CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE OLLUCO (Ullucus tuberosus)

BIOCHEMISTRY CHARACTERIZATION OF THE PROTEINS OF OLLUCO (Ullucus tuberosus)

*NARCIZO GÓMEZ VILLANES*

RESUMEN

El trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de biotecnología del Instituto de Desarrollo e Investigación en Biotecnología (IDIB) de la Universidad Nacional del Centro del Perú y de Química Bioorgánica del Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición (CIBN) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, con el objetivo de evaluar el contenido proteico de 50 variedades promisorias de olluco así como la variabilidad proteica y complejidad bioquímica. El contenido proteico de olluco liofilizado fue determinado en forma indirecta por el método de semimicro Kjeldahl, encontrándose un contenido alto de proteínas que están en un rango de 10,07 a 11,55 g /100g, de contenido medio de proteínas siendo el rango 7,00 a 9,98 g /100 g y de bajo contenido de proteínas siendo el rango de 5,60 a 6,65 g /100 g. También se ha caracterizado las proteínas de las variedades promisorias de olluco mediante la técnica de electroforesis no denaturante en gel de poliacrilamida (ND - PAGE) y de electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida (SDS - PAGE), encontrándose variabilidad proteica por presentar dos grupos de bandas proteicas uno de 14 - 24 kD y el otro de 24 – 60 kD.

Palabras clave gel de poliacrilamida, variabilidad proteica

ABSTRACT

The present research was carried out in the laboratories of Biotechnology of the Institute of Development and Investigation in Biotechnology (IDIB) of the National University of the Center of the Peru and of Bioorganic chemistry of the Investigation Center of Biochemistry and Nutrition (CIBN) of the National University of San Marcos, with the objective to evaluate the protein content of 50 promissory varieties of olluco as well as the protein variability and biochemical complexity. The protein content of liofilized olluco was determined in indirect form by the semimicro Kjeldahl method, by finding a high content of proteins in a range from 10,07 to 11,55 g /100g, a half content of proteins in a range from 7,00 to 9,98 g /100 g and a low content of proteins in a range from 5,60 to 6,65 g /100 g. It has also been characterized the proteins of the promissory varieties of olluco by means of the technique of electrophoresis non denaturant in polyacrylamide gel (ND - PAGE) and of electrophoresis with SDS in polyacrylamide gel (SDS - PAGE), finding protein variability because it is presented two groups of bands proteins one of 14 - 24 kD and the other of 24-60 kD. Key words polyacrylamide gel, protein variability

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*Profesor Asociado a T.C. – Departamento de Cultivos y Fitomejoramiento, Facultad de Agronomía – Universidad Nacional del Centro del Perú.

INTRODUCCIÓN

El olluco (Ullucus tuberosus Caldas) en

el Perú es el segundo tubérculo en importancia luego de la papa. Es parte de la alimentación de la población peruana de todas las clases sociales.

Existen estudios realizados por diferentes investigadores que enfocan los aspectos nutricionales. Estos estudios muestran que el olluco tiene un aporte nutricional de energía 62 kcal/ 100 y un contenido de ácido ascórbico de 15, 40 mg/100g y que además representa una buena variante nutricional por su contenido de proteínas reportándose como valor máximo un total de 15,7% sobre la base de peso seco (Pietila y Tapia 1991).

Se han realizado estudios sobre la caracterización morfológica de las accesiones pertenecientes al Banco de Germoplasma de olluco del Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA), Programa Nacional de Investigación de Recursos Genéticos y Biotecnología (PRONIRGEB), Estación Experimental Santa Ana – Huancayo. Utilizando los descriptores morfológicos propuestos por Arbizu (1994), modificados por INIA – PRONIRGEB (1985), logrando identificar 343 morfotipos, encontrándose además que el 14% de las entradas serian posibles duplicados.

Diferentes métodos de análisis electroforético han sido ensayados como electroforesis en gradiente de porosidad (poroPAGE) usando una gradiente de poliacrilamida entre 12 a 25% y encontraron en el olluco dos grupos principales de bandas entre 6,5 – 12 kD y entre 25 – 58 kD. En electroforesis discontinua con SDS (SDS – disc – PAGE) y electroforesis en gradiente de porosidad con SDS (SDS – poro PAGE) revelaron para el olluco 21 bandas para muestras no reducidas y 25 bandas para muestras reducidas (Akbar y col., 1993).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron 50 variedades promisorias de olluco, procedentes del Banco de

Germoplasma del Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA), Programa Nacional de Investigación de Recursos Genéticos y Biotecnología (PRONIRGEB), Estación Experimental Santa Ana – Huancayo.

Determinación de nitrógeno total mediante el método de semi micro Kjeldahl

Para la digestión se pesó 0,5 g de muestra liofilizada de cada variedad de olluco, se colocaron en balones y se agrego 2 g de mezcla de sales y 4 mL de ácido sulfúrico concentrado, se calentó a 460 °C durante 2 horas. Las muestras digeridas fueron diluidas con 15 mL de agua destilada y luego se procedió a la destilación en un equipo de destilación semi micro Kjeldahl, el sulfato de amonio presente en la muestra digerida, es atacada con 15 mL de hidróxido de sodio al 50%, liberando el amoniaco que es recepcionado en 10 mL de ácido bórico al 2% con indicador rojo de metilo enmascarado. La titulación se realizó en una bureta de vidrio de 100 mL utilizando como titulante ácido clorhídrico valorado al 0,1 normal. Para la determinación del contenido de proteína de olluco se usó el factor 6,25, para convertir el nitrógeno total en proteína cruda.

Electroforesis en geles de poliacrilamida denaturante (SDS - PAGE)

Para obtener las proteínas totales de olluco, los tubérculos se congelaron a – 20 °C durante 24 horas, se pesaron y descongelaron. Para la obtención de extractos se utilizó una extractora de jugos, así mismo para evitar la oxidación se adicionó una solución antioxidante compuesta de sulfito de sodio al 20% y bisulfito de sodio al 15% de concentración final. El extracto se centrifugó a 3 000 rpm durante 10 minutos con la finalidad de remover el almidón y demás restos y el sobrenadante se guardó en refrigeración a una temperatura de –20 °C hasta el momento de ser usado. Para hacer uso del extracto para los análisis electroforéticos se procedió de la siguiente manera. Se tomó 1 mL de extracto de olluco y se precipitó con 4 volúmenes de

acetona fría, luego se centrifugó a 3 000 rpm por 5 minutos se descartó el sobrenadante y el sedimento fue resuspendido por buffer de muestra/agua (1:1), según el sistema discontinuo descritos por Laemili (1960) que contiene Tris – HCl pH 6,8, 0,5M, SDS 10%, glicerol 20% y 2 – mercaptoetanol 10%, y

se llevó a un volumen final de 250 l, se homogenizó bien y luego se centrifugó a 12 000 rpm, durante 5 minutos, luego se calentó la muestra en baño maría por 3

minutos. Se enfrió con agua, luego se

agregó 5 l de amidoblack. Las muestras fueron aplicadas en un gel de poliacrilamida al 12% (SDS – PAGE). La electrofóresis se realizó en una cámara electroforética de tipo vertical durante 6 horas, para lo cual se usó una corriente constante de 10 a 40 miliamperios. Una vez terminada la corrida electroforética los geles fueron teñidos durante toda la noche con una solución colorante de coommassie blue R – 250 al 1 % en 40 mL de ácido acético, 12 mL de ácido tricloroacético 10%, 40 mL de metanol y 160 mL de agua destilada. Posteriormente fueron decoloradas con una solución de 10 mL de ácido acético y 60 mL de metanol y 140 mL de agua destilada. Se usaron estándares de proteína (SIGMA) de pesos moleculares (PM) que van de 14 200 a 66 000 daltons.

Electroforesis en geles de poliacrilamida no denaturante (ND– PAGE)

Las proteínas totales de olluco fueron tratadas con una solución de sucrosa al 60% para dar densidad y amidoblack al 0,003 % como indicador de corrida. Se utilizó el sistema discontinuo, con geles de separación de concentración 12 % a pH 8,8 y el gel de stacking o concentrador a una concentración de 5% a pH 6,8. La electrofóresis, la coloración y decoloración de los geles se siguió el mismo procedimiento descrito para los geles denaturantes.

RESULTADOS DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO

Cuadro 1. Contenido proteico de 50 variedades promisorias de olluco

En el cuadro 1 se observa que, el contenido de proteína en las 50 variedades promisorias de olluco liofilizado varía entre 11,55 g/ 100g como valor máximo y 5,60 g /100g como valor mínimo. En la figura 1 se observa que del total de variedades, el 20% tienen alto contenido de proteínas, el 62% tienen un contenido medio de proteínas y el 18% tienen un bajo contenido de proteínas Fig. 1. Rangos de contenido de proteínas de olluco (Ullucus tuberosus)

18%

62%

20%

0

5

10

15

20

25

30

35

Nú

mero

de v

ari

ed

ad

es

5,60-6,65 7,00-9,98 10,07-11,55

% de proteínas

Bajo

Medio

Alto

Variedades g/100g Peso seco

Variedades g/100g Peso seco

HNCO-062 SA-323 HNCO-072

HNCO-98 HNCO-010 AYA-26-A SA-343

AYA-24 HNCO-059 SA-339

HNCO-083 HNCO-058 SA-264

HNCO-040 AYA-04 HNCO-085

AYA-01 SA-110-B HNCO-038

SA-177 SA-179 HNCO-09

HNCO-087 SA-136 AYA-17

11,55 11,32 11,20

10,85 10,85 10,68 10,68

10,33 10,33 10,07

9,98 9,80 9,80

9,80 9,45 9,45

9,45 9,45 9,10

8,75 8,75 8,75

8,75 8,40 8,40

HNCO-076 HNCO-080 AYA-060

HNCO-011 HNCO-016 SA-051 HNCO-28

SA-12-A SA-262 SA-138

SA-207 SA-342 HNCO-55

HNCO.018 HNCO-045 SA-353

HNCO-067 HNCO-017 HNCO-019

HNCO-061 SA-110 HNCO-88

SA-350 SA-060 SA-042

8,40 8,40 8,40

8,05 8,05 7,70 7,70

7,70 7,70 7,70

7,35 7,05 7,00

7,00 7,00 7,00

6,65 6,65 6,65

6,30 6,30 6,30

5,95 5,95 5,60

ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO

Fig.2. Gel de poliacrilamida denaturante con sodio dodecil sulfato (SDS – PAGE) al 12%, de proteína total extraída de 9 variedades promisorias de olluco

En la figura 2, el análisis electroforético de las proteínas de olluco, muestran un grupo de proteínas con pesos moleculares de 24 a 60 kD aproximadamente. Y otro grupo de proteínas, cuyo peso molecular está en el rango de 14 a 24 kD. Las proteínas menos abundantes son las de peso molecular que probablemente estaría en el rango de 5 kD a 10 kD. Se observa una gran variedad de pesos moleculares entre proteínas.

Fig.3. Gel de poliacrilamida no denaturante (ND-PAGE) al 12%, de proteína nativa total extraída de 10 variedades promisorias de olluco

Fig. 4. Gel de poliacrilamida no denaturante (ND-PAGE) al 12%, de proteína nativa total extraída de 10 variedades promisorias de olluco

DISCUSIÓN

Los tubérculos andinos como la oca, olluco y la mashua representan una buena variante nutricional por su contenido en proteínas. Collazos y col., (1975) reportan que, el contenido proteínico en base húmeda es muy similar en estas especies de 1.0 a 1,5%; pero hay una considerable variación nutricional especialmente en el contenido de proteínas cuando la muestra es deshidratada; así el porcentaje de proteína en las 50 variedades promisorias analizadas fluctúa entre 11,55 % como valor máximo y 5,60 % como valor mínimo (cuadro 1), en estudios realizados por Pietila y Tapia (1991) reportan que, el porcentaje de proteína sobre la base de peso seco está entre 15,7 % como valor máximo y 5,1 % como valor mínimo. Así mismo Samanez (1974) reporta que, los porcentajes de proteína de 20 clones de olluco están en rangos de 5,1 a 8,35 %.

Estos resultados al ser comparados con los obtenidos en el presente trabajo se observan que existen diferencias en el porcentaje de proteínas sobre la base de peso seco, las causas de estas diferencias, probablemente se debe a factores externos como fotoperiodo, riego, los niveles de nitrógeno disponibles para la planta, que podría haber afectado

66,000

45,000

36,000

20,100

14,200

29 000

24 000

marcadamente en la concentración relativa de las proteínas de los tubérculos, pero se puede sugerir que en esta especie existe una apreciable variación genética con respecto al contenido proteico del tubérculo, debido probablemente al carácter genético que gobierna a cada variedad. Se podría también atribuir que posiblemente se produjo alteraciones de las regiones regulatorias de genes de proteínas de reserva que provocaron sus niveles de expresión. La caracterización bioquímica de las proteínas totales de olluco mediante electrofóresis denaturante (SDS – PAGE) Figura 2, demuestran que las proteínas están divididos en dos grupos principales de bandas proteicas uno de 14 - 24 kD y el otro de 24 – 60 kD aproximadamente, esta alta variabilidad proteica hace pensar que las proteínas presentes en el olluco son bioquímicamente complejas. Similares resultados fueron reportados por Espinoza (1998) para proteínas de mashua a pesar de ser una especie genéticamente diferente, presentan también dos grupos de bandas uno formado por proteínas con pesos moleculares de 24 a 70 kD y el otro por proteínas medianamente abundantes, con pesos moleculares en el rango de 14 a 23 kD. Por otro lado resultados semejantes fueron reportados por Akbar y col., (1993) en Poro PAGE, detectándose que las proteínas del olluco están divididos en dos grupos principales uno entre 8 – 12 kD y el otro entre 25 - 58 kD, lo que confirma la complejidad de las proteínas del olluco.

Así mismo, mediante electroforesis no denaturante (ND – PAGE) (Figuras 3 y 4), se observa dos grupos de posibles duplicados formados por las variedades HNCO-040, SA-177 y un segundo grupo formado por las variedades HNCO-55, HNCO-061 y HNCO-088 por presentar bandas similares, es decir las proteínas tienen la misma movilidad electroforética, esto podría deberse a que no hay variaciones en la secuencia de los aminoácidos de la proteína, lo que implicaría que no hay variaciones alélicas

en el gen que la codifican. Las 15 variedades restantes presentan bandas diferentes, esto me hace suponer que las variantes alélicas en un locus dado codifican para proteínas similares en estructura, pero que difieren en alguna parte de la secuencia de sus aminoácidos, lo cual probablemente se traduce en cambios en la movilidad electroforética de las proteínas. Lo que me hace pensar que existe variabilidad genética entre estas accesiones. REFERENCIAS

1. PIETILA y TAPIA. 1991. Investigación Sobre el Ulluku. TURKU.

2. ARBIZU, C. 1994. Descriptores

Morfológicos de Olluco. Separata de 10 pag. Lima – Perú.

3. AKBAR, A., STEGEMANN, H. &

GALVEZ, M. 1993. Mashua, Oca and Ulluco: Protein Characters and Optimizing Discrimination of varieties by Electrophoretic Techniques.Institut fur Biochemie und Pflanzenvirologie, Biologische Bundesanstalt, D-3300 Braunschweig, Germany.

4. LAEMMLI, U.K. 1970, Natur. 227,

680-688.

5. COLLAZOS, C. y col., 1975. La

Composición de los Alimentos Peruanos. 5ta. Edición. Ministerio de Salud. Lima – Perú.

6. ESPINOZA,S. 1998. Caracterización

Bioquímica de las Proteínas de Tropaeolum tuberosum Procedentes de Junín. Tesis de Magíster UNMSM. Lima – Perú.

7. SAMANEZ, H. 1974. Aspectos de

Análisis Bromatológico en Veinte Clones de Ollucos (Ullucus tuberosus Loz). Tesis Universidad

San Antonio Abad del Cuzco.