cebi e7 4: precipitación, sedimentación y centrifugación
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CEBI_E7_4: Precipitación,
Sedimentación y
Centrifugación
Precipitación y
sedimentación
• Agregados celulares
que sedimentan. Ej:
recuperacion de
biomasa, reciclo de
celulas hacia los lodos
activados en un
tratamiento de aguas,
separacion de la
levadura en la
produccion de cerveza
Precipitación y
sedimentación
• Otra aplicación importante y método típico
es la purificación de proteínas y ácidos
nucleídos
Factores utilizados para
la precipitación
• Enfriamiento
• Ajuste de pH
• Adición de solventes
• Adición de sales anti-caotropicas
• Adición de sales caotrópicas (ej. Urea,
hidrocloruro de guanidina)
• Adicion de reactivos bioespecificos como
en inmunoprecipitacion
Temperatura y pH
• La solubilidad de una
proteína depende de
la temperatura y del
pH.
• Generalmente se las
utiliza como variables
de ajuste para
separar por
precipitación
juntamente con el
agregado de
solventes o sales.
Agregado de sales y
solventes
• La precipitación mediante el agregado de
aditivos está regida por la ecuación
termodinámica: mppt = mliq
Potencial químico del
soluto precipitado
Potencial químico del
soluto en solución
Por otro lado mliq depende de la concentración del soluto disuelto:
mliq = mliq (0) +RT ln(x)
Potencial químico del soluto en
una referencia estandar
Fracción
molar
Si mliq (0) aumenta por el agregado de un aditivo→ x debe disminuir para
mentener la igualdad y eso se logra al precipitar el soluto.
Agregado de
solventes
• Ejemplos: alcoholes, acetona.
• Aplicaciones: ↓↓ proteinas, ADN y ARN.
• Mecanismo de precipitación → reducción
de la cte. dieléctrica del medio en el cual se
hallan presentes.
• A bajas T°C para minimizar la
desnaturalización.
S: solubilidad de la proteína (kmol/m3).
SW: solubilidad de la proteína (kmol/m3) en agua
A: constante
e: cte dielectrica del medio (-)
eW: cte dielectrica del agua (-)
Agregado de Sales
• Anti-caotrópicas: la precipitación se produce por la
formación de agregados pero la desnaturalización
proteica es despreciable.
• Por ese motivo este tipo de sales son ampliamente
utilizadas en purificación de proteínas.
• Las tres sales mas utilizadas son sulfato de
amonio, sulfato de sodio y cloruro de sodio.
• Las sales cao trópicas: urea, hidrocloruro de
guanidina producen ↓por desnaturalización proteica
(disrupción intramolecular de ptes de H y repliegue
proteico. → Se las utiliza para purificación de
ADN y ARN
Precipitación utilizando
sales anticaotrópicas
• Efecto salting-in: a bajas
concentraciones de sal un
aumento de la misma
produce un aumento de la
solubilidad.
• Efecto salting-out: a
concentraciones un
aumento de la misma
reduce la solubilidad
• En frio ≈ 4°C.
• “Cortes diferenciales” de
concentracion de sales.
B: cte.
Ks: cte salting out (m3/kmol)
Cs: concentracion de sal (kmol/m3)
Mecanismo de la
formación de precipitado
1. Mezclado
2. Nucleación→se inicia
con el agregado de tres
o mas moléculas de
proteínas.
3. Crecimiento controlado
por difusión (k: depende de la
difusividad y diámetro de la proteína)
4. Crecimiento controlado
por convección (k: depende
del tamaño y tendencia al pegado de las
partículas, del volumen del sistema, la
densidad y viscosidad del medio y de la
potencia del mezclado.
En ambos casos cinetica de 2do. Orden
n: numero de particulas de un
dado tamaño (-).
k: cte de velocidad
Inmunoprecipitación
• Se basa en la unión antígeno-anticuerpo.
• Se trata la solución que contiene el
antígeno con el anticuerpo o con una
forma insoluble de su anticuerpo o vice-
versa.
• Se forman largos complejos moleculares
por cross-linking que precipitan y pueden
separarse fácilmente de la solución por
técnicas convencionales.
Centrifugación
• Se utiliza para separar materiales de
diferente densidad aplicando una fuerza
mayor a la gravitacional.
• Las centrifugas esterilizables por vapor se
utilizan para reciclar celulas o medio al
fermentador.
• Las centrifugas industriales generan gran
cantidad de calor que debe ser eliminado
por enfriamiento.
Sedimentación de
partículas esféricas
Haciendo un balance
de fuerzas
Densidad de material
biológico Material Densidad (g/cm3)
Células microbianas 1,05-1,15
Células de mamíferos 1,04-1,10
Organelas 1,10-1,60
Proteínas 1,30
ADN 1,70
ARN 2,00
Calculando y eligiendo la
centrifuga mas apropiada
Cambio de escala