centrifugación de un embrión de ratón en fase de 2 células
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CENTRIFUGACIÓN DE UN EMBRIÓN DE RATÓN EN FASE DE 2 CÉLULAS: ESTRATIFICACIÓN Y
RESTABLECIMIENTO CITOPLASMÁTICO
AUTORES: VERÓNICA TÉLLEZ, ARIEL AHUMADA, JUAN MURO, SOLEDAD SEPÚLVEDA Y LUIS
EZQUIERDO
AÑO: 1988
RESUMEN
Embriones de ratón en fase de 2 células, los cuales fueron durante 1h a 70 000-90 000 x g,
mostró una precisa estratificación del citoplasma y una elongación del núcleo. Los embriones
fueron fijados en diferentes tiempos y fueron observados por microscopía óptica y electrónica
utilizando métodos citoquímicas y extracciones con detergente. Entre 40 minutos después de
la centrifugación, se recuperó el aspecto normal de su morfología con excepción de las tapas
de lípidos persistentes en los polos centrípetos de los blastómeros. Segmentación,
compactación y blastulación no fueron impedidos por centrifugación. Los tratamientos con
colcemid o citocalasina D retrasaron, mas no perjudicaron el restablecimiento. Estos
resultados sugieren que una estructura elástica del citoesqueleto puede estar implicada en
este tipo de regulación embrionaria.
INTRODUCCIÓN
Embriones de ratón en fase de 2 células, observados por inmunofluorescencia, muestran una
regionalización de miosina. fodrina y espectrina y de la etapa 4-NCHA en adelante una
regionalización de fosfatasa alcalina y actividad de 5' Nucleotidasa, lo cual se puede demostrar en la
membrana celular. Ninguna región distinta ha sido reconocida anteriormente, ya sea en el ovocito
o en el óvulo fertilizado, lo cual puede ayudar a establecer una línea de células que enlace los
primeros blastómeros con las células diferenciadas de blastocitos. Además, embriones alterados
experimentalmente son capaces de regular y desarrollar un blastocito normal. Estas
observaciones, sin embargo, no excluyen la existencia de una estructura espacial oculta que puede
determinar el desarrollo, aunque tal determinación podría ser controlada por la regulación
embrionaria. Aquí se analiza la estructura espacial de un embrión de 2-celulas por medio de su
centrifugación y posterior cultivo in vitro. Este método no se ha utilizado en los mamíferos, excepto
por un interesante informe de investigación preliminar por Mulnard (1970).
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de embriones. Los embriones de dos células fueron colectados en medio Biggers el cual
contiene 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) (Calbiochem) de ratones superovulados de la
cepa CF1, 36 h después de la supuesto tiempo de ovulación.
Procedimiento de centrifugación. Soluciones Dextran (MW 40.000 Sigma) fueron preparadas en
medio Biggers a concentraciones de 17%, 15%, 13% y 11% (w/v). Gaseados por separado con C02
en aire con el fin de ajustar el pH entre 7.2 a 7.4 y luego fueron introducidos secuencialmente en
tubos de 0,8 ml de nitrocelulosa. Los embriones fueron colocados en la capa más ligera de la
gradiente discontínua y los tubos fueron centrifugaron durante 60 min utilizando el rotor de
cubeta oscilante SW 39 de la centrífuga Beckman modelo L. Las fuerzas centrífugas aplicadas
oscilaron de 15.000 hasta 120.000 x g. La temperatura del contenido de los tubos varió entre 13 y
18 ° C, excepto para los experimentos en los que se llevó a centrifugación a 4 ° C.
El cultivo in vitro. Después de la centrifugación los embriones se enjuagaron con medio Biggers
y, o bien fijado inmediatamente o cultivadas durante diferentes momentos antes de la fijación.
Los embriones fueron cultivados en microgotas de medio Bigger con BSA en placas Petri de
plástico (Falcon) bajo aceite mineral a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO, en el
aire, pH 7.2 a 7.4. El número de células se determinaron por el método de Tarkowski. Antes de
y durante la centrifugación los embriones fueron expuestos a temperatura ambiente y a la
atmósfera; los controles se trataron de forma similar.
Microscopía óptica y electrónica. Después de centrifugación y cultivo in vitro, los embriones
fueron procesados para microscopía óptica y electrónica como se informó anteriormente sin la
adición de ácido tánico. La microscopía de luz se llevó a cabo en preparaciones completas en
glicerol. En algunas series experimentales, inmediatamente después de la centrifugación los
embriones se lavaron en un buffer de estabilización, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100
en buffer de estabilización para 1 min a 37 ° C y se lavó en el mismo buffer durante 30 s antes
de la fijación.
Técnicas citoquímicas. La Manifestación inespecífica de lípidos se logró mediante Red Oil, Sudán Black
y por su osmiofilia. La presencia de fosfatasa ácida se demostró en todos los embriones según el
método de Gomori modificado por Weissenfels. EL ADN se demostró mediante una prueba
modificada de Feulgen se habían fijado en akohol-formaldehído ácidoacético.
Inhibidores del citoesqueleto: Estos inhibidores se añadieron al medio de cultivo y al gradiente
de Dextrano. Algunos experimentos se llevaron a cabo con una mezcla de 0,5 ug/ml de colemid
(Sigma) y 0,5 ug/ml de citocalasina D (Sigma), otros se llevaron a cabo ya sea con colcemid (2
ug/ml) o con citocalasina D (0,5 giga ml); por último, algunos experimentos se llevaron a cabo a
4 º C. Los embriones fueron cultivados en medios que contenían inhibidores por 1h antes,
durante y después de la centrifugación. Los inhibidores se prepararon en dimetilsulfoxido
(DMSO) y no se observaron diferencias ser entre los controles con o sin DMSO.
Embrión fijado después de centrifugación a 90000x g (fig. 1) o en 70000X g (fig. 2-5). 1-2 zona
de lípidos (L), zona de vesículas y membranas (VM), zona homogénea (H); plana cisternas
(flecha), zona pelúcida (ZP). Bares. Figura 1, 2 um; Fig. 2, 1um; Fig. 2, 1um, 3 Zona de las
mitocondrias (m) un material fibrilar (f). Golgi sustancia (g); cuerpos multivesiculares (mb).
Microvellosidades (mv) en el espacio interblastomerico.
Bar, 1um. 4 Zona de cuerpos cristaloides (cb). Sección tangencial revela corteza (Co) y
microvellosidades (MV). Material fibrilar (f). Bar, 0,5 um, 5 de contraste de fase de óvulo
entero; tapa lípidos (L), capa hialina (H) y la capa granular (G). Bar, 10um
RESULTADOS
Estratificación: observaciones al microscopio óptico
Después de la centrifugación, los embriones se encontraron en las capas correspondientes a
13% o 15% de Dextrano. Las fuerzas centrífugas superiores a 30.000 x g indujo una visible y
reproducible estratificación del citoplasma (ver Fig. 5-7). Algunos embriones empezaron a
romperse a 120.000 x g.
El embrión 71 fijado tras la centrifugación a 70000 x g o 90.000 x g mostró bajo el microscopio
de luz una ligera elongación de sus blastómeros en el sentido de la fuerza centrífuga y algunas
veces un estrechamiento”. Los embriones orientados generalmente a sí mismos de tal manera
que los estratos estaban en un ángulo de 90° con respecto al plano de separación de los
blastomeros. El cuerpo polar se observó con mayor frecuencia en el polo centrífugo.
Una tapa de material lipídico fuertemente teñidas con Sudán Negro o Rojo Aceite o Tetroxido
osmio fue encontrado en el polo centrípeto de cada blastómero (fig. 5). Debajo de la tapa de
lípidos se observó una capa hialina, que en su margen centrípeto se tiñó débilmente para la
actividad de fosfatasa ácida. Bajo la capa hialina, una capa granular se extendió hasta el polo
centrífugo. En esta capa, el núcleo puede verse abarcando desde el centro del blastómero al
polo centrífugo, como si hubiese sido
empujado en esa dirección por el
denso nucléolo (Fig. 7).
La prueba Feulgen no reveló ninguna
cromatina fuera del núcleo elongado.
El 33 que fue extraído con Triton X-
100 antes de la fijación y la
observación a microscopía de luz
mostró estratificación similar a la de
los no extraídos. Incluyendo las tapas
de lípidos. Sin embargo, la capa de
hialina apareció parcialmente extraída
y se observó una reducción general en
el volumen de los blastómeros de
alrededor de 50% (fig. 8).
Estratificación. Observaciones al microscopio electrónico
En 62 embriones, que se observaron por microscopía electrónica, las capas descritas por
microscopía de luz pueden ser subdivididas en zonas. La tapa de lípidos corresponde a la zona
de lípidos y la capa hialina se subdivide en una zona centrípeta llena de vesículas y membranas,
y una zona centrífuga homogénea.
L= zona lipídica
VM = zona de vesículas y membranas. (zona hialina)
N = zona homogénea. (Zona hialina)
La capa granular está subdividida en una zona centrípeta que se caracteriza por el material de
las mitocondrias y material fibrilar y una zona de centrífuga que muestra cuerpos cristaloides.
M = zona de mitocondrias
f = material fibrilar
cb = cuerpos cristaloides
La zona de lípidos contiene innumerables gotitas y entre ellas, vesículas y vesiculadas
mitocondrias eran ocasionalmente reconocidas. La zona de vesículas y membranas contiene
vesículas de diferente tamaño, aisladas o asociadas y una plana y membranosa cisterna. Las
vesículas junto a la zona de lípidos probablemente corresponden a los lisosomas ya que su
localización coincide con la actividad de la fosfatasa ácida demostrada en los embriones en
conjunto y las membranas pueden corresponder a suavizar el retículo endoplásmico. La zona
homogénea contiene material fino granular uniformemente distribuido y sin orgánulos.
La zona caracterizada por el material de las mitocondrias y fibrilar también contiene la
sustancia de Golgi, cuerpos multivesiculares y las vesículas que son más pequeñas que las que
se encuentran en la zona de vesículas y membranas. La zona de cuerpos cristaloides no se
detecta cuando los embriones han sido centrifugados a menos de 70.000 x g; a esta o fuerzas
superiores esta zona parece llena de material fibrilar y cuerpos cristaloides. El cortex de
lacélula es claro y muestra una malla fina carecente de orgánulos. Parece ser afectado por
centrifugación y no cambia apreciablemente de acuerdo a la fuerza centrífuga aplicada.
En 25 embriones los cuales fueron extraídos con detergente inmediatamente después de la
centrifugación y antes de la fijación para microscopía electrónica, la capa lipídica persiste pero
parece algo extraído y numerosas gotitas de lípido se agregan en unas pocas gotas grandes.
Todas la citomembranas en ésta y las otras capas han desaparecido, quedando fragmentos de
materia amorfa.
El material fibrilar se conserva y componentes del citoesqueleto se vuelven distintos con el
tratamiento con detergente. Particularmente evidente se muestran la corteza celular densa, la
red interna de microfilamentos de actina (7nm) y los microtúbulos (21 nm) observados en
diversas ubicaciones, especialmente próxima al núcleo.
f = material fibrilar
microfilamentos señalados con la flecha
co = corteza de la zona centrífuga
Relaciones espaciales cercanas fueron observadas entre los microtúbulos y las indentaciones
en el polo centripetal del núcleo, y microfilamentos son encontrados alrededor del núcleo.
La cabeza de la flecha señala los microfilamentes y la flecha muestra
los microtúbulos cercanos al núcleo (N)
El núcleo, ya sea visualizado en preparados de extracción con detergente o no, no se
desubica por centrifugación, de su inserción en la zona de material mitocondrial y fibrilar y se
muestra elongado hacia polo centrifugo del blastómero. La parte centrípeta final del núcleo
nos muestra indentaciones profundas y el extremo centrífugo contiene los nucleolos,
fusionados en uno o dos.
Núcleo elongado hacia la zona centrífuga,
con el nucleolo (Nu), con indentaciones
en la zona centrípeda
Restablecimiento de embriones estratificados: Observaciones al microscopio óptico
Un número embriones (66) se fija 30 mm a 4 h después de ser centrifugada a 70.000 o 90.000
x g y se observaron al microscopio óptico. Dentro de 30 a 40 minutos después de
centrifugación, los núcleos y nucléolos se encuentran de nuevo en el centro de la célula y la
estratificación del citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapas de lípidos persistir en los polos
centrípetos de ambos blastómeros.
En embriones en los que se permitió seguir con su desarrollo, la segunda división por lo
general divide a las tapas y conforme se da escisión, las gotas de lípidos son redistribuidas
entre los blastómeros.
La centrifugación no impide el desarrollo a blastocitos normales con cerca de 30 células,
aunque la blastulasion es algo retrasada. El porcentaje de blastulación en embriones
centrifugados es de aproximadamente 20% menos que en los embriones no centrifugada y
tratados en condiciones similares: sin embargo, un aumento en la fuerza centrífuga de 50.000
x g a 90.000 x g no cambia el porcentaje de blastulación significativamente. El porcentaje
blastulación sobre los controles en experimentos de centrifugación es aproximadamente 73%
que es considerablemente más bajo que el 91-92% observado en nuestros cultivos estándares.
Ésta diferencia puede atribuirse a bajas temperaturas y a la alcalinización de los medios,
cuando los embriones están fuera de la incubadora (ver Materiales y métodos).
Efecto de los inhibidores del citoesqueleto: observaciones al microscopio óptico y electrónico
Las observaciones por microscopía de luz en 180 embriones que fueron tanto centrifugados
como cultivados en un medio que contenía una mezcla de colcemid (0,5 ug / ml) y
citocalasina D (. 0.5 ug/ ml) revelan que los embriones tratados con esta mezcla de mineral de
drogas son frágiles: a 70.000 x g. 30% de ellos se rompieron entre la capa hialina y granular, y
en 90.000 x g. Esto se observa en el 60% de los embriones. Sólo el 10% de los embriones no
tratados se rompieron a 130.000 x g. La estratificación de los óvulos tratada y no tratada es
bastante similar, pero los embriones tratados a 30.000 x g muestran el efecto producido por
5,000 x g en los óvulos sin tratar.
Los óvulos que se centrifugaron y cultivaron en medios que contienen colcemid o citocalasina
D se repusieron de la estratificación mucho más lento que óvulos de control, y su desarrollo
normal se detuvo. Nosotros comparamos el efecto de estas medicinas registrando el tiempo
que pasó después de la centrifugación hasta que el nucléolo recobrara una posición central
en blastómeros, que revela la recuperación de forma y la posición de los núcleos. La
observación de 144 óvulos tratados con colcemid muestra que en el 93% de ellos el nucléolo
recuperó su posición central 180 minutos después de la centrifugación, mientras esta
situación se recuperó después de 240 minutos en el 95% de 236 óvulos tratados con
citocalasina D.
La morfología de los 98 óvulos centrifugados tratados con colcemid o citocalasina D, que se
extrajeron del detergente después de la centrifugación, es diferente de la descrita
anteriormente para los óvulos sin tratar. Bajo el microscopio óptico la diferencia destacable es
el contorno liso o el polo centrípeto nuclear en óvulos tratados con fármacos, en comparación
con las hendiduras observadas en los óvulos sin tratar.
Los embriones que fueron tratados con colcemid o en frio el núcleo permanece en la capa
granular, mientras que el tratamiento con citocalasina D causa una separación del núcleo
dejando un espacio entre el material fibrilar y la membrana nuclear colapsada. El citoplasma
de los embriones tratados con colcemid carece de perfiles de micro túbulos y los embriones
tratados con citocalasina D demuestran una corteza discontinua y una red interior relajada
(suelta floja) del material fibrilar.
DISCUSION
Estratificación de los componentes celulares:
La estratificación del citoplasma ha demostrado que al menos dos tipos de (o estados) de los
cuerpos vesiculares pueda ser reconocido por su densidad: vesículas de luz que se encuentran
debajo de la tapa de lípidos, que incluyen elementos que muestran la actividad fosfatasa ácida
y las vesículas pesados que se encuentran en la capa granular mezclan con el material de las
mitocondrias y fibrilar nuestras observaciones sugieren que este material fibrilar, en virtud de
la fuerza de las pilas centrífugas hasta la formación de cuerpos cristaloides.
El alargamiento de los núcleos y la muesca en su fuerza centrípeta postes pueden atribuirse a
un discontinuo de la membrana nuclear en el citoesqueleto. De hecho, el detergente de óvulos
extraídos revelan los microtúbulos y microfilamentos asociado a la hendiduras nucleares y
estas desaparecen de óvulos que han sido tratados con coloemid o denominado citocalasina o
frío en él no se ha estudiado los otros componentes del citoesqueleto que han sido
identificadas en embriones de preimplantación, alfa-actinina, citoqueratina, miosina, fodrin y
spectrin.
RECUPERACION POR ESTRATIFICACION
La recuperación pasiva de acuerdo a la densidad relativa probablemente requeriría de un
periodo más largo que el tiempo de recuperación que nosotros hemos encontrado y no
explicaría por qué las gotas de lípidos permanecen coleccionadas en los polos centrípetos. Sin
embargo, esto no es posible para descartar el rol de una matriz viscosa no estructurada con
comportamiento elástico (Crick y Hughes 1950) en la recuperación del OVA después de la
centrifugación. El rol del citoesqueleto es sugerido por el retraso observado en la
recuperación cuando los rectritores son usados especialmente con cytocalasina D. Aunque
estas drogas en las concentraciones usadas aquí, previenen la división celular y el desarrollo
normal (mirar Izquierdo et. at. 1984), el citoesqueleto no es desmantelado y la recuperación
desde la estratificación quizá aún sea atribuida para un armazón resiliente que está conectado
para diversas citomembranas y de este modo mantenerlos o restaurarlos en una orden
especial.
EL DESARROLLO DESPUÉS DE LA RECUPERACIÓN
En todos los experimentos de centrifugación, la hendidura y el desarrollo del blastocisto
parcialmente son perjudicados probablemente porque los embriones son observados bajo el
microscopio simple durante la hendidura, la consolidación o la formación del blastocisto,
parece que la centrifugación no causa ningún desorden de organización de célula fundamental.
La asumisión que el desarrollo posterior es completamente normal, al menos dos
interpretaciones generales de los resultados es posible. Primero, la existencia de estructura
preestablecida que se opone a la centrifugación o fácilmente nuevas ensenadas de ello, que
retira los componentes de célula complicados en morfogénesis a su lugar apropiado. Segundo,
la ausencia en esta etapa de cualquier estructura de morfogénesis espacial. Nuestros
resultados aquí apoyan la primera interpretación pero no podemos ser más asertivos porque la
recuperación de la estratificación puede ser un proceso pasivo, o aún uno activo que es sin
relaciones a morfogénesis del blastocisto; y más lejos, porque las anormalidades del desarrollo
que pueden aparecer posteriores no han sido excluidas. Estas publicaciones están todavía
abiertas para el debate (mirar discusiones en 1997 Izquierdo, 1986; Johnson 1981; Johnson et
Al-, 1984).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Biggers JD, Whiten WK, Whittingham DG (1971) The culture of mouse embryos in vitro.
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