2. vida y muerte de los microorganismos -...

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 1

2. Vida y muerte de los microorganismos 2.1. Crecimiento

Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la biogénesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo (1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular .

Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se

puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población (3). Una bacteria originará cuatro células (22) después de dos ciclos, dieciseis (24) después de cuatro ciclos, etc. Cada célula de bacteria o levadura da, por escisión o gemación, dos células y el número inicial Xo de células (en el instante to=0) se convierte, después de n generaciones en un tiempo t, en X = Xo. 2n Como n representa el número de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t, el tiempo de generación g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln Xo + t.ln 2/g * El término ln 2/g es la velocidad específica de crecimiento (µ) de la población o sea µ = 0,69/g La ecuación * puede escribirse bajo la forma lnX - lnXo = µ.t por lo tanto X = Xo.eµt

y dX/dt = µX En el curso de la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento alcanza su valor más elevado (µmáx).


En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida, más temprano o más tarde, por la fase de muerte (3). En los estudios de la cinética del crecimiento individual de los microorganismos pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observó que: a) la velocidad de extensión de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las

mismas y a la velocidad específica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden crecer exponencialmente;

b) cada ápice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad de aumento de la biomasa;

c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificación) (4).

2.2. Tipos de nutrición

Los organismos fotosintéticos y los que obtienen energía por oxidación de compuestos inorgánicos suelen usar generalmente CO2 como fuente única o principal de carbono (autótrofos). Pero, la mayoría de los microorganismos del laboratorio son heterotróficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgánico y nitrógeno asimilables, así como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un único compuesto orgánico que sirve tanto de fuente de carbono y de energía, y de una fuente inorgánica u orgánica de nitrógeno (1).

Metabolismo energético de los microorganismos (1) tipo de organismos dependientes de fotótrofos radiación solar fotolitótrofos= autótrofos dadores de electrones inorgánicos fotoorganótrofos dadores de electrones orgánicos quimiótrofos compuestos químicos quimiolitótrofos= autótrofos oxidación de compuestos inorgánicos quimioorganótrofos= heterótrofos oxidación o fermentación de compuestos . orgánicos Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que crece como simbionte en los nódulos de la raíz de leguminosas, así como cianobacterias, pueden fijar el nitrógeno gaseoso de la atmósfera, es decir reducirlo convirtiéndolo en nitrógeno orgánico. Por otra parte, las formas parásitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5). En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos hace uso del amonio como fuente única o principal de nitrógeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan también muchos otros elementos, como fósforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno (1)


2.3. Factores de crecimiento

Son los compuestos, necesarios en pequeña cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotróficos para ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 µg/mL de biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).

2.3.1. Factores orgánicos Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o vitaminas. Éstos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las células de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no excretan ácido glutámico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminoácidos, por ejemplo Leuconostoc mesenteroides , pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6). Vitaminas del grupo B Función (1) ácido nicotínico (niacina) precursor de piridín-nucleótidos (NAD y NADP) ácido pantoténico “ “ coenzima A riboflavina (B2) “ “ flavín-nucleótidos (FMN, FAD) ácido fólico participa en transferencia de grupos metilo biotina “ “ biosíntesis de ácidos grasos, fijación de CO2

cobalamina (B12) “ “ síntesis de desoxirribosa y transferencia de restos monocarbonados piridoxal- piridoxina (B6) “ “ transformaciones de aminoácidos y cetoácidos tiamina (B1) “ “ α-descarboxilaciones

2.3.2. Factores minerales La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestión de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiológicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas específicas (1). Además, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las diatomeas (7).

2. 4. Transporte de solutos

El transporte de nutrientes a través de la membrana citoplasmática es específico porque son captados por la célula solamente aquéllos para los cuales existe un sistema transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K+) produciendo alteraciones en el potencial electroquímico. Las fuerzas que intervienen son el transporte de electrones respiratorio o fotosintético, o las bombas iónicas dependientes del ATP o de la descarboxilación de metabolitos. El transporte secundario está guiado por gradientes en el potencial electroquímico (9). La difusión pasiva o simple esté gobernada por el tamaño molecular y las propiedades lipofílicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares y ciertos inhibidores. La difusión facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una


permeasa específica para el substrato y depende de la concentración de substrato en el medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la célula. El transporte activo y la trasladación del grupo se parecen a la anterior en que participan proteínas específicas y difieren en que necesitan la provisión de energía. El nutriente puede ser acumulado dentro de la célula. En el transporte activo la molécula liberada en el interior de la célula es idéntica a la del exterior, mientras que en la trasladación del grupo la molécula fue modificada durante el transporte, por ejemplo por fosforilación en el caso de un azúcar (9). Se distinguen diferentes procesos de transporte activo según la vía por la cual se dispone de la energía necesaria: potencial protón, ATP o fosfoenolpiruvato. El transporte de muchas substancias (azúcares, iones inorgánicos y orgánicos) es empujado por el potencial protón, La célula bacteriana mantiene dicho potencial por bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen proteínas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas proteínas tiene una función específica. Por ejemplo, una proteína cataliza el transporte simultáneo de una molécula de azúcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protón en la misma dirección, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces más) substancias.

Otras proteínas catalizan el transporte simultáneo de dos substancias en direcciones opuestas, por ejemplo un protón y otro ión (Na+ o un ácido orgánico), lo que se llama antiporte, como se muestra en la figura 2. En las células procarióticas la entrada de azúcares a la célula es favorecida por un simporte acoplado a H+, mientras que en las eucarióticas está casi siempre acoplado a Na+. Además de los sistemas de transporte

que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP, donde intervienen las proteínas del espacio periplásmico en las proteobacterias (8) . Cuando el transporte ocurre mediante trasladación de grupos, la molécula transportada es modificada químicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u otro azúcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2). En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentración del Fe+++ es a lo sumo 10 -18

moles/L pues se forma el hidróxido férrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++ que permitan transportado. Tales substancias se denominan sideróforos y son compuestos fenólicos e hidroxamatos (9). La levadura de cerveza posee distintos sistemas específicos para la captación de cada ión metálico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a


Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmática, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporación a las células con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento actúa otro sistema de captación de alta afinidad. La levadura también tiene dos sistemas de captación para la incorporación de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patógenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metálicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captación de iones metálicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgénicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales tóxicos como, por ejemplo unas plantas donde se había expresado un gen que les posibilitó convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales

El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios más dinámicos en interacciones biológicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgánica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo (12).

2.5.1. Agua y presión osmótica La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en términos de actividad del agua (aw), la que se define como la razón entre la presión de vapor de agua del substrato o solución (p ) y la presión de vapor del agua pura (po) a la misma temperatura, es decir, aw = p/po Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmósfera en equilibrio con el sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una aw por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores más bajos obtenidos para arqueobacterias halófilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerófilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmófilas (que prefieren presiones osmóticas elevadas) se multiplican muy lentamente aún con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los límites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son más amplios a la temperatura óptima de multiplicación. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce la aw. La presencia de ciertos elementos nutritivos amplía los límites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presión osmótica (θ) está relacionada con la actividad del agua a través una expresión θ = -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R), la temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo ψ es la suma de los potenciales osmótico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es también una medida indirecta del potencial agua. El potencial osmótico de la solución del suelo (π ) puede expresarse mediante la ecuación π = -RT ρ υ m φ /109 donde ρ es la densidad del agua, υ los iones por molécula de soluto, m la molalidad, φ el coeficiente osmótico a la molalidad m y la temperatura T°K. El potencial matricial (τ) está dado por la ecuación τ = (RT ρ ln p/po) /106 M donde M es el peso molecular del agua.


El término capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado después de la saturación, cuando la velocidad de la pérdida de agua debida a la gravedad es pequeña. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica interna (1). En contraposición a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentración más elevada que la del medio externo. Además de neutralizar las cargas negativas de la célula y de regular la función enzimática, el potasio actúa como un soluto implicado en la regulación osmótica de algunos organismos Algunos organismos halófilos que viven en ambientes de alta salinidad sódica, por ejemplo Halobacterium, son la excepción a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua (ψ) óptimo y mínimo para el crecimiento: grupo 1. óptimo –0.1 MPa, mínimo alrededor de –2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. óptimo alrededor de –1 MPa, mínimo alrededor –5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. óptimo alrededor de –1MPa, mínimo –10 a –15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram-positivas (12).

2.5.2. Tensión superficial La tensión superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de película o velo en los medios corrientes con una tensión superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es función de la tensión superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeños e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedaría por encima sin mostrar penetración alguna.

2.5.3. pH El pH del medio puede influir sobre la expresión de genes y regular el transporte de protones, la degradación de los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o básicas y aún la virulencia. Las células perciben los cambios del pH ambiente a través de diferentes mecanismos. La protonacíón y desprotonación de los aminoácidos inducida por el pH, puede alterar la estructura proteínica secundaria y por lo tanto la función que señala el cambio. La célula puede responder sólo a una de las formas de las moléculas de señal. Por ejemplo, los ácidos orgánicos atraviesan la membrana citoplasmática solamente en la forma protonada y un aumento de la concentración intracelular indicaría un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a través de la membrana puede servir, por sí mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energía (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crítico en el cual las proteínas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeostática, la respuesta de tolerancia al ácido y la síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las células bacterianas ajustan su pH interno a través de la respuesta homeostática modulando la actividad de las bombas de protones,


antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeostático es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la síntesis proteica. La respuesta de tolerancia al ácido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la síntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La pérdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metabólicos, anula la respuesta de tolerancia al ácido pero no el mecanismo homeostático. Esta respuesta también puede conferir protección cruzada frente a otros agentes ambientales de estrés. La síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico es la tercera vía por la que la célula regula el pH interno. Esta síntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de proteínas reguladoras distintas de las proteínas de la respuesta de tolerancia al ácido.

Rango de pH para el crecimiento (2) Bacterias límite inferior óptimo límite superior Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-3,5 6,0 Azotobacter sp. 5,5 7,0-7,5 8,5 Erwinia carotovora 5,6 7,1 9,3 Clorobium limicola 6,0 6,8 7,0 Thermus aquaticus 6,0 7,5-7,8 9,5 Nitrobacter spp. 6,6 7,6-8,6 10,0 Hongos Aspergillus oryzae 1,6 9,3 Fusarium oxysporum 1,8 11,1 Penicillium italicum 1,9 9,3 Rhizoctonia solani 2,5 8,5 Botrytis cinerea <2,8 7,4 Aspergillus niger 2,8 8,8 Aunque para la mayoría de las bacterias el pH óptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidófilas (Thiobacillus), algunas son ácido-tolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolíticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un medio de pH 5, pero no a pH 8 (15). Algunos organismos productores de ácidos no son ácido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias (2).

2.5.4. Oxígeno El metabolismo de los microorganismos está fuertemente influído por el oxígeno molecular. Los organismos que dependen de la respiración aeróbica, para los cuales el oxígeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aeróbicos estrictos. Un ejemplo de éstos es la actinobacteria Streptomyces. Por el contrario para los organismos anaeróbicos estrictos el oxígeno es generalmente tóxico. Las células somáticas de las bacterias del género Clostridium son muy sensibles al oxígeno mientras que los endosporos están protegidos de su efecto letal. Un grupo intermedio de organismos, los anaeróbicos facultativos, pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su energía tanto de la fermentación como de la respiración. Por otro lado están los organismos que únicamente toleran al oxígeno, como algunas bacterias lácticas que


obtienen su energía exclusivamente de la fermentación sin ser dañadas por el oxígeno. Ciertas bacterias aeróbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentración de oxígeno es reducida y se las denomina microaerofílicas (14).

2.5.5 Potencial de reducción El potencial de reducción de un substrato es aquel en que dicho substrato gana electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV). Cuanto más oxidada esté una substancia más positivo será su potencial eléctrico, y cuanto más reducida el potencial será más negativo. El potencial de reducción de un sistema se expresa con el símbolo Eo’. Los microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores Eo’ positivos mientras que los anaeróbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo’ negativo. Entre las substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se encuentran los aminoácidos con un grupo tiol (-SH) y los azúcares con un grupo aldehído libre (15).

2.5.6. Temperatura En muestras de agua recogidas en las proximidades inmediatas a las surgencias termales se han hallado hasta 108 - 109 células bacterianas por mL. Las bacterias adaptadas a elevadas presiones hidrostáticas (250–260 bares o sea 25-26 MPa) muestran además una notable adaptación a las altas temperaturas, por ejemplo unas bacterias metanogénicas tenían tiempos de duplicación entre 37 y 65 minutos a 100°C bajo tales presiones (16).

Temperaturas cardinales en °C para microorganismos procarióticos (17) grupo mínima óptima máxima termófilos 40-45 55-75 60-90 mesófilos 5-15 30-45 35-47 psicrotrofos -5-+5 25-30 30-35 psicrófilos -5-+5 12-15 15-20 Los valores de las temperaturas cardinales (mínima, óptima, máxima) varían ampliamente entre las bacterias como se muestra en el cuadro siguiente, pero algunas tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12 y 50°C. Los organismos aislados de ambientes fríos crecen a temperaturas por debajo de 0°C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelación del medio (1).

Temperaturas en °C para el crecimiento de bacterias (1) especie mínima óptima máxima Listeria monocytogenes 1 30-37 45 Pseudomonas maltophila 4 35 41 Escherichia coli 10 37 45 Clostridium kluyveri 19 35 37 Bacillus flavothermus 30 60 72 Thermus aquaticus 40 70-72 79 Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90 Pyrobacterium brockii 80 102-105 115 Los mohos psicrotrofos pertenecen a los géneros Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Trichothecium y las levaduras a Candida, Cryptococcus, Torulopsis, Rhodotorula (18).


Temperaturas cardinales de algunos hongos (18,19)

temperatura °C grupo mínima óptima máxima Alternaria solani 2 27 45 Aspergillus fumigatus 12 35 55 Botrytis cinerea 0 20 30 Fusarium moniliforme <5 25 35 Rhizoctonia solani 2 25-30 35 Trichothecium roseum <10 30 35 La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y en los rangos inferiores el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas. Los microorganismos eucarióticos, por ejemplo protozoos, son más sensibles a las bajas temperaturas que los procarióticos, y entre estos últimos los gram negativos son más afectados que los gram positivos (17).

2.6. Medios de cultivo El medio sirve de reservorio para los nutrientes. El componente dominante es casi siempre el agua. También en el caso en el que los microorganismos se hallen sobre un substrato sólido, por ejemplo cereales o forrajes, éste debe estar húmedo para permitir la acción microbiana o enzimática.

Medios complejos para el enriquecimiento de bacterias heterótrofas (21) base : extracto de levadura 1%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,02% incubación : 30°C, en la obscuridad fuente condiciones agregado organismos suelo pH 7,0 - aerobiosis --- oxidantes de aminoácidos " pH 3,0 - anaerobiosis glucosa 2% Sarcina sp. suelo pasterizado pH 7,0 - aerobiosis --- Bacillus spp. " pH 7,0 - anaerobiosis --- Clostridium fermentadores

de aminoácidos " pH 8,0 - aerobiosis urea 5% Bacillus pasteurii " pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, Clostridium fermentadores

CaCO3 2% de azúcares vegetales, leche, pH 6,5 - anaerobiosis glucosa 2% bacterias lácticas frutas, cerveza pH 6,0 - aerobiosis etanol 4% bacterias acéticas suelo, agua pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, bacterias coliformes residual CaCO3 2% queso suizo pH 7,0 - anaerobiosis lactato Na 2% bacterias propiónicas Los microorganismos heterotróficos pueden utilizar azúcares, alcoholes y aminoácidos como fuente de energía. Algunos son capaces de emplear polisacáridos, como almidón y celulosa, al tener la posibilidad de hidrolizar estos compuestos hasta azúcares sencillos. Loa aminoácidos y nucleótidos suelen constituir la fuente primaria de nitrógeno y para obtenerlos, algunos organismos son capaces de degradar péptidos, proteínas y polinucleótidos. También las grasas son utilizadas como fuente de energía, aunque sólo un número relativamente pequeño de microorganismos las atacan (20). Además del carbono, los nutrientes primordiales son nitrógeno y fósforo que se incorporan como amonio o nitrato, y fosfato. Otros nutrientes, tales como vitaminas e iones metálicos, se requieren en pequeña cantidad (micronutrientes) y suelen estar, como contaminantes, en los componentes principales de los medios de cultivo e incluso


en los recipientes de vidrio que los contienen. Cuando el oxígeno es necesario para el metabolismo, la fuente usual de suministro es el aire filtrado (5). La mayoría de los mohos, así como unas pocas bacterias y levaduras, cuando crecen sin alteraciones, forman una película fuerte y contínua en la superficie del medio. En cambio, si crecen bajo el efecto de una agitación vigorosa, originan bolitas de una pulpa fibrosa dispersadas por todo el medio fluído (20). Los requerimientos nutritivos de los mohos son muy parecidos a los de las levaduras, salvo que los mohos presentan más diversidad en los tipos de substratos orgánicos que pueden asimilar (5). En el laboratorio un medio corriente es el extracto de malta, con o sin extracto de levadura y agar. Para el crecimiento de algunos mohos se utiliza un medio definido constituído por sacarosa y sales minerales conocido como agar Czapek, a veces adicionado de extracto de levadura. Cuando se desea aislar hongos osmófilos se le agrega 20 a 50% de sacarosa (18). Un medio con cloruro de amonio y otras sales, sin ninguna fuente de carbono, cuando se incuba aeróbicamente tendrá disuelto CO2 atmosférico y en presencia de luz permitirá el crecimiento de algas y cianobacterias. Pero si se incuba en la obscuridad facilitará el desarrollo de bacterias que obtienen energía por oxidación del amonio (20).

Medios para el enriquecimiento de bacterias fotosíntetizantes (21)

base : NH4Cl 0,1%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubación : 25 - 30°C, iluminación constante, sin aire agregado pH organismos Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 7,5 bacterias verdes del azufre Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 8,0 - 8,5 bacterias purpúreas del azufre Na malato 0,5% + ext de levadura 0,05% 7,0 - 7,5 bacterias purpúreas no del azufre

Medios sintéticos para el enriquecimiento de bacterias autotróficas (21) base: K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubación: 25 - 30°C, en la obscuridad agregado pH atmósfera organismos NH4Cl 0,15% + CaCO3 0,5% 8,5 aire Nitrosomonas NaNO2 0,3% 8,5 aire Nitrobacter NH4Cl 0,1% + Na2S2O3 0,7% 7,0 aire Thiobacillus NH4NO3 0,3% + Na2S2O3 0,7% + NaHCO3 0,5% 7,0 sin aire T. denitrificans NH4Cl 0,1% 7,0 H2 85%,

O2 10%, bacterias . CO2 5% del hidrógeno Sea cual fuere la composición química del medio, es necesario que todos los componentes estén perfectamente mezclados, de modo que el microorganismo tenga acceso a todos los nutrientes. La mayoría de las bacterias y algunas levaduras crecen comúnmente como células individuales o como agregados de varias de ellas, y permanecen suspendidas en el medio. Cuando se trata de una población densa o las células secretan polímeros, el medio fluído se vuelve viscoso y además, pueden formar grandes agregados o crecer como una película mucosa sobre la superficie.


2. 7 Esterilización

2.7.1. Acción del calor Con el fin de evitar el crecimiento de microorganismos extraños introducidos por la contaminación, se esterilizan con vapor de agua a presión todos los materiales que integran el medio de cultivo. El vapor también se suele emplear para esterilizar recipientes y otras superficies con las que el medio está en contacto (20).

Tiempo de destrucción de algunos endosporos bacterianos (2)

calor húmedo minutos a organismo 100 105 110 115 120 125 130 1340C bact. termófilas ... 400 100-300 40-110 11-35 4-8 3,5 1 Bacillus anthracis 2-15 5-10 ... ... ... ... ... ... B. subtilis horas ... … 40 … … … … Clostridium tetani 5-90 5-25 … … … … … … C. perfringens 5-45 5-27 10-15 4 1 … … ... C. botulinum 300-530 40-120 32-90 10-40 4-20 ... ... ... C.sporogenes 150 45 12 ... ... ... ... ... calor seco minutos a organismo 120 130 140 150 160 170 1800C bacilos termófilos ... ... ... 180 30-90 15-60 15 B. anthracis ... ... >180 60-120 9-90 3 C. botulinum 120 60 15-60 25 20-25 10-15 5-10 C.pefringens 50 15-35 5 … … … … C. tetani … 20-40 5-15 30 12 5 1 Los factores que afectan a la termodestrucción pertenecen a tres tipos generales: (a) factores intrínsecos, por ejemplo diferencias entre cepas y especies, entre

endosporos y células somáticas; (b) factores ambientales que ejercen su influencia durante el crecimiento y la

formación de las células o los endosporos, como edad, temperatura y medio de cultivo;

(c) factores ambientales que actúan durante el tratamiento térmico de las células o los endosporos, por ejemplo pH, aw, medio de suspensión, tipo de substrato, sales y otros compuestos orgá nicos o inorgánicos.

Los endosporos bacterianos son muy resistentes a la temperatura, algunos pueden incluso sobrevivir tratamientos de varios minutos a 120°C en ambiente húmedo. Cuando se utiliza el calor para destruir los microorganismos presentes en una película líquida es posible utilizar tratamientos muy cortos, pero la esterilización de algunos sólidos exige horas debido a las dificultades impuestas por la penetración del calor (17). El autoclave es un aparato cuyo funcionamiento se basa en que la temperatura de ebullición del agua aumenta con la presión. Por consiguiente si la presión absoluta del vapor en el recipiente cerrado se eleva a 2,02 kg/cm2 la temperatura subirá hasta 1200C. La presión absoluta es la suma de la presión atmosférica y la presión manométrica del autoclave. La temperatura de una mezcla de vapor y aire a determinada presión es inferior a la del vapor solo, por lo que debe evacuarse todo el aire de la cámara de esterilización (1). Otra precaución importante es la de que el vapor se introduzca bien en los materiales sometidos a esterilización. El tiempo de funcionamiento depende de la naturaleza y volumen del material que se esteriliza, así como del tipo de envase.


El orden de la termodestrucción microbiana es logarítmico, lo que permite desarrollar combinaciones de tiempo y temperatura que aseguren un efecto destructivo. La figura 3 muestra una recta típica de supervivencia microbiana obtenida representando, en función del tiempo, el logaritmo del número de los supervivientes a la exposición a una determinada temperatura. A partir de este gráfico se puede determinar el tiempo de reducción, decimal (D) que es el número de minutos precisos para destruir el 90% de una población. La línea recta se extiende teóricamente hasta la zona de logaritmos negativos, por ejemplo log 10-3 = 1 célula por cada 1000 g (14).

La muerte de los microbios por una fuente de calor, u otro agente letal, se expresan mediante la ecuación cinética de primer orden N = No .e-kt donde N es el número de células (UFC/g), No el número inicial de células, t el tiempo, k la constante de

velocidad, luego 2,3 log(N/No) = - (k∆t) y entonces ∆t = - [2,3 log(N/No)] / k El tiempo de reducción decimal es la constante cinética usada con más frecuencia en la industria de conservas vegetales e igual a D = 2,3 / k estando D y k definidos para una temperatura dada. La interrelación entre k y T está relacionada con la energía de activación Ea mediante la ecuación de Arrhenius k=s-Ea/RT donde s es la constante de frecuencia, R la constante de los gases ideales, T temperatura en grados Kelvin.

La interrelación entre D y T está dada por el valor z y está relacionado con Ea por la ecuación Ea = [2,3 R. T1. T2 / z]. 9/ 5 siendo T1 la temperatura de referencia y T2 la del ensayo, en grados Kelvin (14).

2.7.2. Acción de las radiaciones La irradiación consiste en proyectar una cierta cantidad de energía sobre un cuerpo para expulsar los electrones periféricos fuera de los átomos y producir de esta manera iones. Estos ion es, así como los electrones expulsados, reaccionan a su vez con otros átomos. El resultado es la rotura de enlaces entre los átomos y las moléculas que constituyen la substancia tratada. En las células, la radiación afecta en primer lugar a los ácidos nucleicos y las proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido nucleico son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y por tanto de la bacteria. Se emplean tres formas de radiación: los rayos gamma, los electrones acelerados y los rayos X. Los irradiadores de rayos gamma funcionan con cobalto 60, emitiendo estos rayos con gran poder de penetración, de hasta varias decenas de centímetros, lo que permite tratar productos a granel. La irradiación también inhibe la germinación de las papas y las cebollas, prolongando el tiempo de almacenamiento, así como afecta a las larvas y huevos de insectos en los cereales.


El gray es la cantidad de energía absorbida correspondiente a un joule por kg de substancia ionizada y reemplaza al rad (1 Gy = 100 rad) en el sistema internacional (22).

2.7.3. Acción de la luz ultravioleta El rango de la radiación UV que más afecta a los microorganismos está entre 240 y 280 nm, y se utiliza para el tratamiento de superficies contaminadas pues tienen poco poder de penetración. La radiación germicida (254 nm) es absorbido por el material celular pero de manera más significativa por los ácidos nucleicos, a los que causa el mayor daño. Los endosporos bacterianos son 7 a 50 veces más resistentes a la radiación UV de 254 nm que las células vegetativas (23). El principal efecto de la luz UV es causar la formación de dímeros, mediante enlaces transversales, entre pirimidinas adyacentes, especialmente residuos de timina del ADN. Estos residuos unidos por enlaces transversales, alteran el proceso normal de replicación dando como resultado mutaciones. Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivación para reparar el daño causado por la radiación UV cuando se exponen inmediatamente después a la luz visible (2).

2.7.4. Acción de las microondas Las microondas son una parte del espectro de ondas electromagnéticas cuya banda se extiende desde los 500 megahertz hasta los 10 gigahertz, es decir incluye ondas cuyas frecuencias de oscilación van desde los 500 millones a los 10.000 millones de ciclos por segundo, y se usan para generar calor interno en diversos productos (24). Las moléculas de agua son dipolos eléctricos y cuando se aplica un campo de microondas, se reorientan con cada cambio en la dirección del campo produciendo calor por la fricción intermolecular. Las características físicas, térmicas, dieléctricas del tejido biológico, su masa y la frecuencia de la radiación, causan un calentamiento diferencial de los distintos constituyentes. Esta falta de uniformidad térmica ha limitado el uso de las microondas para la inactivación microbiana, pues el calentamiento heterogéneo puede dejar puntos donde sobrevivan microorganismos, aunque teóricamente estas células son calentadas específicamente dentro de la matriz del producto que las contiene. La frecuencia comúnmente usada, por distintas razones, es 2,45 GHz y no parece ser la más conveniente (23).

2.7.5. Acción del ultrasonido Las ondas sonoras de alta frecuencia (ultrasonido) también se usan para desintegrar células microbianas y eliminar microorganismos de un equipo (2). Se ha usado para productos líquidos un proceso combinado de inactivación microbiana que incluye calor (112ºC) y ultrasonido (20kHz) bajo una presión de 300 kPa (23).

2.7.6. Separación por filtración Las preparaciones que contienen productos sensibles al calor se esterilizan mejor por filtración. El material filtrante se prepara con un éster de celulosa u otros polímeros con poros de tamaño preciso y uniforme. Es muy delgado, con un espesor de unos 150 µm y por eso se le denomina membrana filtrante. Los filtros más usados tienen un diámetro de poro de 0,2 µm ó de 0,45 µm. Para su uso se suele colocar la membrana preesterilizada sobre el disco que la soporta en la unidad de filtración estéril. Los filtros de aire de elevada eficiencia (HEPA) permiten suministrar aire libre de polvo y microorganismos a una cámara de siembra, y están acoplados a un sistema de flujo laminar (2).

2. 8. Desinfección

Los desinfectantes son substancias químicas que matan a las células somáticas adheridas a las superficies inanimadas, pero no necesariamente a las formas


esporuladas. Los antisépticos destruyen o inhiben el crecimiento y la actividad de los microorganismos que están sobre los tejidos vivos (1). Se llama bactericida a la substancia que mata las células bacterianas y bacteriostático a la que impide el crecimiento y multiplicación de las mismas. Un agente antimicrobiano interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microorganismos y cuando se refiere a grupos específicos se usan los términos antibacteriano o antifúngico (2). Varios factores influyen sobre la velocidad con que son inhibidos o destruídos los microorganismos. A medida que aumenta la concentración del agente las células mueren más rápido, por ejemplo 4,25 g de fenol/L requieren unas 10 horas para obtener el mismo resultado que una concentración de 6,04 g/L en 1,5 horas. Un ligero aumento de la temperatura permite aumentar grandemente la efectividad de un desinfectante por ejemplo, para una solución de fenol de 4,62 g/L, un incremento de 30 a 42°C permite obtener el mismo resultado en un tiempo diez veces menor (2). Las especies de microorganismos difieren en la sensibilidad a los diversos agentes antimicrobianos. Los endosporos bacterianos son las células más resistentes por su capacidad de sobrevivir a las condiciones químicas adversas. La presencia de materia orgánica puede reducir significativamente la efectividad de un antimicrobiano, inactivándolo por combinación con el mismo o protegiendo al microorganismo al dificultar el contacto con el desinfectante. Cuando están en un ambiente con un pH ácido los microorganismos son destruídos a temperatura más baja y en menor tiempo que en un medio ligeramente alcalino (1). Los compuestos fenólicos pueden ser bactericidas o bacteriostáticos según la concentración usada, pero algunos son fungicidas. La actividad es reducida por un pH alcalino o la presencia de materia orgánica. El alcohol etílico en concentraciones de 50 a 70% v/v es efectivo contra células somáticas. Los productos que contienen 5 a 7% de hipoclorito de sodio se usan para higienizar diversos equipos, pero es muy afectado por la presencia de materia orgánica. Los detergentes disminuyen la tensión superficial y no son afectados por las aguas “duras”. Los agentes que al ionizarse tienen la propiedad detergente en el anión son conocidos como detergentes aniónicos, por ejemplo el lauril sulfato sódico o los jabones. Producen la eliminación mecánica de los microorganismos al atraparlos en la espuma. Los que tienen la propiedad detergente en el catión son llamados catiónicos, por ejemplo los cloruros de amonio cuaternario. Son bactericidas frente a las grampositivas pero tienen poca acción contra las gramnegativas (2). El formaldehído es un gas que se comercializa como una solución acuosa (formol o formalina) que contiene entre 37 y 40 % de formaldehído. Se emplea en soluciones del 3 al 8%. Tiene una alta actividad microbicida. Se lo suele usar para esterilizar ambientes cerrados bajo c ondiciones apropiadas pues los vapores son nocivos (2).

2. 9. Interacciones microbianas

2.9.1. Antibiosis Un microorganismo puede producir metabolitos que hagan el ambiente desfavorable para el desarrollo de otros o que perturben su metabolismo hasta el punto de que mueran o sean incapaces de reproducirse. El fenómero recibe el nombre de antibiosis o antagonismo. Los antibióticos constituyen un grupo heterogéneo de moléculas orgánicas relativamente pequeñas, producidas por unos microorganismos para inhibir a otros a una concentración muy baja. La mayoría de los microorganismos notoriamente productores de antibióticos se alojan en el suelo (8). Otro grupo se moléculas antagonistas son las bacteriocinas. Constituyen un grupo relativamente heterogéneo de pequeñas proteínas sintetizadas en los ribosomas


microbianos. Actúan sobre bacterias estrechamente relacionadas al agente productor pero no afectan a éste. Algunas bacteriocinas son: nisina producida por Lactococcus Iactis, subtilina por B. subtilis, colicinas por E. coIi, pediocina por Pediococcus acidilactici (26).

Productos metabólicos microbianos que actúan como antibióticos (1, 25) antibacterianos producido por modo de acción aminoglucósidos estreptomicina Streptomyces griseus induce síntesis anormal de proteínas neomicina Streptomyces fradiae “ “ “ “ cefalosporinas Acremonium cephalosporium inhiben síntesis de pared celular cloranfenicol Streptomyces venezuelae “ “ “ “ eritromicina Saccharopolyspora erythraea interfiere con síntesis de proteínas lincomicina Streptomyces lincolnensis “ “ “ “ penicilinas Penicillium chrysogenum inhiben síntesis de pared celular polipéptidos polimixinas BaciIIus polymyxa deterioro de membrana celular bacitracina BaciIIus subtilis inhibe formación de pared celular rifamicinas Amycolatopsis mediterranei interfiere con síntesis de proteínas tetraciclinas Streptomyces spp. “ “ “ “ vancomicina Arnycolatopsis orientalis “ “ “ “ viomicina Streptomyces griseus “ “ “ “ antifúngicos anfotericina B Streptomyces nodosus interfiere con función de membrana griseofulvina PeniciIIium griseofulvum daña la membrana celular lipopéptidos iturina A BaciIIus subtilis interfiere con función de membrana surfactina BaciIIus subtilis “ “ “ “ nistatina Streptomyces noursei daña la membrana celular

2.9.2. Mutualismo y simbiosis Los microorganismos que habitan en un ecosistema presentan varios tipos de asociaciones e interacciones entre las especies. A veces se asocian diferentes especies bacterianas, o bien bacterias y otra clase de organismos, como levaduras, mohos, algas, protozoos e incluso plantas, u hongos con plantas como en el caso de las micorrizas. En muchos casos, el crecimiento y la reproducción son más vigorosos en asociaciones favorables de dos tipos de organismos que en cultivos de una sola especie (9). El mutualismo es la vida en común de dos o más organismos asociados en beneficio mutuo pero no implica necesariamente el contacto físico. Simbiosis es una asociación específica entre dos tipos de organismos que están en contacto físico. Generalmente el de menor tamaño (simbionte) vive dentro o está adherido a la superficie del mayor (hospedador). La simbiosis no siempre implica mutualismo. El hospedador es siempre un organismo eucariótico y puede mantener al simbionte (eubacteria, actinomiceto, hongo o alga) intracelular o albergarlo en el interior de cavidades u órganos (12). Por otra parte, la sintrofia es la acción cooperante de dos microorganismos con metabolismos complementarios (un tipo de mutualismo) alcanzando un efecto que no es logrado separadamente por ninguno de ellos (9). Un organismo puede ser incapaz de crecer en presencia de cierto substrato, pero si coincide con un microorganismo capaz de degradarlo y producir moléculas útiles para el primero, se observa su crecimiento. Esta asociación recibe el nombre de comensalismo o vida en común de dos especies con beneficio para una de ellas y sin


daño ni provecho para la otra, por ejemplo cuando los microbios colonizan la superficie externa de una planta obteniendo energía de la metabolización de exudados producidos por el hospedador. Otro ejemplo es la influencia favorable de un microbio facultativo sobre el desarrollo de uno anaerobio, el primero reduce la tensión de oxígeno y crea un ambiente adecuado para que prospere el segundo (27). Las comunidades microbianas están caracterizadas por siete diferentes mecanismos biológicos: a) provisión de nutrientes específicos por los diferentes miembros de la comunidad, b) moderación de la inhibición del crecimiento, c) interacciones que causan la alteración de los parámetros de crecimiento de las

poblaciones individuales, produciendo un desempeño de la comunidad más eficiente y/o competitivo,

d) actividad metabólica combinada no expresada por las poblaciones individuales aisladas,

e) cometabolismo, f) reacciones de transferencia de hidrógeno, g) interacción entre varias especies dominantes (28).

2.9.2.1. Fijación simbiótica del nitrógeno Una particularidad de las plantas leguminosas es su capacidad para asociarse con bacterias fijadoras de nitrógeno pertenecientes a los géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium. Esta simbiosis se traduce en el desarrollo del nódulo en cuyo interior las bacterias se multiplican y transforman el nitrógeno del aire en amonio

(ver 3.10). La asimilación de ese amonio por parte de las plantas les permite crecer en suelos pobres en nitrógeno. En la primera etapa, la planta secreta en su exudado radicular unos flavonoides que atraen a los rizobios por quimiotactismo y activan en la bacterias la expresión de ciertos genes que determinan la producción, en los rizobios, de moléculas fundamentales para el reconocimiento y la infección de la planta hospedadora induciendo la formación de los nódulos. Las bacterias se adhieren a los pelos absorbentes de la raíz e inducen la curvatura del extremo de los mismos (29).

Los rizobios infectan la planta mediante un filamento de infección que avanza hacia la base del pelo y el interior de la raíz, simultáneamente las células de la corteza interna de la raíz se dividen y forman el primordium nodular. La multiplicación muy intensa de estas células provoca la aparición del nódulo, que es un verdadero órgano especializado en el intercambio metabólico entre ambos asociados.

Algunas especies de bacterias fijadoras de nitrógeno en simbiosis (33) Género, especie, biovar Planta hospedadora Sinorhizobium meliloti alfalfa Rhizobium leguminosarum biovar trifolii trébol Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli poroto Rhizobium ciceri garbanzo Bradyrhizobium japonicum soja Azorhizobium caulinodans Sesbania (nódulos en el tallo)


Las simbiosis entre rizobios y leguminosas son muy específicas, por ejemplo R. leguminosarum induce la nodulación en el poroto pero no en la alfalfa (30). Las bacterias no se mezclan con los orgánulos citoplasmáticos, sino que se mantienen confinadas en los simbiosomas que son vesículas protegidas por membranas. Los simbiosomas del lupino tienen una sola bacteria, los de la soja varias. La figura 4 muestra el corte de un

nódulo. La membrana del simbiosoma actúa a modo de barrera que controla el flujo de ácidos carboxílicos (malato, succinato, fumarato). Éstos constituyen la fuente de carbono para los bacteroides. Tales ácidos proceden de la oxidación de azúcares sintetizados en las hojas por la fotosíntesis. Durante el proceso de formación de los simbiosoma s, las bacterias se van transformando en bacteroides que expresan diversas proteínas específicas como la enzima nitrogenasa y algunos citocromos. Las células intersticiales sin infectar intervienen en las últimas etapas de la síntesis de ureidos, asparagina o glutamina, por incorporación del nitrógeno fijado. Éstos se exportan hacia la parte aérea a través de los vasos del xilema. Para que los nódulos de las leguminosas fijen nitrógeno es imprescindible que contengan leghemoglobina cuyo grupo hemo es sintetizado por el vegetal (32). La fijación de nitrógeno requiere gran cantidad de energía que se produce en los bacteroides durante la oxidación de los ácidos dicarboxílicos y la leghemoglobina transporta el O2 a una concentración baja pero estable que permite mantener una elevada actividad respiratoria sin afectar la nitrogenasa, pues

esta enzima se inactiva en presencia de oxígeno (30). La rizósfera de algunas plantas contienen acumulaciones de bacterias fijadoras, tal como Azotobacter paspali sobre la superficie de la raíz de Paspalum notatum y Azospirillum brasilense en la de caña de azúcar. Las bacterias se hallan en el espacio intercelular del córtex radical, en una simbiosis donde se benefician los dos participantes de la asociación. Por otra parte, el helecho de agua Azolla contiene a la cianobacteria Anabaena azollae en las cavidades de las hojas. Nostoc vive simbióticamente en el líquen Peltigera y sobre las raíces aéreas de Cycas y Gunnera (29). Varias dicotiledóneas que no pertenecen a las leguminosas, también contiene nódulos en las raíces capaces de fijar N2. En la mayoría de los casos se trata de actinomicetos del género Frankia. En la figura 5 se esquematiza la forma en que los filamentos penetran a las células de la raíz y produce nódulos donde también se encuentra una hemoglobina que facilita la provisión de O2 al endófito (32). Un inoculante para enriquecer el suelo con la bacteria simbiótica deseada, contiene altas concentraciones celulares en un substrato que favorece largos períodos de supervivencia sin pérdidas de las características fisiológicas del microorganismo. Los pasos a seguir comprenden: a) selección de las cepas convenientes por su mayor eficiencia; b) cultivo del microorganismo en un medio líquido; c) elección, preparación y esterilización del material de soporte; d) impregnación del soporte con el cultivo líquido que posee un alto número de células, e) control del número de bacterias vivas en el producto terminado (34).


No todas la cepas infectivas en un hospedador particular son capaces de fijar nitrógeno, debido a la interrrelación varietal y a la interacción con los suelos y sistemas de producción. La cepa seleccionada debe ser genéticamente estable, tener una alta competencia frente a las cepas menos eficientes propias del suelo, crecer en los medios corrientemente utilizados en la industria y sobrevivir en el soporte a las condiciones de comercialización. El empleo de turba estéril como soporte, el almacenamiento refrigerado del producto y el control de calidad, permiten mantener altos niveles de rizobios vivos en la distribución del inoculante. Esto se traduce en un incremento de rizobios por semilla. Se suele exigir 2*109

bacterias/g de inoculante a la salida de la fábrica, para así asegurar que el momento de aplicación permanezcan vivos unos mil millones por gramo. Las condiciones de transporte, almacenamiento y uso determinan el éxito de la inoculación (34).

2.9.2.2. Micorrizas Una de las funciones más importantes de las micorrizas (asociaciones entre hongos y plantas) es absorber los elementos minerales menos móviles del suelo (fosfato, cobre, zinc) y transferirlos a la planta hospedadora, así como amonio. La planta proporciona azúcares al hongo (36). Las ectomicorrizas se caracterizan por una modificación de la raíz, que pierde sus pelos absorbentes. El hongo rodea la raíz con un manto de filamentos, del cual parte una red micelial externa que

se extiende por el suelo y una red micelial interna que penetra la raíz en el espacio intercelular. Los hongos implicados son macromicetos que solamente en simbiosis pueden formar basidiomas (por ejemplo Amanita, Boletus, Lactarius, Pisolithus, Suillus) o

ascomas (como las trufas) (ver 7.3). En las endomicorrizas el micelio entra en la raíz donde inicialmente es intercelular, luego penetra en las células y se ramifica formando los arbúsculos que son más o menos digeridos por el hospedador, y unas vesículas. Los hongos de las endomicorrizas son micromicetos (Glomus). En la figura 6 se observa un esquema de una endomicorriza y en la 7 de una ectomicorriza.

2.9.2.3. Biopelículas Las biopelículas que se forman en el forraje ingerido por el ganado vacuno y otros rumiantes, están inicialmente formadas por microorganismos que digieren la celulosa del material vegetal y producen ácidos grasos y otros metabolitos. Luego las células de otras especies invaden la película y comienzan a usar


esas sustancias para su propio metabolismo. Así es como el forraje desaparece y es transformado en una masa bacteriana que el animal digiere más tarde. Estas películas son imprescindibles para los rumiantes. Menos de la tercera parte de la biopelícula está constituída por microcolonias de bacterias, el resto es una sustancia blanda y pegajosa (matriz extracelular) secretada por ellas que absorbe agua, atrapa partículas pequeñas y mantiene unidas a las microcolonias (figura 8). La película biológica está atravesada por diminutos conductos que bañan a cada agrupación bacteriana, aportando nutrientes disueltos y eliminando productos de desecho (37).

2.9.3. Predación Algunos microorganismos predadores se alimentan de las bacterias, como los protozoos, mixobacterias, acrasiomicetos y varios flagelados fotosintetizantes que no siempre están clasificados como algas. Siempre que existen protozoos en estado trófico hay una población bacteriana que le sirve de presa. Debido a que una sola célula de protozoo consume entre divisiones 103 a 104 bacterias, una comunidad con 103 protozoos por mL ó g está caracterizada por una predación activa. Un suelo suele tener 109 bacterias/cm3, pero en solución los protozoos reducen el número de células a 106/cm3 Sin embargo, a pesar de su abundancia y actividad, los protozoos no suelen eliminar sus presas porque esto acarrearía la desaparición consecuente del predador. Con una baja densidad de presas el protozoo debe utilizar gran cantidad de energía para llegar a las pocas células que le sirven de alimento y puede morir cuando se acaben o bien enquistarse (27).

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2. vida y muerte de los microorganismos -...

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