animals modificats genèticament: ratolins transgènics i...

36
Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i mutants definició, obtenció i aplicacions en biologia, biomedicina i biotecnologia Lluís Montoliu CSIC Centro Nacional de Biotecnología, Madrid Octubre de 2006 1 de 36

Upload: truongcong

Post on 08-Apr-2019

227 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Animals modificats genèticament:ratolins transgènics i mutants

definició, obtenció i aplicacionsen biologia, biomedicina i biotecnologia

Lluís MontoliuCSICCentro Nacional de Biotecnología, Madrid

Octubre de 2006

1 de 36

Page 2: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Fenotip(aspecte)

Genotip(gen)

Genotip

Fenotip

Afegir unafunció

Transgènics

Suprimir unafunció

genoanul·lats / mutants

Genètica clàssica Genètica inversa

2 de 36

Page 3: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Fases inicials del desenvolupamentd’un embrió de mamífer (ratolí)

Oòcitsfecundats

Embrió2 cèl·lules

Embrió8 cèl·lules(mòrula)

Blastocist

TOTIPOTÈNCIA

PLURIPOTÈNCIA

3 de 36

Page 4: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Blastocists de ratolí (dia 3-4)

De la fase de preimplantacióa l’embrió en gestació

I.C.M. (ES cells)(Epiblast)Ectodermprimitiu

Trofectoderm(Trofoblasts)

Zonapel·lúcida

Blastocel Endoderm primitiu

Embrió de ratolí en gestació (dia 12)4 de 36

Page 5: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Obtenció de cèl·lules troncals embrionàries(cèl·lules mare pluripotents, ES cells)

I.C.M. (ES cells)(Epiblast)Ectodermprimitiu

5 de 36

Page 6: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Afegir una nova funció: Animals transgènics (Microinjecció)

6 de 36

Page 7: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Control de l’expressió del transgèn:

- En l’espai (promotor, regions reguladores)- En el temps (sistema induïble)

Un sistema induïble ha de garantir:

Capacitat de reacció i rang ampli de respostaNo- interacció amb els sistemes endògens

No- toxicitatReversibilitat

Proporcional a la dosi de l'efector(més dosi, més resposta)

Inducció ràpida

7 de 36

Page 8: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

EFECTOR

Els transgens induïbles són binaris

LacZ pA

Promotor induïble

pA

+

TRANSACTIVADOR

INACTIU ACTIU

Promotor específic de cervell

Com es pot controlar l’expressió d’un transgèn?

Ratolins transgènics amb expressió induïble8 de 36

Page 9: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

EFECTOR

TRE

TtAVP16

TRE

TtAVP16

TRE

rTtAVP16

TRE

rTtAVP16

-Dox +Dox

-Dox +Dox

TET-OFF

TET-ON

Gossen & Bujard 1992

Kistner et al., 1996

El sistema induïble mitjançant tetraciclina/doxiciclina

EFECTOR

TET-ON TET-OFF

9 de 36

Page 10: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Los EP pueden provocar expresión

ectópica osilenciamiento

+?

CH3 CH3 CH3CH3 CH3

CH3 CH3

EFECTES DE POSICIÓ

Expressió normal del transgèn

Problema: efectes de posició en animals transgènics, variabilitat

10 de 36

Page 11: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Domini d’expressió

INSULATOR

S/MAR

ENHANCER

SILENCER

REPRESSOR

L.C.R.

Expressió del transgèn

+

-

+

+/-

+/-

+++++ OK

EXPLICACIÓ DELS RESULTATS VARIABLES:No-inclusió de tots els elements reguladors propis del domini d’expressió

11 de 36

Page 12: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Com es millora l’expressió d’un transgèn?

Promotor minigen / cDNA poliA

SOLUCIÓ: Us de transgens genómics, amb fragments grans de DNA que garanteixin la inclusió de tots els elements

reguladors que són propis del domini d’expressió

12 de 36

Page 13: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Exemple: correcció de l’albinisme en ratolins transgènicsEl gen de la tirosinasa

Ratolí albí Ratolí salvatge (agouti )

TRANSGÈNESI

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

ptrTYR4(5 kb promoter)

ptrTYR5(280 bp promoter)minigens

YACs12345 YRT2 (250 kb)

13 de 36

Page 14: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Inactivació gènica en ratolins transgénicsTransgènics antisentit (antisense)

Transgènics amb RNA d’interferènciasiRNA/shRNA (small interfering RNA/short hairpin RNA)

gen A a l’inreves poliA

Transgènics antisenseRNA Pol IIpromotor

Gen A

Pot funcionarResultats imprevisiblesDesactivació no completa

Transgènics siRNA / shRNA

polyARNA Pol IIIpromotor

Molt específicsResultats previsiblesDesactivació variable

Gene A A

Ratolins genominvats (knock-down)

14 de 36

Page 15: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Generació de ratolins transgènics

Eficiència en la generació de ratolins transgènics:

100 óvuls fecundats microinjectats10-30 % poden implantar-se i gestar-se correctament

10-30 cries nascudes10-30 % de las cries són transgènics

1-9 ratolins transgènics

Eficiència global: 1-9 % (habitualment 2-5%)

15 de 36

Page 16: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Cèl·lules ESsobre fibroblastes

embrionaris de ratolí

Desactivació específica de gens mitjançant recombinació homòloga en cèl·lules ES

Generació de ratolins genoanul·lats / mutants (knock-out)

16 de 36

Page 17: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Obtenció de quimeras mitjançant la microinjecció de cèl·lules ES en blastocists

17 de 36

Page 18: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Obtenció de quimeras mitjançant l’agregació de mòrules i cèl·lules ES

Cèl·lules ES

Mòrula

Quimera

18 de 36

Page 19: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Estratègia general per lageneració d’un ratolí mutan-genoanul·lat (knock-out)

mitjançant recombinació homòloga en cèl·lules ES

gen A

x x Inicialment les cèl·lules ES són

sensibles a G418resistents a Ganciclovir

NeoRTKTargeting construct

gen A

gen ASTOP

RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Les cèl·lules ES són

resistents a G418resistents a Ganciclovir

genA A

INTEGRACIÓ A L’ATZAR Les cèl·lules ES són

resistents a G418sensibles a Ganciclovir

19 de36

Page 20: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Generació de ratolins genoanul·lats / mutants

Eficiència de recombinació homòloga en cèl·lules ES:

0-25 % clons de cèl·lules ES recombinants són positius (habitualment 2-10%)

80-90% mòrules agreguen amb cèl·lules ES40-60% blastocists inyectats/agregats amb cèl·lules ES arriben a terme

Contribució del genotip ES a la línia germinal

Quimeres amb > 50 % tendeixen a transmetreQuimeres < 50 % contribució tendeixen a no transmetre

SíNo20 de 36

Page 21: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Obtenció de ratolins mutants / genoanul·lats a partir de quimeres

X+

X

Primera generació F1

Segona generació F2

Quimera Salvatge

Heterozigot Heterozigot

Heterozigot SalvatgeMutant

Ratolí mutant (<= 25% de la F2)

21 de 36

Page 22: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

gen A

gen A

gen A

gen A

gen A*

neo

neoEGFP

neoGen B

Al·lel originalGen A actiu

Al·lel genoanul·lat (knock-out) Gen A inactiu

Al·lel genomodificat (knock-in) Gen indicador sota el control de AGen A inactivat

Al·lel genomodificat (knock-in) Gen B sota el control de AGen A inactivat

Al·lel genomodificat (knock-in) Gen A “modificat” actiu

neo

*

ESTRATÈGIES DIFERENTS PER A LA GENERACIÓ D’ANIMALS MUTANTS

22 de 36

Page 23: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

PROBLEMA: Com avaluem la funció d’aquests gens en individus adults?

PROBLEMA: Les mutacions poden ser letals

en gens que afectin el desenvolupament de l’organisme

FGF4FGF2R

XPD

Postimplantació

BRCA1Hoxa-10

Otx-2

Organogènesi

FibronectinaHNF-3βN-myc

Desenvolupament fetal

WT-1NF1

RXRα

Supervivència perinatal

CREBGR

GDNF

DE

SE

NV

OL

UP

AM

EN

T

Preimplantació

23 de 36

Page 24: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Solució: generar mutants condicionals

El sistema CRE-loxP

de recombinació específica de lloc

(bacteriòfag P1)

+

+

CRERecombinasa

específica

loxP loxP

loxP

escissió integració

24 de 36

Page 25: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

El sistema CRE-loxP i la generació de ratolins KO mutants condicionals(específics de teixit)

RecombinacióHomòloga en cèl·lules ES

CRE

Microinjecció(transgénic)

CRE

CRE

X

CRE

RATOLÍ AMB LA MUTACIÓ PRESENT NOMÉS EN UN TEIXIT

Ratolí 1

Ratolí 2

Ratolí 1 Ratolí 2

25 de 36

Page 26: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

gen A

gen Aneo

Al·lel originalGen A actiu

Al·lel “floxed”Gen A actiu

ESTRATÈGIES DIFERENTS PER LA GENERACIÓ D’ANIMALS MUTANTS CONDICIONALS

gen AAl·lel “floxed”Gen A actiu

gen AAl·lel genoanul·latGen A inactiu

gen A*Al·lel genomodificat "floxed”Gen A “modificat” actiu

*

+ CRE

+ CRE

+ CRE

Floxed = “Flanked by LoxP sites”

LoxP

26 de 36

Page 27: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Fusió de la proteïna CRE amb dominis d’unió a ligand (LBD)de receptors hormonals mutats.

CRE ER-LBD*

CRE GR-LBD*

CRE PR-LBD*

S’activa per 4-OH-tamoxiféNo s’activa per β-estradiol

S’activa per dexametasonaNo s’activa per cortisol

S’activa per RU486No s’activa per progesterona

Schewnk et al. (1998)

Brocard et al. (1998)

Kellendonk et al. (1996)

hsp90

CRE inactiva CRE activa

Fonament científic

Ligand

Control de la mutació en el temps i en l’espaiGeneració de ratolins amb mutacions

específiques de teixit en un moment determinat

27 de 36

Page 28: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Aplicacions dels animals transgènics / mutants (genoanul·lats)

Identificació de gens per complementació de mutacions

Mutagènesi per inserció

Anàlisi de la funció d’un gen al llarg del desenvolupament

Estudi d’unitats de transcripció complexes

Identificació de dominis d’expressió i reguladors llunyans

Diseny d’estratègies de teràpia gènica

Models animals de malalties humanes

Transgens induïbles, indicadors

Producció de proteïnes recombinants d’interès

Xenotransplantaments28 de 36

Page 29: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Aplicacions dels animals transgènics i mutants

Biologia coneixement

Biomedicina salut humana i animal

Biotecnologia producció

29 de 36

Page 30: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Number of Medline Citations Listed by General Phenotype in Transgenic or Knockout Mice

GrupDiabetesObesitatCàncerCàncer de pitAlèrgiaCardiovascularsAterosclerosiHipertensióDesenvolupament embrionàriFertilitatReproduccióOrganogènesiAnomalies craniofacials

MUTANTS131607444813924419181

2521107

130337763

TRANSGÈNICS57311726661981043472251924994

9971853156

Anna Anagnostopoulos (The Jackson Lab., 2000)

MODELS ANIMALS TRANSGÈNICS O MUTANTS EN L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES

30 de 36

Page 31: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Number of Medline CitationsListed by Behavioral Phenotype

TIPUS

AnsietatAprenentatgeEpilepsiaPorEstrésPsicosiAgresióDolorCapacitats motoresInstint maternalAlcoholismeMemòriaAlimentació

TRANSGÈNICS

221634717282

22631375

724331119

MUTANTS

421895324

23513764

23318

15119030

Anna Anagnostopoulos (The Jackson Lab., 2000)

… I TAMBÉ PER MALALTIES O DESORDRES DE TIPUS NERVIÓS O DE LA CONDUCTA

31 de 36

Page 32: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

Animals transgènics en biotecnologia

Augment de producció (quantitat)

Augment de producció (qualitat)

Bioreactors

Xenotransplantaments

32 de 36

Page 33: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

DollyIan Wilmut (1945- )

i la ovella Dolly (1996-2003)

TRANSFERÈNCIANUCLEAR EN

MAMÍFERS(1997)

33 de 36

Page 34: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

ANIMALS “CLONATS” (2006)

34 de 36

Espècie animal Any del clonatge

Ovella 1997

Vaca 1998

Ratolí 1998

Cabra 1999

Porc 2000

Gat 2002

Conill 2002

Peix zebra 2002

Mula 2003

Caball 2003

Rata 2003

Gos 2005

Fura 2006

Page 35: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

ÒVULENUCLEACIÓ

TRANSFERÈNCIANUCLEAR

BIÒPSIACÈL·LULA

SOMÀTICA

CULTIU IN VITRO

CÈL·LULES ESEN CULTIU

MODIFICACIÓGENÈTICA

DIFERENCIACIÓIN VITRO A UN

TIPUS CEL·LULAR NOU

TRANSPLANTAMENT

USO DE CÉLULAS MADRE (STEM CELLS)EN TERAPIA HUMANA

Reprogramacióin vivo

BLASTOCIST

TERÀPIA CEL·LULAR

35 de 36

Page 36: Animals modificats genèticament: ratolins transgènics i ...montoliu/Montoliu_SCB57_transgenics.pdf · De la fase de preimplantació ... CH3 CH3 CH3 CH3CH 3 CH3 CH3 EFECTES DE POSICIÓ

http://www.cnb.csic.es/~transimp/

Pàgines web:Transgénesis en Mamíferos

Células troncales - embriones - clonación

[email protected]

http://www.cnb.csic.es/~montoliu/

[email protected]

Lluís MontoliuCSICCentro Nacional de Biotecnología, Madrid

36 de 36