7/23/2019 Centrifugacin de Embriones de Ratn en Fase de Dos Clulas

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CENTRIFUGACIN DE EMBRIONES DE RATN EN FASE DE 2

CLULAS: ESTRATIFICACIN Y RECUPERACIN CITOPLASMTICA

ResumenEmbriones de ratn en fase de 2 clulas, los cuales fueron durante 1h

a 70 000-90 000 x g, lo cual mostr una precisa estraticacin delcitoplasma y una elonacin del n!cleo" #os embriones fueron $adosa diferentes tiempos y fueron obser%ados por microscop&a ptica yelectrnica utili'ando mtodos cito(u&micos y extracciones condeterente" Entre )0 minutos despus de la centrifuacin, serecuper el aspecto normal de su morfolo&a con excepcin de lastapas de l&pidos persistentes en los polos centr&petos de losblastmeros" #a sementacin, compactacin y blastulacin nofueron impedidos por centrifuacin" #os tratamientos con colcemid ocitocalasina * retrasaron, mas no e%itaron la recuperacincitoplasmatica" Estos resultados suieren (ue una estructuraresiliente del citoes(ueleto (ue puede estar implicada en este tipode reulacin embrionaria"

Intr!u""#$n

Embriones de ratn en fase de 2 clulas, obser%ados porinmuno+uorescencia, muestran una reionali'acin de miosina" fodrinay espectrina y en la fase de cuatro clulas en adelante unareionali'acin de fosfatasa alcalina y acti%idad de la nucleotidasa,locual se puede demostrar en la membrana celular" .inuna reindistinta ha sido reconocida anteriormente, ya sea en el o%ocito o en el

%ulo fertili'ado, lo cual puede ayudar a establecer una l&nea de clulas(ue enlace los primeros blastmeros con las clulas diferenciadas deblastocistos" /dems, embriones alterados experimentalmente soncapaces de reular y desarrollar un blastocisto normal" Estasobser%aciones, sin embaro, no excluyen la existencia de unaestructura espacial oculta (ue puede determinar el desarrollo, aun(uetal determinacin podr&a ser controlada por la reulacin embrionaria"/(u& se anali'a la estructura espacial de un embrin de 2-celulas pormedio de su centrifuacin y posterior culti%o in %itro" Este mtodo no seha utili'ado en los mam&feros, excepto por un interesante informe de

in%estiacin preliminar por ulnard19703"M%ter#%&es ' m(t!s

Recoleccin de embriones.dos clulas colectadas en medio 4iers )m 5 ml de alb!mina de suero bo%ino 46/3 albiochem3 de ratonessupero%ulados de la cepa 8 1, : h despus de la supuesto tiempo deo%ulacin3"

Procedimiento de centrifugacin. 6oluciones de *extrano ; )0"0006ima3 fueron preparadas en medio 4iers a concentraciones de 17

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fueron colocados en la capa ms liera de la radiente discont&nua y lostubos fueron centrifuaron durante :0 min utili'ando el rotor de cubetaoscilante 6; 9 de la centr&fua 4ecAman modelo #" #as fuer'ascentr&fuas aplicadas oscilaron de 1"000 hasta 120"000 x g. #atemperatura del contenido de los tubos %ari entre 1 y 1@ B , excepto

para los experimentos en los (ue se lle% a centrifuacin a ) B "El cultivo in vitro. *espus de la centrifuacin los embriones seen$uaaron con medio 4iers y, o bien $ado inmediatamente oculti%adas durante diferentes momentos antes de la $acin" #osembriones fueron culti%ados en microotas de medio 4ier con 46/en placas Cetri de plstico 8alcon3 ba$o aceite mineral a 7 B enuna atmsfera h!meda con < de D, en el aire, p? 7"2 a 7")" Eln!mero de clulas se determinaron por el mtodo de arAo=sAi" /ntesde y durante la centrifuacin los embriones fueron expuestos atemperatura ambiente y a la atmsferaF los controles se trataron de

forma similar"

Microscopa ptica y electrnica.*espus de centrifuacin y culti%o in%itro, los embriones fueron procesados para microscop&a ptica yelectrnica como se inform anteriormente sin la adicin de cidotnico" #a microscop&a de lu' se lle% a cabo en preparacionescompletas en licerol" En alunas series experimentales,inmediatamente despus de la centrifuacin los embriones sela%aron en un buGer de estabili'acin, se permeabili'aron con 0,oli, cuerpos multi%esiculares y las%es&culas (ue son ms pe(ueMas (ue las (ue se encuentran en la'ona de %es&culas y membranas 8i" 3" #a 'ona de cuerposcristaloides no se detecta cuando los embriones han sidocentrifuados a menos de 70"000 x F a esta o fuer'as superioresesta 'ona parece llena de material brilar y cuerpos cristaloides ")3" El cortex de laclula es claro y muestra una malla na carecentede ornulos" Carece ser afectado por centrifuacin y no cambiaapreciablemente de acuerdo a la fuer'a centr&fua aplicada uras

)" 113

En 2 embriones los cuales fueronextra&dos con deterenteinmediatamente despus de la centrifuacin y antes de la $acinpara microscop&a electrnica, la capa lip&dica persiste pero parecealo extra&do y numerosas otitas de l&pido se arean en unas pocasotas randes 8i" @3" odas la citomembranas en sta y las otrascapas han desaparecido, (uedando framentos de materia amorfa" Elmaterial brilar se conser%a " 113 y componentes del

citoes(ueleto se %uel%en distintos con el tratamiento con deterente"Carticularmente e%idente se muestran la corte'a celular densa, la redinterna de microlamentos de actina 7 nm3 y los microt!bulos 21nm3 obser%ados en di%ersas ubicaciones, especialmente prxima aln!cleo 8is" 10, JJ3" errar las relaciones espaciales se obser%aronentre los microt!bulos y las indentaciones en el polo centr&peto deln!cleo, y los microlamentos se encuentran en todo el n!cleo 8i"103"

El n!cleo, ya sea %isuali'ado en preparados de extraccin condeterente o no, no se desubica por centrifuacin, de su insercinen la 'ona de material mitocondrial y brilar y se muestra elonadohacia polo centrifuo del blastmero" #a parte centr&peta nal del

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n!cleo nos muestra indentaciones profundas y el extremo centr&fuocontiene los nucleolos, fusionados en uno o dos 8i" : R3"

Restablecimiento de embriones estrati#cados$ %bservaciones al

microscopio ptico

Pn n!mero embriones ::3 se $a 0 mm a ) h despus de sercentrifuada a 70"000 o 90"000 x gy se obser%aron al microscopioptico" *entro de 0 a )0 minutos despus de centrifuacin, losn!cleos y nuclolos se encuentran de nue%o en el centro de la clulay la estraticacin del citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapasde l&pidos persistir en los polos centr&petos de ambos blastmeros8i" 1)3"

En embriones en los (ue se permiti seuir con su desarrolo, laseunda di%isin por lo eneral di%ide a las tapas y conforme se daescisin, las otas de l&pidos son redistribuidas entre los blastmeros"

#a centrifuacin no impide el desarrollo a blastocistos normalescon cerca de 0 clulas 8i" 13, aun(ue la blastulation es aloretrasada" El porcenta$e de blastulacin en embriones centrifuadoses de aproximadamente 20< menos (ue en los embriones no

centrifuada y tratados en condiciones similaresK sin embaro, unaumento en la fuer'a centr&fua de 0"000 x g a 90"000 x g nocambia el porcenta$e de blastulacin sinicati%amente abla 13" Elporcenta$e blastulacin sobre los controles en experimentos decentrifuacin es aproximadamente 7

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tratados se rompieron a 10"000 x " #a estraticacin de los %ulostratada y no tratada es bastante similar, pero los embriones tratadosa 0"000 x muestran el efecto producido por ,000 x en los %ulossin tratar"

#os %ulos (ue se centrifuaron y culti%aron en medios (uecontien&an colcemid o citocalasina * se repusieron de laestraticacin en mucho menos tiempo (ue %ulos control, y sudesarrollo normal se detu%o" 6e compar el efecto de estas medicinas

reistrando el tiempo (ue pas despus de la centrifuacin hasta(ue el nuclolo recobrara una posicin central en blastmeros, lo (uere%ela la recuperacin de la forma y la posicin de los n!cleos" #aobser%acin de 1)) %ulos tratados con colcemid muestra (ue en el9< de ellos el nuclolo recuper su posicin central 1@0 minutosdespus de la centrifuacin, mientras esta situacin se recuperodespus de 2)0 minutos en el 9< de 2: %ulos tratados concitocalasina *"

#a morfolo&a de los 9@ %ulos centrifuados tratados con colcemid ocitocalasina *, (ue se extra$eron del deterente despus de lacentrifuacin, es diferente de la descrita anteriormente para los%ulos sin tratar" 4a$o el microscopio ptico la diferencia destacablees el contorno liso o el polo centr&peto nuclear en %ulos tratados confrmacos, en comparacin con las hendiduras obser%adas en los%ulos sin tratar"

#os %ulos (ue fueron tratados con colcemid o en frio el n!cleopermanece en la capa ranular, mientras (ue el tratamiento concitocalasina * causa una separacin del n!cleo de$ando un espacioentre el material brilar y la membrana nuclear colapsada" Elcitoplasma de los %ulos tratados con colcemid carece de perles demicro t!bulos y los %ulos tratados con citocalasina * demuestranuna corte'a discontinua y una red interior rela$ada suelta +o$a3 delmaterial brilar"

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*J6P6JD.

Estraticacin de los componentes celulares

#a estraticacin del citoplasma ha demostrado (ue al menos dostipos de o estados3 de los cuerpos %esiculares pueda ser reconocidopor su densidadK %es&culas de lu' (ue se encuentran deba$o de la tapade l&pidos, (ue incluyen elementos (ue muestran la acti%idadfosfatasa cida y las %es&culas pesados (ue se encuentran en la caparanular me'clan con el material de las mitocondrias y brilarnuestras obser%aciones suieren (ue este material brilar, en %irtudde la fuer'a de las pilas centr&fuas hasta la formacin de cuerposcristaloides"

El alaramiento de los n!cleos y la muesca en su fuer'a centr&petapostes pueden atribuirse a un discontinuo de la membrana nuclear enel citoes(ueleto" *e hecho, el deterente de %ulos extra&dos re%elanlos microt!bulos y microlamentos asociado a la hendidurasnucleares y estas desaparecen de %ulos (ue han sido tratados con

coloemid o denominado citocalasina o fr&o

En el no se ha estudiado los otros componentes del citoes(ueleto (uehan sido identicadas en embriones de preimplantacin, alfa-actinina,cito(ueratina, miosina, fodrin y spectrin"

IEPCEI/JS. *E #/ E6I/J8J/JD.

El restablecimiento pasi%o se!n las densidades relati%as

probablemente re(uerir&an un mayor tiempo (ue el tiempo derestablecimiento (ue hablamos y adems esto no explicar&a por(uelas otas de l&pidos se mantienen $untas en dos polos centr&petos, sinembaro no es posible descartar el rol de una matri' %iscosa noestructurada con comportamiento elstico" En el restablecimiento delos embriones lueo de la centrifuacin" El rol del citoes(ueleto estain+uenciado por el retraso obser%ado en el restablecimiento cuandose usan inhibidores especialmente con cytocalasina d" a pesar (uestos inhibidores a las concentraciones usadas e%itan la di%isin celular

y el desarrollo normal, el citoes(ueleto no se altera y elrestablecimiento puede ser atribuida a una estructura resiliente el

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cual esta conectdao a di%ersas citomenbranas y de este modo losmantiene o restaura su orden espacial"

E# *E6/IID##D *E6CPE6 *E #/ IEPCEI/JD.

En todos los experimentos de centrifuacin, la sementacin y eldesarrollo del blastocisto parcialmente es dispare$o probablementepor(ue el embrin es culti%ado por 1-2ras fuera de la incubadora" 6in

embaro ya (ue no se obser%aron alteraciones ba$o microscopia obticdurante la sementacin, compactacin y formacin del blastocistode los embriones centrifuados, al parecer la centrifuacin no causaalteracin en la orani'acin fundamental de la celula asumiendo (uedespus del desarrollo sea completamente normal y al menos dosinterpretaciones enerales de los resultados son posibles" Crimero laexistencia de una estructura preestablecida (ue o resiste lacetrifuacion o (ue fcilmente se recupera esta, lo cual despla'a loscomponentes celulares in%olucrados en la morfonesis a su celular

apropiado" 6eundo la usencia en esta etapa de cual(uier estructuramorfoenetica espacial" .uestros resultados sustentar&an la seundainterpretacin, lo cual sin embaro no podemos armar debido (ue elrestablecimeinto desde la estraticacin puede ser un proceso pasi%oo incluso acti%os el cual no se relaciona con la morfoenista delblastocisto, adems por(ue las anormalidades propias de desarrollo(ue pueden aparecer lueo no han sido descartados"