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Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas

Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. 

Crecimiento balanceado.  Cinética de crecimiento. Curva de crecimiento en sistema cerrado (batch, discontínuo)

Introducción al crecimiento microbiano 

• Puntos de vista del estudio:

– Individual: Ciclo celular

• Replicación DNA y segregación de cromosomas

• Síntesis de nuevos materiales  

• Coordinación de la replicación y la división celular

– Poblacional

• Cinética del crecimiento

• Parámetros cinéticos: tiempo de generación (g), tasa de crecimiento

• Factores ambientales que afectan al crecimiento

– Físicos

– Químicos

Crecimiento bacteriano• Aumento en el # de células más que en su tamaño

• Mecanismo  fisión binaria– Duplicación de DNA

– Duplicación de macromoléculas, monómeros, iones 

– Síntesis de membranas y pared celular 

– División celular

• Tiempo de generación variable (prom. 1 ‐ 3 hr)

– Depende de factores genéticos, nutricionales y ambientales

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Fisión binaria

• Fase C

• Fase D

• n = 1

n=?

Medida del número de individuos (I)

• Métodos directos:

– Cámara de Neubauer o Petroff‐Hauser (para levaduras y células mayores que las bacterianas)

– Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)

• Métodos indirectos:

– Métodos turbidimétricos (ópticos):

• Espectrofotómetro (mide luz transmitida)

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Cuenta en Cámara

Método turbidimétricoEl espectrofotómetro mide la turbidezcomo la cantidad de luz que desvía uncultivo, en unidades de absorbancia(DO)

La célula bacteriana dispersa la luz, demanera que no es detectada por eldetector sensible a la luz.

La curva estandar relaciona la DO conel #células/mL. Una vez que seobtiene, esta curva puede usarse paraconvertir cualquier medida de DO en#células/mL.Por ejemplo, a partir de esta curva, unalectura de 1,6 unidades de DO significa que elcultivo contiene 1x108 células /mL.

Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)

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Medida del número de individuos (II)

• Métodos directos:

– Recuento de  UFC = viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri

– Recuento de UFC a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas:

• se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore®), y se incuban sobre medio sólido

Dispersión sobre superficieMedio líquido en sobrefusión

Filtración por membrana de Millipore® de una muestra (en muestras muy diluidas)

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Medida del crecimiento por masa celular (I)

• Métodos directos:

– Determinación del peso húmedo

– Determinación del peso seco

– Determinación del N total

– Determinación de algún componente característico:• ADN, ARN

• Proteínas

• ATP

• Clorofilas (en fotosintéticos)

Medida del crecimiento por biomasa (II)

• Métodos indirectos:– Consumo de nutrientes 

• QO2 (consumo de oxígeno)

• QCO2 (consumo de dióxido de carbono)

– Productos del metabolismo• Producción de ácidos orgánicos

• Producción de CO2

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Cuando se inoculan células a un medio de cultivo?

Crecimiento balanceado (=equilibrado) 

• El número de células, cantidad de biomasa,concentración de proteínas, ácidos nucléicos, etc.evolucionan en paralelo (cambian en la misma forma)

• El incremento por unidad de tiempo de losconstituyentes de la población es un valor constante:

• y el nº de células, la masa u otros componentes seduplican en un mismo lapso de tiempo

Let’s take look at animationhttp://www.biology.arizona.edu/biomath/tutorials/Applications/Population.html

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Considerando que el cultivo tiene un crecimiento equilibrado en la ecuación 1. “N” puede representar cualquiera de estos factores.

Ecuación 1 N= No x 2n

Como n= número de generación y td es el tiempo que transcurre, en cualquier tiempo de cultivo (T) se puede calcular

Ecuación 2 n= T_ td

Cinética de crecimiento en cultivo discontínuo (batch)

Importancia?

No = número inicial de célulasN= número de células después de n generacionesn= número de generaciones

combinando las ec. 1 y 2:

Ec. 3 N = N0 2T/td

Ec. 1. N= No x 2n

NNo

2n

No = # de células al inicioN = # de células después de “n” generacionesn = # de generaciones o duplicaciones

Ec. 2 n= T Tiempo de crec. Exp.td tiempo de duplicación

1. Conociendo n y T se puede calcular td = tiempo de generación (g) para diferentes poblaciones bacterianas creciendo exponencialmente en diferentes condiciones de crecimiento.

2. Los Tiempos de generación son buenos indicadores del estado de salud fisiológico de una población bacteriana.

3. Se utilizan frecuentemente para evaluar el efecto + o – de algún tratamiento sobre el cultivo bacteriano

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Si se inoculan N bacterias que se duplican cada 3 horas en un medio de cultivo fresco... después de 3 h tendremos 2N bacterias, en otras 3 horas 4N..

Se considera que haycrecimiento sincrónico quese ajusta a un modelogeométrico de crecimientoes decir que el aumento dela población se dá enpuntos discretos (3, 6, 9,12, etc. horas) . Pero en lapráctica aún en lascondiciones óptimas decrecimiento esto no seobtiene, porque?

Modelo de crecimiento en escalera

•Porque las bacterias generalmentepueden encontrarse en diferentesetapas del proceso de división celularpor lo que el cultivo no estásincronizado.

•Incluso si se iniciara con 1 solacélula, la sincronicidad se mantendrásolamente por algunas generaciones.

•Así, se observa que la gráfica decrecimiento es de tipo exponencial,que permite utilizar modelos confunciones exponenciales para cálcularparámetros de crecimiento ypredecirlo a diferentes tiempos.

Las ecuaciones exponenciales son difíciles de manejar gráficamente, setransforman en una recta, aplicando logaritmos en los dos términos yresulta:

Ecuación 4 ln N = ln N0 + (T/td) ln 2

Donde (T/td)=µ = constante o tasa de crecimiento

N = N0 2T/td

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Ejercicios:

1. Si se inoculan 1.2 x103 bacterias en un medio de cultivo y después de 4 horas de incubación creciendo exponencialmente se obtienen 1.8 X105 bacterias.n=?g =?td=?

2. Cuántas bacterias habrá en un cultivo después de 18 horas si este se inocula con 1x102 bacteria que tiene un td= 3 horas

3. Con cuántas bacterias deberá inocularse un medio de cultivo si queremos tener 81,920 bacterias después de 12 horas?

4. Cuánto tiempo tardará una población inicial de 6x102 para llegar a 1.3 x 104bacterias?

R2=1.31x105

R3= 5R4=33 h

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:

Ecuación 5

Una recta con m=k=µ

A la (μ), y se le conoce como constante de crecimiento (tasa de crecimiento). Se puede calcular , despejando

Ln N – Ln N0 = μt

También se transforma en la siguiente función exponencial:

Ecuación 6 y 7 N = N0 eμt = X = X0 eμt

Es la ecuación general del crecimiento exponencial.

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Ejercicio:Si a un t0 = 2h se cuantifican N = 9.6x102 células/mLY a t = 8h: N = 4.7x106

Calcular el valor de µ y Td µ =1.42 h-1

Td = 0.48 horas

Para calcular el Td, consideramos que N=2N0

2N0 = N0 eμtd

Ln2+LnN0 = LnN0 +μtd

Ln2+LnN0 - LnN0 = μtd

Ln2+LnN0 - LnN0 = μtd

Ln 2 = tdμ

Crecimiento en sistemas cerrados líquidos

• El más habitual en laboratorio

• Cultivo en frascos, tubos, etc.

• No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo

• Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento

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Cultivo continuo(sistema abierto)

• Cultivo balanceado que se mantiene por tiempo indefinido, por un flujo de nutrientes contínuo; que incluye:– Una cámara de cultivo de volumen constante

– A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio

– Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero

Medio fresco desde reservorio

Válvula para controlar el flujo

f (en ml/h)

f (en ml/h)

vx

Pérdida neta células: -dx/dt = x·D

Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ

Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D)

En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante

D = f/v (en h-1)

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