planta piloto de fermentaciones departamento de...

Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Ingeniería Enzimática

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


Naturaleza Industria química

Síntesis de compuestos orgánicos


La naturaleza de las enzimas

1) La reacción química se lleva a cabo bajo condiciones suaves

2) Acción específica de acuerdo a la clase de enzima

3) Tasas de reacción muy rápidas4) Numerosas enzimas para diferentes

objetivosEnzymes at work(www.novozymes.com)


Clase Enzimas Industriales

1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa oxidasas, lacasas

2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-transferasas

3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas, pectinasas, proteasas, pululanasas

4. Liasas Pectato-liasas, αααα-acetolactatodecarboxilasas

5. Isomerasas Glucosa isomerasa

6. Ligasas No son usadas actualmente

Enzymes at work(www.novozymes.com)

Enzimas típicas usadas en procesos industriales


El código de cada enzima consiste de las letras "EC" seguida de cuatro númerosseparados por puntos. Esos números representan progresivamente una clsificaciónmás fina de la enzima.

Por ejemplo, la amino peptidasa tripéptida tiene el código"EC 3.4.11.4"

Cuyos componentes indican los siguientes grupos de enzimas:

EC 3 son hidrolasas(enzimas que usan agua para romper otra molécula)EC 3.4 son hidrolasas que actúan sobre enlaces peptídicosEC 3.4.11son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un

aminoácido de un polipéptidoEC 3.4.11.4son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un

aminoácido de un tripéptido

Nomenclatura


Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos


Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering

Shuang Li, Xiaofeng Yang , Shuai Yang , Muzi Zhu , Xiaoning WangComputational and Structural Biotechnology Journal, Volume No: 2, Issue: 3, September 2012


Puntos principales de la aplicación comercial de

un catalizador enzimático

• Velocidad de reacción

(actividad catalítica)

• Extensión de la reacción

(constante de equilibrio)

• Duración de la actividad

(estabilidad)


• Energía de activación es la cantidad de energía necesaria para empujar a los reactantes sobre una barrera de energía.

� En el pico las moléculas

están en un punto inestable, el estado de transición

� ∆G es todavía sólo la diferencia entre sustratos y productos


Reacciones catalizadas por enzimas

Por lo general, todas las reacciones de enzimas catalizadas se clasifican en dos categorías:

1. Anabolismo - Pequeñas moléculas se unen entre sí para formar moléculas complejas.

2. Catabolismo – Moléculas complejas se dividen en moléculas simples.

Algunas enzimas pueden catalizar ambos tipos de reacción. La enzima actúa en ambos sentidos hasta que encuentra equilibrio.

ABBA Enzima →+

BAAB Enzima + →


Diseño de biorreactores

reactorroi VvSSF =− )(

ννννr = velocidad de reacción

F, S0

F, Si

donde:

Balance de materia


Leyes fundamentales de la cinética

• Velocidad de la reacción

• Orden de la reacción

---- = v = k

---- = v = k CA CB

Orden uno

Orden cero

Orden dos

v0

[P]

t

[A] 0

d[P]dt

---- = v = k CAd[P]dt

d[P]dt

A P

A P

A + B P


Consideraciones al definir el orden de una reacción

• No se puede decir que todas las

reacciones poseen un cierto orden

(Reacciones complejas)

• No se debe intentar deducir el orden de

una reacción de su ecuación

estequiométrica

(Depende del mecanismo de la reacción)


Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato


ES

k 1

k -1

k cat

E

S P

Modelo llave-cerradura

EE

El mecanismo candado-llave de Fischer (1894) sugiere que el sustrato se ajusta a una cavidad en la superficie de la enzima similar a la de una llave que entra en un candado.

Hermann Emil Fischer (1852 -1919)


Modelo de ajuste inducido

Hexoquinasa

Daniel Koshland (1963) sugirió que la enzima era más flexible de lo que se pensaba. Con un mecanismo de “ajuste inducido” , el centro activo de la enzima sufría cambios en su forma en presencia del sustrato.

Daniel Edward Koshland (1920-2007)


Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato

Efecto de proximidad y efecto de orientación


Los experimentos cinéticos revelan propiedades enzimáticas

Cinética química

• Los experimentos examinan la cantidad de producto(P) formado por unidad de tiempo (∆∆∆∆[P] / ∆∆∆∆t)

• Velocidad (v) – la tasa de una reacción (varía con la concentración de reactante)

• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o eficiencia de una reacción


Cinética enzimática

• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de substrato (la enzima está saturada con el substrato)

• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E], y la reacción es pseudo-primer orden

• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la enzima

E + S ES E + P


Velocidad inicial (vo)

• La velocidad al inicio de una reacción catalizada enzimáticamente es

vo (velocidad inicial )

• k1 y k-1 representan una rápida asociación /disociación no covalente de substrato del sitio activo de la enzima

• kcat = constante de la tasa para formación de producto de ES

E + S ES E + P k1

kcat

k-1


Curva de progreso para una reacción catalizada enzimáticamente

• La velocidad inicial (vo) es la pendiente de la porción lineal inicial de la curva

• La tasa de la reacción se duplica cuando se usa el doble de enzima


Leonor Michaelis1875-1949

Maud Menten1879-1960


Consideraciones de equilibrio rápido(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)

E + Sk 1k -1

ESk cat E + P

[ ] [ ] [ ]ESEE t +=

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ][ ] [ ] [ ] [ ]E

K

SES

ES

SEK

S

S =∴= ,

[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EK

Sk

E

v

S

Scat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax +=

1. Reacciones involucradas

2. Balance de masa

3. Velocidad limitante

4. Dividir por [E] t

5. Expresión de equilibrio

6. Sustituir en términos de [E]

7. Donde Vmax = kcat [E] t


JBS HaldaneBriggs


Consideraciones de estado estacionario(Ecuación de Briggs-Haldane)

E + Sk 1

k -1ES

k catE + P

[ ] [ ] [ ] ( ) [ ]ESkkSEkdt

ESdcat ⋅+−⋅= −11

[ ]0=

dt

ESd

[ ] [ ][ ] M

cat Kk

kk

ES

SE =+=⋅ −

1

1

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

M +=

max

1. Reacciones involucradas

2. Balance de masa

3. En estado estacionario

4. Constante de Michaelis

6. Dividir por [E] t

8. Donde Vmax = kcat [E] t

5. Velocidad limitante

[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EKS

Ek

v

M

M

tcat +=7. Sustituyendo [ES]


νννν

[S]

Vmax

KM

Vmax2

νννν = Vmax [S]

KM + [S]

Cinética de Michaelis-Menten


La ecuación de Michaelis-Menten

• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está saturada con el substrato (alta [S])

• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden cero con respecto a S)

• A bajas [S] la reacción es de primer orden con resp ecto a S

• La forma de una curva v o versus [S] es una hipérbola rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima conforme [S] se incrementa


Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]

(a) Cada punto v o vs [S] se obtiene de un experimento cinético

(b) La constante de Michaelis (K M) iguala la concentración de substrato necesario para alcanzar ½ de la velocidad máxima


El significado de KM

• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax

• KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1

• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado será el enlace del substrato

• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S


KM y concentraciones de substrato fisiológicas

• Los valores de KM paralas enzimas son típicamente arriba de [S], tal que las tasas enzimáticas son sensibles a pequeños cambios en [S]


• La constante catalítica(kcat) – constante de la tasa de orden uno para la conversión de complejoESaE + P

• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con S

• La relaciónkcat /KM , llamada también coeficiente de especificidad, es una constante de segundo orden para

E + S E + P

a bajas concentraciones de [S]

Las constantes cinéticas indican la actividad enzimática y la especificidad


Significados de kcat y kcat/KM


Ejemplos de constantes catalíticas

Enzyme kcat(s-1)


Valores of kcat/KM

• kcat/KM puede aproximar la tasa de encuentro de dos moléculas no cargadas en solución (108 to 109 M-1s-1)

• kcat/KM es también una medida de la especificidad de la enzima por diferentes substratos (constante de especificidad )

• Aceleración de la tasa = kcat/KM


Determinación de parámetros cinéticos

1. Gráfico

2. Linearización de la Ec. M-MA. Lineweaver-BurkB. Hanes-WoolfC. Eadie-Hofstee

3. Integración de la Ec. M-M

4. Sistema de ecuaciones diferenciales

5. Regresión no lineal

Método


Hans Lineweaver Dean Burk

Lineweaver, H and Burke, D. (1934). "The Determination of Enzyme Dissociation Constants". Journal of the American Chemical Society56 (3): 658–666. doi:10.1021/ja01318a036

Linearización de la Ecuación de Michaelis-Menten


Cálculo de KM y Vmax

La gráfica doble-recíproca Lineweaver-Burk es una transformación lineal de la gráfica de Michaelis-Menten

(1/vo versus 1/[S])


[ ] [ ]maxmax

1

V

KS

Vv

S M+=

[ ]S

vKVv M−= max

Hanes-Woolf

Eadie-Hofsteev

v/[S]

Vmax

Vmax/KM

-KM


Otra opción es utilizar la forma integral de la ecuación de Michaelis-Menten:

[ ] [ ][ ]SK

SV

dt

Sd

M +=− max

dejando del lado izquierdo los términos que contengan [S] y del lado todos los que contengan t e integrando

[ ][ ][ ]

[ ] [ ][ ]

[ ]∫∫∫ =−−

tS

S

S

SM dtVSdS

SdK

0max00

[ ][ ] [ ] [ ]( ) tVSSS

SKM max0

0ln =−+

Resolviendo la integral

[ ] [ ]( )[ ][ ]

[ ][ ]S

St

V

S

SSS

KM0

max0

0

lnln=−+

dividiendo entre[ ][ ]

S

S 0ln


Formas lineares de la integral de la ecuación de Michaelis-Menten:

[ ] [ ][ ][ ]

[ ][ ]S

St

VK

S

SSS

M0

max0

0

lnln+−=−

[ ] [ ][ ][ ]S

SSS

0

0

ln

−

Vmax

-KM[ ][ ]S

St

0ln


Otras formas de linearización


[ ]tf EkV 2max = [ ]tEkVb 1max −=

1

12

k

kkK

Sm−+=

2

12

−

−+=

k

kkK

pm

Donde:

Reacciones reversibles

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]PEESSEK

K

K

K

+←→

←→

+−− 2

2

1

1

[ ] [ ]

[ ] [ ]PS

Pb

Sf

neta

K

P

K

SK

PV

K

SV

v++

−=

1

maxmax

Glucosa Isomerasa

Consideración de estado estacionario


[ ][ ] eq

eq

eq

Sb

Pf KS

P

KV

KV==

max

maxRelación de Haldane0=netav

En el equilibrio

Borges da Silva y col., 2006

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