,000

Germoplasma en los centros del CGIAR

Centro Especie Número de accesiones

CIP Papa cultivada 5,000

Papa silvestre 1,500

Camote 5,200

ICARDA Gramíneas (Cebada, trigo) 50,000

Leguminosas (Lenteja, haba, garbanzo) 17,000

Especies forrajeras 20,000

ICRISAT Sorgo 22,500

Mijo 16,000

Garbanzo 24,000

Maní 14,300

Cajanus 11,000

Germoplasma en los centros del CGIARCentro Especie Número de accesiones

IITA Camote 1,000

Plátano 450

Yuca 2,000

Dioscorea 1,000

Caupí 15,000

Arroz 12,000

Bambara 2,000

Soya 1,500

Vigna 800

ILCA Gramíneas 1,500

Leguminosas 6,500

Forrajeras arbustivas 1,400

IRRI Arroz (Oriza sativa) 80,000

Arroz (especies relacionadas) 4,521

Conservación de semillas

Conservación in vitro

Bajas temperaturas y/o alta concentración osmótica en el medio de cultivo

Infraestructura para incubación de los

cultivos in vitro

• Cultivo in vitro de bajo nivel de

crecimiento:

– Almacenamiento frio: 0 – 15° C. considerar un

deshumidificador.

– Almacenamiento templado: 15 – 35°C.

• Cultivo in vitro sin crecimiento

– Almacenamiento criogénico

Número de réplicas en una accesión

• En bancos de germoplasma en todo el

mundo, el número de replicas en campo

varía, por ejemplo:

– 22 a 100 para pastos y forrajes.

– 5 a 10 para Cassava.

– 10 a 12 para el camote.

– 2 a 3 para ajo, arboles o arbustos

– 6 a 10 para plantas herbaceas

– 3 a 20 para plátano/banano


• El mantenimiento de tales replicas

requieren espacio y mano de obra, los

cuales son factores limitantes.

• Si se realiza una caracterización botánica

o morfológica, se requerirán pocas

plantas, sin embargo, la caracterización

agronómica si requiere una considerable

cantidad.


• Para las colecciones in vitro, el numero de

replicas varia de 3 a 20, dependiendo del

cultivo o especie en particular.

Mantenimiento de la estabilidad genética

Variación genética debe ser reducida al mínimo

1. Plantas propagadas por semilla

Colección base:-18°C, asume regeneración después de 50 años.

-196 °C, podría ser bueno para semillas recalcitrantes.

Apropiado para pequeñas poblaciones.

Colección activa/trabajo: 4° C, regeneración c/20 años aprox.

Estabilidad

2. Plantas propagadas clonalmente/semillas recalcitrantes

• Campo

• In vitro: colección base (6 – 8 °C), col activa (16°C). Reacción diferente de genotipos a los protocolos

• Criopreservación (-196 °C): en investigación. Exitoso para embriones.

Ejemplo de Crioconservación:

Banano

Justificación

• El “International Network for the Improvement of Banana and Plantain” (INIBAP), es responsable por la colección mundial del germoplasma de Musa.

• La colección cuenta con más de 1100 accesiones, tanto de especies silvestres, como de variedades cultivadas.

Justificación

• Actualmente, la colección se mantiene in vitro, en condiciones de crecimiento lento (baja intensidad de luz y temperatura baja) con el fin de reducir las tasas de crecimiento de los cultivos.

• A pesar de estas condiciones, aún es necesario hacer nuevos cultivos de todas las accesiones una vez al año con riesgos de contaminación por bacterias endófitas.

• Asimismo, las accesiones que se mantienen in vitro, aún bajo condiciones de crecimiento lento, están expuestas a la variación somaclonal.

Técnica que asegura un almacenamiento a largo plazo y a costo reducido de los recursos genéticos de especies que tienen semillas recalcitrantes o se propagan vegetativamente.

Aplicable a cualquier tipo de tejido vegetal con potencial de regeneración y se realiza a temperatura ultra baja, como la del nitrógeno líquido (-196 °C).

Qué es la Crioconservación o Criopreservación?

Antes, los protocolos de crioconservación para tejidos vegetales involucraban un congelamiento lento en presencia de mezclas crioprotectoras que contenían DMSO (sulfóxido de dimetilo), azúcares, glicerol y/o prolina.

Implicancia: deshidratación inducida por la congelación que dejaba menos agua en las células para que formen cristales de hielo durante la exposición a las ultra bajas temperaturas.

• Podemos mencionar dos protocolos:

A) Congelamiento rápido de los cultivos de meristemas altamente proliferantes precultivados durante dos semanas en 0,4 M de sacarosa.

B) La Vitrificación de los cultivos de meristemas altamente proliferantes precultivados en sacarosa (el más exitoso).

Crioconservación en Banano

Crioconservación en Banano

• La “Vitrificación” es usada en la actualidad.

• Involucra un tratamiento con soluciones crioprotectoras seguido por la deshidratación con soluciones de vitrificación de alta concentración.

• Las tasas de regeneración después de la descongelación, dependen del cultivar y del método utilizado.

AISLAMIENTO,

PURIFICACIÓN Y CULTIVO

DE PROTOPLASTOS

Desinfeccion Inmersion en

agua

Preplasmolisis

Eliminar la

epidermis

Enzimas Pared Celular

Protoplasto

Tratamiento Enzimatico

Protoplastos

Aislados

Proceso de lavado para eliminar desechos

Cultivo en

medio

semisolido

AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTOPLASTOS

Usos

• Estudio del comportamiento de la membrana plasmática, incluyendo el ingreso de macromoléculas y virus.

• También se usan ampliamente en la transformación genética de bacterias y de células vegetales.

• Al estar desprovistos depared, es más fácilintroducir ADN exógeno enlos protoplastos, que en lasbacterias o célulasvegetales íntegras.

• Son ampliamente usados enIngeniería Genética deBacterias y en el estudio dela expresión temporal degenes en plantas.

• Se puede regenerar unaplanta completa usandomicropropagación, unatécnica moderna usada encultivo de tejidos vegetales.

Usos

• Se usan protoplastos en el mejoramientogenético vegetal. Para ello se usa una técnicaconocida como fusión de protoplastos, en la queprotoplastos de diferentes plantas se fuerzan afusionarse para generar tejidos híbridos. De estaforma se puede generar:– Plantas poliploides, fusionando dos plantas de la misma especie,

lo que lleva a una duplicación del número de cromosomas queposeen respecto a las plantas originales.

– Plantas que posean cromosomas de distintas especies ovariedades en una misma planta, a partir de la fusión de dosplantas diferentes.

Protoplastos aislados

a. El tejido debe ser joven y contener alta proporcion de celulas

meristematicas.

b. El tejido consiste en celulas sin un excesivo engrosamiento secundario

de las paredes celulares.

c. Tejido inicial en dicotiledoneas es proporcionado por hojas jovenes en

expansion los cuales deben ser desinfectadas sin daño a los tejidos.

d. Un “semillero” continuo de tejido fuente ya desinfectado o aseptico

puede ser dado por el subcultivo de meristemas de dicotiledoneas.

e. Es dificil regenerar plantas de tejido foliar de monocotiledoneas.

f. Los embriones inmaduros escindidos de flores fertilizadas produce

callos embriogenicos, que suministra tejido inicial para el aislamiento

de protoplastos.

Fuente de tejido del explante

Medio de cultivo para cultivo de protoplastos

a. El medio usado para el mantenimiento de cultivo de

tejidos de las especies o genotipos que están siendo

estudiados sirve de base para formular la composición de

un medio de cultivo de protoplastos.

b. Los iones amonio son a menudo tóxicos para los

protoplastos los cuales deben ser reducidos u omitidos.

c. La presión osmótica de la solución externa debe ser

ajustada por la adición de azucares no metabolizables y

azucares alcoholes, tales como manitol o sorbitol

Composición de un medio inorgánico usado

para el aislamiento de protoplastos

Concentracion (mg l-1)

27.2

101.0

1480.0

246.0

0.16

0.025

5.8

Constituyentes

KH2PO4

KNO3

CaCl2 2H2O

MgSO4 7H2O

KI

CuSO4 7H2O

pH

Sales CPW

Preplasmolisis y disolución de la pared celular de los

explantes

a. Tejidos como hojas, tallos, o raices deben cortarse en tiritas y

mantenidas 1 hora en una solucion osmotica que contiene una

mezcla de sales inorganicas tales como las sales CPW y 13% w/v

de manitol como un osmoprotector para prevenir que la celula

pierda o gane agua despues de la remocion de la pared celular.

b. Si el tejido inicial proviene de in vitro, se puede hacer un

desagregado de las celulas y luego mantenerlos en el medio

osmotico a 25°C.

c. Los tejidos son luego expuestos a una mezcla de enzimas liticas en

la solucion osmotica. La digestion con diferentes enzimas puede

hacerse de manera secuencial o simultaneamente.

d. El periodo de exposicion depende de la fuente del tejido y de la fuerza

de las enzimas, por ejemplo las hojas cortadas de la mayoria de

especies pueden ser incubadas en 1% celulisina, 0.1% macerozyme

R10 y medio CPW13M at pH 5.6 de un dia para otro en oscuridad.

e. Para los cereales, donde se le ha eliminado la epidermis a las hojas, la

mezcla consiste en 2% celulisina, 0.2% macerozyme R10, 0.5%

hemicelulasa, 1% sulfato de dextran potasio, 11% manitol a pH 5.8

usando un buffer Tris-malato e incubado en la oscuridad por 1-2 h y

para la mayoria de cultivos de tejidos la mezcla de incubacion consiste

en 2% rhozyme HP150, 2% meicelase, 0.03% macerozyme R10 y

medio CPW13M a pH 5.8 e incubado de un dia a otro en oscuridad.


explantes

f. Las celulas son luego separadas de tal mezcla enzimatica por

filtracion a traves de un filtro de tamiz muy fino (tamaño poro 64 mM)

y centrifugando a baja velocidad (100g por 10 min).

g. Los protoplastos son resuspendidos en 5 ml del medio osmotico sin

enzimas y luego se realiza otra centrifugacion.

h. El precipitado es separado de los desechos transfiriendolo con

pipeta a una solucion densa (19-20% sacarosa o 30% Percoll) luego

se repite la centrifugacion pero esta vez los desechos van al fondo y

los protoplastos van a la superficie.

i. La banda flotante formada de protoplastos es posteriomente

transferida cuidadosamente con pipeta y luego cultivada en un

medio MS, 2.0 mgl-1ANA, 0.5 mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol)


explantes

Influencia de la densidad de cultivo de protoplastos en la frequencia de division de

protoplastos y la eficiencia de plaqueo. Los datos son la media de 5 repeticiones

Influencia de la composicion de mezclas enzimaticas en el rendimiento de protoplastos. Los dados

son la media de 6 repeticiones.

Ma et al., 2003, Plant Cell Rep, 22, 320–327

Protoplastos de Sorgo derivados de suspension celular (Secale cereale L.)

Durante la prueba del efecto del la concentracion del 2,4-D la BAP fue mantenida a 1.8uM.

Cuando se probo la respuesta al BAP, la concentracion de 2,4-D fue mantenida a 6.3 uM. El

medio de cultivo fue tambien sumplementado con 1% de sacarosa, 0.5% glucosa y 0.5 M

sorbitol. Los datos se presentan como el numero de celulas que sufren division,

expresados como porcentaje.

El efecto de diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D en la

eficiencia de la eficiencia de plaqueo de los protoplastos de

hoja de C. melo `Green Delica'

Sutiojonos et al., 1998, Annals of Botany, 81, 775-777

Protoplastos purificados

Las hojas son cortadas en finas tiritas y

digeridas en una solucion de enzima y manitol

Purificación de protoplastos de los

desechos en un gradiente de sacarosa.

Cultivo de protoplastos aislados

a. Un medio tipico seria el MS suplementado con 2.0 mgl-1 ANA, 0.5

mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol.

b. La prueba experimental para establecer los niveles correctos de

auxina y citokinina requeridos para estimular el crecimiento de

protoplastos se basa en un arreglo de Cuadrado Latino.

c. Un metodo para estimular la division celular y la regeneracion (facil

tecnicamente) es el transferir el protoplasto directamente a un medio

liquido o semi-liquido en el cual los niveles de auxina y citokinina se

varien.

d. El agar normal es toxico para los protoplastos, y deben reemplazarse

por agentes gelificantes como agarosa, que solidifican a menor

temperatura.

e. Una suspension de protoplastos en la solución osmótica se mezcla

en un volumen similar de agar al 1.2% a 40oC luego de solidificar

es transferido como capas de 5 mm de diametro a placas petri.

f. Despues de dos semanas los bloques de agarosa que contienen

las colonias tanto en su superficie o incrustados al medio son

transferidos a medio fresco con una concentration de manitol

reducida al 6%.

g. Las colonias son sucesivamente transferidad a medio fresco cada

dos semanas con una reduccion progresiva del 3% de la

concentracion de manitol.

Cultivo de protoplastos aislados

Regeneración de protoplastos

Etapas

Desarrollo de Microcolonias

(a) 1ra division, 10 dias despues del aislamiento de protoplastos

(b,c) microcolonias.

(d,e) microcallos

(f) microcallos justo antes de ser transferidos en medio B5h

c

d

b

e f

a

ihg

Recuperacion de plántulas a traves de Embriogénesis somática

g: Transferir microcallos en medio B5H e inducir embriogenesis somatica.

h: Transferir los embriones globulares medio Boi2y para la maduracion de embriones somaticos.

i: Transferir embriones de fase cotiledonar en medio MS para su paso hacia plantulas.

Dovzhenko et al., 2003 , Protoplasma, 222, 107–111

Regeneración de brotes fértiles de protoplastos de cotiledones de A. thaliana

(a) Divisiones de protoplastos despues de 4 dias de cultivo (b) Formacion de microcolonias (flechas) despues de 3 dias mas (c) dentro del area identica: las colonias despues de dos semanas de cultivo (d) Formacion de brotes Shoot de una colonia 19 dias despues del aislamiento (e) Regeneracion de los brotes (flechas) despues de 5 semanas (f).

Los Regenerantes formaron raices despues de 7 semanas (g) y semillas despues de 9semans (h)

Cultivo de Protoplastos y regeneracion de plantas verdes y fertiles de sorgo.

FUSION DE PROTOPLASTOS

Fuente de Tejido (hojas jovenes, callos embriogenicos)

Protoplasto A Protoplasto B

Hibridizacion estandar –Mejoramiento de plantas

Fusion AB

Formacion Callo

Regeneracion

Brotes, Raices, Embriones

Plantas

Fusion

Seleccion

Disolucion de la Pared Celular

Seleccion

Seleccion

Seleccion

FUSION DE PROTOPLASTOS 1

Obtención de protoplastos

Cocultivo Inducción /Fusión

somática

Separación del Heterocarión

Regeneración de plantas


1

2 3

45

Protoplastos de dos especies de tabaco son fusionados para producir una célula que adquiera algunas de las características de ambas parentales, y pueda ser regenerado en

una planta con esas características heredadas.

A

B

Protoplastos fusionados

[Miwa et al 1992]


Productos de la Fusion

• Protoplastos parentales: +

Cibrido

NN

Hibrido

Fusion de protoplastos

(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )

a. La funcion de la PEG es el alterar las caaracteristicas de la membrana por

los que los protoplastos que se entran en contacto unos a otros se

adhirieren y los contenidos se mezclan.

b. Unos 4 ml de suspension de los protoplastos aislados de cada parental,

con una densidad celular de aproximadamente 2 x 105 medio CPW con

13% manitol son mezclados y centrifugados a 100g por 10 min y luego

resuspender los protoplastos in aproximadamente 0.5 ml de medio.

c. Las membranas exteriores son desestabilizadas añadiendo 2 ml de una

solucion PEG esteril (30% PEG 6000, 4% sacarosa, 0.01M CaCl2.6H2O) para

que actue por 10 min.

e. Los protoplastos se fusionan diluyendo el PEG cada 5 min añadiendo un

medio de cultivo de protoplastos (medio MS, 2.0 mgl-1 ANA, 0.5 mgl-1 BAP,

3% sacarosa y 9% manitol) con volumenes en incremento (0.5, 1.0, 2.0, 3.0,

4.0 ml por tubo)

f. Los protoplastos se resuspenden despues de cada dilucion por agitacion

suave y la mezcla se centrifuga a 100g (gravedades) por 10 min y luego los

protoplastos son lavados con medio de cultivo sin PEG, centrifugados y

resuspendidos en el mismo medio.

g. La suspension de protoplastos es luego “incrustada” o mezclada en medio

de agarosa, lo cual permite la estimulacion de formacion de pared celular,

division celular y separacion de microcolonias de cloroplastos.

Fusion de protoplastos

(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )

Híbridos somáticos obtenidos por fusión de protoplastos entre Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum y la especie silvestre Solanum circaeifolium Bitter .

Rosa Espejo, Giselle Cipriani, Genoveva Rosel, Alí Golmirzaie and William Roca

El numero cromosomico de S. tuberosum es 2n=4X=48 y el de S. circaeifolium es de: 2X=2X=24.

Cual sera el numero de cromosomas del Hibrido somatico = ¿?

a. La suspension de protoplastos que se van a fusionar se colocan

entre dos electrodos

b. Se pasa una corriente continua (AC) debil de A (400,000 Hz, 1.5V) a

traves de los electrodos lo cual causa que los protoplastos adquieran

carga positiva en un polo y carga negativa en el lado opuesto.

c. Como resultado de esta carga, los protoplastos se alinean en grupos

a lo largo de la linea de la corriente, tocandose uno con otro y

formando una cadena de perlas.

d. Las unidades que forman cada cadena pueden estar modificados

segun la densidad celular de protoplastos, la frecuencia del campo

AC y del voltaje pico-a- pico.

Electrofusion

e. Después de un periodo de aproximadamente 90s, el campo

AC es reemplazado por una descarga de 1000 V cm-1 unica

de pulso en un solo instante.

f. Donde los protoplastos estan en contacto, las membranas

plasmaticas se rompen y se fusionan formando una

membrana continua alrededor de la cadena de perlas.

g. Este evento es luego seguida de la fusion citoplasmatica.

Electrofusion

Esquema de la electrofusion

• Se realiza usando una corriente electrica.

• Se causa un menor daño que los metodos quimicos.

1. Camara de fusion

Generador sinusoidal

Generador de pulso DC

Electrodos

2. Corriente AC de bajo voltaje

altamente oscilante3. Pulso DC de alto voltaje

4. Rotura de membranas y fusion

1) Alineamiento:

Las celulas son

alineadas en

cercano contacto

por medio de

dielectroforesis.

2) Pulso fusion :

Un pulso de solo 15

microsegundos se

aplica con el fin de

permeabilizar las

membranas. Luego

estas se fusionan.

3) Fase de

Heterocarionte :

Las membranas

celulares se fusionan

completamente y los

citoplasmas se ha

unido. Solo los

nucleos quedan

separados.

4) Producto de

Fusion completa:

Cuando los

nucleos se

fusionan, los

cromosomas se

van perdiendo y

se reduce su

numero.

Etapas de la electrofusion

Fases de Fusion de protoplasts de Avena sativa

Seleccion de heterocariontes

a. La técnica mas simple es permitir que los protoplastos regeneren y

luego identificar el heterocarionte en el estadio de plántula joven o

inmadura por diferencias morfológicas (la eficiencia es buena).

b. Una técnica directa pero laboriosa es cuando los heterocariontes

son identificados visualmente luego removidos manualmente

usando un microscopio o un micromanipulador (la eficiencia no es

buena si no se visualiza la fusión de protoplastos parentales con

marcadores fácilmente visibles)

c. El método mas popular pero mas costoso es el uso de un citómetro

de flujo automatizado.

d. Utilizando una característica diferencial de uno de los parentales,

por ejemplo, la nula regeneración de los protoplastos individuales.

Citómetro de FlujoLas células son transportadas a través de un flujo del delgadísimo ancho de una célula.

Esta columna de fluido es interceptada por un rayo laser que enfoca su haz a unas pocas células después de la salida de la columna de células.

Cada célula que atraviesa el rayo laser emite una luz dispersa en todas direcciones.

La luz dispersa, medida a 90º de incidencia corresponde a la cantidad y la calidad de luz difractiva de estructuras granulares al interior de la célula.

http://flowcytometry.uchc.edu/CYTOMETERSWORK/cytometerswork.html

Analisis de un Citometro de Flujo del contenido de ADN en el nucleo. (Secale cereale L. cv. Auvinen)

a. Control externo de celulas rojas sanguineas de pollo (CRBC, 2C=2.33 pg DNA)

b. Planta (2C=6.47 pg DNA)

c. Diploide normal (2C=6.51 pg DNA)

d. Cromosomas del regenerante (2n=14)

Fusion de células de Citrus sp.

Células en suspension de Citrus x sinensis var. Hamlin

Protoplastos blancos

Naranjo espinoso Poncirus trifoliata

protoplastos verdes

Los protoplastos de Citrus Hamlin no regeneran y actuan como una capa de propagacion

Los protoplastos del naranjo espinoso no forman pared celular ni se dividen

Solo los productos de la fusion se regeneraran

Contribución de la fusión de protoplastos

al mejoramiento de Cultivos

a. Originalmente la hibridizacion celular fue considerada

como un medio para la unión de dos diferentes

genotipos que eran incapaces de hibridizar por medio

sexual normal.

b. La producción de la semilla hibrida tiene el potencial

de la induccion de la esterilidad citoplasmatica

masculina.

c. Transformación.

Fig. 2A–M Flower morphology of parental plants

used for somatic hybridization and their somatic

hybrids. A Oriental hybrid lily (Lilium L.) cv.

Acapulco. B Lilium·formolongi cv. Hakucho. C

Oriental hybrid lily cv. Shirotae. D, E Flowering

regenerants derived from somatic hybrids in the

fusion combinations of Acapulco+Hakucho (D)

and Shirotae+Hakucho (E). F–L Morphological

features of flower organs of the intact parents

and regenerants. Regenerants from

Acapulco+Hakucho (G) and Shirotae+Hakucho (I)

showed anther colours different from those of

their parents, Acapulco (F), Hakucho (H) and

Shirotae (J). The regenerant from

Shirotae+Hakucho (E) also showed a shorter

prominence at the top of petals (K) compared to

that of its parent, Shirotae (L). M Propagated

plants obtained by in vitro culture derived from

a somatic hybrid plant of Acapulco+Hakucho

Production of fertile somatic hybrid plants between Oriental hybrid lily

and Lilium formolongiMitsugu Horita Æ Hitomi Morohashi Æ Fuminori Komai .Planta (2003) 217: 597–601

Visualisacion de la expresion transitoria en protoplastos transformados con GFP

(Green Fluorescent Protein

Expresion estable de GFP en hojas de plantas transgenicas obtenidas despues de

una transformacion de protoplastos y regeneracion de la planta completa.

Metabolitos secundarios

- Insecticidas

- Saborizantes

- Colorantes

Las plantascomo fuentede metabolitossecundarios de interés comercial

Potencial

75 % de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.

Sólo se tiene buen conocimiento de 5 000 de las 250 000 a 300 000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.

25 % de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.

75 % de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

- Medicinas

- Herbicidas

- Proteasas

- Fragancias

- Antimicrobianos

- Enzimas

Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?

- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc.

- Evitar la extinción de especies vegetales.- Disponer de condiciones controladas en el

proceso de producción y extracción.- Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos

mas cortos.- Hacer viable la producción de compuestos

complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química.

- Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre.

- Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas.

Resveratrol

Estructura del Limoneno (A) y el Mentol.

Son los monoterpenosmas conocidos que sirven como defensa ante insectos y otros organismos que se alimentan de estas plantas

Fuentes Naturales

Fuentes Naturales

Vincristina y Vinblastina, alcaloides antitumorales extraidos de las hojas de Catharanthus roseus “Isabelita”

COOCH3

CH3

H

OH

N

N

N

OCOCH3

R

H3CO

H COOCH3

CH3

OHN

Taxol, extracto anti tumoral, de la Corteza de Taxus brevifolia

O

C

H

CH3 - C - O

O - C -CH3

O

O

OO

OH

OH

OH

O O

O

CH33HC

C - NH - CH - CH - C - O

Fuentes Naturales

Los metabolitos secundarios

• Los metabolitos secundarios están siempre

presentes en las plantas y pueden tener un relación

estructural y evolutiva con los metabolitos

primarios.

• Usualmente ocurren en diferentes rutas

bioquímicas y procesos al mismo tiempo.

• El costo para producir un metabolito secundario es

alto y consume energía que podría utilizarse para el

crecimiento y la reproducción.

HIPOTESIS: los metabolitos secundarios evolucionaron de una derivación de una ruta biosintetica básica

MoleculaPrecursora

TriptofanoAmino acido,

Un compuesto primario

Enzima A

B

C

E

F

D

DIMBOApesticida,

metabolito secundario

2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one

NH

MoleculaPrecursora

TSA

TSBNH

CO2H

NH2NH

Triptofano

BX1

BX2

BX3

BX4

BX5

NH

O

NH

OH

OH

O

NH

OH

O

O OH

ONOH

O OH

ONOH

CH3O

DIMBOA

Comparación entre la síntesis de triptófano y DIMBOA

• Los metabolitos secundarios en los vegetales son economicamente importantes, en los diferentescampos, en aplicaciones como los farmacos, fragancias, pigmentos, aditivos alimenticios y pesticidas.

• Una alternativa para su extraccion de las plantas, es su sintesis a partir de cultivos in vitro.

Cultivos en suspensióncélulas, tejidos u órganos

Material de partida

• Cultivos en suspensión:derivan de célulasindiferenciadas o callos,en medio líquido decomposición adecuada,crecimiento más rápido yhomogéneo.

• Hair root culture (cultivode raices pilosas): sontejidos infectados porAgrobacteriumrhizogenes.

Callos

• Tejidos no diferenciados en división activa.

• Se pueden desarrollar a partir de heridas.

Microscopio Invertido

Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación.

Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Aplicaciones de las suspensiones Celulares

• Estudios sobre el ciclo celular.

• Estudios fisiológicos y bioquímicos.

• Producción de metabolitos secundarios.

• Aislamiento de Mutantes.

• Embriogénesis Somática.

Embriogénesis somática y micropropagación

Introducción a suspensión

+

Plaqueo

Filtrar las células1 2

Elección de los mas altos productores

Alta densidad inicial

Subcultivo y filtrado

Procesos industriales

Tipo de compuesto

Farmacéuticos

Pigmentos

Fragancias

Saborizantes

Depigmentadores

Producto

Shikonina

Berberina

Sanguinarina

Gingsenósidos

Taxol

Cartamina

Geraniol

Citronerol

Vanillina

Arbutina

Compañía

Mitsui Petrochemical Ind.


Vigont Researol Lab.

Nitto Denko Co.

Phyton USA

Kibun Kyoto University

Kanedo Co.

Kanedo Co.

Kanedo Co.


Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002

Nombre Tipo Origen Uso terapéutico

Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$

Hiosciamina, escopolamina

Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos

Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata

Antineoplásico

Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local

Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico

Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota

Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa

Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico

Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco

Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico

Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico

Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico

Vinblastina, vincristina

Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico

Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae

Afrodisíaco

Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$

Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico

Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales

Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$

Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico

Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$

Ipecac Mezcla de alcaloides de ipecacuana

Cephaelis ipecacuanha

Emético

Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico

Cultivo de órganos: raíces transformadas

Propiedad

Forma de crecimiento

Patrón de crecimiento

Tiempo de duplicación

Biomasa final

(peso seco/L)

Background genético

Formación inicial de producto

Medio de crecimiento

Localización del producto

Tipo de proceso

Suspensiones

Células simples-agregados

Desorganizado; cada célula

puede dividirse y expandirse

15 h-días

30-60 g

Heterogéneo

Usualmente bajo

Complejo; hormonas

y vitaminas

Intracelular- extracelular

Batch; continuo, deben

ser inmovilizadas

Raíces transformadas

Red de ramificaciones

División celular localizada;

crecimiento linear con

ramificaciones laterales

36 h-días

30-60 g

Euploide

Similares a la planta madre

Simple, sales y azúcar

Intracelular- extracelular

Batch o continuo, no hay

necesidad de inmovilizar

Agrobacterium

rhizogenes

Tumor de raíces producido por Agrobacterium

rhizogenes en discos de remolacha

Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Género

Nicotiana

Catharanthus

Cinchona

Duboisia

Datura

Beta

Lippia

Artemisia

Coreopsis, Bidens

Tagetes

Digitalis

Cassia

Panax

Chaenactis

Podophyllum

Linum

Lithospermum

Solanum

Metabolito

Alcaloide

Alcaloides piridínicos

Indoles

Tropano

Otros

Betalaina

Sesquiterpenos

Poliacetilenos

Tiofenos

Glicósidos cardioactivos

Antraquinonas

Saponinas

Polyines

Lignanos

Naftoquinonas

Esteroides

Algunos

metabolitos

secundarios

producidos

por raíces

transformadas

Agrobiotecnología

Cultivos

celulares

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Compuesto

PiretrinasCardenólidosArtemisinina

Aceites esencialesAceites esenciales

Planta

Chrysanthemum spp. Digitalis spp.

Artemisia annuaMentha spp.

Pelargoium spp.

Cultivode tallos

• Ventajas

- Cultivos genética y bioquímicamente estables

- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos

presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales

- Niveles similares a los de la planta (no siempre se

cumple).

• Desventajas

- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas

- Vitrificación

Procesos Biotecnológicos

Taxol®

• Planta entera

- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.

- Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.

• Semisíntesis

- El material vegetal empleado presenta variación en la concentración de precursores.

- Las plantas empleadas crecen lentamente.

- Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.

Schoepke Plant Image Gallery

Producción de taxol por Taxus spp.

• Condiciones económicas:

- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)

- Alto rendimiento y productividad del cultivo

comparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta entera

como fuente alternativa

• Parámetros principales:

- Productividad: g de producto/L/día

- Concentración máxima de producto:

g de producto/L

- Rendimiento: g producto/g sustrato

Viabilidad de

un proceso

para su

escalado a

nivel industrial

Estrategias para incrementar

la producción de metabolitos secundarios

• Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inóculo

- Tamaño y agregación de las células

- Oxigenación

- Agitación

Cultivos en

suspensión

Diferencias entre suspensiones de células vegetales

y de células microbianas

Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.

Consecuencias para

cultivos a gran escala

Sedimentación rápida;

sensibilidad a fuerzas de corte;

formación de gradientes;

dificultad para tomar muestras

Largos tiempos de proceso;

baja productividad

Necesidad de grandes

cantidades de inóculo;

escalado más largo

Bajas velocidades

de agitación

Baja demanda de oxígeno:

fermentadores con baja

transferencia de oxígeno

Permeabilización;

remoción in situ

Células

vegetales

Agregados de

10-200 mm y

de hasta 2 mm

de diámetro

Lenta; td ~ 2-5 días

5-20%

Sensible /

Tolerante

Baja

Intracelular /

a veces extracelular

Células

microbianas

Células

Individuales

2-10 mm

Rápida;

td ~ 1-2 h

Pequeña

Insensible

Alta

Extracelular

Caracterización

Tamaño

y morfología

Velocidad

de crecimiento

Densidad de

inoculación

Sensibilidad a

fuerzas de corte

Aireación

Acumulación

del producto

• Selección de especies vegetales apropiadas

• Selección de líneas celulares mejoradas

• Optimización de las condiciones de cultivo

• Agregado de precursores

• Tipo de cultivo: suspensiones, órganoso células inmovilizadas

• Uso de elicitores microbianosy estrés abiótico

• Permeabilización y remoción in situ

Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios

• Screening y selección de líneas sobreproductoras

- Se facilita cuando el metabolito de interés es un

pigmento, ya que puede hacerse una selección

visual.

- Es importante contar con un método rápido y sencillo

para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo,

ELISA).

• Optimización del medio de cultivo (variables másensayadas)

- Fuente de carbono

- Limitación en nitrógeno

- Limitación en fosfato

- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)

- Relación C/N

• Agregado de precursores

- Bajo costo

- Baja toxicidad

- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica

Metodologías

utilizadas para

optimizar

la producción

de metabolitos

secundarios

Patrón de flujo de dos diseños de propulsor

Agitador de paletas inclinadasAgitador de paletas planas o Rushton

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Proceso para la producción de shikonina a partir de células

de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Caracterización La caracterización de las variedades locales

es una labor imprescindible que permite conocer en profundidad los recursos fitogenéticos que estamos conservando.

Las diferencias entre las variedades, sus características, tanto morfológicas como agronómicas y por último sus cualidades nutritivas, representan una información muy útil, que puede dar una idea del valor real y potencial de las variedades locales que conservamos.

Marcadores Morfológicos

Marcadores basados en características

fenotípicas cualitativas o cuantitativas:

forma, altura, etc.

Caracterización

morfológica

La

caracterización

morfológica se

basa en la

observación de

aquellos

caracteres que

pueden ser

visualmente

diferentes.

Caracterización

morfológica

El conjunto de todos estos caracteres se

conocen como "Descriptores«

Existen listas de descriptores elaborados

por organismos internacionales de

referencia cuya utilización permite

obtener resultados homogéneos y que

además están adaptados a las

variedades tradicionales.

Obtenemos así medidas de longitud,

anchura, diámetro, área... de diferentes

partes de la planta, (flor, hojas, fruto, etc.)

y otras características, como el color,

forma, pilosidad, rugosidad, etc.

Esto permitirá establecer las diferencias y

similitudes entre las distintas variedades

de un mismo cultivo.

Variedades de Lycopersicon sculentum

Homo sapiens

Liguus

fasciatus

Harmonia axyridia

Caracterización

agronómica

Mediante la evaluación agronómica

podemos conocer mejor aspectos

relacionados con la adaptación de las

variedades a las condiciones

ambientales locales.

Estudiamos así las características

productivas de las variedades, su

eficiencia fotosintética o la tolerancia a

plagas y enfermedades.

Este nivel de caracterización permite

conocer qué variedades son más

adecuadas para la producción con

estándares de cantidad y calidad.

Marcadores Bioquimicos Son marcadores basados en reacciones

enzimáticas:

1. Isoenzimas, son enzimas de función idéntica pero de estructura diferente.

2. Aloenzimas, son enzimas de función idéntica pero expresados por alelos diferentes.

3. Western Blot, técnica de separación y detección inmunológica de proteínas.

Lactato deshidrogenasa (LDH)

F1

P1

P2

aloenzimas

Patron simple de aloenzima

P1 P2 F1

Gel de electroforesis

Fig. 1. Patrones de isoenzimas Peroxidasas de cultivares de caña de azúcar en explotación comercial en el Ecuador. Carriles 2: Ragnar; 3: Cali-Colombia; 4: C87-51; 5: Mex64-1487; 6: Ragnar; 7: Ragnar; 8: CC85-92; 9: CC95-¿?; 10: CR74-??; 11: CR74-250; 12: RD75-??; 13: RD75-11; 14: PR??; 15: Esmeraldas; 16: BJ70-??; 17: BJ70-46; 18: SP70-1143; 19: CP??; 20: PCG127-4.

Identificación de cultivares comerciales de caña de azúcar (Saccharumspp. híbrido) mediante el empleo de isoenzimas peroxidasas

Figure 3.11 Allozymeelectrophoresis. (A) A tissue sample is homogenized in a buffer solution and centrifuged. (B) The supernatant liquid is placed in the gel with filter paper inserts. (C) Proteins migrate at different rates in the gel because of differences in their charge, size, or shape. (D) Specific enzymes are visualized in the gel by biochemical staining procedures. FromUtter et al. (1987).

MARCADORES MOLECULARES

Marcadores de ADN, ARN o proteinas

Que son los cromosomas?

Esqueleto desoxirribosa

fostato

Puentes de hidrógeno entre pares de bases

ADN

Esqueleto ribosa fostato

Bases nitrogenadas

Bases nitrogenadas

ARN

Tipos de bases nitrogenadas

Pirimidina

Guanina (G)Adenina (A)

Citosina (C)

Purina

Timina (T)Uracilo (U)

Nucleósidos y nucleótidos

Esqueleto de ribosas y fosfatos

Grupo fosfato

Enlace fosfodiéster

Pentosa

Base nitrogenada

Formación de puentes de hidrógeno entre las bases del ADN

CODIGO GENÉTICO: DEL ADN A LAS PROTEINAS

Cadena sentido (+) o codificante

Cadena molde (-) o codogenica

Codón o triplete

ADNARN mensajero proteína

El Código Genético

ADN

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA

PROTEINAARN

Replicación del ADN

Replicación del ARN

Trascripción Reversa

Replicación de la proteina

La Expresión genética o Síntesis de proteinas

Términos importantes

• GENOMA

• LOCUS (singular) o LOCI (plural) - Un segmento o region unica del ADN

• ALELO - Variantes de un locus

– Ejemplo

• Considere el siguiente segmento de ADN (polimorfismos de unico nucleotido = SNP):

......TACCGT….Alelo 1

.….TACCAT….Alelo 2

• En un organismo diploide:

– Si un individuo tiene 2 alelos diferentes en un locus , es denominado HETEROCIGOTO

– Si un individuo tiene 1 unico alelo en ambos cromosomas de un locus, es denominado HOMOCIGOTO


Omicas

Genómica: ADN

Transcriptómica: ARN

Proteómica: proteinas

Metabolomica, etc.

Que es un marcador de ADN?

Es una forma de determinar una posición a lo largo de un cromosoma.

Pueden identificar un nucleótido especifico o puede representar una gran longitud del ADN.

Pueden estar constituidos por segmentos clonados o simplemente amplificados por PCR.

Tipos de marcadores de ADN

Marcadores de única copia, ocurren en regiones de secuencia única.

Marcadores de múltiples copias, contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por eso están en múltiples posiciones (aunque están siempre flanqueados por ADN de única copia)

Marcadores polimórficos

Son marcadores genéticos detectan un polimorfismo (diferencia) en el ADN entre dos individuos.

Las diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para la construcción de mapas genéticos.


Los marcadores polimórficos pueden ser anotados para determinar el origen ancestral de una porcion de ADN.


Pueden ser codominantes, es decir, los genotipos heterocigota se distingue del homocigota.

Polimorfismos

de único

nucleótido

Obtención del

material

genético

EDTA -> Mg+2

Muestra de pelo

Separación de las moléculas

de ADN

Electroforesis

Visualización de los

Fragmentos Amplificados

Polimorfismo

A B A B

Electroforesis de agarosa

Camara de electroforesis horizontal: Whatman Horizon 11.14

Fuente de poder: Whatman Powerpack P25

Camara vertical de electroforesis

Secuenciamientodel ADN

Tecnica del shotgun

Applied Biosystems PRISM 377(Gel, 34-96 lanes)

Applied Biosystems PRISM 3100(Capillary, 16 capillaries)


Electroforesiscapilar

“virtual autorad” – generador en tiempo real de secuencias de ADN del ABI 377

1. Trace files (dye signals) are analyzed and bases called to create chromatograms.

2. Chromatograms from opposite strands are reconciled with software to create double-stranded sequence data.

Aplicaciones de los Marcadores moleculares

Deteccion de la variación

somaclonal

ENTRECRUZAMIENTO Y MAPEO

Tipos de Mapas

Mapa

Genetico

Mapa Físico

Secuencia

Mapa Genetico Moderno

Marcadores

fenotipicos para

el genoma del

tomate

Un grupo

clasico de

marcadores

geneticos

LOCALIZACION GENÉTICA DE FACTORES DE

RIESGO PARA ENFERMEDADES

MAPA GÉNETICO

MAPA FISICO

Superposición de clones (YAC, BAC,...)

SECUENCIA DEL ADN ...GGCCAAATCGACCAGGTT...CGCGGATCAATTCCCCGCGA...

Marcador A Marcador B

Especies

Tamaño del genoma

(Kpb)

Longitud (centiMorgans)

Kilobases/ centiMorgan

Yeast 2.2 x 104 3,700 6 Neurospora 4.2 x 104 500 80 Arabidopsis 7.0 x 104 500 140 Drosophila 2.0 x 105 290 700 Tomato 7.2 x 105 1,400 510 Human 3.0 x 105 2,710 1,110 Corn 3.0 x 105 1,400 2,140

Gen de

ResistenciaGenes (QTLs, genes conocidos,...) Marcadores Geneticos

(RAPD, RFLP, AFLP,...)

¿Importancia de un mapa genético?... Un paso hacia el descubrimiento de genes...

Bacterial artificial Chromosome

Trazabilidad molecular

Centro Internacional de la PapaEjemplos de tecnología genómica

• Identificación de secuencias microsatelites en EST en papa

>p2OB8 (TA)9 and (GGT)6 (S109) y (S110)AAACAGCTTTACTCTGCTCAACAAAAACATATATATATATATATATAAAAAAAAAACTAACAGTGAGAAGAAGGAGAAAGCAAATATGCCAATCGCCGCCGCCGTCAACTTCCACCCGGTGACGACACGATATGGCGGCGCACTCGCCTTACAACCATCTCCTTCCTTACGTACCTCCGTATCTGTTTGTAATAACGCCGTCAATACTAACGCGGCGCGTGTTGCTTCCCTCTCGCTTTCCATGAATTCCAGCCCTAATTTCACCTCAGGCCGTCGCACATTTCTAATGTTATCCTTCGCTGCTGTTGGAGGTGGCGGTGGAGATAGTGATGATAATTTTAACGGTGGAAATGGAGGCGGTAACGGTGGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGAAATGAGGAGAGTGGCGATCAGAAAAAAAAAAAAAAA

>p23L21 (ACC)5 (S111)CTCTGTTTTTTTTTTGTAGATGATGGAAATGGAAGATAAAGAGAGTACAGAATCTGGGTCACTAGGGGTTAACTCGGAGTATGATTCACCACCACCACCACCGGCGGCAGCAGTGGTGGCAGCAGCAGTAGCAGGAACAAATGGGAGTTTTAACAGTGGGGGTGGTGGGGTGGTGGTTCCCCAAGTGATGAATATGAGTTTAGGAGTAACTGGGGGTGGAGGG

>p2lMl (TTC)6 (S112)GAAAAGTGATGGCACTTAGAGCTTCAGCCACCGCTAAATCACCTCTTCCTCCGCCCCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCATCACCACCTATAGTCTTAAATCTTCCTAAACTTACTCAAAAAACTGTGTCAGTGGCATTCTCTACATCCACTGCACTTTTCCTCTTTCCCCTTTTCACTGCGACCCATGAAGCCAGAGCAATCAGCTTACCCAAGGAAGACATAGTCTCTTCCCTTAATCAGGTAGAATCTGCAGTTAATCAAGCTCAAGAGGTTGGTTCGAACATCTTTG ATACTATAAGCGGAGTGATTGGGCCCGTG

W. Dejong, R. Waugh SCRIProjecto de secuenciamiento por EST en Papa

Biologia in silico

Evolucion de las ballenas: cual es el pariente mas cercano?

Taxonomia Clasica:Las ballenas estan en un grupo hermano de las Artiodactyla

ancestro comun de las ballenas y otras Artiodactyls

Nueva hipotesis:las ballenas estan en un grupo hermano de los hipopotamos

MAPEO GENETICO ASISTIDO POR MARCADORES MOLECULARES

Figure 3 | Marker-assisted pre-selection forprogeny testing. Because milk production is asex-limited trait, dairy bulls go through aprogeny test, in which they are evaluated onthe basis of the milk production of 60–100daughters. After the progeny test, the bestbulls are selected for widespread use in thepopulation through artificial insemination.Because of the high cost involved, only alimited number of bulls can be progeny testedeach year. Selection of bulls to be tested isbased on ancestral information, which meansthat all members of a full-sib family have thesame estimated breeding value. Molecularscores will, however, differ between full-sibs ifthey inherited different marker alleles. Throughreproductive technology, such as multipleovulation and embryo transfer, several bullcalves are produced per female and selectionof bulls to progeny test can be on the basis ofmolecular score. The combination of marker-assisted pre-selection and progeny testing hasa greater chance of producing highlyproductive animals.


GENES DE DEFENSA – ESTUDIO DE PAPA

MPMI Vol. 15, No. 6, 2002, pp. 587–597

AFLP RAPD SSR

TIPOS

Marcadores de ADN

• Basados en Hibridación: RFLP• Basados en Secuenciamiento: SNP (Single

Nucleotide Polymorphisms).• Basados en PCR:

TIPOS

Marcadores de ARN

• Basados en hibridación: Microarrays (Microchips).

• Basados en PCR: RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, usa la transcriptasa reversa).

• Basados en secuenciamiento: EST (ExpressedSequence Tags – etiquetas de secuencia expresada).

RFLP

Restriction Fragment Length

Polymorphism.

Polimorfismo en longitud de Fragmentos de restriccion

Pasos:

1. Digestion con enzimas de restriccion.

2. Southern Blotting.

3. Hibridizacion con sondas (“Probing”).

4. Deteccion (radiactiva o no radiactiva).

Enzimas de Restricción

Análisis RFLP

PCR

o

Polimerase Chain Reaction

Reaccion en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction (PCR)

Conocida como Amplificación del ADNProceso multiplica exponencialmente una

region especifica del ADN. Los limites del producto amplificado lo

determinan los iniciadores o “primers”. El producto amplificado se le llama amplicón. Es altamente sensible, rapido, especifico y

pocas veces limitado por la calidad o cantidad de ADN.

Bacteria de aguastermales: Thermusaquaticus.

De la cual se produce la Taq ADN polimerasa.

Life at High Temperatures by Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27

La PCR típicamente involucra tres diferentes temperaturas:

(94 - 96oC) o desnaturalizacion, las hebras de AND se separan.

(55-72oC) o alineamiento, los primers se unen o “alinean” con el ADN molde.

(72oC) o extension, la ADN polimerasa “extiende” los primers copiando la region de ADN molde, añadiendodesoxirribonucleotidos.

Perfil Típico de Temperatura en PCR

El Proceso de Amplificación del ADN

Denaturacion

Alineamiento

Extension

Repetir…

1. Molde de ADN.2. Iniciadores (primers)3. ADN polimerasa termoestable (Taq, Pfu, etc.)

4. MgCl25. Buffer 10X: KCl, Tris-HCl y/o gelatina.6. dNTPs (desoxirribonucleotidos: dATPs, dGTPs,

dCTPs, dTTPs7. Agua destilada estéril.8. Albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de

dimetilo (DMSO), formamida, glicerol9. Aceite mineral

Reactivos PCR

PCR Se realiza en un volumen

de 0,05 – 0,1 ml.

Se utilizan tubos de 0,2

ml. De pared delgada.

Tambien se pueden usar

placas de 96-384 pocillos.

Controles (para monitorear la PCR)

Control negativo: mezcla de reaccion PCR mix sin ADN molde. Para asegurarse que ninguno de los reactivos de PCR estan contaminados con el PCR.

Control Positivo: se usa ADN molde estandar de fuente conocida, que se puede amplificar con los mismos primers. Para asegurarse que los componentes y las condiciones de la reaccion estan funcionando.

Blanco de extracción: Para asegurarse que los reactivos de extraccion de ADN están libres de ADN extraño.

Termociclador: GeneAmp PCR System 240

Bloque

Termociclador: Whatman Biometra

Para prevenir la contaminación

Las áreas de extraccion de ADN y del procesamiento de la PCR deben estar fisicamente separadas.

Lo mismo para los equipos y reactivos.

Los guantes descartables de latex deberian ser cambiados frecuentemente.

Instalar los tubos de reaccion PCR en una camara de flujo laminar.

Usar puntas de micropipeta a prueba de aerosoles.

Los reactivos deber ser libres de nucleasas.

Irradie con luz UV las areas de trabajo.

Extracción y pre-PCR

PCR y electroforesis

Clonación y procesamiento de productos PCR

Ventajas de la PCR

Se requieren de cantidades minúsculas de ADN molde (gran sensibilidad).

Generalmente el ADN contaminante de bacterias y hongos no amplifican dado que los primers son especificos (gran especificidad).

Los fragmentos de ADN degradado pueden ser amplificados (gran versatilidad).

Se pueden instalar reacciones “multiplex” Se disponen de kits comerciales.

Desventajas de la PCR

Existen inhibidores de la PCR, presentes en el ADN extraído (vg: ácidos húmicos, polifenoles).

Puede haber fallas en la amplificación debido a cambios en la secuencia de la unión al primer.

Contaminación de ADN de otras fuentes (de la misma especie).

Marcadores de ADN basados en PCR

RAPD (Random

Amplified

Polimorphism

DNA)

polimorfismos

de ADN

amplificado al

azar

Variantes: • AP-PCR (Arbitrarily Primed-

PCR)• DAF (DNA Amplification

Fingerprinting)

Técnica RAPD

Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria

Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud

CAGGCCTTCT

Los RAPDs son marcadores dominantes

1

3

2

1 2 3AA

aA

aa

AA Aa aa

Origen del polimorfismo de los RAPDs

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5

Primers de Operon Technologies Inc.

______________________________________________

Código 5´ ………………… 3´ PM mg/tubo____________________________________________________________________________________________________________________________________

OPA- 01 CAGGCCCTTC 2955 18.0

OPA 02 TGCCGAGCTG 3035 16.5

OPA 03 AGTCAGCCAC 2988 15.5

OPA 04 AATCGGGCTG 3059 15.5

OPA 05 AGGGGTCTTG 3090 16.0

OPA 06 GGTCCCTGAC 2995 17.0

OPA 07 GAAACGGGTG3108 14.5

OPA 08 GTGACGTAGG 3099 15.0

OPA 09 GGGTAACGCC 3044 15.5

OPA 10 GTGATCGCAG 3059 15.5________________________________________________

Microsatélites

o

Secuencias simples repetitivas

(SSR)

o

Secuencias cortas repetitivas en tándem

Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivasde secuencia simple.

Estas unidades o motivos se componen de 1 a 5 paresde bases y su grado de repetición es relativamentebajo.

Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para suamplificación

¿Que son microsatélites?

TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT

AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

5’

5’



5’

5’

TCTTCTTCTTCTTCT

AGA AGA AGA AGA AGA

5’

5’

TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT

AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

5’

5’

Homocigote

Heterocigote

Los SSR son marcadores codominantes

1

2

3

4

1 2 3 4

X

Geles de electroforesis con

microsatélites

Selección de la

Colección

Núcleo para

Solanum

phureja

mediante el

Uso de

Marcadores

MicrosatélitesBach. Daniel Andrade

Sánchez

Coeficiente de Asociación Simple

0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

1PER-Puno

17PER-Lambayequ 6COL-Nothing 53COL-Boyacá

91COL-Boyacá

120COL-Cauca 7PER-Cajamarca

20COL-Narino

77ECU-Cotopaxi 9COL-Cauca 71COL-Cundinama

47ECU-Azuay 110ECU-Cotopaxi 38COL-Valle 75COL-Narino 85COL-Cauca 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá

87COL-Boyaca 74COL-ValleDelC 118COL-Boyacá 90COL-Nariño 107COL-Nariño 2COL-Valle 51ECU-Azuay 44ECU-Imbabura 100COL-Boyacá

94COL-Boyacá 14COL-Boyacá 46COL-Cauca 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 26COL-Cauca 82COL-Boyacá 109ECU-Tungurah 102COL-Boyacá 108ECU-Imbabura 45COL-Narino 104COL-Narino

86ECU-Cotopaxi 54COL-Boyacá 126COL-Nariño 98COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 83COL-Cauca 36COL-Narino

4COL-Cauca 22COL-Cauca 8COL-Narino 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 23PER-Huanuco

13COL-Narino 101COL-Boyacá

50PER-Puno 122PER-Junin

89ECU-Azuay 15COL-Nariño

16COL-Cundinama 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz

117COL-Cundinam

105COL-Nothing

116COL-Nariño 70ECU-Imbabura

127COL-Cauca

24BOL-LaPaz 35PER-Piura

19BOL-LaPaz 68COL-Nariño 121COL-Boyaca

RAPD

0.59 0.98

0.73

0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

1PER-Puno 50PER-Puno 35PER-Piura 2COL-Valle 51ECU-Azuay 94COL-Boyacá

100COL-Boyacá 44ECU-Imbabura 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 46COL-Cauca 101COL-Boyacá 70ECU-Imbabura 17PER-Lambayequ 47ECU-Azuay 89ECU-Azuay

122PER-Junin 6COL-Nothing 16COL-Cundinama 24BOL-LaPaz 4COL-Cauca 104COL-Narino 8COL-Narino 108ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño

45COL-Narino 82COL-Boyacá 86ECU-Cotopaxi 102COL-Boyacá 20COL-Narino 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 110ECU-Cotopaxi 117COL-Cundinam 87COL-Boyaca

127COL-Cauca 7PER-Cajamarca 120COL-Cauca 23PER-Huanuco 118COL-Boyacá 9COL-Cauca 71COL-Cundinama 26COL-Cauca 77ECU-Cotopaxi 109ECU-Tungurah 14COL-Boyacá 53COL-Boyacá

91COL-Boyacá 13COL-Narino 54COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 121COL-Boyaca 98COL-Boyacá 126COL-Nariño 36COL-Narino 68COL-Nariño 22COL-Cauca

38COL-Valle 85COL-Cauca 75COL-Narino 74COL-ValleDelC 83COL-Cauca 90COL-Nariño 107COL-Nariño 116COL-Nariño 19BOL-LaPaz 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá

105COL-Nothing 15COL-Nariño 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz

SSR

Coeficiente de Asociación de DICE

0.45 0.98

0.74

AnálisisArcview

SSR

AnálisisArcview

RAPD

Los marcadores microsatélites nos permitieron seleccionar

una colección núcleo, formada por 16 genotipos, para

Solanum phureja,

Existe una correlación muy pobre entre la información

provista por los marcadores moleculares, RAPD y SSR en S.

phureja.

No se pueden dar conclusiones de patrones geográficos de

diversidad, debido a que el muestreo de las entradas no es

representativo en todas las regiones muestreadas.

Conclusiones

“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE

MARCADORES ISSR DE UNA COLECCIÓN DE 50 ÁRBOLES CLONALES e HÍBRIDOS DE CACAO (Theobroma cacao L.) DE LA UNAS – TINGO

MARIA”

Julio A. Chia Wong

Colecta de muestras

Conservación en silicagel

Extracción de ADN de 50 genotipos


OK

Pruebas PCR con 59

iniciadores ISSR

13 iniciadores

OK (con replica por genotipo)

Elección de 5 iniciadores anclados

Amplificación del ADN de 50

genotipos con 5 iniciadores

Datos binarios Cross Checker 2.9

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37

-0.23

-0.08

0.06

0.20

0.34

EET400

EET228EET233

EET62ICS6 ICS78

ICS1ICS95

ICS39

M18.16

M1.7

UF667

U1

CAT4

U9

U12

U15

U26

U43

U48

U54

U60

U68

U70

SCA6C42

C53

C65HTM1

CCN51

IMC67

I12.12

I14.20

I16.20

C69

C81

C85

SilvHu

H12H61

Pand

PA150

P7ChuC

ChuS

SeñoA

Dimensión 1

Dim

en

sió

n 2

PCoA50 OTUs

Marcadores de expresión

genética

Marcadores basados en

secuenciamiento

Single nucleotide polymorphisms

(SNPs) polimorfismo de unico

nucleotido

Las secuencias de ADN de la mayoría de

individuos es casi idéntica, >99%.

Las diferencias de unico par de bases

ocurren cada 500-1000 pb.

En la mayoria de las poblaciones, hay un

comun SNP, y pocos SNPs raros.

Cerca de 3 millones de SNPs ocurren en el

genoma humano, y estos se han

convertido en marcadores geneticos

populares.

Los SNPs pueden ser usados como

cualquier marcador para genotipado,

pero una mayor cantidad de loci deben

ser usados tipicamente debido a que solo

4 alelos (G, G, C, T) son posibles.

Como detectar SNPs:

Los SNPs pueden ser obtenidos por

hibridizacion de un oligonucleotido

complementario.

Muchos cientos de SNPs pueden ser

obtenidos simultaneamente usando:

microarrays de ADN (DNA-chips, Gene-

Chips, SNP-chips)

Esquema de un chip paraensayos SNP

Fig. 9.2 Typing a SNP with an oligonucleotide.

Que son los cromosomas?

El Código Genético

ADN ARN PROTEINA

Dogma central de la Biología molecular

Replicación del ADN

Replicación del ARN

Trascripción Reversa

Replicación de la proteina

Transcripción Traduccion

La Expresión genética o Síntesis de proteinas


• LOCUS (singular) o LOCI (plural) - Un segmento o region unica del ADN

• ALELO - Variantes de un locus

– Ejemplo

• Considere el siguiente segmento de ADN (polimorfismos de unico nucleotido = SNP):

......TACCGT….Alelo 1

.….TACCAT….Alelo 2

• En un organismo diploide:

– Si un individuo tiene 2 alelos diferentes en un locus , es denominado HETEROCIGOTO

– Si un individuo tiene 1 unico alelo en ambos cromosomas de un locus, es denominado HOMOCIGOTO


MARCADORES MORFOLOGICOS

Marcadores basados en caracteristicas fenotipicascualitativas o cuantitativas: forma de hoja, forma de frutos, altura, etc.

Variedades de Lycopersicon sculentum

Homo sapiens

Liguus

fasciatus

Harmonia axyridia

MARCADORES BIOQUIMICOS

Son marcadores basados en reacciones enzimáticas:

1. Isoenzimas, son enzimas de función idéntica pero de estructura diferente.

2. Aloenzimas, son enzimas de función identica pero expresados por alelos diferentes.

3. Western Blot, técnica de separación y detección inmunológica de proteínas.

F1

P1

P2

aloenzimas

Patron simple de aloenzima

P1 P2 F1

Gel de electroforesis

MARCADORES MOLECULARES

Marcadores de ADN, ARN o proteinas

Omicas

• Genómica: ADN

• Transcriptómica: ARN

• Proteómica: proteinas

• Metabolomica, etc.

Que es un marcador de ADN?

• Es una forma de determinar una posición a lo largo de un cromosoma.

• Pueden identificar un nucleótido especifico o puede representar una gran longitud del ADN.

• Pueden estar constituidos por segmentos clonados o simplemente amplificados por PCR.

Tipos de marcadores de ADN

• Marcadores de única copia, ocurren en regiones de secuencia única.

• Marcadores de múltiples copias, contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por eso están en múltiples posiciones (aunque están siempre flanqueados por ADN de única copia)


• Son marcadores genéticos detectan un polimorfismo(diferencia) en el ADN entre dos individuos.

• Las diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para la construcción de mapas genéticos.

• Los marcadores polimórficos pueden ser anotados para determinar el origen ancestral de una porcionde ADN.

• Pueden ser codominantes (los genotipos heterocigotase distingue del homocigota) o dominante/recesivo (+/-)

EDTA -> Mg+2

Muestra de pelo

Electroforesis

Visualización de los

Fragmentos Amplificados

Polimorfismo

A B A B

Electroforesis de agarosa

Camara de electroforesis horizontal: Whatman

Horizon 11.14

Fuente de poder: Whatman Powerpack P25

Camara vertical de electroforesis

Secuenciamientodel ADN

Tecnica del shotgun

Applied Biosystems PRISM 377(Gel, 34-96 lanes)



Electroforesiscapilar

“virtual autorad” – generador en tiempo real de secuencias de ADN del ABI 377

1. Trace files (dye signals) are analyzed and bases called to create chromatograms.

2. Chromatograms from opposite strands are reconciled with software to create double-stranded sequence data.

Aplicaciones de los Marcadores moleculares

Deteccion de la variación

somaclonal

ENTRECRUZAMIENTO Y MAPEO

Tipos de Mapas

Mapa

Genetico

Mapa Físico

Secuencia

Mapa Genetico Moderno

Marcadores

fenotipicos para

el genoma del

tomate

Un grupo

clasico de

marcadores

geneticos

LOCALIZACION GENÉTICA DE FACTORES DE

RIESGO PARA ENFERMEDADES

MAPA GÉNETICO

MAPA FISICO

Superposición de clones (YAC, BAC,...)

SECUENCIA DEL ADN ...GGCCAAATCGACCAGGTT...CGCGGATCAATTCCCCGCGA...

Marcador A Marcador B

EspeciesTamaño del

genoma(Kpb)

Longitud(centiMorgans)

Kilobases/centiMorgan

Yeast 2.2 x 104 3,700 6Neurospora 4.2 x 104 500 80Arabidopsis 7.0 x 104 500 140Drosophila 2.0 x 105 290 700Tomato 7.2 x 105 1,400 510Human 3.0 x 105 2,710 1,110Corn 3.0 x 105 1,400 2,140

Gen de

ResistenciaGenes (QTLs, genes conocidos,...) Marcadores Geneticos

(RAPD, RFLP, AFLP,...)

¿Importancia de un mapa genético?... Un paso hacia el descubrimiento de genes...

Trazabilidad molecular

Centro Internacional de la PapaEjemplos de tecnología genómica

• Identificación de secuencias microsatelites en EST en papa

>p2OB8 (TA)9 and (GGT)6 (S109) y (S110)AAACAGCTTTACTCTGCTCAACAAAAACATATATATATATATATATAAAAAAAAAACTAACAGTGAGAAGAAGGAGAAAGCAAATATGCCAATCGCCGCCGCCGTCAACTTCCACCCGGTGACGACACGATATGGCGGCGCACTCGCCTTACAACCATCTCCTTCCTTACGTACCTCCGTATCTGTTTGTAATAACGCCGTCAATACTAACGCGGCGCGTGTTGCTTCCCTCTCGCTTTCCATGAATTCCAGCCCTAATTTCACCTCAGGCCGTCGCACATTTCTAATGTTATCCTTCGCTGCTGTTGGAGGTGGCGGTGGAGATAGTGATGATAATTTTAACGGTGGAAATGGAGGCGGTAACGGTGGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGAAATGAGGAGAGTGGCGATCAGAAAAAAAAAAAAAAA

>p23L21 (ACC)5 (S111)CTCTGTTTTTTTTTTGTAGATGATGGAAATGGAAGATAAAGAGAGTACAGAATCTGGGTCACTAGGGGTTAACTCGGAGTATGATTCACCACCACCACCACCGGCGGCAGCAGTGGTGGCAGCAGCAGTAGCAGGAACAAATGGGAGTTTTAACAGTGGGGGTGGTGGGGTGGTGGTTCCCCAAGTGATGAATATGAGTTTAGGAGTAACTGGGGGTGGAGGG

>p2lMl (TTC)6 (S112)GAAAAGTGATGGCACTTAGAGCTTCAGCCACCGCTAAATCACCTCTTCCTCCGCCCCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCATCACCACCTATAGTCTTAAATCTTCCTAAACTTACTCAAAAAACTGTGTCAGTGGCATTCTCTACATCCACTGCACTTTTCCTCTTTCCCCTTTTCACTGCGACCCATGAAGCCAGAGCAATCAGCTTACCCAAGGAAGACATAGTCTCTTCCCTTAATCAGGTAGAATCTGCAGTTAATCAAGCTCAAGAGGTTGGTTCGAACATCTTTG ATACTATAAGCGGAGTGATTGGGCCCGTG

W. Dejong, R. Waugh SCRIProjecto de secuenciamiento por EST en Papa

Biologia in silico

Evolucion de las ballenas: cual es el pariente mas cercano?

Taxonomia Clasica:Las ballenas estan en un grupo hermano de las Artiodactyla

ancestro comun de las ballenas y otras Artiodactyls

Nueva hipotesis:las ballenas estan en un grupo hermano de los hipopotamos

Figure 3 | Marker-assisted pre-selection forprogeny testing. Because milk production is asex-limited trait, dairy bulls go through aprogeny test, in which they are evaluated onthe basis of the milk production of 60–100daughters. After the progeny test, the bestbulls are selected for widespread use in thepopulation through artificial insemination.Because of the high cost involved, only alimited number of bulls can be progeny testedeach year. Selection of bulls to be tested isbased on ancestral information, which meansthat all members of a full-sib family have thesame estimated breeding value. Molecularscores will, however, differ between full-sibs ifthey inherited different marker alleles. Throughreproductive technology, such as multipleovulation and embryo transfer, several bullcalves are produced per female and selectionof bulls to progeny test can be on the basis ofmolecular score. The combination of marker-assisted pre-selection and progeny testing hasa greater chance of producing highlyproductive animals.


GENES DE DEFENSA – ESTUDIO DE PAPA

MPMI Vol. 15, No. 6, 2002, pp. 587–597

AFLP RAPD SSR

TIPOS

Marcadores de ADN

• Basados en Hibridación: RFLP• Basados en Secuenciamiento: SNP (Single

Nucleotide Polymorphisms).• Basados en PCR:

TIPOS

Marcadores de ARN

• Basados en hibridación: Microarrays (Microchips).

• Basados en PCR: RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, usa la transcriptasa reversa).

• Basados en secuenciamiento: EST (ExpressedSequence Tags – etiquetas de secuencia expresada).

RFLP

• Restriction Fragment Length

Polymorphism.

• Pasos:

1. Digestion con enzimas de restriccion.

2. Southern Blotting.

3. Hibridizacion con sondas (“Probing”).

4. Deteccion (radiactiva o no radiactiva).

Enzimas de Restricción

Análisis RFLP

PCR

o

Polimerase Chain Reaction

Reaccion en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Conocida como Amplificación del ADN

• Proceso multiplica exponencialmente una region especifica del ADN.

• Los limites del producto amplificado lo determinan los iniciadores o “primers”.

• El producto amplificado se le llama amplicón.

• Es altamente sensible, rapido, especifico y pocas veces limitado por la calidad o cantidad de ADN.

Bacteria de aguastermales: Thermusaquaticus.

De la cual se produce la Taq ADN polimerasa.

Life at High Temperatures by Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27

La PCR típicamente involucra tres diferentes temperaturas:

• (94 - 96oC) o desnaturalizacion, las hebras de AND se separan.

• (55-72oC) o alineamiento, los primers se unen o “alinean” con el ADN molde.

• (72oC) o extension, la ADN polimerasa“extiende” los primers copiando la region de ADN molde, añadiendodesoxirribonucleotidos.

Perfil Típico de Temperatura en PCR

El Proceso de Amplificación del

ADN

Denaturacion

Alineamiento

Extension

Repetir…

1. Molde de ADN.2. Iniciadores (primers)3. ADN polimerasa termoestable (Taq, Pfu, etc.)

4. MgCl25. Buffer 10X: KCl, Tris-HCl y/o gelatina.6. dNTPs (desoxirribonucleotidos: dATPs, dGTPs,

dCTPs, dTTPs7. Agua destilada estéril.8. Albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de

dimetilo (DMSO), formamida, glicerol9. Aceite mineral

Reactivos PCR

PCR

• Se realiza en un volumen

de 0,05 – 0,1 ml.

• Se utilizan tubos de 0,2

ml. De pared delgada.

• Tambien se pueden usar

placas de 96-384 pocillos.

Controles (para monitorear la PCR)

• Control negativo: mezcla de reaccion PCR mix sin ADN molde. Para asegurarse que ninguno de los reactivos de PCR estan contaminados con el PCR.

• Control Positivo: se usa ADN molde estandar de fuente conocida, que se puede amplificar con los mismos primers. Para asegurarse que los componentes y las condiciones de la reaccion estan funcionando.

• Blanco de extracción: Para asegurarse que los reactivos de extraccion de ADN están libres de ADN extraño.

Termociclador: GeneAmp PCR System 240

Bloque

Termociclador: Whatman Biometra

Para prevenir la contaminación

• Las áreas de extraccion de ADN y del procesamiento de la PCR deben estar fisicamente separadas.

• Lo mismo para los equipos y reactivos.

• Los guantes descartables de latex deberian ser cambiados frecuentemente.

• Instalar los tubos de reaccion PCR en una camara de flujo laminar.

• Usar puntas de micropipeta a prueba de aerosoles.

• Los reactivos deber ser libres de nucleasas.

• Irradie con luz UV las areas de trabajo.

Extracción y pre-PCR

PCR y electroforesis

Clonación y procesamiento de productos PCR

Ventajas de la PCR

• Se requieren de cantidades minúsculas de ADN molde (gran sensibilidad).

• Generalmente el ADN contaminante de bacterias y hongos no amplifican dado que los primers son especificos (gran especificidad).

• Los fragmentos de ADN degradado pueden ser amplificados (gran versatilidad).

• Se pueden instalar reacciones “multiplex”

• Se disponen de kits comerciales.

Desventajas de la PCR

• Existen inhibidores de la PCR, presentes en el ADN extraído (vg: ácidos húmicos, polifenoles).

• Puede haber fallas en la amplificación debido a cambios en la secuencia de la unión al primer.

• Contaminación de ADN de otras fuentes (de la misma especie).

Marcadores de ADN basados en PCR

RAPD (Random AmplifiedPolimorphism DNA)

polimorfismos de ADN amplificado al azar

AP-PCR (Arbitrarily Primed-PCR)

DAF (DNA Amplification Fingerprinting)

Técnica RAPD

Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria

Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud

CAGGCCTTCT

Los RAPDs son marcadores dominantes

1

3

2

1 2 3AA

aA

aa

AA Aa aa

Origen del polimorfismo de los RAPDs

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5

Primers de Operon Technologies Inc.

______________________________________________

Código 5´ ………………… 3´ PM mg/tubo____________________________________________________________________________________________________________________________________

OPA- 01 CAGGCCCTTC 2955 18.0

OPA 02 TGCCGAGCTG 3035 16.5

OPA 03 AGTCAGCCAC 2988 15.5

OPA 04 AATCGGGCTG 3059 15.5

OPA 05 AGGGGTCTTG 3090 16.0

OPA 06 GGTCCCTGAC 2995 17.0

OPA 07 GAAACGGGTG 3108 14.5

OPA 08 GTGACGTAGG 3099 15.0

OPA 09 GGGTAACGCC 3044 15.5

OPA 10 GTGATCGCAG 3059 15.5________________________________________________

MICROSATELITES

o

SECUENCIAS SIMPLES REPETITIVAS

o

SECUENCIAS CORTAS REPETITIVAS EN TÁNDEM

Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivasde secuencia simple.

Estas unidades o motivos se componen de 1 a 5 paresde bases y su grado de repetición es relativamentebajo.

Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para suamplificación

¿Que son microsatélites?



5’

5’



5’

5’

TCTTCTTCTTCTTCT

AGA AGA AGA AGA AGA

5’

5’

TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT

AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

5’

5’

Homocigote

Heterocigote

Los SSR son marcadores codominantes

1

2

3

4

1 2 3 4

X

Selección de la Colección Núcleo paraSolanum phureja mediante el Uso de

Marcadores Microsatélites

Bach. Daniel Andrade Sánchez

Coeficiente de Asociación Simple

0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

1PER-Puno

17PER-Lambayequ 6COL-Nothing 53COL-Boyacá

91COL-Boyacá

120COL-Cauca 7PER-Cajamarca

20COL-Narino

77ECU-Cotopaxi 9COL-Cauca 71COL-Cundinama

47ECU-Azuay 110ECU-Cotopaxi 38COL-Valle 75COL-Narino 85COL-Cauca 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá

87COL-Boyaca 74COL-ValleDelC 118COL-Boyacá 90COL-Nariño 107COL-Nariño 2COL-Valle 51ECU-Azuay 44ECU-Imbabura 100COL-Boyacá

94COL-Boyacá 14COL-Boyacá 46COL-Cauca 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 26COL-Cauca 82COL-Boyacá 109ECU-Tungurah 102COL-Boyacá 108ECU-Imbabura 45COL-Narino 104COL-Narino

86ECU-Cotopaxi 54COL-Boyacá 126COL-Nariño 98COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 83COL-Cauca 36COL-Narino

4COL-Cauca 22COL-Cauca 8COL-Narino 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 23PER-Huanuco

13COL-Narino 101COL-Boyacá

50PER-Puno 122PER-Junin

89ECU-Azuay 15COL-Nariño

16COL-Cundinama 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz

117COL-Cundinam

105COL-Nothing

116COL-Nariño 70ECU-Imbabura

127COL-Cauca

24BOL-LaPaz 35PER-Piura

19BOL-LaPaz 68COL-Nariño 121COL-Boyaca

RAPD

0.59 0.98

0.73

0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

1PER-Puno 50PER-Puno 35PER-Piura 2COL-Valle 51ECU-Azuay 94COL-Boyacá

100COL-Boyacá 44ECU-Imbabura 49COL-Nariño 64COL-Cundinama 46COL-Cauca 101COL-Boyacá 70ECU-Imbabura 17PER-Lambayequ 47ECU-Azuay 89ECU-Azuay

122PER-Junin 6COL-Nothing 16COL-Cundinama 24BOL-LaPaz 4COL-Cauca 104COL-Narino 8COL-Narino 108ECU-Imbabura 33BOL-LaPaz 39COL-Boyacá 65COL-Cundinama 125COL-Nariño

45COL-Narino 82COL-Boyacá 86ECU-Cotopaxi 102COL-Boyacá 20COL-Narino 61COL-Cundinama 93COL-Boyacá 110ECU-Cotopaxi 117COL-Cundinam 87COL-Boyaca

127COL-Cauca 7PER-Cajamarca 120COL-Cauca 23PER-Huanuco 118COL-Boyacá 9COL-Cauca 71COL-Cundinama 26COL-Cauca 77ECU-Cotopaxi 109ECU-Tungurah 14COL-Boyacá 53COL-Boyacá

91COL-Boyacá 13COL-Narino 54COL-Boyacá 119ECU-Imbabura 121COL-Boyaca 98COL-Boyacá 126COL-Nariño 36COL-Narino 68COL-Nariño 22COL-Cauca

38COL-Valle 85COL-Cauca 75COL-Narino 74COL-ValleDelC 83COL-Cauca 90COL-Nariño 107COL-Nariño 116COL-Nariño 19BOL-LaPaz 32COL-Narino 58COL-Nariño 99COL-Boyacá

105COL-Nothing 15COL-Nariño 21PER-Puno 40COL-Narino 72BOL-LaPaz

SSR

Coeficiente de Asociación de DICE

0.45 0.98

0.74

AnálisisArcview

SSR

AnálisisArcview

RAPD

Los marcadores microsatélites nos permitieron seleccionar

una colección núcleo, formada por 16 genotipos, para

Solanum phureja,

Existe una correlación muy pobre entre la información

provista por los marcadores moleculares, RAPD y SSR en S.

phureja.

No se pueden dar conclusiones de patrones geográficos de

diversidad, debido a que el muestreo de las entradas no es

representativo en todas las regiones muestreadas.

Conclusiones

“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR MEDIANTE

MARCADORES ISSR DE UNA COLECCIÓN DE 50 ÁRBOLES CLONALES e HÍBRIDOS DE CACAO (Theobroma cacao L.) DE LA UNAS – TINGO

MARIA”

Julio A. Chia Wong

CONCYTEC

Colecta de muestras

Conservación en silicagel



OK

Pruebas PCR con 59

iniciadores ISSR

13 iniciadores

OK (con replica por genotipo)

Elección de 5 iniciadores anclados

Amplificación del ADN de 50

genotipos con 5 iniciadores

Datos binarios Cross Checker 2.9

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20-0.37

-0.23

-0.08

0.06

0.20

0.34

EET400

EET228EET233

EET62ICS6 ICS78

ICS1ICS95

ICS39

M18.16

M1.7

UF667

U1

CAT4

U9

U12

U15

U26

U43

U48

U54

U60

U68

U70

SCA6C42

C53

C65HTM1

CCN51

IMC67

I12.12

I14.20

I16.20

C69

C81

C85

SilvHu

H12H61

Pand

PA150

P7ChuC

ChuS

SeñoA

Dimensión 1

Dim

en

sió

n 2

PCoA50 OTUs

Marcadores basados en secuenciamiento

Single nucleotide polymorphisms (SNPs) polimorfismo de uniconucleotido:

1. DNA sequences of most individuals are almost identical, >99%.

2. Single base pair differences occur about once every 500-1000 bp.

3. In most populations there is a common SNP, and several less common SNPs.

4. About 3 million SNPs occur in the human genome, and these are becoming popular genetic markers.

5. SNPs can be used just like other genotyping markers, but more loci typically must be used because only 4 alleles (G, G, C, T) are possible.

How to type SNPs:

1. SNPs can be typed by hybridizing a complementary oligonucleotide (e.g., single-base extension assay).

2. If the stringency is high (i.e., temperature), the oligonucleotide will fail to bind to DNAs showing polymorphism.

3. Many hundreds of SNPs can be tested simultaneously using:

DNA microarrays (DNA-chips, Gene-Chips, SNP-chips)

First developed in the early 1990s.

Ordered grid of short, complementary, known sequence oligonucleotides placed at fixed positions on silicon, glass, or nylon substrate.

Fig. 9.2, Typing a SNP with an oligonucleotide.

How to type SNPs (cont.):

1. SNP chip is designed with an array of user defined oligonucleotides attached to the substrate (the SNP chip is the probe).

2. Oligonucleotides match each of the common and variant alleles in the population (all alleles of interest).

3. Target DNAs are labeled with a fluorescent tag and hybridized (or not) to the chip.

4. Fluorescence pattern is detected by a laser.

5. Because the oligonucleotides are known, the pattern indicates the type of alleles the individual possesses.

6. Many different alleles at thousands of different loci can be screened simultaneously in the same experiment.

Fig. 9.5, Schematic of a SNP chip assay.

Transformación genética

o

Ingeniería Genética

o

Tecnología del ADN recombinante

Plantas transgénicas

http://www.ucsusa.org/pharm/pharm_open.html

http://www.ucsusa.org/pharm/pharm_open.html

Mejoramiento Tradicional

Tecnologia del ADN

Recombinante

Los resultados del mejoramiento tradicional son

buenos, pero es necesario un tiempo prolongado

teosinte

cob

corn

John Doebley photo

Tomate silvestre

(Lycopersicon pimpinellifolium)

D = 1 cm

www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg

http://images.google.com/imgres?imgurl=www.athensseed.com/catalog/images/20020311145133.jpg&imgrefurl=http://www.athensseed.com/catalog/gardenseed.html&h=150&w=240&prev=/images?q=hybrid+corn&start=40&svnum=10&hl=en&lr=&ie=UTF-8&oe=UTF-8&sa=N

http://images.google.com/imgres?imgurl=www.athensseed.com/catalog/images/20020311145133.jpg&imgrefurl=http://www.athensseed.com/catalog/gardenseed.html&h=150&w=240&prev=/images?q=hybrid+corn&start=40&svnum=10&hl=en&lr=&ie=UTF-8&oe=UTF-8&sa=N

Hybrid plants

(heterosis)

La Biotecnología en la Agricultura

http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5

Crossbreeding Recombinant DNA

Species Related Related/unrelated

Efficiency

Susceptibility to external

gene influences

Genes shuffled in one

exepriment

10s of 1000s 1 – few

Random insertion + +

Insecti and herbicides

Fertilizers

Pollution/run off

Potential toxins/risk + +

Introducción de genes en plantas

1) Infectar a celulas

vegetales con plasmidos

como vectores

transportando el gen

deseado

2) Disparando pellets

microscopicos conteniendo al

gen directamente en la celula.

Tres pasos para una transformación

estable

• Transporte del ADN dentro de una unica

celula vegetal.

• Integración del ADN dentro del genoma.

• Regeneracion de la celula transformada

en una plant completa.

Transformación de Plantas

Biobalística

o

Agrobacterium

Mejoramiento

Genético

Color Postcosecha

Resistencia a

Patógenos

MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

Insectos

Resistencia a

HerbicidasEsterilidad

Sexual

Calidad del

Producto

Hongos BacteriasMaterna

Paterna

Roundup

Listo

Tomate (1994) Flavr Savr CalgeneSabor de madurez

en rama, larga vida.

ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS

TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)

CULTIVO

(FECHA

LIBERACIÓN)

NOMBRE

COMERCIALCOMPAÑÍA CARACTERÍSTICAS

Tomate (1995) ZenecaConsistencia de

pasta de tomate

Algodón

Papas

Maiz (1996-97)

Bollgard

NewLeaf

YieldGuardMonsanto

Toxina deBacillus

thuringiensis para

resistencia insectos

Soya

Raps

Algodón (95-96)

Roundup Ready MonsantoResistencia a

Glifosato (herbicida)

OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

AbetoAcelgaAlfalfaAlgodónAlamoArabidopsisArrozArvejaCamoteCaña de azucarCebadaCentenoClavelCrisantemoEspárrago

EucalyptusFrambuesaFrutillaKiwiLechugaLirioMaízManíManzanaMaravillaOrquideaPapaPapayaPetuniaPera

PinoPlátanoPorotoPoroto de soyaRemolachaRepolloRosaSorgoTabacoTomateTulipánTrigoVidesZanahoriaZapallo

GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO ENPLANTAS TRANSGÉNICAS

Tipo de gen utilizado en transgénesis Caracter que confiere

a la planta

Toxina de Bacillus thuringensis Resistencia a Insectos

Proteína de la cubierta viral Resistencia a Virus

Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros

organismosResistencia a Hongos

Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos

bactericidasResistencia a Bacterias

Genes cuyos productos afectan la biosíntesis

de aminoácidos, o la fotosíntesis

Resistencia a

HerbicidasGenes cuyos productos afectan la biosíntesis

del etileno, o la formación de pared celular

Retraso maduración de

frutos

Transgenic Virus-Resistant Papaya:The Hawaiian ‘Rainbow’ was Rapidly Adopted by Farmers and is of

Major Importance in Hawaii Today

Carol Gonsalves789 Hoolaulea StreetHilo, Hawaii 96720David R. Lee

Applied Economics and Management, Dept.248 Warren Hall

Cornell UniversityIthaca, NY 14853

Dennis GonsalvesU.S. Pacific Basin Agricultural Research Center

99 Aupuni Street, Suite 204Hilo, HI 96720

Corresponding author: Carol Gonsalves. [email protected]

mailto:[email protected]

Comparacion de un arbol de papaya productiva (izq.) versus una infectada

con el virus Papaya ringspot (der.)

Efecto de la diseminacion

rapida del virus en campos

comerciales.

A

C

B

Técnicas básicas

• Enzimas de restricción

• Clonación de genes

• Secuenciación

• Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN

• Hibridación con anticuerpos (western blot)

• Hibridación de ácidos nucleicos (southern,

northern)

• Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

Secuenciación

Electroforesis (ADN, ARN, proteinas)

southern

northern

western

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Tecnología del ADN recombinante

• El uso de la biotecnología moderna implica,el conocimiento y aislamiento de secuenciasde ADN que corresponden a genesresponsables de conferir una característicadeseada (fenotipo)

• El aislamiento de los genes de interés esrealizado por medio de técnicas de clonadomolecular

Estructura del gen de interés

Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico

Promotores

ExonesSitio de inicio de la Transcripción Sitio de terminación

de la Transcripción

Realzadores

< 100 Kb

Intrones

La actividad del gen depende de los Factores de Transcripción (FT) que activan las ARN

polimerasas• Los FT pueden ser: los Factores de Transcripción General

(se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas).

• Los FT pueden encenderse o apagarse en respuesta a estímulos del entorno del individuo.

• Entre los promotores de los genes que desarrollan la capacidad cerebral o talento de los individuos están la alimentación, la salud, el estímulo temprano con experiencias motivadoras (el juego), el amor.

Clonación molecular

• Amplificación en un organismo vivo de unasecuencia de ADN.

• Vectores de clonación (plásmidos o virus):Vectores en los que la secuencia de ADN esintroducida usando una DNA ligasa. Cuando serequiera, el fragmento de ADN de interés, puedeser liberado del vector por medio de enzimas derestricción.

• Una vez aislados los genes de interés sonincorporados al organismo blanco resultando enun organismo genéticamente modificado (OGM)y esta característica adquirida pasa a serhereditaria.

Herramientas Básicas para el clonado de Genes

• ADN BLANCO O SECUENCIA DE INTERES, que puede ser:

– ADN genómico (aislado directamente del cromosoma).

– ADN complementario (ADNc) preparado in vitro a partir de un molde de ARNm, usando la transcriptasa reversa.

– ADN sintético, sintetizado a partir de oligonucleótidos o por amplificación de fragmentos mediante PCR.

• ENZIMAS:

– DNA polimerasa.

– Transcriptasa reversa.

– DNA ligasa.

– Endonucleasas de restriccion (cortan el DNA en sitios especificos)

.

EXTRACCION DEL ADN FUENTE

VECTOR DE

CLONADO

FRAGMENTACION ENZIMATICA

LINEARIZACION

AISLAR CELULAS CON EL GEN

CELULA HUESPED

PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GEN CLONADO

PRODUCCION DE PROTEINAS

LIGADO

INTRODUCCION DEL ADN EN EL HUESPED

VECTORES RECOMBINANTES

Transformación Genetica

Requerimientos:

• Mecanismo de transferencia del gen

– Mecanismos de transferencia genética indirecta

– Mecanismos de transferencia genética directa

• Sistemas de regeneración

Transformación genetica indirecta

Mediada por Agrobacterium:

• Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas.– Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease

(tumores)– Agrobacterium rhizogenes – enfermedad de raices

pilosas (hairy roots)

• Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium rhizogenes

¿Como se realiza la transformacion de las plantas con Agrobacterium?

Co-cultivar la cepa de A. tumefaciens que contiene el gen de interes con un explante del cual se pueden obtener regenerantes.

Cultivar el explante en medio de cultivo en presencia de un agente selectivo (tal como la kanamycina si el T-DNA contiene NPT II) y un antobiotico para eliminar el Agrobacterium o disminuir su crecimiento (carbinecillin, cefotaxime, timitin).

Después de un periodo de tiempo, seleccionar los brotes regenerantes (o embriones) que son resistentes.

Probar los brotes regenerados para comprobar la expresion del marcador.

Enraizar los tallos.

¿Como se realiza la transformacion de las plantas con Agrobacterium?

Haciendo plantas transgenicas

• Dos vias usando plasmidos Ti:

1. Cointegración

2. Sistema de vector binario

Transformando con A. tumefaciens

• El proceso es relativamente ineficiente.

• Solo una pequeña fraccion de las celulas infectadas son transformadas.

• El ADN debe ser integrado a un cromosoma para una transformacion estable.

• Cada célula transformada es única.

Transformación genética

Marcador génico seleccionable

• Se cuenta con pocos.• Resistancia a kanamicina, nptII• Resistancia a higromicina, hpt• Gen Bar (resistancia al herbicida

fosfinotricina = PPT)• Gen DHFR (resistancia al metotrexato)• Gen ESPS (resistancia al herbicida Round-

up)

Transformación de la caña de

azúcar por Agrobacteriumtumefaciens.

Selección de callos resistentes a PPT.

Medio selectivo con 4 mg/L of PPT.

Un marcador genico observable (opcional, pero de mucha utilidad)

• Actividad NPT II

• Producción de opinas

• Actividad beta-Glucuronidasa (GUS)

• Green fluorescent protein (GFP)

• Actividad Luciferasa

Glifosato

Bromoxinil

Glifosato

Gen de interés

• Puede provenir de cualquier organismo.

• Usualmente quimericos (hechos de diferentes partes de genes)

• Promotor: CaMV 35S, etc.

• Terminador: Nos, CaMV 35S, etc.

CaMV es un virus de genome circular con ADN de doble cadena

Transferencia directa del ADN

• Bombardeo de microparticulas (biolistica).

• Poración química con PEG o electroporación de protoplastos.

Transformación por Biolística

• El ADN es mezclado y precipitado con particulas microscopicas (1 a 10 micras de diametro) de tungsteno u oro.

• Estas partículas son colocadas en el extremo de un proyectil más grande de plástico.

• La “bala” o proyectil es colocado en un en una “pistola” y el tejido a bombardear se coloca en el extremo de la “pistola”.

• El “arma” es disparada, acelerando el proyectil.


• Una placa con un pequeño agujero detiene al proyectil de plastico.

• Las particulas cubiertas del ADN, mediante la fuerza inercial pasan a traves del agujero y golpean al tejido vegetal.


“Pistola” de ADN para transformación de plantas

• Algunas de las partículas pasarán a través de la pared celular y entrarán a las células individuales.


• Algunos de las moleculas de ADN se liberarán de la partícula, viajarán al nucleo y se integrarán en un cromosoma, resultando al final, la tranformación.


• Rango ilimitado de hospederos.

• El tejido no requiere ser totipotente.

• Multiple copias del transgen puede llevar al silenciamiento.

• Los reactivos y materiales son costosos.


Transformación por bombardeo de Coffea arabica cv. Catuaí Vermelho

Análisis molecular

Transformacion mediada por PEG

• El polietilen glicol (PEG) induce unapermeabilizacion reversible de la membrana plasmatica.

• Baja viabilidad de los protoplastos.

• Baja eficiencia de transformacion (1-2%).

• Dificultades para regenerar.

Transformación de Arabidopsis

Los transgénicos

1. Definiciones y conceptos básicos

2. Métodos de obtención

3. Las generaciones de transgénicos

4. Detección de OVMs

DEFINICIONES Y CONCEPTOS BÁSICOS

1. OVMs

2. Ingeniería Genética

3. Gen (estructura)

4. Transgen

ORGANISMO VIVO MODIFICADO (OVM)

• Es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gene exógeno (transgén), esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.

• Tambien incluye a los híbridos somaticos (fusionde protoplastos), y los CISGENICOS (OVM con genes provenientes de especies relacionadas)

INGENIERÍA GENÉTICA

• Conjunto de metodologías y técnicas dirigidas a lograr la modificación del material hereditario de una especie, con el fin de conferirle atributos (por ejemplo características del individuo o capacidad de producir sustancias) que no los tenía hasta ese momento.

ESTRUCTURA DE UN GEN

¿QUE ES UN TRANSGEN?

• Es el gen construido mediante ingeniería genética que se transfiere a una especie.

• Ejemplo: El gen cp4 epsp tomado de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (cepa CP4).

ORIGEN DE UN TRANSGEN

Su origen puede ser :

• Vegetal

• Animal

• Microbiano

• Sintético

ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DELTRANSGENICO

• Identificación del problema

• Identificación del gen de interés para el hospedero adecuado.

• Construcción del transgen (“constructo”)

• Transformación genética

• Selección y ensayos en espacio confinado

• Ensayos en campo y liberación

ETAPAS EN LA OBTENCION DE UNTRANSGEN

Identificación del problema que se desea resolver.

• Identificación y valoración de los problemas que pueden no pueden ser fácilmente resueltos con métodos convencionales.

• Identificación del tipo de problema que se quiere solucionar: resistencia plagas, sequía, patógenos, valor nutricional, otros.


• Construcción del transgén (“constructo”)

Genmarcador deselección:resistencia aantibióticos

PromotorGen deinterés

Gen determinación

• Un promotor es una secuencia de ADN que actúa

• como un “interruptor” para “encender” un “gen”.

• • Su secuencia contiene regiones que funcionan

• como “sensores” para modular la expresión del

• gen que gobiernan. Algunas veces, estas regiones

• dan una señal para detener la expresión del gen.

Promotores constitutivos

• • Actividad independiente de factores ambientales y del desarrollo,• pues su expresión no está condicionada por factores endógenos• • Producción de compuestos necesarios en todos los estadíos de• desarrollo de la planta• • Altos niveles de producción de proteínas en diferentes células o• tejidos• • Altos niveles de expresión de proteínas reporteras o marcadores,• permitiendo una fácil detección y cuantificación• • Altos niveles de producción de factores de transcripción que sean• parte de la regulación de un sistema más complejo• • Producción de compuestos con actividad permanente en toda la• planta

Promotores constitutivos y 35S CaMV

• • Los promotores más utilizados para expresar genes en forma• constitutiva son aquellos derivados de virus que atacan plantas.

Dentro• de ellos el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o

35SCaMV• (Cauliflower Mosaic Virus) ha sido uno de los más utilizados (Odell

et al.,• 1985).• • Este promotor, al igual que la mayoría de los promotores

derivados de• genomas virales, utilizan la maquinaria de transcripción de la célula• vegetal (RNA polimerasa y factores asociados) y no requieren de• factores en trans o proteínas virales para su activación.

• • 35SCaMV es capaz de inducir una alta expresión del transgén tanto en• monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se ha descrito que el• fragmento de 343 pb de este promotor es suficiente para activar en• forma constitutiva la transcripción (Fang et al., 1989). Además se• identificaron dos regiones involucradas en la expresión tejido específica• del promotor, el dominio A (‐90 a +8) que posee un elemento regulador• (‐82 a ‐64) capaz de unir al factor de transcripción ASF‐1 de tabaco, el• que está involucrado en la expresión en raíz (Lam et al., 1989), y el• dominio B (‐343 a ‐90) que contiene un motivo GATA altamente• conservado, ubicado entre ‐185 y ‐105.• • Al utilizar dos copias de este promotor, se incrementa la expresión del• transgén.• • Otros promotores utilizados, en menor frecuencia que el promotor• 35SCaMV, son el promotor del CsVMV (cassava vein mosaic virus) y el• promotor del BSV (Australian banana streak virus).

Promotores inducibles

• • Inducción química:

• – Tetraciclina (operón de resistencia a tetraciclina)

• • Inducción física/mecánica:

• – Luz (“small subunit” del promotor de la ribulosa‐1,5‐

• bifosfato‐carboxilasa de la soya)

• – Heridas (super promotor)

Promotores tejido‐específicos

• • Dirigen la expresión de un gen en un tejido en particular y/o

• en ciertas etapas del desarrollo• • Los elementos que se encuentran en los promotores de• genes de plantas, definen la especificidad de la expresión• tejido específica ya sea ésta en tubérculos, raíces, tejidos• vasculares u otros tejidos vegetativos, semillas u otros• órganos reproductivos. Estos elementos pueden• encontrarse también en sistemas heterólogos (por ejemplo• en otra especie) pero la regulación que ellos cumplen debe• ser evaluada caso a caso.

• A promoter sequence must be added for the gene to be correctly expressed (i.e., translated into a protein product). The promoter is the on/off switch that controls when and where in the plant the gene will be expressed. To date, most promoters in transgenic crop varieties have been "constitutive", i.e., causing gene expression throughout the life cycle of the plant in most tissues. The most commonly used constitutive promoter is CaMV35S, from the cauliflower mosaic virus, which generally results in a high degree of expression in plants. Other promoters are more specific and respond to cues in the plant's internal or external environment. An example of a light-inducible promoter is the promoter from the cab gene, encoding the major chlorophyll a/b binding protein.

• Sometimes, the cloned gene is modified to achieve greater expression in a plant. For example, the Bt gene for insect resistance is of bacterial origin and has a higher percentage of A-T nucleotide pairs compared to plants, which prefer G-C nucleotide pairs. In a clever modification, researchers substituted A-T nucleotides with G-C nucleotides in the Bt gene without significantly changing the amino acid sequence. The result was enhanced production of the gene product in plant cells.

• The termination sequence signals to the cellular machinery that the end of the gene sequence has been reached.

• A selectable marker gene is added to the gene "construct" in order to identify plant cells or tissues that have successfully integrated the transgene. This is necessary because achieving incorporation and expression of transgenes in plant cells is a rare event, occurring in just a few percent of the targeted tissues or cells. Selectable marker genes encode proteins that provide resistance to agents that are normally toxic to plants, such as antibiotics or herbicides. As explained below, only plant cells that have integrated the selectable marker gene will survive when grown on a medium containing the appropriate antibiotic or herbicide. As for other inserted genes, marker genes also require promoter and termination sequences for proper function.


Construcción del transgén (“constructo”)

• En plantas existen tres clases de genes marcadores seleccionable:

• Genes que dan resistencia a los antibióticos.

• Genes que dan resistencia a herbicidas

• Genes involucrados con varias vías metabólicas.


• Construcción del transgén (“constructo”)

• Promotor:

• Inicia la transcripción.

• Controla la expresión del gen.

• Los mas comúnmente usados son los derivados del virus del mosaico de la coliflor (CaMV),19S CaMV y 35S CaMV.


• Construcción del transgen (“constructo”)

• Genes de interés:

• Tolerancia al herbicida Glyphosato Zea mays L. (Maize) Roundup Ready®

• Tolerancia al herbicida Phosfinotricina PPT –Glifocinato de amonio

• Resistencia a Ostrinia nubilalis (European cornborer )

Métodos para generar plantas transgénicas

1. Microinyección

2. Electroporación de Protoplastos

3. Biolística

4. Inmersión floral

5. Agrobacterium (A. tumefaciens y A. rhizogenes)

Microinyección

Transformación genética por electroporación

• La electroporación es un proceso mediante el cual se aplica un campo eléctrico (pulsos) a una célula viva por un pequeño período de tiempo, ocasionando una ruptura transitoria reversible de la membrana celular.

• Esta ruptura transitoria resulta en la formación de poros que permiten que moléculas exógenas (ADN, proteínas o drogas) ingresen a la célula.


Electroporador: equipo que crea un campo magnético que altera la permebilidadde las membranas celulares.

http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/CultivosTransgenicos/sp_animation.html


• Transformación genética mediada por biolística (Biolistic Particle Delivery System)

Transformación genética mediada porbiolística (Biolistic Particle Delivery

System)• Método físico de transformación de células

mediante el cual se bombardea a éstas con partículas de alta densidad, de tamaño sub-celular que son aceleradas a gran velocidad para introducir ADN dentro de células vivas.

• Fue inicialmente propuesto para su uso con

plantas m ahora tiene mayores aplicaciones.

Helios™ Gene Gun (Bio Rad)

Transformación genética mediada porbiolística (Biolistic Particle Delivery

System)Emplea partículas de oro recubiertas con ADN, precipitadas en la superficie interna de un disco de plástico, y aceleradas mediante un flujo de helio presurizado.

• Transformación genética mediada por Agrobacterium


• Transformación genética

• Mediada por Agrobacterium

• Por biolística (Gene Gun)

• Por electroporación

Transformación genética mediada porAgrobacterium

• Agrobacterium es una bacteria que causa una enfermedad conocida como “agalla de la corona” en plantas.

• Es un parásito y puede causar grave daño a la planta afectada.

• Se encuentra en el suelo.


• La relación Agrobacterium – planta es un caso único de transferencia de ADN entre bacterias y plantas (reinos diferentes).

• Esta situación es aprovechada para emplear a la bacteria como un vector natural para la transformación en plantas.


• Durante el proceso de infección Agrobacteriumintroduce en la célula vegetal una parte de su ADN (ADN-T, de transferencia).

• Los genes ADN-T son integrados a la planta y su expresión induce la formación de tumores y la síntesis de opinas (derivados de aminoácidos) que la bacteria provecha.

• El ADN-T esta localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor de tumor).

Las generaciones de transgénicos

• 1ra Generación.

• 2da Generación.

• 3ra Generación.

Transgénicos de 1ra Generación

• Características introducidas como insumos agrícolas y combate de plagas - plantas Bt y plantas RR (Resistencia a las plagas ... la resistencia a los insectos (Maíz Bt.)

• Es una combinación de resistencia al taladro y al herbicida glifosato. Incorpora el gen de la endotoxina - Bt (Bacillus thuringiensis).

Aplicaciones

• Alimento para animales

• Grasas comestibles: Margarina, aceites

• Edulcorantes: Bebidas de frutas, cereales y helados.

• Maíz molido: Harina, copos de maíz.

Plantas transgénicas Bt


• Tolerancia a Herbicidas La soja “Roundup Ready” contiene un gen bacteriano que codifica la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa, que participa en la síntesis de los a.a. aromáticos. El vegetal que no contiene dicho gen, es inhibido por el glifosato, de ahí su acción herbicida.

• Aplicaciones: harina, concentrados proteicos, lecitinas, aceite,...

Transgénicos de 2da Generación

• La deficiencia de vitamina A causa ceguera en 200 millones de personas

• Golden Rice: Arroz transgénico enriquecido con pro-vitamina A

Transgénicos de 2da Generación

• Tecnologías que incluyen productos de calidad mejorada para la nutrición y procesos industriales “ALIMENTOS FUNCIONALES”


• Cultivos o animales utilizados como “biofábricas” para la producción de fármacos (vacunas, enzimas industriales).

• En el caso de produccion de anticuerpos o vacunas, se conoce como «Biopharming»


• Ejemplo: SemBioSys Genetics Inc.

Algunos transgénicos disponibles (hasta el 2010)

Detección de OVMs

Detección de OVMs

• Se requiere contar con metodologías que permitan realizar la detección e identificación de «eventos» transgénicos de manera sensible, reproducible, rápida y de bajo costo.

Detección de OVMs

1. Detección inmunoquímica de las proteínas Modificadas

– ELISA (Ensayo de inmunodetección)

– Strips o tiras reactivas

– Western Blot

2. Detección del ADN de los OVMs

– PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)

Detección inmunoquímica de lasproteínas modificadas

• Esta metodología se basa en el reconocimiento específico de una porción de proteína expresada por el OVM mediante un anticuerpo, recreando una respuesta inmune.

• Puede permitir la detección específica de determinado anticuerpo por un epítope único.

• Alta especificidad.

Detección inmunoquímica de las proteínas modificadas

ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”• Básicamente, esta prueba es una reacción

antígeno-anticuerpo que se lleva a cabo en una fase sólida (placa de 96 pozos).

• El antígeno-anticuerpo reacciona y produce un complejo estable que puede ser visualizado por la adición de un segundo anticuerpo unido a una enzima.

• La adición de un sustrato que reacciona con la enzima resulta en una formación de color, que puede ser medida fotométricamente.


Kit ELISA


Tiras de flujo lateral

• Variación comercial de las pruebas de ELISA que permiten obtener resultados semicuantitativos de forma sencilla y rápida.

• Se emplean para la detección de OVMs en hojas, semillas y granos. Como soporte se emplean tiras de papel o plásticas, que es donde ocurre la reacción.


Tiras de flujo lateral


Ventajas de las tiras de flujo lateral

• No requiere mucha preparación de la muestra.

• Ensayo relativamente rápido (2-4 horas, incluyendo preparación de la muestra).

• Produce resultados cualitativos o semi-cuantitativos.

• Costo relativamente bajo.

• Aplicable para el análisis de muestras numerosas.


Desventajas de las tiras de flujo lateral

• Faltan anticuerpos relevantes para los diversos eventos OVM.

• Pueden producirse falsos positivos debido a contaminación cruzada por otros componentes derivados de la muestra analizada.

Marco contextual

• Objetivo 1: Erradicar la pobreza extrema y el hambre.

• Objetivo 2: Lograr la enseñanza primaria universal.

• Objetivo 3: Promover la igualdad entre los géneros y la autonomía de la mujer.

• Objetivo 4: Reducir la mortalidad infantil.

• Objetivo 5: Mejorar la salud materna

• Objetivo 6: Combatir el VIH/SIDA, el paludismo y otras enfermedades.

• Objetivo 7: Garantizar el sustento del medio ambiente.

• Objetivo 8: Fomentar una asociación mundial para el desarrollo.

Objetivos del Desarrollo del Milenio 2000 - 2015

ODS 2015 - 2030

El Plan Bicentenario: El Perú hacia el 2021

1. Un Estado basado en la plena vigencia de los derechos fundamentales y el respeto a la dignidad de las personas.

2. Una economía competitiva basada en la generación masiva de empleos con alta productividad.

3. Una economía que ofrezca igualdad de oportunidades y acceso irrestricto a los servicios.

4. Un crecimiento económico basado en el aprovechamiento sostenible de los recursos naturales.

5. Desarrollo de una infraestructura adecuada y distribuida adecuadamente entre las regiones.

6. Lograr desde el Estado una gestión pública eficiente que facilite la gobernabilidad y llegue a todos los sectores de la sociedad y rincones del país.

Plan Nacional Estratégico de Ciencia, Tecnología e Innovación para la Competitividad

y el Desarrollo Humano

PNCTI 2006-2021

(D.S. Nº 001-2006-ED)

PNCTI: Objetivos Específicos al 2021

1. Promover el desarrollo y la transferencia de innovaciones tecnológicasen las empresas elevando la competitividad productiva y el valoragregado con criterio de sostenibilidad económica y ambiental.

2. Impulsar la investigación científica y tecnológica orientada a la soluciónde problemas y satisfacción de demandas en las áreas estratégicasprioritarias del país.

3. Mejorar, cuantitativa y cualitativamente, las capacidades humanas enCTI, con énfasis en una formación de excelencia en el postgrado y en elámbito técnico especializado.

4. Fortalecer, dinamizar y articular sinérgicamente la institucionalidad de laciencia, la tecnología y la innovación, en el marco del Sistema Nacionalde Planeamiento Estratégico.

Los Programas de CTI: Programas Nacionales Sectoriales

• Programa de Agricultura y Agroindustria Alimentaria.• Programa de Plantas Medicinales, Nutracéuticas y Afines.• Programa Forestal Maderable.• Programa de Zoocría y Manejo de Fauna Silvestre.• Programa de Camélidos Sudamericanos.• Programa de Acuicultura.• Programa de Pesca.• Programa de Educación.• Programa de Salud.• Programa de Minería.• Programa de Transporte.• Programa de Turismo.

Programas Nacionales Transversales

• Programa de Investigación Básica.• Programa de Valorización de la Biodiversidad.• Programa de Biotecnología.• Programa de Ciencia y Tecnología de Materiales.• Programa de Ciencia y Tecnología Ambiental.• Programa de Ciencia y Tecnología de Recursos

Hídricos.• Programa de Tecnologías de la Información y

Comunicación.• Programa de Ciencia y Tecnología de la Energía.

Importancia de la Biotecnología

Las Biotecnologías y los sectores económicos de influencia

Salud y Farmacia Agricultura

Enzimas Procesamiento alimentos

Foresteria Biorremediación

Industria química

Pulpa y papel

Textiles

Cosméticos

Electrónica

Minería

Energía

Manejo ambiental

etc. etc. etc.

Tecnologías

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Cadena de valor en el tiempo

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Las Biotecnologías

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¿Qué es la Biotecnología?

Uso o modificación de organismos vivos o partes de los mismos, para obtener productos o servicios para la humanidad; usándose con responsabilidad social y medioambiental

Clasificación

Clasificación de la biotecnología

1. Biotecnología tradicional

2. Biotecnología clasica

3. Biotecnología moderna

Aplicaciones de la Biotecnología

Bioreactor o tanque fermentador

Inserción del gen para la hormona del crecimiento

Clonación de Dolly

Clonación de toros de lidia

Animales clonados en el mundo

Las enzimas más utilizadas a nivel industrial y las

características enzimáticas que han sido

modificadas por ingeniería de proteínas

ESQUEMA DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA S DEL VIRUS DE

LA HEPATITIS B EN CÉLULAS DE LEVADURA

Colonia de Penicillium, productor de

penicilina (antibiótico)

Tecnología biotecnológica para el tratamiento de aguas residuales

Bioterrorismo

http://imageshack.us/

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Armas de destrucción masiva

Ventajas de la Biotecnología

• Bajo consumo energético.

• Facilidad de acceso a materias primas (producción in situ).

• Contrastados y probados a lo largo de toda la Evolución Biológica.

• Especificidad.

• Sustentabilidad medioambiental

Inconvenientes de la Biotecnología

• Requerimiento de muy alta tecnología y personal altamente cualificado.

• Inversiones de alto riesgo.

• Consecuencias biológicas y medioambientales difícilmente predecibles.

• Problemas éticos.


Western Blot

• Es un método altamente específico que permite determinar si la muestra contiene la proteína objetivo, eficiente con proteínas insolubles.

• Se basa en la separación de proteínas de una muestra en función de su tamaño mediante electroforesis y posterior detección mediante anticuerpos específicos para la proteína.


Western Blot

Detección del ADN de los OVMs

• La detección de una secuencia específica de ADN es uno de los métodos más utilizados para la identificación y cuantificación de OVMsy sus productos derivados.

• Los métodos que permiten la detección cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa de OVMs.

• Se emplea la tecnología de la PCR, ya sea en punto final (convencional) o en tiempo real.

Detección del ADN de los OVMs

• Primers no específicos de evento: diseñados sobre secuencias presentes en la mayoría de las construcciones vegetales (promotores, terminadores, etc), por lo tanto, permiten detectar varios eventos.

• Primers específicos de evento: diseñados sobre el inserto y sobre una región genómica adyacente, por lo tanto, permiten detectar un sólo evento.

• Primers específicos: diseñados usualmente sobre la secuencia codificante del transgén, permiten detectar uno o pocos eventos.

PCR Multiplex

• Variación de la técnica de PCR en la cual se usan dos o mas sets de primers en un único tubo de mezcla.

• Tiene por objetivo lograr la amplificación simultánea de múltiples segmentos de ADN.

• Debe ser estandarizado.

Ejemplo de detecciónempleando PCR

Inia, 2010

BIOSEGURIDAD

• Normativa: Protocolo de Cartagena

• Movimiento transfronterizo

• Análisis de Riesgo

• Evaluación de Riesgo

• Biosafety Clearing House

Plantas como Biofábricas

Llamadas también “farmaplantas” o (molecular) Pharming

• No sólo podemos hacer Ingeniería genética para fines agrícolas, sino que también podemos transferir genes que hagan que las plantas fabriquen sustancias valiosas en la industria farmacéutica o química: plantas transgénicas convertidas en fábricas vivas (biorreactores) de sustancias de alto valor añadido.

• El atractivo de esto es enorme, ya que podemos disponer de campos de tabaco, girasol, tomate, colza, etc., produciendo enormes cantidades de sustancias difíciles o caras de obtener por otros medios. Además, a diferencia de las fermentaciones industriales, aquí no hacen falta grandes inversiones ni trabajadores especializados. Ya hay ensayos a pequeña escala de plantas productoras de medicamentos: – encefalina

– seroalbúmina humana

– interferón humano

– vacunas comestibles (p. ej., tomate-vacuna antirrábica para animales)

Sin embargo, quizá lo más espectacular ha sido comprobar que las plantas pueden fabricar anticuerpos monoclonales funcionales. Incluso son capaces de ensamblar correctamente la IgA dimérica, con su cadena J y su componente secretor. Esto es muy interesante, ya que no es fácil de obtener por otros métodos. Se han hecho pruebas con éxito que demuestra que confieren protección mucosal pasiva en boca (contra caries), tracto intestinal, etc.

• Posibilidad de protegernos comiendo fruta fresca transgénica (!)

• Primeros ensayos de producción en plantas (colza, soja) de plásticos totalmente biodegradables (PHA, polihidroxialcanoatos a partir de genes bacterianos).

Definición• Plantas geneticamente transformadas para producir

moleculas que no son originalmente vegetales.

• Productos: terapeuticos, vacunas, antibioticos, proteínas industrial, bioplásticos, etc.

• Pros: grandes cantidades, sin contaminación bacteriana o viral, bajo costo de producción.

• Contras: seguridad y biodiversidad, residuos diferentes de azucares; estabilidad.

• Vacunas comestibles: minimizan la necesidad de costos de refrigeración, de distribución y administracion. Ejemplo: cólera, sarampión, enterotoxina de la E. coli (agente causante de la diarrea), hepatitis B.

Procesos clave

• Transformación

• Expresión

• Patente

Potencial

• Primeros productos lanzados en el 2006.

• La demanda de biofarmacos es creciente en 13% por año (Estados Unidos).

• Se espera que el Molecular Pharming se valore en $100 millones de millones en el 2020.

Ventajas del “Pharming” en plantas

• La mayoría de la investigación se ha enfocado en el uso de plantas geneticamente modificadas o transgénicas.

– Porque son mas facilmente modificables que los animales.

– Se reproducen fácilmente y son rápidamente clonables.

– Vienen en diferentes formas útiles para casi cada necesidad de producción y crecimiento.

Ejemplo: SemBioSys Genetics Inc.

Insulina de SemBioSys

• El problema: 1 nuevo diagnóstico cada 5 segundos; para el 2025 habrán 380 millones de casos en todo el mundo; 50% de ellos no tendrán acceso a la insulina.

• La solucion: insulina en plantas usando la tecnologia “oilbody”

• Estatus: Fase I/II pruebas clinicas empezaron en Diciembre del 2008, y los resultados fueron presentados en Junio del 2009.

http://www.sembiosys.com/Default.aspx

http://www.sembiosys.com/Default.aspx

SemBioSys ApoA1 (Apoproteína A1)

• El problema: Las enfermedadesCardiovasculares se convertiránen una de las causas principalesde muerte en el mundo; los tratamientos disminuyen la enfermedad, pero el ApoA1 disminuye el tamaño de lasplaquetas; dificultad para produciren masa ApoA1.

• La solución: ApoAI en los cuerposlipidicos (oilbodies)

• Estatus: niveles comerciales de ApoAI se producen y se muestrafuntionalidad ensayos celulares.

Otras aplicaciones del “oilbody”

• Aceites nutricionales: acidos grasos omega-6; DHA (Ácido docosahexaenoico) como suplementos e ingredientes.

• Vacunas animales.

• Immunosphere™, un aditivo alimenticio que mejora la sobrevivencia contra enfermedades virales.

• Quimosina para la producción de queso.

Ejemplo: Geneware® de Advanced Cancer Therapeutic (ACT)

• Virus modificado del mosaico del tabaco (TMV) más un promotor ARN insertado y gen(es) estructurales para codificar la proteína de interés.

http://www.advancedcancertherapeutics.com/

http://www.advancedcancertherapeutics.com/

Organización del genoma del TMV

HPV (virus del papiloma humano)

• El problema: el HPV infecta la epidermis y las membranas mucosas; verrugas; pueden conducir a cancer de la cervix y genitales; la vacuna vale $350.

• La solución: un equivalente de Gardasil® por Merck, sera producido con produced by ACT using Geneware® technology.

• Estatus: la vacuna de ACT está en etapa preclinica.

Otros productos ACT y su estatus

Macrophage migration inhib factor vs cancer, autoimm MS

Synthetic oligonucleotide vs c-myc

3PO block gluc uptake by cancer cell

CK37 inh choline kinase in cancer

Salvando el planeta

• Si todos los plasticosfueran bioplasticos, entonces el consumo del petroleo bajaria 90-145 millones de barriles/año , casi como el petroleo queconsume Estados unidosen una semana.

• Las algas no son usadaspara producción de alimentos y pueden ser transformadas en combustible.

• Biopolimeros: producir termoplasticos biodegradables tales como el polihidroxibutirato (PHB) por ingenieria metabolica en la semilla de canola.

Consideraciones normativas

• Pruebas clinicas of terapeuticos y vacunas

• Las mismas normas concernientes para los alimentos transgenicos.

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