IMMA FOLCH I MONTORI

Laboratori Agroalimentari, DARP de la Generalitat de Catalunya

1. INTRODUCCIÓ

ConceptesUn organisme genèticament modi-ficat, en endavant OGM, és un orga-nisme, a excepció dels éssers vius, elmaterial genètic del qual ha estatmodificat d’una manera que no esprodueix naturalment en l’aparella-ment ni en la recombinació natural.Quan la modificació s’ha produïtmitjançant la incorporació al seugenoma d’un fragment d’ADN queprocedeix d’una altra espècie, es diuque l’OGM és un organisme trans-gènic.

En general, un OGM té una com-binació nova de material genètic que li confereix noves propietats:resistència a plagues, resistència aherbicides, producció de substàn-cies d’interès nutritiu, organolèp-tic o farmacològic (figura 1). Aixòimplica que s’ha modificat el mate-rial genètic de l’animal o la plantadel qual prové l’aliment o algun delsingredients que conté, o bé que s’hamodificat el material genètic d’algundels microorganismes implicats enel procés d’elaboració de l’aliment.

En aquest sentit, aliments i pin-sos genèticament modificats (GM)

TECA [Associació Catalana de Ciències de l’Alimentació], núm. 10 (desembre 2006), p. 17-24 • 17

CIÈNCIA

Mecanismes de detecció d’organismesgenèticament modificats

RESUM: El contingut d’organismes genèticament modificats (OGM) a l’alimentacióhumana i animal està regulat per la norma europea, que n’estableix l’etiquetatgeobligatori quan el contingut en OGM és superior al 0,9 %.

El Comitè Europeu per a l’Estandardització ha desenvolupat mètodes de detecció,d’identificació i de quantificació dels OGM per tal de dur a terme aquesta normaeuropea.

Els laboratoris que treballen en OGM poden aplicar aquests mètodes específics,sensibles i precisos i poden repetir-los i reproduir-los amb resultats segurs.

SUMMARY: Food and feed GMO’s content is regulated by the European standards,which establish that the labeling is mandatory when the GMO content is higherthan 0.9 %.

The European Committee for Standardization has developed the detection, theidentification and the quantification methods of GMOs to carry out this Europeanstandard.

The laboratories that work in GMO can apply these specific, sensitive and precisemethods and can repeat and reproduce them with safety results.

PARAULES CLAU: mètodes, detecció, OGM.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:46 Página 17

són aquells que contenen OGM, hiestan compostos o han estat pro-duïts a partir d’aquests.

Reglament (CE) núm.1829/2003El Reglament (CE) núm. 1829/2003del Parlament europeu i del Consell,

18 • TECA / 10

de 22 de setembre, sobre aliments ipinsos modificats genèticament,aplicable des de l’abril de 2004, vaestablir els procediments comuni-taris per a l’autorització i la supervi-sió dels aliments i pinsos GM i lesdisposicions relatives a l’etiquetatgedels aliments i pinsos GM. Això va

incidir en les metodologies de detec-ció d’OGM.

El reglament estableix que l’eti-quetatge serà obligatori quan el con-tingut d’OGM sigui igual o superioral 0,9 % de cada ingredient conside-rat individualment (figura 2). Perexemple, en un producte processatque contingui blat de moro i soja, elpercentatge d’OGM permès no és el 0,9 % del producte final, sinó el 0,9 % de blat de moro i el 0,9 % desoja (figura 3).

També s’accepta el 0,5 % de lapresència accidental o tècnicamentinevitable de material GM, si l’OGMencara no ha estat aprovat per laUnió Europea (UE), però està enprocés d’avaluació favorable.

La normativa europea estableixcom a obligatori l’etiquetatge delsaliments i pinsos quan el contingutd’OGM sigui igual o superior al 0,9 %.

Detecció d’OGMPer facilitar el compliment delsreglaments europeus, l’anàlisi dematerial transgènic en aliments hade ser aplicable tant a matèries pri-meres com a aliments processats iha de permetre detectar i quantifi-car la presència o l’absència dematerial transgènic. Detectar si somdavant d’un OGM no és una feinasenzilla. El mètode més fiable persaber si un aliment és transgènic ésanalitzar-ne el material genètic oADN o analitzar-ne la composicióper identificar la presència de pro-teïnes derivades de l’activitat del’ADN transgènic. Malgrat tot, elsmètodes moleculars fiables i sensi-bles funcionen molt bé amb mate-rial vegetal fresc o poc processat,però tenen menys sensibilitat quanaquest material ha estat sotmès alsprocessos industrials d’elaboraciód’aliments preparats o de purifica-ció dels seus components.

Diferents processos químics,físics o enzimàtics poden contribuira la degradació de l’ADN. Fins i toten aliments que pel processamenthan sofert una gran degradació delseu ADN o de les seves proteïnes noes poden fer aquestes anàlisis per-què no s’hi troben restes d’aquests,o quasi no queden traces en forma

Varietat transgènica resistental banyarriquer

Varietat convencional

Blat de moro atacat per banyarriquer,Ostrinia nubilalis

FIGURA 1. En el blat de moro transgènic resistent al banyarriquer (en cast.,taladro) s’ha introduït un gen provinent de Bacillus thurirgiensis, el qualcodifica la proteïna Bt, que es produeix en la medul·la de la tija o en elpol·len, tòxica per al lepidòpter i de la qual s’alimenta.

La normativa europea estableixcom a obligatori l’etiquetatge

dels aliments i pinsos quan el contingut d’OGM sigui igual

o superior al 0,9 %

Blat de moro 1

Blat de moro

Blat de moro GM

99,5 %

0,5 %

NO ETIQUETAT

Blat de moro 2

Blat de moro

Blat de moro GM

97 %

3 %

ETIQUETAT OBLIGATORI

FIGURA 2. Etiquetat i no etiquetat de dos tipus de blat de moro.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:46 Página 18

de fragments curts dels productes dedegradació.

El procés de detecció d’OGMengloba tres etapes (figura 4):• Detectar la presència o l’absènciad’OGM.• Identificar si són OGM autoritzatsa la UE.• Quantificar si els OGM identifi-cats no superen el 0,9 % permès ala UE.

El mètode més fiable per saber siun aliment és transgènic és analit-zar-ne el material genètic o ADN oanalitzar la presència de proteïnesderivades de l’activitat de l’ADNtransgènic.

2. MÈTODES DE DETECCIÓ

L’obligatorietat d’etiquetar els aliments transgènics planteja laposada a punt d’uns mètodes d’anà-lisi:• Adaptats a cada producte brut oderivat i a cada OGM buscat.• Fiables i sensibles per respondrea la legislació establerta i a una infor-mació de qualitat exigida pels con-sumidors.• Homogenis per a tots els labora-toris europeus per garantir els resul-tats.

Perquè els mètodes de detecciód’OGM compleixin tots aquestsrequisits, han de ser:• Específics, és a dir, han de sercapaços de detectar i d’identificarl’OGM buscat.• Sensibles, és a dir, han de sercapaços de detectar un percentatged’OGM igual o inferior al límit mar-cat per la normativa europea.• Precisos, és a dir, a partir de l’úsde materials de referència, hem dedemostrar que són mètodes esta-dísticament representatius.• Repetibles, és a dir, el resultatd’una anàlisi ha de ser el mateixquan es repeteix amb el mateix mè-tode, amb idèntiques característi-ques del test, en el mateix laboratori,pel mateix analista i utilitzant elmateix equip dins d’un interval curtde temps.• Reproduïbles, és a dir, el resultatd’una anàlisi ha de ser el mateix

TECA / 10 • 19

quan es repeteix amb el mateixmètode, amb idèntiques caracterís-tiques del test, en diferents labora-toris, per diferents analistes i utilit-zant diferents equips.

A partir de la capacitat de detec-ció dels mètodes, els podem classi-ficar en dos grans grups:• Detectar l’expressió del gen, és adir, proteïnes: mètode d’ELISA.

El mètode més fiable per saber siun aliment és transgènic ésanalitzar-ne el material genètic oADN o analitzar la presència deproteïnes derivades de l’activitatde l’ADN transgènic

Blat de moro 60 %

Blat de moro GM 0,0 %

Soja 19,5 %

Soja GM 0,5 %

ETIQUETAT

OBLIGATORI

Blat de moro 59,6 %

Blat de moro GM 0,4 %

Soja 19,9 %

Soja GM 0,1 %

NO ETIQUETAT

El 2,5 % de la soja és GM

El 0,66 % del blat de moro és GMEl 0,5 % de la soja és GM

Galeta 1Soja 20 %

Blat de moro 60 %

Cacau 20 %

Galeta 2Soja 20 %

Blat de moro 60 %

Cacau 20 %

FIGURA 3. Etiquetat i no etiquetat de dos tipus de galetes.

FIGURA 4. Procés de detecció de transgènics.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:46 Página 19

• Detectar el gen responsable, és adir, ADN: mètode de PCR.

Els mètodes d’anàlisi que detectenl’ADN transgènic són els més utilitzatsperquè proporcionen més especifi-citat i sensibilitat; no obstant això, en determinades ocasions, pot inte-ressar la detecció de proteïnes. Ve-geu a dalt la comparació de les carac-terístiques entre les dues tècniques.

prés s’afegeix la mostra que actuad’antigen en el cas de ser positiva. A continuació s’afegeix l’anticòsadherit a un enzim específic per al’antigen. Finalment, s’afegeix unsubstracte específic que quan actuïl’enzim produirà color observable aprimera vista o quantificable a l’es-pectrofotòmetre (figura 5).

En el cas de la detecció d’anti-cossos, els antígens s’adhereixen ala superfície de plàstic de la placa.Després s’afegeix la mostra queactua d’anticòs en el cas de ser posi-tiva. A continuació s’afegeix l’an-ticòs adherit a un enzim específicper a l’anticòs. Finalment, s’afegeixun substracte específic que quanactua l’enzim produeix un colorobservable a primera vista o quan-tificable a l’espectrofotòmetre (fi-gura 6).

Reacció en cadena per la polimerasa: PCRL’objectiu de la PCR és l’obtenció degran quantitat d’ADN. A partir d’unamostra que contingui una quantitatmínima de material genètic difícil demanipular o de detectar es pot obte-nir una gran quantitat d’ADN idèn-tic al de partida.

L’ADN és una molècula termos-table i és present en totes les cèl·lulesd’un organisme. Aquestes caracte-rístiques el converteixen en la dianaperfecta per detectar la presènciad’OGM en matèries primeres i ali-ments. La PCR és capaç de detectarla presència d’ADN, tot i que es trobien quantitats molt petites.

La PCR permet copiar moltesvegades un fragment específicd’ADN, és a dir, mitjançant unaamplificació d’un tros d’ADN, obte-nim milions de còpies. L’ADN tédues cadenes complementàries queporten la mateixa informació i percopiar-la és necessari separar física-ment les dues cadenes i utilitzar-necada una com un motllo, és a dir,com una plantilla que serveix demodel en forma de mirall, per sinte-titzar-ne l’altre. Aquesta feina la faun enzim anomenat ADN polime-rasa, que en aquest cas és termore-sistent per suportar les elevadestemperatures que s’utilitzen en l’e-

20 • TECA / 10

Mètode d’enzyme-linkedimmunosorbent assay: ELISAL’assaig immunoenzimàtic ELISA esbasa en la detecció d’antígens o anti-cossos en una mostra.

En el cas de la detecció d’antí-gens, els anticossos específics per al’antigen s’adhereixen a la superfíciede plàstic de la placa immunoab-sorbent que ens fa de suport. Des-

Tècniques d’ELISA Tècniques de PCR

Detecta proteïnes a partir de la Detecta seqüències d’ADN a partir interacció específica amb els de la seva exclusivitatanticossos

No detecta sense la presència No detecta sense la presència d’ADN de proteïnes d’ADN

Menys sensible Molt sensible

Requereixen personal experimentat tant per a la posada a punt com per a la interpretació de resultats

Requereixen l’anàlisi de material de referència

Requereixen l’estandardització del mostreig i de l’extracció de material

Requereixen un coneixement Requereixen un coneixement detallat de l’estructura molecular detallat de l’estructura molecular i de les propietats fisicoquímiques de les seqüències introduïdes de la proteïna

Obtenció d’una resposta qualitativa Obtenció d’una resposta qualitativai quantitativa de menor precisió i quantitativa de gran precisió

FIGURA 5. Detecció d’antígens pel mètode d’ELISA.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:46 Página 20

tapa de separació de les dues cade-nes d’ADN en cada cicle de copiat.Perquè l’ADN polimerasa iniciï lacòpia de les cadenes d’ADN, cal dosencebadors, que són petits frag-ments d’ADN complementaris alsextrems d’ambdues cadenes i que enenganxar-se a l’ADN actuen comuna primera anella de la cadena per-què se n’iniciï la còpia. Aquests ence-badors donen especificitat al procésd’ampliació i per això el disseny delsencebadors requereix conèixer laseqüència de l’ADN específic ques’amplificarà (figura 7).

La PCR permet obtenir granquantitat d’ADN idèntic al de par-tida.

El procés d’amplificació o copiatté lloc en un aparell anomenat ter-mociclador, que permet programarautomàticament cicles successiusd’escalfament i de refredament deles mostres que contenen el mate-rial genètic.

La reacció es realitza mitjançantla repetició (20-40 cicles) del procésde còpia, així l’amplificació es pro-dueix de manera exponencial, i alfinal del procés s’obtenen 2n còpiesdel fragment d’ADN; n és el nombrede cicles que es realitza en el termo-ciclador (figura 8).

3. DETECCIÓ D’OGM A TRAVÉS DE LA PCR

El procés de detecció de transgènicsengloba una sèrie d’etapes succes-sives tal com esquematitza la figu-ra 9.

Extracció de l’ADNL’objectiu de l’extracció de l’ADN ésobtenir-ne la quantitat suficient ique sigui de bona qualitat, és a dir,com menys degradat i més lliure decontaminants millor. La degradacióde l’ADN i les contaminacionsredueixen l’eficiència de la PCR i potportar-nos a resultats erronis.

S’han descrit molts mètodes perextreure ADN de matèries primeresi productes finals, alguns més indi-cats per a un tipus de matriu deter-minada i d’altres d’aplicació mésàmplia.

TECA / 10 • 21

Control de qualitat de l’ADN extretLa qualitat de l’ADN extret es con-trola de manera consecutiva i com-plementària mitjançant:

• La quantificació de l’ADN a l’es-pectrofotòmetre.• Un gel de qualitat.• Gens específics.

FIGURA 6. Detecció d’anticossos pel mètode d’ELISA.

FIGURA 7. Procés de la PCR.

La PCR permet obtenir granquantitat d’ADN idèntic al de partida

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:47 Página 21

L’amplificació mitjançant PCR degens específics d’organismes euca-riotes o gens d’endògens de les espè-cies amb què es treballa, permet d’i-dentificar la presència d’ADN d’unaespècie determinada i a la vegadaveure si hi ha inhibidors de la PCR.Per exemple, per a mostres de blat demoro s’utilitza el gen de la Zeina, quees troba tant en varietats transgè-niques com en varietats no transgèni-ques de blat de moro. Per a mostresde soja s’utilitza el gen de la Lectina,que es troba tant en varietats trans-gèniques com en varietats no transgè-niques de soja. La imatge superioresquerra de la figura 10 mostra la resposta de senyal del gen de la Lec-tina en mostres de soja (S) i mostresbarreja de blat de moro i soja (BS). La imatge superior dreta de la ma-teixa figura mostra la resposta desenyal del gen de la Zeina en mostresde blat de moro (B) i mostres barre-ja de blat de moro i soja (BS).

Un senyal intens en l’amplifica-ció de la PCR indica un ADN de qua-litat. Si no s’obté un bon senyal, laqualitat de l’ADN es qüestiona i estorna a purificar o se’n fa una altraextracció.

Cribratge mitjançant seqüènciesreguladoresDesprés de comprovar que la mos-tra té un ADN de qualitat, el passegüent és veure si conté o no contéOGM. La detecció del transgèn oADN transgènic es realitza mit-jançant l’amplificació específicad’un dels fragments utilitzant la tèc-nica de la PCR.

Les seqüències reguladores sóninterruptors que controlen l’expres-sió del gen. Molts dels vegetals trans-gènics són portadors de seqüènciesd’ADN característiques, el promotorCaMV35S i el terminador T-Nos.

Si l’aliment conté aquests trans-gens, s’obtindrà un senyal positiu enla reacció de la PCR, tal com veiemen la imatge inferior de la figura 10,on les mostres transgèniques de blatde moro (B), soja (S) i barreja de blat de moro i soja (BS) donen se-nyal per a aquestes seqüències.

Els gens específics permeten con-trolar la qualitat de l’ADN extret. La

22 • TECA / 10

EXTRACCIÓ DE L’ADN

CONTROL DE QUALITAT

CRIBRATGE D’OMG

GEL DE QUALITAT

ESPECTROFOTOMETRIA

GENS ESPECÍFICS

PCR NEGATIU PCR POSITIU

NOETIQUETAT

NOETIQUETAT

QUANTIFICACIÓ IDENTIFICACIÓ

<0,9 % >0,9 %

ETIQUETATOBLIGATORI

AUTORITZAT?USOS?

FIGURA 9. Procés de la PCR.

FIGURA 10. Detecció del gen de la Lectina (a dalt, esquerra), del gen de laZeina (a dalt, dreta) i detecció del promotor 35S i del terminador T-Nos (a baix) en mostres que contenen blat de moro i soja.

FIGURA 8. Amplificació exponencial de l’ADN en la PCR.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:47 Página 22

detecció de seqüències reguladoresens indica que som davant d’unorganisme genèticament modificat.

IdentificacióDesprés de detectar que som davantd’un OGM, identificarem de quinOGM es tracta mitjançant l’amplifi-cació per PCR de seqüències espe-cífiques.

L’objectiu és la identificació del’OGM per saber si està autoritzat ono i, en el cas que ho estigui, per aquins usos està permès.

Un exemple conegut és el genCry 1A(b) que codifica per la toxinaBt del blat de moro Bt 176 i el genEPSPS de la tolerància a l’herbicidaglifosat de la soja Roundup Ready(figura 11).

QuantificacióLa quantificació d’OGM ha esdevin-gut molt important en els darrersanys, arran de la normativa europea(v. l’apartat Reglament (CE) núm.1829/2003).

El llindar obligatori d’etiquetatgedel 0,9 % d’OGM establert per la UEfa que cada vegada siguin mésnecessàries les anàlisis quantitati-ves, que indiquen la proporciód’OGM a la mostra, en lloc de lesqualitatives, que només ens indi-quen la presència o l’absènciad’OGM.

Les característiques de la PCRquantitativa fan que aquest sigui unprocés idoni com a mecanisme dedetecció d’OGM:• Mètode que respon a les necessi-tats creades per la normativa eu-ropea.• Es basa en una quantificacióexacta del percentatge de productetransgènic present a la mostra.• Mesura la quantitat del producteamplificat després de cada cicle dela PCR mentre aquesta és en marxa.• El resultat final és l’emissió de fluo-rescència, la qual és proporcional ala quantitat de producte amplificat.• La fluorescència emesa es con-verteix en quantitat d’OGM gràciesal tractament informàtic de lesdades i permet expressar els resul-tats en percentatge d’OGM en lamostra.

La detecció de seqüències espe-cífiques permet identificar el tipusd’OGM i saber si som davant d’unOGM autoritzat o no.

La PCR quantitativa permet de-terminar si estem dins el llindard’OGM establert per la normativa.

Mètodes basats en la quantificacióSYBR Green. Es basa en la medicióde fluorescència emesa quan s’in-tercalen les molècules de colorantfluorescent SG entre els ponts d’hi-drogen de les molècules de doblehèlice d’ADN (figura 12).

TECA / 10 • 23

Els gens específics permetencontrolar la qualitat de l’ADNextret. La detecció de seqüènciesreguladores ens indica que somdavant d’un organismegenèticament modificat

La detecció de seqüènciesespecífiques permet identificar el tipus d’OGM i saber si somdavant d’un OGM autoritzat o no.La PCR quantitativa permetdeterminar si estem dins el llindar d’OGM establert per la normativa

FIGURA 11. Identificació de la seqüència Cry 5-6 específica del blat de moroBT 176 (esquerra) i de la seqüència CTP 1-2 específica de la soja RoundupReady (dreta) en mostres que contenen blat de moro i soja.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:47 Página 23

Sondes FRET. Es basa en la medicióde fluorescència emesa per sondesd’hibridació específiques del trans-gèn marcades amb un fluorocrom(figura 12).

4. PER SABER-NE MÉS

ERLICH, H. A. (1989). PCR technology. Prin-ciples and Applications for DNA Ampli-fication. Stockton Press.

ISO 21569:2005. Foodstuffs – Methods ofanalysis for the detection of geneticallymodified organisms and derived pro-ducts – Qualitative nucleic acid basedmethods. CEN/TC 275/WG 11.

ISO 21570:2005. Foodstuffs – Methods ofanalysis for the detection of geneticallymodified organisms and derived pro-ducts – Quantitative nucleic acid basedmethods. CEN/TC 275/WG 11.

ISO 21571:2005. Foodstuffs – Methods ofanalysis for the detection of geneticallymodified organisms and derived pro-ducts – Nucleic acid extraction. CEN/TC275/WG 11.

ISO 21572:2004. Foodstuffs – Methods forthe detection of genetically modifiedorganisms and derived products – Pro-tein based methods. CEN/TC 275/WG 11.

ISO 24276:2005. Foodstuffs – Methods ofanalysis for the detection of geneticallymodified organisms and derived pro-ducts – General requirements and defi-nitions. CEN/TC 275/WG 11.

TAMAMES, R. (2003). Los transgénicos,conóz-calos a fondo. Ariel.

24 • TECA / 10

FIGURA 12. Mètodes de quantificació d’OGM.

Procés de quantificació per Procés de quantificacióSYBR Green per sondes FRET

1. A l’inici de l’amplificació, la barreja 1. Components essencials: dues de la reacció conté l’ADN sondes marcades amb dues desnaturalitzat, els encebadors molècules fluorescents diferents,i el colorant. una sonda donant FL i una sonda

receptora LC.Les infinites molècules de colorant dèbilment fluorescents produeixen Aquestes dues sondes hibriden un senyal fluorescent de fons que és parts seqüencials de la sostret durant l’anàlisi. monocadena d’ADN de la mostra.

2. Després de l’anellament dels 2. El desenvolupament de senyal enencebadors, unes quantes el sistema depèn de la formaciómolècules de colorant s’intercalen de la doble cadena d’ADN.en la doble hèlice.

El procés té lloc quan les dues La unió de l’ADN acaba amb un gran sondes es troben molt pròximes increment de molècules SYBR Green i quan l’espectre d’emissió donant que emet llum a partir de l’excitació. se solapa amb l’espectre d’absorció

del receptor.

3. Durant l’elongació, més molècules 3. Quan té lloc la hibridació, les de colorant s’intercalen al nou ADN dues sondes se situen una al costatsintetitzat. de l’altra i, llavors, l’encebador

donant FL s’excita i emet la Si la reacció continua, es visualitza un fluorescència F1, que transfereix la increment de la fluorescència, el qual seva energia a la sonda receptora és proporcional a la quantitat d’ADN LC, la qual al seu torn emet amplificat. fluorescència F2.

Aquesta emissió de radiació escorrelaciona amb la quantitat demolècules d’ADN que tenim.

Capitulo 03 Teca 10 9/2/07 14:47 Página 24