caracterizaciÓn estructural y funcional de la …
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Universidad Autoacutenoma de Madrid Facultad de Ciencias
Departamento de Biologiacutea Molecular
CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y
FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
Director Joseacute Antonio Melero
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR QUE PRESENTA LORENA SOLEDAD VER
MARZO 2008
Summary
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Summary
The human metapneumovirus (HMPV) was first described in 2001 when it was
classified as the first mammalian member of the Paramyxoviridae family subfamily
Pneumovirinae genus Metapneumovirus Analysis of sequences of the surface
glycoprotein genes of several HMPV isolates revealed the existence of two main genetic
virus lineages (A B) each divided into at least two sublineages (A1 A2 B1 B2)
One of the major HMPV glycoproteins is the fusion (F) protein which is relatively
conserved among HMPV strains and shares structural features with other paramyxovirus
F proteins These proteins are class I viral fusion proteins that are synthesized as inactive
precursors that must be cleaved to yield fusion-competent disulfide-linked chains They
mediate fusion of the viral and cell membranes to facilitate virus entry into the cell and in
addition they commonly promote cell-cell fusion leading to syncytia formation Membrane
fusion promoted by paramyxovirus F proteins occurs at the cell surface and usually at
neutral pH
In the present study we have cloned expressed and purified a soluble form of the
HMPV F protein The three dimensional (3D) structure of the ectodomain of the F protein
was determined by electron microscopy of single molecules and subsequent 3D
reconstruction at a resolution of ~14 Å
It has been recently suggested that membrane fusion promoted by the human
metapneumovirus (HMPV) fusion (F) protein requires low pH (Schowalter et al 2007)
We demonstrate that low pH dependency for fusion was associated to a glycine at amino
acid position 294 in F proteins of some lineage A strains (sublineages A1 and A2) but not
in lineage B proteins Since 294G was only observed in 4 of HMPV sequences in public
databases we conclude that the low pH requirement of HMPV F protein is a rare and
strain dependent phenomenon Other amino acid changes selected in the F protein of a
sublineage B2 strain after repeated passage in vitro also influenced F-mediated
membrane fusion independently of pH We hypothesize that adaptation of HMPV to cell
cultures may select for F sequences with more fusogenic phenotypes either pH-
dependent or pH-independent
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I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I1 Clasificacioacuten y analogiacutea con otros virushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I2 Caracteriacutesticas de la enfermedadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I21 Epidemiologiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I23 Tratamiento y prevencioacuten del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I3 Biologiacutea Molecular del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I31 Genoma viralhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
I33 Proteiacutena Viraleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I4 La glicoproteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I5 Proceso de fusioacuten de membranashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I52 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por
paramixovirushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I62 El microscopio electroacutenicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensionalhelliphelliphelliphelliphelliphellip
II OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip III1 MATERIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III11 Material Bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III111 Liacuteneas celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III112 Virus helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III113 Bacterias y plaacutesmidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III114 Animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III115 Anticuerposhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III116 Oligonucleacuteotidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III117 Enzimashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III118 Oligopeacuteptidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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III12 Medios de cultivohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III121 Ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III122 Bacteriashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III13 Reactivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III2 MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III212 Crecimiento del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
II213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III215 Crecimiento del virus vacciniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III216 Titulacioacuten del virus vaccinia por plaqueo en agarhelliphelliphelliphelliphelliphellip
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinanteshelliphelliphelliphelliphelliphellip
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentehelliphellip
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCRhelliphelliphelliphelliphellip
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competenteshelliphelliphelliphelliphellip
III225 Seleccioacuten de bacterias trasnformadas y secuenciacioacuten de las
colonias positivahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la
proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH
en el plaacutesmido pCaggshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III231 Cromatografiacutea de intercambio anioacutenico
III232 Cromatografiacutea de afinidad de iones metaacutelicos (IMAC)helliphelliphellip
III233 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel
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III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
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IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
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V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
Summary
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Summary
The human metapneumovirus (HMPV) was first described in 2001 when it was
classified as the first mammalian member of the Paramyxoviridae family subfamily
Pneumovirinae genus Metapneumovirus Analysis of sequences of the surface
glycoprotein genes of several HMPV isolates revealed the existence of two main genetic
virus lineages (A B) each divided into at least two sublineages (A1 A2 B1 B2)
One of the major HMPV glycoproteins is the fusion (F) protein which is relatively
conserved among HMPV strains and shares structural features with other paramyxovirus
F proteins These proteins are class I viral fusion proteins that are synthesized as inactive
precursors that must be cleaved to yield fusion-competent disulfide-linked chains They
mediate fusion of the viral and cell membranes to facilitate virus entry into the cell and in
addition they commonly promote cell-cell fusion leading to syncytia formation Membrane
fusion promoted by paramyxovirus F proteins occurs at the cell surface and usually at
neutral pH
In the present study we have cloned expressed and purified a soluble form of the
HMPV F protein The three dimensional (3D) structure of the ectodomain of the F protein
was determined by electron microscopy of single molecules and subsequent 3D
reconstruction at a resolution of ~14 Å
It has been recently suggested that membrane fusion promoted by the human
metapneumovirus (HMPV) fusion (F) protein requires low pH (Schowalter et al 2007)
We demonstrate that low pH dependency for fusion was associated to a glycine at amino
acid position 294 in F proteins of some lineage A strains (sublineages A1 and A2) but not
in lineage B proteins Since 294G was only observed in 4 of HMPV sequences in public
databases we conclude that the low pH requirement of HMPV F protein is a rare and
strain dependent phenomenon Other amino acid changes selected in the F protein of a
sublineage B2 strain after repeated passage in vitro also influenced F-mediated
membrane fusion independently of pH We hypothesize that adaptation of HMPV to cell
cultures may select for F sequences with more fusogenic phenotypes either pH-
dependent or pH-independent
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I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I1 Clasificacioacuten y analogiacutea con otros virushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I2 Caracteriacutesticas de la enfermedadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I21 Epidemiologiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I23 Tratamiento y prevencioacuten del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I3 Biologiacutea Molecular del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I31 Genoma viralhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
I33 Proteiacutena Viraleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I4 La glicoproteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I5 Proceso de fusioacuten de membranashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I52 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por
paramixovirushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I62 El microscopio electroacutenicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensionalhelliphelliphelliphelliphelliphellip
II OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip III1 MATERIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III11 Material Bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III111 Liacuteneas celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III112 Virus helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III113 Bacterias y plaacutesmidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III114 Animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III115 Anticuerposhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III116 Oligonucleacuteotidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III117 Enzimashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III118 Oligopeacuteptidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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III12 Medios de cultivohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III121 Ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III122 Bacteriashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III13 Reactivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III2 MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III212 Crecimiento del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
II213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III215 Crecimiento del virus vacciniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III216 Titulacioacuten del virus vaccinia por plaqueo en agarhelliphelliphelliphelliphelliphellip
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinanteshelliphelliphelliphelliphelliphellip
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentehelliphellip
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCRhelliphelliphelliphelliphellip
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competenteshelliphelliphelliphelliphellip
III225 Seleccioacuten de bacterias trasnformadas y secuenciacioacuten de las
colonias positivahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la
proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH
en el plaacutesmido pCaggshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III231 Cromatografiacutea de intercambio anioacutenico
III232 Cromatografiacutea de afinidad de iones metaacutelicos (IMAC)helliphelliphellip
III233 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel
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III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
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IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
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V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Indice
vi
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
INDICE
Indice
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I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I1 Clasificacioacuten y analogiacutea con otros virushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I2 Caracteriacutesticas de la enfermedadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I21 Epidemiologiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I23 Tratamiento y prevencioacuten del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I3 Biologiacutea Molecular del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I31 Genoma viralhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
I33 Proteiacutena Viraleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I4 La glicoproteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I5 Proceso de fusioacuten de membranashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I52 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por
paramixovirushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I62 El microscopio electroacutenicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensionalhelliphelliphelliphelliphelliphellip
II OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip III1 MATERIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III11 Material Bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III111 Liacuteneas celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III112 Virus helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III113 Bacterias y plaacutesmidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III114 Animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III115 Anticuerposhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III116 Oligonucleacuteotidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III117 Enzimashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III118 Oligopeacuteptidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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III12 Medios de cultivohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III121 Ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III122 Bacteriashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III13 Reactivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III2 MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III212 Crecimiento del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
II213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III215 Crecimiento del virus vacciniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III216 Titulacioacuten del virus vaccinia por plaqueo en agarhelliphelliphelliphelliphelliphellip
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinanteshelliphelliphelliphelliphelliphellip
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentehelliphellip
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCRhelliphelliphelliphelliphellip
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competenteshelliphelliphelliphelliphellip
III225 Seleccioacuten de bacterias trasnformadas y secuenciacioacuten de las
colonias positivahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la
proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH
en el plaacutesmido pCaggshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III231 Cromatografiacutea de intercambio anioacutenico
III232 Cromatografiacutea de afinidad de iones metaacutelicos (IMAC)helliphelliphellip
III233 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel
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III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
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IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
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V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
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36
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I1 Clasificacioacuten y analogiacutea con otros virushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I2 Caracteriacutesticas de la enfermedadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I21 Epidemiologiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I23 Tratamiento y prevencioacuten del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I3 Biologiacutea Molecular del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I31 Genoma viralhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
I33 Proteiacutena Viraleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I4 La glicoproteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I5 Proceso de fusioacuten de membranashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I52 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por
paramixovirushelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I62 El microscopio electroacutenicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensionalhelliphelliphelliphelliphelliphellip
II OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip III1 MATERIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III11 Material Bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III111 Liacuteneas celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III112 Virus helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III113 Bacterias y plaacutesmidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III114 Animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III115 Anticuerposhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III116 Oligonucleacuteotidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III117 Enzimashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III118 Oligopeacuteptidoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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III12 Medios de cultivohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III121 Ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III122 Bacteriashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III13 Reactivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III2 MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III212 Crecimiento del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
II213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III215 Crecimiento del virus vacciniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III216 Titulacioacuten del virus vaccinia por plaqueo en agarhelliphelliphelliphelliphelliphellip
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinanteshelliphelliphelliphelliphelliphellip
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentehelliphellip
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCRhelliphelliphelliphelliphellip
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competenteshelliphelliphelliphelliphellip
III225 Seleccioacuten de bacterias trasnformadas y secuenciacioacuten de las
colonias positivahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la
proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH
en el plaacutesmido pCaggshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III231 Cromatografiacutea de intercambio anioacutenico
III232 Cromatografiacutea de afinidad de iones metaacutelicos (IMAC)helliphelliphellip
III233 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel
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III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
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IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
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V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
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III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
Indice
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III12 Medios de cultivohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III121 Ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III122 Bacteriashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III13 Reactivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III2 MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III212 Crecimiento del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
II213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III215 Crecimiento del virus vacciniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III216 Titulacioacuten del virus vaccinia por plaqueo en agarhelliphelliphelliphelliphelliphellip
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinanteshelliphelliphelliphelliphelliphellip
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentehelliphellip
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCRhelliphelliphelliphelliphellip
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competenteshelliphelliphelliphelliphellip
III225 Seleccioacuten de bacterias trasnformadas y secuenciacioacuten de las
colonias positivahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la
proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH
en el plaacutesmido pCaggshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III231 Cromatografiacutea de intercambio anioacutenico
III232 Cromatografiacutea de afinidad de iones metaacutelicos (IMAC)helliphelliphellip
III233 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel
Indice
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III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
Indice
iv
63
66
68
70
72
75
75
76
78
79
81
81
82
83
84
85
85
86
86
87
89
89
89
90
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Indice
v
91
91
91
94
94
95
96
100
102
102
103
105
106
107
109
119
V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Indice
vi
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
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Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
Indice
iii
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47
48
48
48
48
49
49
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50
50
50
50
51
51
51
53
54
57
60
62
62
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealandhelliphelliphelliphellip
III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia
de la proteiacutena F del MNVHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III242 Sueros anti-virus vaccinia recombinantes vvF y vvFTM-helliphellip
III243 Sueros anti-proteiacutena FTM- 6His purificadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III25 Meacutetodos de anaacutelisis de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III251 ELISAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de
proteiacutenas (Western Blot)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III253 Inmunofluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III254 Microscopiacutea electroacutenicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III26 Estudios bioinformaacuteticoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III261 Alineamiento de secuencias helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena Fhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
III263 Determinacioacuten del punto isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F
de MNVH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el
MNVH en cultivos celulareshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
IV2A Purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico y filtracioacuten en
gel
IV2B Purificacioacuten por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y
filtracioacuten en gel
IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His
purificada
Indice
iv
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66
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75
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86
86
87
89
89
89
90
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Indice
v
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91
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94
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102
102
103
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109
119
V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Indice
vi
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
-
- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
-
- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
-
- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
-
- IV RESULTADOS
-
- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- V DISCUSIOacuteN
-
- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
-
- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
-
Indice
iv
63
66
68
70
72
75
75
76
78
79
81
81
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85
86
86
87
89
89
89
90
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un
volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
del MNVH IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura
terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a
partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea
electroacutenica (ldquoDockingrdquo) helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH y su
dependencia del pH
IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
IV4A Pool de sueros humanos
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
IV4B1 ELISA IV4B2 Western blot IV4C Sueros policlonales dirigidos frente a virus vaccinia recombinantes
IV4C1 ELISA IV4C2 Western blot
IV4C3 Inmunofluorescencia IV4C4 Neutralizacioacuten IV4D Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
IV4D1 ELISA IV4D2 Western blot
IV4D3 Inmunofluorescencia IV4D4 Neutralizacioacuten V DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Indice
v
91
91
91
94
94
95
96
100
102
102
103
105
106
107
109
119
V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH V21 Clonaje y expresioacuten
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His
implicaciones estructurales
V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH V31 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de
la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales
publicados hasta el momento V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la
proteiacutena F del MNVH V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del
ectodominio de la proteiacutena F del MNVH V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH
comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras
proteiacutenas de fusioacuten
V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
V41 Pool de sueros humanos V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos V43 Sueros policlonales dirigidos frente a vaccinias recombinantes V44 Sueros policlonales dirigidos frente a proteiacutena purificada
VI CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VII BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
VIII ANEXOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Indice
vi
ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Aring Amstrong
AcM Anticuerpo monoclonal
AEC Aminoetilcarbazol
AmpR Resistencia al antibioacutetico ampicilina
β-ME β-Mercaptoetanol
cRNA RNA complementario
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfoacutexido
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleoacutetido trifosfato
DO Densidad oacuteptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Etilen diamino tetracetato soacutedico
ELISA Ensayo inmunoenzimaacutetico
F Proteiacutena de fusioacuten
FTM- Proteiacutena de fusioacuten que carece de la regioacuten transmembrana
HEPES Aacutecido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfoacutenico
HN Hemaglutinina
Ig Inmunoglobulina
IMAC Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos
IPTG Isopropil-b-D-tiogalactoacutesido
ITR Infecciones del tracto respiratorio
Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
M Molaridad
mA Miliamperios
MES Aacutecido 2-(N-morfolino)etanosulfoacutenico
MNVA Metaneumovirus aviar
MNVH Metaneumovirus humano
mRNA RNA mensajero
MWCO Peso molecular corte del ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo
Abreviaturas
nm Nanoacutemetro
nt Nucleacuteotido
OPD O-fenildiamina
ORF Fase abierta de lectura
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
Pb Pares de bases
pdb del ingleacutes ldquoprotein data baserdquo
PIVH Virus de la parainfluenza humana
pEL Promotor tempranotardiacuteo
pI Punto isoeleacutectrico
PSA Persulfato amoacutenico
PBS Tampoacuten fosfato salino
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
RNA Aacutecido ribonucleico
RHA Regioacuten heptaacutedica A
RHB Regioacuten heptaacutedica B
rpm Revoluciones por minuto
RT Enzima retrotranscriptasa
SAB Seroalbuacutemina bovina
SC Suero de cerdo
SDS Dodecil sulfato soacutedico
STF Suero de ternera fetal
TEMED N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
Tris Tris(hidroximetil)-aminoetano
U Unidades de enzima
uff Unidades formadoras de foco
ufp Unidades formadoras de placa
UTR Regioacuten no traducible
V voltios
VNR Virus de la neumoniacutea de ratoacuten
VPI 5 Virus de la parainfluenza 5 antes virus del simio 5 (SV5)
vRNA RNA viral
vRB12 virus vaccinia carente del gen VP37
VRSH Virus respiratorio sincitial humano
Abreviaturas
vv-F virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH
vv-FTM- virus vaccinia recombinante que expresa un mutante de la proteiacutena F
del MNVH que carece de la regioacuten transmembrana
vv-FTM-6His virus vaccinia recombinante que expresa la FTM- con una cola de 6
histidinas
vTF73 virus vaccinia recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago
T7
6HB de sus siglas en ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
1
I INTRODUCCIOacuteN I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
El metaneumovirus humano (MNVH) aislado por primera vez en 2001 (van den
Hoogen et al 2001) se ha clasificado en el geacutenero Metaneumovirus subfamilia
Neumovirinae dentro de la familia Paramixoviridae
La familia Paramixoviridae pertenece al orden Mononegavirales Los virus de este
orden se caracterizan por (1) tener un genoma formado por una uacutenica moleacutecula de RNA
de polaridad negativa que se encuentra en el interior de una nucleocaacutepsida helicoidal que
le confiere resistencia a la digestioacuten por RNAsas y que ademaacutes contiene el complejo de
la polimerasa viral (2) el genoma se transcribe por la RNA polimerasa viral de forma
secuencial dando lugar a moleacuteculas de RNA mensajero (mRNAs) subgenoacutemico (3) el
ciclo replicativo es citoplasmaacutetico (4) la progenie viral adquiere una envuelta lipiacutedica que
procede de la membrana plasmaacutetica de la ceacutelula infectada y (5) la entrada en la ceacutelula
hospedadora es a traveacutes de la fusioacuten entre la membranas viral y celular
Basaacutendose en criterios morfoloacutegicos la organizacioacuten del genoma la actividad
bioloacutegica de las proteiacutenas y la relacioacuten de secuencia entre las distintas proteiacutenas
codificadas la familia Paramixoviridae se divide en dos subfamilias Paramixovirinae y
Neumovirinae (figura I1) La subfamilia Paramixovirinae contiene los geacuteneros Morbilivirus
(virus del sarampioacuten) Respirovirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 1 y 3 y virus
Sendai) Rubulavirus (virus de la Parainfluenza humana tipos 2 y 4 virus de la
Parainfluenza 5 tambieacuten conocido como virus del simio 5 y virus de las paperas)
Avulavirus (virus de la Enfermedad de Newcastle) y el geacutenero reciente Henipavirus (virus
Hendra y Nipah) Por su parte la subfamilia Neumovirinae contiene los geacuteneros
Neumovirus y Metaneumovirus La clasificacioacuten de los dos geacuteneros estaacute basada
principalmente en su constelacioacuten geacutenica Los metaneumovirus carecen de ciertas
proteiacutenas no estructurales y el orden de los genes difiere del de los neumovirus (Lamb et
al 2006)
El geacutenero Neumovirus contiene al virus respiratorio sincitial humano (VRSH)
humano y al virus de la neumoniacutea de ratoacuten (VNR) Hasta el descubrimiento del MNVH el
Introduccioacuten
2
neumovirus aviar (MNVA) era el uacutenico miembro del geacutenero Metaneumovirus Asiacute el
MNVH estaacute estrechamente relacionado con el metaneumovirus aviar (MNVA) y de forma
algo maacutes distante con el virus respiratorio sincitial humano (VRSH) (van den Hoogen et
al 2002)
I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
I21 Epidemiologiacutea
El metaneumovirus humano se aisloacute por primera vez en Holanda en junio de 2001
de aspirados nasofariacutengeos de nintildeos con infecciones del tracto respiratorio (ITR) Desde
su descubrimiento la infeccioacuten con este virus ha sido descrita en Europa (Biacchesi et al
2003 Freymouth et al 2003 Greensill et al 2003) en Ameacuterica (Esper et al 2003
Falsey et al 2003) en Asia (Ebihara et al 2003) en Africa (Madhi et al 2003) y en
Australia (Howe 2002) Actualmente se acepta que existen dos linajes geneacuteticos (ver
maacutes adelante) subdivididos en dos sublinajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) que producen
la misma patologiacutea
Las infecciones del tracto respiratorio de origen viral afectan a personas de todas
las edades pero su incidencia es mayor en nintildeos que en adultos En nintildeos menores de 2
antildeos el virus respiratorio sincitial (VRSH) es la causa principal de ITR En cuanto al
MNVH tambieacuten los nintildeos menores de 2 antildeos parecen ser los maacutes susceptibles a la
infeccioacuten Diversos estudios han mostrado que entre un 5 y un 15 de los nintildeos con ITR
son positivos para el MNVH (Peret et al 2002 Bastien et al 2003 Boivin et al 2003
Esper et al 2004) aunque hay estudios en los que estos porcentajes fueron mayores
Morbilivirus Sarampioacuten Paramixovirinae Respirovirus VPIH 1 y 3Sendai Rubulavirus VPIH 2 y 4 Paperas VPI5 Paramixoviridae Henipahvirus Hendra Nipah Avulavirus Enfermedad de Newcastle
Neumovirinae Neumovirus VRSH VNR Metaneumovirus MNVA MNVH
Figura I1 Diagrama esquemaacutetico de la familia paramixoviridae con especial referencia al metaneumovirus humano (MNVH) En cada geacutenero se indican sus miembros maacutes representativos VPIH 1 2 3 o 4 virus de la parainfluenza humana tipo 1 2 3 o 4 respectivamente VPI 5 virus de la parainfluenza 5 VRSH virus respiratorio sincitial humano VNR virus de la neumoniacutea de ratoacuten MNVA metaneumovirus aviar
Introduccioacuten
3
(Maggi et al 2003 Dollner et al 2004) De hecho la mayoriacutea de los humanos han
estado expuestos al MNVH antes de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001
Ebihara et al 2003) Ademaacutes las infecciones asintomaacuteticas en nintildeos de muy corta edad
parecen no ser comunes (Williams et al 2004) Los ancianos e inmunodeprimidos
debido a sus caracteriacutesticas inmunoloacutegicas son tambieacuten hueacutespedes comunes y en
algunos estudios aproximadamente el 3 de individuos de todas las edades con ITR
fueron positivos para el MNVH (van den Hoogen et al 2004b) Como en el caso de
VRSH las re-infecciones con MNVH son frecuentes aunque la inmunidad inducida por
exposiciones anteriores al virus parece reducir el grado de replicacioacuten del virus y los
siacutentomas de la enfermedad Dado el solapamiento estacional que se ha observado entre
las infecciones del MNVH con otros virus respiratorios se han descrito coinfecciones de
este virus con VRSH y con el virus de la gripe (Boivin et al 2002 Falsey et al 2003
Greensill et al 2003) Debido a esto los porcentajes de infecciones por el MNVH estaacuten
probablemente subestimados ya que la mayor parte de los estudios se realizaron en
muestras negativas para otros virus respiratorios
I22 Manifestaciones cliacutenicas y diagnoacutestico
Se ha descrito un amplio espectro de siacutentomas cliacutenicos asociados a la infeccioacuten
con el MNVH en pacientes de todas las edades comprendiendo desde ITR leves hasta
enfermedades severas que requirieron hospitalizacioacuten y que en alguacuten caso
desencadenaron la muerte En nintildeos menores de 5 antildeos la infeccioacuten puede venir
acompantildeada de fiebre congestioacuten nasal conjuntivitis faringitis y otitis media En general
los adultos infectados con el MNVH sufren los siacutentomas respiratorios de un resfriado
comuacuten como tos congestioacuten nasal ronquera dolor de garganta y a veces fiebre En
nintildeos hospitalizados individuos inmunocomprometidos y ancianos deacutebiles la enfermedad
puede llegar a ser maacutes severa con diagnoacutestico de rinofaringitis o incluso bronquitis y
neumoniacutea Este amplio espectro de siacutentomas hace a la enfermedad inducida por el
MNVH muy similar aunque en general levemente maacutes suave a la ocasionada por la
infeccioacuten con el VRSH (Boivin et al 2002 Viazov et al 2003) Sin embargo algunos
estudios han postulado que el desarrollo de asma podriacutea ser maacutes frecuente en nintildeos
hospitalizados infectados por MNVH que por VRSH (Freymouth et al 2003 Peiris et al
2003 Mullins et al 2004 Manoha et al 2007) Por uacuteltimo existen evidencias de que el
Introduccioacuten
4
MNVH podriacutea ser un agente causal en raras ocasiones del desarrollo de encefalopatiacuteas
(Schildgen et al 2005 Glaser et al 2006 Kaida et al 2006) Teniendo en cuenta que
este virus pertenece a la misma familia que el virus del sarampioacuten o el virus Nipah virus
que se sabe pueden infectar el sistema nervioso central es posible que el MNVH pudiera
cruzar en alguna ocasioacuten la barrera cerebro-espinal
El MNVH crece muy mal en cultivos celulares La replicacioacuten del virus in vitro estaacute
restringida a ceacutelulas Vero o LLC-MK2 (que por su origen primate no son de uso frecuente
en laboratorios de diagnoacutestico) a las que es necesario suplementar con tripsina (la cual
no se utiliza de manera rutinaria en diagnoacutestico) Ademaacutes la sensibilidad de las teacutecnicas
de cultivo celular para la deteccioacuten del MNVH en secreciones del tracto respiratorio es
baja Estas propiedades podriacutean explicar por queacute el virus no fue identificado hasta hace
poco tiempo Asiacute aunque actualmente existen anticuerpos monoclonales comerciales
para la inmunodeteccioacuten del virus (inmunofluorescencia ELISA) la mayor sensibilidad de
deteccioacuten en muestras cliacutenicas se alcanza por RT-PCR (Ebihara et al 2005 Landry et al
2005 Percivalle et al 2005) La RT-PCR en tiempo real es una variante del meacutetodo
anterior que para detectar al MNVH (Maertzdorf et al 2004 Scheltinga et al 2005)
I23 Tratamiento y prevencioacuten
El tratamiento de las enfermedades graves del tracto respiratorio requiere cuidados
paliativos considerables eliminacioacuten mecaacutenica de secreciones administracioacuten de oxiacutegeno
humidificado y en los casos maacutes severos asistencia respiratoria y ventilacioacuten mecaacutenica
La Ribavirina (un anaacutelogo de nucleoacutesido) ha mostrado actividad contra el MNVH in
vitro (Wyde et al 2003) En estudios in vivo (ratones BALBc) esta droga disminuyoacute
significativamente (hasta 5 logaritmos) la replicacioacuten viral en pulmones y redujo la
inflamacioacuten pulmonar a los 5 diacuteas post-infeccioacuten (Hamelin et al 2006) Por otra parte en
un caso cliacutenico publicado recientemente (Raza et al 2007) un paciente transplantado de
pulmoacuten con una neumoniacutea grave por MNVH pudo recuperarse de la infeccioacuten por el
tratamiento con ribavirina intravenosa Otro compuesto como el NMSO3 un liacutepido sialyl
sulfatado que parece tener una potente actividad viral contra VRSH en cultivos celulares
ha mostrado tener tambieacuten actividad anti-MNVH in vitro (Wyde et al 2004)
Introduccioacuten
5
Como medida profilaacutectica contra el VRSH en nintildeos pertenecientes a los grupos de
alto riesgo y en pacientes con transplante de meacutedula oacutesea en la actualidad se utiliza el
Synagis un anticuerpo monoclonal humanizado y neutralizante dirigido contra la proteiacutena
de fusioacuten del VRSH (Johnson et al 1997) En el caso del MNVH no hay un tratamiento
equivalente por el momento sin embargo hay estudios con anticuerpos neutralizantes que
han mostrado muy buenos resultados tanto in vitro como in vivo (Ulbrandt et al 2006)
El desarrollo de una vacuna segura y efectiva contra el MNVH se encuentra en
intenso estudio Asiacute se estaacuten evaluando virus atenuados que permitan la replicacioacuten del
virus vacunal en el tracto respiratorio para inducir una respuesta secretora IgA local dado
que eacutesta parece ofrecer una potente proteccioacuten contra virus respiratorios Varios
candidatos prometedores han sido probados en animales Por ejemplo un recombinante
del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen adicional el de la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos especiacuteficos que protegieron a ratones y primates
frente a un desafiacuteo con MNVH (Skiadopoulos et al 2004) En otro estudio un virus
quimeacuterico humanobovino de la parainfluenza tipo 3 que expresaba adicionalmente la
proteiacutena F del MNVH indujo anticuerpos neutralizantes contra ambos virus (Tang et al
2005) Por otro lado se describioacute que recombinantes del MNVH desarrollados por geneacutetica
reversa sin las proteiacutenas G yo SH retuvieron su inmunogeneicidad e indujeron proteccioacuten
en ratones y primates (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Estos resultados
indican que la proteiacutena de fusioacuten del MNVH es un determinante antigeacutenico importante
que media una respuesta de anticuerpos neutralizantes protectora contra el MNVH
Esta observacioacuten se ve reforzada por dos trabajos publicados recientemente en los
que la inoculacioacuten de proteiacutena F del MNVH purificada (utilizando diferentes adyuvantes)
en haacutemsteres o ratones dio lugar a una respuesta de anticuerpos neutralizantes que
protegieron a animales frente a un desafiacuteo con MNVH (Cseke et al 2007 Herfst et al
2007) Herfst y colaboradores observaron en este trabajo ademaacutes que los anticuerpos
inducidos por la proteiacutena F de un linaje protegieron a los animales frente al desafiacuteo con
cepas de linajes hoacutemologos o heteroacutelogos
Por uacuteltimo en ensayos de inmunizacioacuten llevados a cabo en macacos con
preparaciones del MNVH inactivado con formalina demostraron que este tipo de vacuna
no soacutelo falloacute en la induccioacuten de una respuesta inmune protectora sino que tambieacuten
Introduccioacuten
6
predispuso a los animales a una respuesta de hipersensibilidad despueacutes de un desafiacuteo
con MNVH (de Swart et al 2007) Estos resultados reproducen la experiencia que hubo
en los antildeos 60 con una vacuna de VRSH inactivado con formalina que se administroacute a
nintildeos de muy corta edad seronegativos para el VRSH Los nintildeos vacunados no soacutelo no
quedaron protegidos frente a una infeccioacuten por el VRSH si no que cuando se infectaron
de forma natural desarrollaron una enfermedad maacutes severa que los nintildeos controles sin
vacunar dando lugar a una tasa muy alta de hospitalizacioacuten e incluso a dos fallecimientos
(Kim et al 1969) Estas experiencias demuestran por tanto que la inmunopatologiacutea
asociada a las infecciones por el MNVH y el VRSH puede ser determinante en el
desarrollo de la enfermedad y que el desarrollo de vacunas frente a estos virus requiere
controles de seguridad muy estrictos
I3 Biologiacutea Molecular del MNVH I31Genoma viral
Como es caracteriacutestico en la familia Paramixoviridae el MNVH es un virus con
envuelta cuyo material geneacutetico es una moleacutecula de RNA de cadena sencilla y polaridad
negativa de aproximadamente 134 Kb que codifica 8 proteiacutenas virales la nucleoproteiacutena
(N) la fosfoproteiacutena (P) la proteiacutena matriz (M) la proteiacutena de fusioacuten (F) la proteiacutena M2 la
proteiacutena SH la proteiacutena de unioacuten al receptor (G) y la polimerasa viral (L) (van den Hoogen
et al 2002 Biacchesi et al 2003) Cada gen contiene una fase abierta de lectura (ORF)
a excepcioacuten del gen M2 que tiene dos tal como ha sido descrito para el virus respiratorio
sincitial humano y bovino el virus de la neumoniacutea de ratoacuten y el metaneumovirus aviar
(Samal et al 1991 Yu et al 1992)
Como sucede en el VRSH y otros virus RNA de cadena negativa no segmentada
la transcripcioacuten del MNVH empieza en un promotor situado en el extremo 3acute del genoma
La transcripcioacuten procede de manera secuencial dando lugar a un mRNA poliadenilado
para cada gen La replicacioacuten del RNA comprende la siacutentesis de una copia completa en
sentido positivo (complementaria) del genoma llamada antigenoma La transcripcioacuten y la
replicacioacuten del RNA tienen lugar en el citoplasma
Introduccioacuten
7
Cada gen comienza con una secuencia de 9 nucleoacutetidos denominada Gene Start
(GS) que determina el inicio de la transcripcioacuten La comparacioacuten de las secuencias no
codificantes de los genes del MNVH revelan una secuencia GS consenso para los genes
N P M F M2 y G GGGACAAAGU Las sentildeales de inicio para los genes L y SH de
MNVH son ligeramente diferentes (SH GGGAUAAAU L GAGACAAAU van den
Hoogen et al 2002)
Los genes acaban con una secuencia menos conservada de 9 nucleoacutetidos
denominada Gene End (GE) que dirige la terminacioacuten de la transcripcioacuten y la
poliadenilacioacuten del mRNA La secuencia GE de los genes en el metaneumovirus aviar
UAGUUAAUU (Randhawa et al 1996) se encuentra soacutelo en los genes L y F del MNVH
En los genes N P M M2 y SH se observan variantes con sustituciones de 1 a 3
nucleoacutetidos (van den Hoogen et al 2002)
Las regiones intergeacutenicas del MNVH variacutean en tamantildeo desde 23 hasta 209
nucleoacutetidos y no revelan identidad de secuencia significativa ni entre siacute ni con las regiones
intergeacutenicas de virus relacionados tales como el MNVA o el VRSH (van den Hoogen et
al 2002)
En los extremos 3acute y 5acute del genoma de los paramixovirus se encuentran las
regiones extrageacutenicas denominadas secuencias leader y trailer respectivamente que
tienen una cierta complementariedad probablemente porque cada una contiene elementos
baacutesicos del promotor viral (Mink et al 1991) Las secuencias 3acute leader de los
metaneumovirus humano y aviar tienen ambas 41 nucleoacutetidos y se observa identidad de
secuencia La secuencia trailer de 179 nucleoacutetidos muestra tambieacuten un alto grado de
similitud con el metaneumovirus aviar (van den Hoogen et al 2002)
En la figura I2 se muestra un esquema comparativo entre los genomas de un
Neumovirus (VRSH) y el MNVH En ella puede observarse que aunque existen ciertas
homologiacuteas en la organizacioacuten geacutenica hay tambieacuten diferencias en el orden de alguno de
los genes (F M2-1 M2-2) ademaacutes el metaneumovirus carece de las proteiacutenas no
estructurales NS1 y NS2
Introduccioacuten
8
Figura I2 Esquema comparativo de los genomas de un neumovirus (VRSH) y el metaneumovirus humano (MNVH) En el esquema puede apreciarse que el MNVH carece de las proteiacutenas no estructurales NS1 y NS2 y difiere en el orden de algunos de sus genes con respecto a los neumovirus
134 Kb N P LM SH GMNVH
N P L
M2-1 2
152 Kb VRSH
NS2 NS1
M2-12
M SH G
F
F
Como en el resto de los mononegavirales se cree que debe existir un gradiente
transcripcional de manera que los genes maacutes proacuteximos al promotor se transcribiraacuten con
maacutes frecuencia que los genes que estaacuten maacutes alejados Este mecanismo junto con la
presencia de las regiones intergeacutenicas actuariacutea como regulador de la transcripcioacuten (Kuo
et al 1996 Hardy et al 1999)
La replicacioacuten del genoma viral de los paramixovirus implica la siacutentesis de un
intermediario replicativo encapsidado de polaridad positiva el antigenoma (cRNA) que es
una copia exacta y complementaria del genoma completo (vRNA) El RNA viral se
sintetiza empleando como molde el antigenoma Ambos se encuentran siempre en forma
de nucleocaacutepsidas y su siacutentesis se inhibe cuando la nucleoproteiacutena es limitante (figura
I3)
TranscripcioacutenTraduccioacuten
5rsquoReplicacioacutencRNA 5rsquo 3rsquo
vRNA 3rsquo
Progenieviral
Virus entrante
Figura I3 Esquema del ciclo replicativo del MNVH Se representa la entrada del virus en el citoplasma celular donde el RNA viral (vRNA) se transcribe secuencialmente para dar lugar a los distintos mRNAs y posteriormente se replica a traveacutes de un RNA intermediario (cRNA) que es una copia completa de polaridad positiva del genoma del virus Por uacuteltimo las partiacuteculas virales se empaquetan y salen de la ceacutelula por gemacioacuten adquiriendo su envuelta de la membrana plasmaacutetica de la propia ceacutelula
Introduccioacuten
9
En lo que a identidad de secuencia se refiere el MNVH tipo A muestra un alto
porcentaje de identidad de secuencia aminoaciacutedica con el MNVH tipo B (85 a 97) en
casi todos sus genes (excepto los genes que codifican para las proteiacutenas SH y G 59 y
37 respectivamente) Si se lo compara dentro de la familia neumovirinae tiene una alta
identidad de secuencia (56 a 88) con el neumovirus aviar (MNVA C) en casi todos sus
genes (excepto en los genes que codifican las proteiacutenas SH y G) y menos del 50 de
identidad con el VRSH (Collins 2006) La tabla I1 indica el porcentaje de identidad en
secuencia de aminoaacutecidos entre cada proteiacutena del MNVH tipo A y el MNVH tipo B En la
misma tabla se muestra la relacioacuten entre el MNVH tipo A y los distintos metaneumovirus y
un neumovirus (el virus respiratorio sincitial humano)
I32 Variabilidad geneacutetica y antigeacutenica del MNVH
Una primera comparacioacuten de secuencias de aislados del MNVH puso de manifiesto
la existencia de dos linajes geneacuteticos (van den Hoogen et al 2002) Esto fue confirmado
posteriormente por otros grupos (Boivin et al 2002 Pelletier et al 2002 Peret et al
2002 Stockton et al 2002 Falsey et al 2003 Galiano et al 2006) Anaacutelisis filogeneacuteticos
obtenidos con parte de la secuencia de la proteiacutena F (n=84) y de la secuencia completa
de la proteiacutena de unioacuten al receptor G (n=35) muestran que ademaacutes cada linaje puede ser
dividido en dos sublinajes (van den Hoogen et al 2004a) donde la proteiacutena de fusioacuten
revela una identidad de secuencia aminoaciacutedica del 94-97 entre los dos linajes y la
proteiacutena G soacutelo el 30-35 de identidad Secuencias obtenidas del genoma completo de
virus de dos linajes diferentes muestran una identidad nucleotiacutedica promedio del 80-81
con un 92-93 de identidad entre cepas pertenecientes al mismo linaje En la figura I4
se muestran los aacuterboles filogeneacuteticos obtenidos al alinear la secuencia completa del gen
que codifica para la proteiacutena G o 451 nucleoacutetidos del gen que codifica para la proteiacutena F
de cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos (tomado
Tabla I1 Porcentaje de identidad de secuencia de aminoaacutecidos entre las secuencias del MNVH (A) y los virus indicados Los virus estaacuten indicados por orden decreciente en relacioacuten entre el MNVH linaje A y los virus indicados NDc secuencia no disponible MNVH B metaneumovirus humano linaje B MNVA C A y B metaneumovirus aviar tipo C A y B VRSH virus respiratorio sincitial humano
N P M SH G F M2-1 M2-2 L MNVH B 96 85 97 59 37 95 96 89 94 MNVA C 88 68 87 24 23 81 83 56 80 MNVA A 70 58 77 20 12 67 73 25 64 MNVA B 69 53 76 20 13 67 71 27 NDc VRSH 42 35 38 23 15 33 36 17 45
Introduccioacuten
10
de van den Hoogen BG 2004)
Como se comentoacute en el apartado I23 la proteiacutena F del MNVH es un determinante
importante de antigenicidad viral en animales sin embargo en el hueacutesped natural humano
esto no ha sido auacuten confirmado La observacioacuten de que la mayor diversidad geneacutetica
entre los dos genotipos ocurre en genes estructurales (G gt SH gtgt F) sugiere que los dos
genotipos podriacutean representar distintos serotipos Para esclarecer este planteamiento se
han utilizado modelos animales Skiadopoulus y colaboradores (Skiadopoulus etal
2004) utilizaron las cepas CAN98-75 y CAN97-83 las cuales representan los dos
genotipos del MNVH en haacutemsteres chimpanceacutes monos verdes africanos y macaco
rhesus En estos ensayos la infeccioacuten con un genotipo protegioacute a los animales contra la
infeccioacuten con virus del otro genotipo Ensayos de neutralizacioacuten cruzada reciacuteprocos con
sueros post-infeccioacuten demostraron que cada cepa indujo altos niveles de anticuerpos
neutralizantes contra cepas homoacutelogas y heteroacutelogas Maacutes auacuten la inmunizacioacuten con un
virus recombinante del virus de la parainfluenza humana tipo 1 que llevaba como gen
adicional el de la proteiacutena F del MNVH CAN97-83 indujo anticuerpos que neutralizaron a
virus de ambos linajes y protegieron a los animales en un desafiacuteo con cualquiera de las
dos cepas (Skiadopoulos et al 2004) Estos datos sugieren que despueacutes de la infeccioacuten
con un virus de un genotipo ocurre una inmunidad protectora cruzada y que la proteiacutena F
parece ser importante en el desarrollo de esta respuesta cruzada en el hueacutesped Por lo
tanto los dos genotipos podriacutean no representar distintos serotipos Esto es anaacutelogo a lo
que ocurre con el VRSH en el cual la infeccioacuten con un virus del subgrupo A o B despierta
Figura I4 Aacuterboles filogeneacuteticos de las proteiacutenas de fusioacuten F y unioacuten al receptor G de distintos aislados del MNVH Se seleccionaron cuatro aislados representativos para cada uno de los cuatro linajes geneacuteticos y se generaron los aacuterboles filogeneacuteticos con el gen G (derecha) y con 451 nucleoacutetidos del gen F (izquierda) Los nuacutemeros representan el porcentaje de identidad de aminoaacutecidos entre los aislados (tomado de van den Hoogen B G 2004)
60-70 gt 85
gt 85
gt 85
gt 85
30-35
60-70
B2B1
A1
A2
01
gt 99
gt 98 gt 99
gt 99
gt 99 gt 98
94-97
B2
B1
A2
A1
01
Introduccioacuten
11
una respuesta de anticuerpos especiacutefica tanto para virus homoacutelogos como heteroacutelogos
(Collins 2006)
Sin embargo van den Hoogen y colaboradores mostraron que el suero obtenido de
hurones infectados con un virus representativo de un genotipo no pudo neutralizar a un
virus de un genotipo heteroacutelogo in vitro sugiriendo que los dos genotipos son de hecho
distintos serotipos (van den Hoogen et al 2004a)
I33 Proteiacutenas virales
No hay todaviacutea estudios relevantes sobre la funcionalidad de la mayoriacutea de las
proteiacutenas del MNVH Diversos estudios entre otros de microscopiacutea electroacutenica denotan
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus y en particular con los
de la subfamilia neumovirinae Debido a esto cabe suponer que las proteiacutenas del MNVH
desempentildeen las mismas funciones que sus homoacutelogas en los paramixovirus Como tal
las partiacuteculas del MNVH tienen una nucleocaacutepsida cubierta por una envoltura lipoproteica
que el virus adquiere al salir de la ceacutelula por gemacioacuten (figura I5) Asiacute mismo la
nucleocaacutepsida estaacute compuesta por el RNA viral asociado con la nucleoproteiacutena (N) la
fosfoproteiacutena (P) un factor antiterminador de la transcripcioacuten (M2-1) y la polimerasa (L)
La proteiacutena matriz (M) debe formar una cubierta en la cara interna de la envuelta del
virioacuten
La envuelta contiene ademaacutes tres glicoproteiacutenas la proteiacutena de unioacuten al receptor o
proteiacutena G la proteiacutena de fusioacuten o proteiacutena F mediadora de la fusioacuten de la membrana
viral y celular y una pequentildea proteiacutena hidrofoacutebica o proteiacutena SH que en el VPI5 y el
VRSH pareceriacutea estar implicada en la inhibicioacuten de apoptosis mediada por el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α) (He et al 2001 Lin et al 2003 Fuentes et al 2007) Estas
glicoproteiacutenas estaacuten organizadas independientemente en espiacuteculas que se visualizan
como proyecciones cortas (13-17nm) al microscopio electroacutenico
A continuacioacuten se indican brevemente las principales caracteriacutesticas que se
conocen hasta el momento de las 9 proteiacutenas codificadas por el genoma del MNVH
Introduccioacuten
12
Proteiacutena SH es aproximadamente tres veces maacutes larga (177-183 aminoaacutecidos)
que la proteiacutena homoacuteloga en VRSH (64-65 aminoaacutecidos) y por analogiacutea con eacutesta se
predice que se inserta en la membrana plasmaacutetica por una regioacuten hidrofoacutebica localizada
en su extremo amino-terminal (van den Hoogen et al 2002 Biacchesi et al 2003)
Aunque su funcioacuten no ha sido auacuten determinada la delecioacuten de esta proteiacutena no tiene un
efecto apreciable en la replicacioacuten del MNVH in vitro en haacutemsteres o en monos verdes
africanos (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005) Al igual que en el caso del VRSH
esta proteiacutena no indujo anticuerpos neutralizantes o inmunidad contra el MNVH en
haacutemsteres inoculados con un virus VPIH tipo 1 recombinante que expresaba dicha
proteiacutena (Skiadopoulos et al 2006)
Proteiacutena matriz (M) la proteiacutena matriz tiene un tamantildeo de 254 aminoaacutecidos al
igual que en el resto de los metaneumovirus Muestra una alta identidad de secuencia con
los metaneumovirus aviares (76-87) maacutes baja con los neumovirus VRSH y VNR (37 y
38) y menos del 10 con la proteiacutena M del resto de paramixovirus (van den Hoogen et
al 2002) En el caso de VRSH esta proteiacutena inhibe la transcripcioacuten del genoma antes de
que se empaquete en la partiacutecula viral y favorece la asociacioacuten entre la nucleocaacutepsida y la
envuelta naciente durante la morfogeacutenesis del virus (Teng et al 1998) pero en el caso
del MNVH no hay por el momento ensayos que definan su funcioacuten
Nucleoproteiacutena (N) proteiacutena de 394 aminoaacutecidos Su tamantildeo es similar al de los
Figura I5 Representacioacuten esquemaacutetica de la estructura del virioacuten del MNVH Se sentildeala la localizacioacuten de las distintas proteiacutenas que componen el virioacuten
Proteiacutena de fusioacuten (F)
Envuelta lipiacutedica
Proteiacutena SHProteiacutena de unioacuten (G)
Proteiacutena matriz Nucleocaacutepsida
vRNA Polimerasa (L) Fosfoproteiacutena
(P) Nucleoproteiacutena (N) y proteiacutena (M2-1)
Introduccioacuten
13
neumovirus y metaneumovirus (391-394 aminoaacutecidos) y maacutes pequentildea que en otros
paramixovirus En el VRSH se localiza junto con las proteiacutenas virales P M2-1 (o 22k) y
probablemente L en cuerpos de inclusioacuten citoplasmaacuteticos observados en ceacutelulas
infectadas por el virus o transfectadas con plaacutesmidos que expresan las proteiacutenas N y P
(Garcia et al 1993) La nucleoproteiacutena se une al RNA genoacutemico de los paramixovirus
formando las ribonucleoproteiacutenas (RNPs) que son el molde funcional para la polimerasa
viral En el caso del MNVH se supone que la proteiacutena N tendraacute una funcioacuten similar
Fosfoproteiacutena (P) el segundo marco de lectura abierto en el genoma del MNVH
codifica para una proteiacutena de 294 aminoaacutecidos que muestra una identidad de secuencia
del 68 con el MNVA tipo C y soacutelo del 35 con la proteiacutena P del VRSH Como en el caso
de esta uacuteltima la proteiacutena P del MNVH carece de residuos cisteiacutena Una regioacuten de alta
similitud entre todos los neumovirus (aminoaacutecidos 185-241) que parece jugar un papel
importante en la siacutentesis de RNA o en mantener la integridad de la estructura del complejo
nucleocaacutepsida aparentemente por representar el dominio de interaccioacuten con la
polimerasa (Ling et al 1995) se encuentra tambieacuten en la proteiacutena P del MNVH
mostrando una similitud de 93-100 con los metaneumovirus aviares y del 81 con el
VRSH (van den Hoogen et al 2002) En el caso del VRSH la proteiacutena P es un cofactor
esencial de la RNA polimerasa y cabe esperar que en el caso del MNVH esta proteiacutena
tenga un papel equivalente
Polimerasa (L) por analogiacutea con otros virus de cadena RNA negativa el uacuteltimo
marco de lectura abierto en el genoma del MNVH codifica para la RNA polimerasa RNA
dependiente (L 2005 aminoaacutecidos) componente de la maquinaria de transcripcioacuten y
replicacioacuten viral Aunque en su totalidad la identidad de secuencia es baja (64 para el
MNVA tipo A 45 para el VRSH y entre el 13-15 con los otros paramixovirus) esta
proteiacutena muestra cuatro motivos altamente conservados (100 con los neumovirus) que
se saben esenciales para la funcioacuten polimerasa (van den Hoogen et al 2002)
Proteiacutena M2-1 El gen M2 es uacutenico entre los miembros de la subfamilia
Neumovirinae y dos marcos abiertos de lectura solapados han sido observados en todos
los neumovirus El primero representa a la proteiacutena M2-1 y codifica para una proteiacutena de
187 aminoaacutecidos que contiene 3 residuos cisteiacutena conservados entre todos los
neumovirus En el caso del VRSH la proteiacutena M2-1 (o 22K) colocaliza con las proteiacutena N
Introduccioacuten
14
y P en los cuerpos de inclusioacuten citoplaacutesmicos (Garcia-Barreno et al 1996) y funciona
como un factor antiterminador de la transcripcioacuten que favorece la formacioacuten de mRNAs
completos (Collins et al 1996) En el MNVH parece tener la misma funcioacuten (Buchholz et
al 2005) Sin embargo una diferencia notable podriacutea ser que mientras la proteiacutena M2-1
es esencial para la viabilidad del VRSH (Collins et al 1995) recombinantes del MNVH
en los cuales se silencioacute el gen M2-1 replicaron in vitro con una eficiencia muy similar al
virus salvaje (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena M2-2 Esta proteiacutena de 71 aminoaacutecidos parece actuar como en el caso
de VRSH como factor regulador implicado en el equilibrio entre la replicacioacuten y la
transcripcioacuten del RNA (Buchholz et al 2005)
Proteiacutena G La proteiacutena G del MNVH (219 a 236 aminoaacutecidos seguacuten los aislados)
es maacutes corta que la proteiacutena homoacuteloga en el VRSH (289-299 aminoaacutecidos) Es una
glicoproteiacutena de tipo II que tiene un alto contenido de residuos serina y treonina (30-34)
los cuales son potenciales aceptores de O-glicosilaciones un alto contenido de residuos
prolina (7-85) y de 3 a 6 sitios potenciales de N-glicosilacioacuten (van den Hoogen et al
2002) No hay estudios al respecto todaviacutea pero se cree que como su homoacuteloga en los
neumovirus la proteiacutena G no tendraacute actividad neuroaminidasa ni hemaglutinina
La funcioacuten de la proteiacutena G del MNVH no se conoce totalmente pero se ha
propuesto que funciona como proteiacutena de unioacuten al receptor Aunque en el caso del MNVH
no hay estudios en este sentido en el VRSH diversos estudios muestran una unioacuten entre
la proteiacutena G del VRSH y glicosaminoglicanos de la superficie celular (Hallak et al 2000
Martinez et al 2000 Escribano-Romero et al 2004)
Experimentos realizados con un mutante natural en el que se delecionoacute
espontaacuteneamente el gen G y el SH o con virus recombinantes construidos por geneacutetica
revesa mostraron que la proteiacutena G del VRSH es dispensable para la replicacioacuten en
ceacutelulas Vero pero esencial para una replicacioacuten eficiente tanto en ceacutelulas HEp-2 como in
vivo (Collins 2006) En el caso del MNVH se ha observado que un virus recombinante al
cual se le habiacutea delecionado la proteiacutena G (solo o en combinacioacuten con la proteiacutena SH) fue
capaz de replicar in vitro Aunque el mutante ∆G del MNVH es atenuado con respecto al
tipo salvaje en haacutemsteres y monos verdes africanos es competente para replicacioacuten
Introduccioacuten
15
demostrando sin ambiguumledad que la proteiacutena G del MNVH no es esencial in vivo o in vitro
(Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005)
En el caso VRSH el 15-20 de la proteiacutena que se sintetiza en la ceacutelula infectada
se secreta al medio exterior en forma soluble (Gs) La forma Gs se produce en la ceacutelula
infectada por el VRSH debido al comienzo de la traduccioacuten en un segundo codoacuten de
iniciacioacuten en fase con el primero lo que produce una proteiacutena sin los primeros 48
aminoaacutecidos de la proteiacutena asociada a la membrana (Gm) (Roberts et al 1994) La
funcioacuten de esta forma soluble de la proteiacutena G del VRSH es auacuten desconocida aunque se
piensa que podriacutea capturar anticuerpos neutralizantes impidiendo la neutralizacioacuten del
VRSH o que podriacutea tener un papel modulador de la respuesta inmune yo inflamatoria
Para el MNVH no se ha descrito auacuten una forma soluble de la proteiacutena G sin embargo el
anaacutelisis de la secuencia de aminoaacutecidos sugiere que esta especie proteica no existe
Proteiacutena F Dado que la proteiacutena F del MNVH es el objeto de estudio de esta tesis
a continuacioacuten y de forma maacutes detallada se describen sus caracteriacutesticas
I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
La proteiacutena de fusioacuten (F) de los paramixovirus desempentildea un papel primordial en la
penetracioacuten viral mediando la fusioacuten entre las membranas viral y celular Este evento
ocurre a un pH neutro Como consecuencia de esta fusioacuten la nucleocaacutepsida es liberada en
el citoplasma de la ceacutelula hueacutesped Maacutes tarde en la infeccioacuten la proteiacutena F expresada en
la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas infectadas facilita tambieacuten la fusioacuten con ceacutelulas
adyacentes dando lugar a la formacioacuten de sincitios ceacutelulas gigantes multinucleadas
(Walsh et al 1983) Este efecto citopaacutetico puede llevar a la necrosis tisular in vivo y
puede explicarse como un mecanismo de expansioacuten viral
La proteiacutena F de los paramixovirus es un homotriacutemero (Russell et al 1994 Calder
et al 2000) que se sintetiza como un precursor inactivo (F0) Para ser bioloacutegicamente
activa debe procesarse proteoliacuteticamente por proteasas de la ceacutelula hueacutesped El corte
proteoliacutetico produce dos cadenas F1 y F2 que forman asiacute una proteiacutena bioloacutegicamente
activa constituida por las dos cadenas unidas por un puente disulfuro (figura I6)
Introduccioacuten
16
El gen que codifica la proteiacutena F del MNVH se localiza adyacente al gen que
codifica la proteiacutena M lo cual es caracteriacutestico de los miembros del geacutenero
metaneumovirus El gen F codifica para una proteiacutena de 539 aminoaacutecidos y un anaacutelisis
de su secuencia muestra una identidad del 81 con el MNVA C 67 con MNVA A y B
33-38 con otros neumovirus (33 con el VRSH) y soacutelo un 10-18 con otros
paramixovirus (van den Hoogen et al 2002)
A pesar del porcentaje relativamente bajo de identidad de secuencia con otros
paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena
de fusioacuten (figura I6) de acuerdo a lo descrito para las proteiacutenas F de los miembros de la
familia Paramixoviridae (Morrison 1988) La proteiacutena inmadura F0 contiene tres regiones
hidrofoacutebicas una en el extremo N-terminal que actuacutea como peacuteptido sentildeal para la
Figura I6 Esquema comparativo de la proteiacutena de fusioacuten F del MNVH y el VRSH (F y FTM-) En la parte superior y media se muestra un esquema de las proteiacutenas F del MNVH y VRSH con los dominios caracteriacutesticos de una proteiacutena de fusioacuten de un paramixovirus En la parte inferior se muestra un esquema del mutante de la proteiacutena F del VRSH al que se le han delecionado los uacuteltimos 50 aminoaacutecidos (FTM-) Las flechas indican los sitios de corte en la proteiacutena El sitio I (RARR) y II (KKRKRR) en VRSH y el sitio uacutenico equivalente a este uacuteltimo (RQSR) en MNVH S-S puente disulfuro PS PF y TM Peacuteptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente RHA y RHB regioacuten heptaacutedica A y B Sitios de N-glicosilacioacuten Residuos cisteiacutena
F1F2
MNVH(539 aa)PS PF RHA RHB TM
S-S RQSR
S-S
(574 aa)
RARR KKRKRR
PS PF RHA RHB TM
VRSH
S-S
(524 aa) PS PF RHA RHB TM
FTM- VRSH
Introduccioacuten
17
translocacioacuten al retiacuteculo endoplaacutesmico durante sus siacutentesis otra regioacuten cerca del extremo
carboxi-terminal (C-terminal) denominada dominio transmembrana (TM) y que sirve para
que la proteiacutena se ancle a la membrana y una tercera regioacuten en el extremo N-terminal de
la cadena F1 denominada peacuteptido de fusioacuten que se inserta en la membrana celular
durante el proceso de fusioacuten de membranas Ademaacutes adyacentes al peacuteptido de fusioacuten y a
la regioacuten transmembrana existen dos regiones heptaacutedicas (RHA y RHB) Las regiones
heptaacutedicas RHA y RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la
estabilizacioacuten de la estructura que adopta la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de
membranas (Lambert et al 1996)
En la zona central de la cadena F1 se encuentra una zona que contiene 12
residuos de cisteiacutena muy cercanos entre siacute 7 de los cuales se conservan en todos los
paramixovirus En la cadena F2 existen dos residuos cisteiacutena de los cuales uno se
encuentra en todos los paramixovirus Como se observa en el alineamiento de las
proteiacutenas F del virus respiratorio sincitial humano y el MNVH (figura I7) los 14 residuos de
cisteiacutena estaacuten conservados en ambos virus Por otro lado esta proteiacutena tiene 3 sitios de
N-glicosilacioacuten dos de los cuales se encuentran tambieacuten en los metaneumovirus aviares
sin embargo ninguno de estos sitios coincide con los sitios de glicosilacioacuten del virus
respiratorio sincitial humano
Como se mencionoacute anteriormente el MNVH estaacute relacionado geneacuteticamente con el
VRSH y produce patologiacuteas similares Sin embargo aunque hay analogiacuteas entre ambos
virus existen tambieacuten importantes diferencias en las propiedades de algunas de sus
proteiacutenas
Una de estas diferencias es en la forma de procesamiento proteoliacutetico de la
glicoproteiacutena F de ambos virus La glicoproteiacutena F del VRSH se sintetiza como un
precursor de 574 aminoaacutecidos que posteriormente experimenta un doble procesamiento
proteoliacutetico por furina para generar las cadenas F1 y F2 (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001) las
cuales se mantienen unidas covalentemente por un puente disulfuro La proteiacutena F del
VRSH forma un homotriacutemero y el procesamiento de los monoacutemeros del triacutemero es un
proceso esencial para su activacioacuten y facilitar la fusioacuten de las membranas viral y celular en
el inicio del ciclo infectivo Este doble procesamiento proteoliacutetico es uacutenico de los virus
respiratorios sincitiales humano y bovino En cambio los metaneumorivus como el resto
Introduccioacuten
18
Figura I7 Alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten del MNVH y del VRSH Sobre la secuencia se indica con fondo amarillo las regiones hidrofoacutebicas peptido sentildeal peacuteptido de fusioacuten y regioacuten transmembrana respectivamente Con fondo verde los sitios de N-glicosilacioacuten Sobre fondo fucsia las ciacutesteiacutenas compartidas entre ambas secuencias Sobre fondo celeste se indican los sitios de corte proteoliacutetico Con letras en azul se indican las regiones heptaacutedicas A y B respectivamente Como consenso se indica con la letra correspondiente cuando hay identidad y con un punto cuando no la hay Los nuacutemeros a izquierda y derecha indican el nuacutemero en la secuencia de aminoaacutecidos y el guioacuten (-) indica un espacio insertado para un mejor alineamiento
de los paramixovirus tienen un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico en la proteiacutena F (figura
I6) Los dos sitios de corte en el precursor inactivo (F0) del VRSH son sitio I (106-RARR-
109) y sitio II (131-KKRKRR-136) (Gonzaacutelez-Reyes et al 2001 Zimmer et al 2001) Es
posible que el peacuteptido que une estos dos sitios forme un bucle expuesto en la estructura
tridimensional de la proteiacutena haciendo a ambos sitios accesibles a la proteasa celular En
la proteiacutena F del MNVH hay un uacutenico sitio de corte proteoliacutetico precedido por la secuencia
RQSR que no es reconocible por furina (la secuencia consenso de furina es R-X-KR-R)
por lo que esta proteiacutena debe procesarse por alguna otra proteasa celular o extracelular
En este sentido es significativo que mientras el VRSH no requiere tripsina en el medio de
cultivo para propagarse en cultivos celulares el MNVH es dependiente de tripsina para
multiplicarse en cultivos de ceacutelulas
HMPV 1 ---------M SWKVVIIISL LITPQHGLKE SYLEESCSTI TEGYLSVLRT GWYTNVFTLE 51 HRSV 1 MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 Consenso E CS GYLSLRT GWYTVTE HMPV 52 VGDVENLTC- -TDGP-SLIK TELDLTKSAL RELKTVSADQ LAREEQ---- ---------- 94 HRSV 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLMK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAANNRARRE LPRFMNYTLN 120 Consenso C TDLK ELDKA EL A HMPV 95 --------IE NPRQSRFVLG AIALGVATAA AVTAGIAIAK TIRLESEVNA IKGALKQTNE 146 HRSV 121 NTKKTNVTLS KKRKRRF-LG -FLLGVG-SA -IASGTAVSK VLHLEGEVNK IKSALLSTNK 176 Consenso RRFLG LGVA GAK LEEVN IKALTN HMPV 147 AVSTLGNGVR VLATAVRELK EFVSKNLTSA INRNKCDIAD LKMAVSFSQF NRRFLNVVRQ 206 HRSV 177 AVVSLSNGVS VLTSKVLDLK NYIDKQLLPI VNKQSCRISN IETVIEFQQK NNRLLEITRE 236 Consenso AVLNGV VLVLK KL NCI FQ NRLR HMPV 207 FSDNAGITPA ISLDLMTDAE LARAVSYMPT SAGQIKLMLE NRAMVRRKGF GILIGVYGSS 266 HRSV 237 FSVNAGVTTP VSTYMLTNSE LLSLINDMPI TNDQKKLMSN NVQIVRQQSY SIMSIIKEEV 296 Consenso FSNAGT STE LMP QKLM NVR I HMPV 267 VIYMVQLPIF GVIDTPCWII KAAPSCSE-- KNGNYACLLR EDQGWYCKNA GSTVYYPNEK 324 HRSV 297 LAYVVQLPLY GVIDTPCWKL HTSPLCTTNT KEGSNICLTR TDRGWYCDNA GSVSFFPQAE 356 Consenso YVQLP GGIDTPCW PC KGCLR DGWYCNA GSP HMPV 325 DCETRGDHVF CDTAAGINVA EQSRECNINI STTNYPCKVS TGRHPISMVA LSPLGALVAC 384 HRSV 357 TCKVQSNRVF CDTMNSLTLP SEVNLCNVDI FNPKYDCKIM TSKTDVSSSV ITSLGAIVSC 416 Consenso CVF CDT CNI YCK TS LGAVC HMPV 385 YKGVSCSIGS NWVGIIKQLP KGCSYITNQD ADTVTIDNTV YQLSKVEGEQ HVIKGRPVSS 444 HRSV 417 YGKTKCTASN KNRGIIKTFS NGCDYVSNKG VDTVSVGNTL YYVNKQEGKS LYVKGEPIIN 476 Consenso YC GIIK GCYN DTVNT YKEG KGP HMPV 445 SFDPIKFPED QFNVALDQVF ESIENSQALV DQSNKILNSA E--KGNTGFI IVVILVAVLG 502 HRSV 477 FYDPLVFPSD EFDASISQVN EKINQSLAFI RKSDELLHNV NAGKSTTNIM ITTIIIVIIV 536 Consenso DPFPD FQV EISA SL KT II HMPV 503 LTMISVSIII IIKKTRKPTG ---APPELNG VTNGGFIPHN 539 HRSV 537 ILLSLIAVGL LLYCKARSTP VTLSKDQLSG INNIAFSN-- 574 Consenso T LG NF
Introduccioacuten
19
En el antildeo 1999 en nuestro laboratorio se desarrolloacute un mutante de la proteiacutena F del
VRSH que careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999 figura I6)
Esta forma soluble de la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena
salvaje en cuanto a procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con
anticuerpos monoclonales (AcMs Calder et al 2000) sin embargo es una forma mucho
maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al sobrenadante de ceacutelulas
infectadas con los virus vaccinia recombinantes que la expresan
I5 Proceso de fusioacuten de membranas
La fusioacuten de las membranas viral y celular es una etapa clave en el proceso
infectivo de los virus Muchos estudios sugieren que las proteiacutenas virales implicadas en
este proceso son capaces de cambiar de una conformacioacuten de un estado metaestable
pre-activo a otra de mayor estabilidad correspondiente al estado post-activo y que este
cambio es esencial para que se produzca la fusioacuten de membranas (Lamb 1993
Hernandez et al 1996 Chan et al 1998 Skehel et al 1998 Weissenhorn et al 1999)
Para muchos virus como el de la influenza el virus de la estomatitis vesicular o el
virus del bosque Semliki este proceso de fusioacuten ocurre en el medio aciacutedico de los
endosomas celulares donde el pH aacutecido dispara un cambio de conformacioacuten en la
proteiacutena de fusioacuten lo cual lleva a la fusioacuten de membranas Para diversos virus incluyendo
los paramixovirus y los retrovirus se ha establecido que la fusioacuten ocurre en la superficie
de la ceacutelula a un pH neutro (Hernandez et al 1996 Dutch et al 2000 Skehel et al
2000) A pesar de esto existen evidencias que indican que los virus podriacutean penetrar en
la ceacutelula utilizando maacutes de una viacutea de entrada Asiacute en casos como el del virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV por sus siglas en ingleacutes ldquoNewcastle disease virusrdquo) o el
virus de la inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) parece que podriacutean ser ademaacutes
internalizados en la ceacutelula por una viacutea endociacutetica pH-dependiente (Daecke et al 2005
Cantiacuten et al 2007)
Las proteiacutenas F de los paramixovirus pertenecen a las proteiacutenas virales de fusioacuten
tipo I de las cuales la proteiacutena Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es el miembro
Introduccioacuten
20
mejor estudiado Las proteiacutenas de clase I incluyen tambieacuten a la gp160Env del VIH-1 la
proteiacutena S de los coronavirus y la proteiacutena G del filovirus Ebola Como es de esperar
todas estas proteiacutenas tienen caracteriacutesticas en comuacuten Todas contienen muacuteltiples sitos de
glicosilacioacuten deben ser trimeacutericas y sufrir un procesamiento proteoliacutetico para ser
fusogeacutenicamente activas Seguido de este procesamiento la subunidad que contiene el
dominio transmembrana tiene ademaacutes en su recientemente generada regioacuten N-terminal
una regioacuten extremadamente hidrofoacutebica denominada peacuteptido de fusioacuten
Ademaacutes todas estas proteiacutenas tienen unas secuencias heptaacutedicas repetitivas
cercanas al peacuteptido de fusioacuten (RHA) y a la regioacuten transmembrana (RHB) Se ha
demostrado que estas regiones forman un complejo muy estable (6HB de sus siglas en
ingleacutes ldquosix helix bundlerdquo) muy similar al inducido en la proteiacutena HA a bajo pH en el cual la
RHA forma un triacutemero de heacutelices α enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por
tres heacutelices de la RHB (figura I8) (Chan et al 1997 Weissenhorn et al 1998 Zhao et al
2000) La similitud de estas estructuras en todos los paramixovirus sugiere fuertemente
un mecanismo de fusioacuten conservado probablemente con una proteiacutena de fusioacuten ancestral
relacionada a todas ellas (Skehel et al 1998 Baker et al 1999)
Figura I8 Estructura del core de alguna de las proteiacutenas de fusioacuten viral de tipo I Las cadenas estaacuten coloreadas en degradeacute desde el azul (N-terminal) hasta el rojo (C-terminal) Tomada de Lamb et al 2007
Introduccioacuten
21
En el antildeo 2001 se determinoacute la estructura cristalina para la mayor parte de la
proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Chen et al 2001a Chen et
al 2001b) y en 2005 la estructura casi completa de la proteiacutena F del virus de la
parainfluenza humana tipo 3 (VPIH3) (Yin et al 2005) Estas estructuras revelaron un
triacutemero con unas regiones bien diferenciadas a las que se llamoacute cabeza cuello y tallo
(figura I9) En un primer momento se creyoacute que estas proteiacutenas estaban en una
conformacioacuten preactiva pero la interpretacioacuten de datos fue complicada por la proteoacutelisis
de la proteiacutena en el cristal de la proteiacutena F de NDV Ademaacutes la estructura de la proteiacutena F
del VPIH3 al que se le habiacutea mutado el sitio de corte para evitar la activacioacuten de la
proteiacutena y tratar asiacute de aislar la estructura pre-fusioacuten conteniacutea la organizacioacuten de heacutelices
6HB que se pensaba ya entonces que por su termoestabilidad debiacutea corresponder con su
estado post-fusioacuten Se planteoacute entonces que aunque el procesamiento proteoliacutetico de la
proteiacutena es necesario para su activacioacuten y funcionalidad este podriacutea no ser
imprescindible para el plegamiento a un estado post-fusioacuten Este trabajo indicaba tambieacuten
que tal vez la regioacuten transmembrana de la que esta proteiacutena careciacutea fuera necesaria
para mantener y estabilizar a la proteiacutena es su conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten
La estructura atoacutemica de la proteiacutena F del VPI5 en la que se propone su
conformacioacuten metaestable pre-fusioacuten se determinoacute en el 2006 (figura I9) (Yin et al
2006) Para esta determinacioacuten se utilizoacute una forma de la proteiacutena F a la que se le eliminoacute
la regioacuten transmembrana para obtenerla de manera soluble y facilitar asiacute su purificacioacuten
Para su estabilizacioacuten fue necesaria la adicioacuten de un dominio trimeacuterico soluble (GCNt)
que suplanta al dominio transmembrana La proteiacutena trimeacuterica obtenida tiene una gran
cabeza globular adyacente a un tallo formado por 3 heacutelices alfa de las RHB de las 3
subunidades orientando la cabeza hacia fuera de la membrana viral La cabeza contiene
3 dominios (DI-III figura I9) por subunidad extendidas a traveacutes de un eje trimeacuterico
manteniendo las subunidades en estrecho contacto Una gran cavidad estaacute presente en la
base de la cabeza con el extremo y los lados formados por DI y DII El dominio DIII cubre
la parte superior de la cabeza y al peacuteptido de fusioacuten (que no habiacutea podido ser resuelto en
las estructuras del NDV y VPIH-3) que queda protegido del solvente entre este dominio y
el DII de otra subunidad El sitio de procesamiento proteoliacuteticoactivacioacuten estaacute adyacente
al peacuteptido de fusioacuten proyectaacutendose en los veacutertices de la estructura trimeacuterica
Introduccioacuten
22
Figura I9 Estructura de las proteiacutenas F del VPI5 y VPIH3 en los propuestos estados pre- y post-fusioacuten respectivamente Cada dominio (DI DII y DIII) se representan en ambos modelos con el mismo color El peacuteptido de fusioacuten en azul en la estructura de la proteiacutena F del VPI5 no pudo ser determinado en la estructura de la proteiacutena del VPIH3 En la parte superior se muestra la estructura del triacutemero y la parte inferior la estructura del monoacutemero correspondiente Tomada de Lamb et al 2007
VPIH3
VPIH3
VPI5
VPI5
Para tratar de correlacionar la funcioacuten bioloacutegica de la proteiacutena F con su estructura
molecular una versioacuten soluble de la proteiacutena F del VPI5 (F-GCNt) en su estado pre-fusioacuten
fue inducida a alcanzar su forma post-fusioacuten (Connolly et al 2006) En este trabajo se
observoacute que el corte con tripsina (procesamiento en el sitio de corte de la proteiacutena F)
induciacutea unos cambios conformacionales locales pero que este procesamiento era
insuficiente para permitir una asociacioacuten con liposomas Solo se observoacute una asociacioacuten a
liposomas de la proteiacutena proteoliacuteticamente procesada cuando dicho procesamiento se
Introduccioacuten
23
realizoacute en presencia de calor Esto sugiere que aunque la proteiacutena esteacute procesada y por
tanto en un estado funcional pre-activo la exposicioacuten del peacuteptido de fusioacuten no ocurre
hasta que el calor dispara un cambio conformacional global en la proteiacutena No se sabe
cuaacutel es el evento o proceso que genera este cambio conformacional en una infeccioacuten real
Existe un modelo para la fusioacuten mediada por la proteiacutena F del virus de la
Enfermedad de Newcastle en el cual se propone que la proteiacutena de unioacuten al receptor del
virus (HN) cambia su conformacioacuten oligomeacuterica al unirse al receptor (aacutecido siaacutelico)
originando un segundo sitio de unioacuten al aacutecido siaacutelico (Zaitsev et al 2004) Este proceso
podriacutea inducir tambieacuten un cambio conformacional en la proteiacutena F que diera lugar a la
fusioacuten de las membranas viral y celular Sin embargo el hecho de que los virus VPI5 y
VPIH3 (virus de la misma subfamilia paramixovirinae) no tengan este segundo sitio de
unioacuten al aacutecido siaacutelico (Lawrence et al 2004 Yuan et al 2005) hace pensar que eacuteste no
sea un proceso general
Por otra parte en la subfamilia neumovirinae a la que pertenecen el MNVH y el
VRSH se han rescatado virus mutantes naturales yu originados por geneacutetica reversa sin
la proteiacutena G (homoacuteloga a la proteiacutena HN) capaces de replicarse in vitro con una
eficiencia similar a la del tipo salvaje (Biacchesi et al 2004 Biacchesi et al 2005 Collins
2006) Debe existir por tanto en esta subfamilia un mecanismo diferente por el cual se
dispare en la proteiacutena F el cambio conformacional necesario para el proceso de fusioacuten
I51 Modelo del proceso de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus
Despueacutes de la activacioacuten de la proteiacutena de fusioacuten y antes de la estabilizacioacuten
mediante la formacioacuten del 6HB presente en el estado post-fusioacuten existen intermediarios
que representan formas parcialmente plegadas de la proteiacutena que han podido ser
identificados por la adicioacuten de peacuteptidos derivados de la regioacuten RHA o RHB (Chan et al
1998 Russell et al 2001 Melikyan et al 2005) indicando que la proteiacutena sufre cambios
conformacionales que exponen ambas regiones heptaacutedicas antes del plegamiento final
que lleva a la estructura final 6HB
Ha sido propuesto un modelo de la fusioacuten de membranas mediada por
Introduccioacuten
24
Figura I10 Representacioacuten esquemaacutetica de la proteiacutena F de los paramixovirus en su estado pre- y postfusioacuten (a) Dominios en la estructura primaria (b) forma pre-fusioacuten y (c) forma post-fusioacuten de la proteiacutena F Tomada de Russell et al 2006
paramixovirus basado en estas estructuras que plantea que la proteiacutena F adoptariacutea al
menos 5 intermediarios para pasar de la forma pre-fusioacuten a la post-fusioacuten (Russell etal
2006) El esquema de la figura I10 muestra a la proteiacutena F en las conformaciones pre-
(panel b) y post-fusioacuten (panel c) de una manera simplificada para un mejor entendimiento
de los cambios producidos en los distintos dominios
Las etapas del modelo de fusioacuten de membranas mediada por paramixovirus
implicariacutean (Figura I11)
a) La proteiacutena proteoliacuteticamente procesada (F1+F2) se encuentra en un estado pre-
activo metaestable
b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten en el cual las cadenas de la regioacuten
heptaacutedica (RHB) se abren
d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) en el cual el peacuteptido de fusioacuten de los tres
monoacutemeros se inserta en la membrana de la ceacutelula diana y la RHA de los tres
monoacutemeros adoptan una conformacioacuten de heacutelices alfa paralelas
e) La estructura de horquilla en la que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB
llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten
Introduccioacuten
25
I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
Actualmente existen distintas teacutecnicas biofiacutesicas que permiten la visualizacioacuten de
proteiacutenas
bull La cristalografiacutea de rayos X que proporciona informacioacuten de alta calidad pero cuya
limitacioacuten es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos lo que no siempre es
factible
bull La espectrometriacutea por resonancia magneacutetica nuclear que proporciona informacioacuten
de moleacuteculas en solucioacuten aunque estaacute limitada a moleacuteculas de pequentildeo tamantildeo (35-
Membrana celular
Membrana viral
fusioacuten
fusioacuten
Figura I11 Esquema del modelo de fusioacuten de membranas mediado por paramixovirus La proteiacutena F adoptariacutea al menos 5 intermediarios (a) La proteiacutena procesada proteoliacuteticamente (F1+F2) en un estado metaestable (b y c) Un intermediario temprano de fusioacuten (d) Un intermediario pre-hairpin (pre-horquilla) (e) La estructura horquilla en el que las RHA y RHB forman la estructura de 6HB llevando a la unioacuten de las membranas viral y celular y produciendo el poro de fusioacuten Tomada de Russell et al 2006
Introduccioacuten
26
40KDa) en una elevada concentracioacuten y alta solubilidad
bull Por uacuteltimo la microscopiacutea electroacutenica de partiacuteculas individuales que si bien ha sido
vista siempre como una herramienta de baja resolucioacuten ha experimentado un gran
avance tanto en teacutecnicas de preparacioacuten de muestras como en el dispositivo instrumental
en siacute Hoy en diacutea praacutecticamente se han eliminado la mayoriacutea de las limitaciones de esta
metodologiacutea como son el dantildeo por radiacioacuten o la elevada proporcioacuten de ruido frente a la
sentildeal especiacutefica (Stowell et al 1998 Ruprecht et al 2001) Tambieacuten se ha avanzado en
el desarrollo de teacutecnicas computacionales que permiten el procesamiento de imaacutegenes
(Thuman-Commike 2001) A pesar de todo la resolucioacuten alcanzada por esta teacutecnica es
normalmente inferior a la obtenida por teacutecnicas cristalograacuteficas o de resonancia magneacutetica
nuclear Esto se debe a factores teacutecnicos como los defectos de las lentes del microscopio
el tipo de tincioacuten etc Sin embargo una ventaja de este meacutetodo es que no necesita
elevadas concentraciones ni grandes cantidades de proteiacutena
I61 Teacutecnicas de microscopiacutea electroacutenica
Existen dos metodologiacuteas principales dentro de la microscopiacutea electroacutenica para la
observacioacuten de moleacuteculas o complejos moleculares tincioacuten negativa y crio-microscopiacutea
La tincioacuten negativa es una teacutecnica sencilla y econoacutemica y su uso se ha generalizado como
teacutecnica fundamental para contrastar muestras particuladas El contraste se obtiene
embebiendo la muestra a observar en una sal de un metal pesado (aacutecido fosfotuacutengstico al
2 acetato de uranilo al 4 etc) que perfila el relieve de la proteiacutena sobre un fondo
oscuro de ahiacute su denominacioacuten como teacutecnica de ldquocontraste negativordquo o de tincioacuten
negativa Estos metales ademaacutes de aumentar el contraste protegen la muestra del dantildeo
por irradiacioacuten Debido a la granulosidad de la tincioacuten al achatamientoaplastamiento
variable de la estructura 3D de la proteiacutena y al movimiento del tinte sobre la rejilla el
liacutemite de resolucioacuten que puede alcanzarse es de 10-20Aring (Ruprecht et al 2001)
En la crio-microscopiacutea la rejilla se congela en etano liacutequido para mantener las
moleacuteculas en un estado de hielo viacutetreo preservaacutendose de este modo su conformacioacuten
nativa En este caso el contraste es menor que en la tincioacuten negativa por ello para esta
teacutecnica se necesita una concentracioacuten de muestra mayor y un tamantildeo miacutenimo de la
Introduccioacuten
27
partiacutecula (aproximadamente 70kDa)
Cualquiera que sea la metodologiacutea a utilizar la muestra debe tener una pureza
elevada ya que se pretende que las partiacuteculas observadas correspondan a una uacutenica
especie molecular Preferiblemente eacutesta debe estar en una conformacioacuten uacutenica o en
conformaciones que sean los suficientemente diferentes para permitir su separacioacuten por
meacutetodos informaacuteticos En el caso de la tincioacuten negativa la concentracioacuten de la muestra
suele estar en los 10-100microgml aunque puede variar en funcioacuten de las caracteriacutesticas de
la moleacutecula (Ruprecht et al 2001)
I62 El microscopio electroacutenico
En el microscopio electroacutenico un haz de electrones incide sobre la muestra y de la
interaccioacuten de estos electrones con los aacutetomos de la misma surgen sentildeales que son
captadas por un detector o bien proyectadas directamente sobre una pantalla Los
electrones pueden ser desviados por las moleacuteculas del aire de forma que tiene que
hacerse un vaciacuteo casi total en el interior de un microscopio de estas caracteriacutesticas La
imagen tomada se llama micrografiacutea
En un microscopio oacuteptico o de fluorescencia la resolucioacuten seraacute definida como la
habilidad del instrumento para resolver dos puntos situados a una distancia d Este
concepto variacutea en el microscopio electroacutenico ya que la resolucioacuten estaacute sometida a una
serie de limitaciones provocadas por la estabilidad de las corrientes aberraciones de las
lentes o el propio fondo inespeciacutefico de la muestra Por tanto en este contexto la
resolucioacuten seraacute definida como la capacidad de discernir la sentildeal especiacutefica de la imagen
frente al ruido de la muestra Una de las estrategias que ayudan a solventar este
problema es trabajar seguacuten los meacutetodos de Fourier (Frank 1996) Dichos meacutetodos
consisten en transformar las funciones ondulatorias de cada una de las imaacutegenes
mediante ecuaciones matemaacuteticas en puntos discretos que representan la frecuencia
amplitud y fase de cada elemento de la imagen Este procedimiento se denomina
Transformada de Fourier y permite extraer las sentildeales correspondientes a la partiacutecula de
aquellas que provienen del fondo inespeciacutefico de la muestra
Introduccioacuten
28
I63 Procesamiento de imagen y reconstruccioacuten tridimensional
Una vez que se consigue una micrografiacutea de calidad en la que las moleacuteculas se
encuentran lo suficientemente dispersas y diferenciables se puede intentar la
reconstruccioacuten tridimensional de la proteiacutena en cuestioacuten mediante el procesamiento de
imaacutegenes por meacutetodos informaacuteticos
Para llevar a cabo este procesamiento de imaacutegenes primero se digitaliza la
micrografiacutea para permitir su transferencia a un ordenador Este proceso se realiza en un
escaacutener de alta eficacia o digitalizador que mide el nivel de gris de cada punto del
negativo o piacutexel (Dunn et al 1998) Estas imaacutegenes son sometidas entonces a una
evaluacioacuten cuantitativa computacional que verifica la calidad de los datos que aporta dicha
foto (Zhou et al 1996)
Una vez que las imaacutegenes han sido obtenidas digitalizadas y se ha evaluado su
calidad comienza el procesamiento de imaacutegenes En la figura I12 se muestra un
esquema que representa los principales pasos en el procesamiento de imaacutegenes para la
reconstruccioacuten tridimensional
En el panel A de esta figura se observa una representacioacuten de lo que seriacutea una
micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio Para
determinar la orientacioacuten individual de las partiacuteculas uno debe trabajar sobre cada
partiacutecula y no sobre la micrografiacutea completa Asiacute el primer paso es especificar la posicioacuten
de cada partiacutecula individual dentro de la micrografiacutea un proceso conocido como seleccioacuten
de partiacuteculas Para esto el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del
ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten
el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (panel B)
El siguiente paso implica el alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes
(panel C) donde cada cada partiacutecula se orienta de una manera similar El objetivo en este
paso es determinar las rotaciones y traslaciones de manera precisa para que cuando las
imaacutegenes sean observadas todas juntas se aprecien caracteriacutesticas estructurales
Introduccioacuten
29
Figura I12 Esquema descriptivo del meacutetodo de procesamiento iterativo de imaacutegenes para la reconstruccioacuten de una estructura tridimensional (A) representacioacuten de una micrografiacutea que muestra un campo con diferentes moleacuteculas del objeto en estudio (B) Seleccioacuten de partiacuteculas el usuario observa la micrografiacutea digitalizada en la pantalla del ordenador e indica la localizacioacuten de cada partiacutecula con el ratoacuten Al finalizar la seleccioacuten el programa presenta cada moleacutecula como una foto particular (C) Alineamiento o reposicionamiento de las imaacutegenes (D) Clasificacioacuten de partiacuteculas (E) Promedio y orientacioacuten de imaacutegenes (F) Reconstruccioacuten tridimensional Adaptada de Thuma-Commike 2001)
D Clasificacioacuten
Clase 1 Clase 2 Clase 3
A Micrografiacutea
B Seleccioacuten de moleacuteculas individuales
C Alineamiento
Superior Lateral Frente
E Promedio y orientacioacuten de las imaacutegenes
G Estructura tridimensional
F Reconstruccioacuten tridimensional
Posteriormente se realiza la clasificacioacuten de partiacuteculas (panel D) es decir la
identificacioacuten de vistas similares del objeto u objetos y clasificacioacuten en clases Las vistas
similares son incluidas en un mismo grupo y son promediadas (panel E) De este modo al
hacer una media de las partiacuteculas se consigue incrementar la relacioacuten sentildealruido debido
a la repeticioacuten de los elementos comunes de partiacuteculas de la misma clase en posiciones
similares y a la distribucioacuten aleatoria del ruido en cada imagen
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas son entonces utilizadas para generar un
primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN (Electron
Micrograhp Anaacutelisis por sus siglas en ingleacutes) (NCMI-EMAN Ludtke et al 1999) Una
vez generado dicho modelo se realiza un refinamiento iterativo de la estructura usando los
Introduccioacuten
30
algoritmos implementados en el programa SPIDER (System for Processing Image Data
from Electron microscopy and Related fields por sus siglas en ingleacutes) hasta que se
alcanza una convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento
ya no mejoran el modelo (Spider Web Frank et al 1996)
II OBJETIVOS
Objetivos
31
II OBJETIVOS
El estudio comparativo de las proteiacutenas de fusioacuten de distintos paramixovirus desde
un punto de vista estructural y funcional puede contribuir a entender tanto el proceso de
fusioacuten de membranas como el mecanismo de activacioacuten y los cambios conformacionales
que estas proteiacutenas experimentan durante dicho proceso
Como ya se ha comentado a lo largo de la Introduccioacuten la proteiacutena F del MNVH es
la responsable de la fusioacuten de las membranas viral y celular asiacute como de la fusioacuten de las
membranas de las ceacutelulas infectadas con las de las ceacutelulas adyacentes no infectadas
dando lugar a la formacioacuten de sincitios
Ademaacutes dada la importancia de la proteiacutena F en la respuesta inmune protectora
del hueacutesped frente al MNVH el conocimiento de la estructura y de los requerimientos
funcionales de esta glicoproteiacutena es a nuestro modo de ver esencial para el desarrollo de
posibles vacunas o terapias paliativas contra el virus
Por todo ello los objetivos planteados para esta tesis fueron
I- Poner a punto un sistema de crecimiento del MNVH en cultivos celulares Dado que en el laboratorio no se trabajoacute anteriormente con el MNVH se probaraacuten
distintas condiciones y liacuteneas celulares para determinar las mejores condiciones de
infeccioacuten y replicacioacuten viral
II - Clonar expresar y purificar la proteiacutena F del MNVH El gen de la glicoproteiacutena F se clonaraacute en vectores de expresioacuten procarioacutetica y
eucarioacutetica Asiacute mismo con el fin de disponer de una forma soluble de la proteiacutena F se
obtendraacuten mutantes de la misma desprovistos de las regiones transmembrana y
citoplaacutesmica Estos mutantes permitiraacuten una produccioacuten y purificacioacuten maacutes sencilla de la
proteiacutena F para su caracterizacioacuten estructural
Objetivos
32
III- Realizar un estudio comparativo de la estructura de la proteiacutena F del MNVH con proteiacutenas homoacutelogas de otros paramixovirus La proteiacutena F purificada se observaraacute al microscopio electroacutenico tras tincioacuten
negativa Las imaacutegenes asiacute obtenidas se emplearaacuten para hacer una reconstruccioacuten
tridimensional de esta moleacutecula que se compararaacute con lo publicado hasta el momento
para las proteiacutenas F de otros paramixovirus
IV- Determinar los requerimientos para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH
Se determinaraacute en ensayos de formacioacuten de sincitios cuales son los requerimientos
necesarios para la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH Se analizaraacuten diferencias y
similitudes con otros miembros de la familia de los paramixovirus
V- Producir reactivos inmunoquiacutemicos especiacuteficos frente al virus y frente a la proteiacutena F del MNVH
Para contar con herramientas para la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten del virus se llevaraacuten a cabo inmunizaciones con peacuteptidos basados en la secuencia
de la proteiacutena F virus vaccinia recombinantes que expresen distintas formas de la
proteiacutena F o proteiacutena F purificada
III MATERIALES Y MEacuteTODOS
Materiales y Meacutetodos
33
III MATERIALES Y MEacuteTODOS III1 MATERIALES III11 Material Bioloacutegico III111 Liacuteneas celulares
Las liacuteneas celulares empleadas fueron las siguientes
bull BHK-21 ceacutelulas de rintildeoacuten de haacutemster Sirio o dorado (Mesocricetus auratus)
American Type Culture Collection ATCC CCL-10
bull BSR T75 liacutenea celular derivada de BHK-21 que expresa la RNA polimerasa del
bacteriofago T7 (Buchholz et al 1999)
bull CV-1 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) American
Type Culture Collection ATCC CCL-70
bull HEp-2 carcinoma de laringe humano American Type Culture Collection ATCC
CCL-23
bull LLC-MK2 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono Rhesus (Macaca mulatta) American Type
Culture Collection ATCC CCL-7
bull Vero 118 ceacutelulas de rintildeoacuten de mono verde africano (Cercopithecus aethiops)
American Type Culture Collection ATCC CCL-81
bull Vero 118 118 clon de ceacutelulas Vero 118 que han sido seleccionadas por su
resistencia a la tripsina cedidas por el Dr ADME Osterhaus Departamento de
Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
III112 Virus Los virus empleados en este trabajo fueron
bull Metaneumovirus humano (MNVH) cepa NL0199 aislado en Holanda en 1999
cedido por el Dr ADME Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC
Roterdam Holanda
bull vRB12 virus vaccinia mutado derivado de la cepa Western Reserve (WR) en el
que 93 de la secuencia que codifica la proteiacutena P37 estaacute delecionada (Blasco et al
1995)
bull vTF73 virus vaccinia mutado que expresa la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst
Materiales y Meacutetodos
34
et al 1986)
bull Virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- (Corral et al 2007) que llevan
clonados el gen de las proteiacutenas F del metaneumovirus humano y una forma soluble de
eacutesta (FTM-) respectivamente La proteiacutena F corresponde a la forma completa de la
proteiacutena mientras que la F TM- es una forma mutada que carece de los uacuteltimos 50
aminoaacutecidos de la regioacuten carboxi-terminal correspondiente a la cola citoplasmaacutetica y la
regioacuten transmembrana
bull Virus vaccinia recombinante vv-FTM-6His que lleva clonado el gen de las proteiacutenas
FTM- del metaneumovirus humano fusionado a una cola de 6 Histidinas
III113 Bacterias y plaacutesmidos La cepa bacteriana utilizada para el crecimiento de los plaacutesmidos que se han
empleado en el trabajo ha sido Escherichia coli DH5α (Hanahan 1983)
Los plaacutesmidos empleados para el desarrollo de este trabajo se resumen en la
siguiente tabla
Plaacutesmidos Tamantildeo
(pb) Caracteriacutesticas Referencia
pRB21 5537 pEL VV vP37 AmpR (Blasco et al 1995)
pRB21-F 7157 Plaacutesmido pRB21 que tiene insertado el gen F del MNVH
pRB21-FTM- 7007 Plaacutesmido pRB21-F al que se le mutoacute la Gly 486 por un
codoacuten de terminacioacuten para generar el mutante TM-
pRB21-FTM- 6His 7025 Plaacutesmido pRB21- FTM- al que se le agregoacute un tag de 6
Histidinas en el extremo C-terminal
pGEM4 2871 AmpR pT7 pSP6 PROMEGA
pGEM4-F 4491 Plaacutesmido pGEM4 que tiene insertado el gen F del MNVH
pTM1 5357 AmpR lider EMC pT7 (Moss et al 1990)
pTM1-F 6977 Plaacutesmido pTM1 que tiene insertado el gen F del MNVH
pCAGGS 4790 AmpR Enhancer CMV-IE promotor e introacuten de la β-
actina de pollo poliA β-globina de conejo (Niwa et al 1991)
pCAGGS-F 6410 Plaacutesmido pCAGGS que tiene insertado el gen F del
MNVH
Tabla III1 Plaacutesmidos utilizados en este trabajo pEL promotor tempranotardiacuteo de vaccinia VV regioacuten para recombinacioacuten homologa en el virus vaccinia vP37 gen de la proteiacutena VP37 del virus vaccinia AmpR gen de resistencia a ampicilina Enhancer CMV-IE enhancer inmediato temprano del citomegalovirus Lider EMC regioacuten no codificante del virus de la encefalomiocarditis pT7 promotor de T7 pSP6 promotor SP6 poliA sentildeal de poliadenilacioacuten
Materiales y Meacutetodos
35
III114 Animales Se utilizaron conejos New Zealand para la realizacioacuten de los distintos sueros
policlonales
III115 Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la proteiacutena F del MNVH asiacute como
el suero policlonal de cobaya anti-MNVH fueron gentilmente cedidos por el Dr ADME
Osterhaus Departamento de Virologiacutea Erasmus MC Roterdam Holanda
El resto de los anticuerpos utilizados en este trabajo se describen en el apartado
IV4 de Resultados
III116 Oligonucleoacutetidos
Los oligonucleoacutetidos utilizados en el clonaje mutageacutenesis y secuenciacioacuten de la
proteiacutena F del MNVH se detallan en la siguiente tabla
Nombre del oligo Utilizacioacuten Secuencia (5acuterarr3acute)
Fm1-18EcoRI+
Clonaje en pRB21 y
pCAGGS CATCTTGAATTCATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601HindIII- Clonaje en pRB21 CGACTGAAGCTTCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18HindIII+ Clonaje en pGEM4 GCATCGAAGCTTATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601Asp718- Clonaje en pGEM4 AGTACGGGTACCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1-18Afl III+ Clonaje en pTM1 GCTAGTACATGTCTTGGAAAGTGGTG
Fm1620-1601BamHI- Clonaje en pTM1 ACGTACGGATCCCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm1620-1601SmaI- Clonaje en pCAGGS ACGTACCCCGGGCTAATTATGTGGTATGAAGC
Fm267-281- Secuenciacioacuten TGCTCCTCTCTCGCC
Fm475-493+ Secuenciacioacuten GCCACTGCAGTGAGAGAGC
Fm732-746- Secuenciacioacuten GCGCGGTTCTCCAAC
Fm918-934- Secuenciacioacuten TACAATACCACCCTTGA
Fm1012-1036+ Secuenciacioacuten GCAGCAGGGATCAATGTTGCTGAGC
Fm1159-1173- Secuenciacioacuten CGAGCAGCTTACCCC
Fm1231-1247+ Secuenciacioacuten ACCAACCAGGATGCGGA
FmT80C+ Mutageacutenesis ATTTGGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAGGG
FmT80C- Mutageacutenesis CCCTCAGTTATAGTACTACATGATTCTTCCAAAT
FmG590A+ Mutageacutenesis CAGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTTCT
Materiales y Meacutetodos
36
FmG590A- Mutageacutenesis AGAAATCTTCTGTTGAATTGACTGAAGCTG
FmG839A+ Mutageacutenesis CTTTGGTGTCATAGATACACCTTGTTGGATC
FmG839A- Mutageacutenesis GATCCAACAAGGTGTATCTATGACACCAAAG
FmG1062A+ Mutageacutenesis GCAACATCAACATATCTACTACCAACTACC
FmG1062A- Mutageacutenesis GGTAGTTGGTAGTAGATATGTTGATGTTGC
Fm1468Stop+ Mutageacutenesis AAGGAAACACTTAGTTCATTATCGTAGTAA
Fm1468Stop- Mutageacutenesis TTACTACGATAATGAACTAAGTGTTTCCTT
FmTM-His1+ Mutageacutenesis GAAAAAGGAAACACTCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His1- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGAGTGTTTCCTTTTTC
FmTM-His2+ Mutageacutenesis CACTCATCATCATCATCATCATTAGTTCATTATCG
FmTM-His2- Mutageacutenesis CGATAATGAACTAATGATGATGATGATGATGAGTG
III117 Enzimas El kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Changereg Site-Directed Mutagenesis kit) fue
suministrado por Stratagene-Europe (Amsterdan Holanda)
El kit de secuenciacioacuten automaacutetica de DNA (DNA Sequencing Kit Big Dye 31) fue
suministrado por Abi Prism (Parking Elmer Biosystems)
Las enzimas de restriccioacuten utilizadas en el clonaje de la proteiacutena F (BamHI EcoRI
HindIII Asp718 NcoI AflIII SmaI) fueron suministradas por Roche
Otras enzimas empleadas en la manipulacioacuten de DNA fueron fosfatasa alcalina de
gamba (USBGE Healthcare) T4 DNA ligasa (kit ligacioacuten raacutepida de Roche) y Ampli Taqreg
DNA polimerasa (Applied Biosystems)
La tripsina se adquirioacute de Sigma (San Luis Estados Unidos)
III118 Oligopeacuteptidos Los oligopeacuteptidos utilizados en el desarrollo de este trabajo se detallan en la
siguiente tabla
Los peacuteptidos F83-102 F226-244 y F465-484 fueron suministrados por el servicio de
proteoacutemica del Centro Nacional de Microbiologiacutea del Instituto de Salud Carlos III
Tabla III2 Secuencia de los oligonucleacuteotidos empleados en esta Tesis El signo + indica que el oligonucleoacutetido tiene la polaridad del mRNA del gen F y el signo ndash la complementaria En cursiva y subrayado se muestra la secuencia que reconocen las enzimas indicadas en cada caso
Materiales y Meacutetodos
37
III12 Medios de cultivos III121 Ceacutelulas eucariotas
DMEM-10 DMEM-25 Y DMEM-0 Medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM Dulbecco y Freeman 1959 Gibco) con 4mM glutamina 100Uml penicilina
01mgml de estreptomicina y enriquecido con 10 25 suero de ternera fetal (STF) o
sin suero
DMEM-agar Medio DMEM-25 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no esenciales
(Biological Industries) y 07 de agar noble (Difco)
DMEM-agar-tripsina Medio DMEM-0 conteniendo un 1 de aminoaacutecidos no
esenciales (Biological Industries) 07 de agar noble (Difco) y tripsina (2microgml Sigma)
Tripsina-Verseno 005 tripsina 002 EDTA en PBS
III122 Bacterias LB 1 bacto-triptona 1NaCl y 05 extracto de levadura
SOB 2 bacto-triptona 05 extracto de levadura 10mM NaCl y 25mM KCl
Circle-GrowR (Bio 101 System)
III13 Reactivos
Los compuestos orgaacutenicos (formaldehiacutedo metanol etanol etc) inorgaacutenicos
colorantes para electroforesis detergentes persulfato amoacutenico (PSA) fraccioacuten V de la
seralbuacutemina bovina (SAB) y glicerol fueron suministrados por VWR
Disco y Bio 101 Systems proporcionaron los componentes de los medios de cultivo
de bacterias (bactotriptona extracto de levadura y agar)
Los reactivos para electroforesis acrilamida N-Nacute-metilen-bisacrilamida dodecil
Nombre del oligo Secuencia
F83-102 TVSADQLAREEQIENPRQSR
F226-244 ELARAVSNMPTSAGQIKLM
F465-484 ESIENSQALVDQSNRILSSA
Tabla 3 Secuencia de aminoaacutecidos de los oligopeacuteptidos empleados en este trabajo F83-102 peacuteptido que tiene los aminoaacutecidos 83 a 102 de la proteiacutena F del MNVH y asiacute sucesivamente Los aminoaacutecidos en rojo son errores de secuencia que se cometieron en la siacutentesis del peacuteptido
Materiales y Meacutetodos
38
sulfato soacutedico (SDS) szlig-mercaptoetanol (szligME) N-N-Nacute-Nacute-tetrametil-etilendiamina
(TEMED) azul de bromofenol y marcadores de peso molecular pretentildeidos (Precision Plus
Protein Standards Dual color y Precision Plus Protein Standards All Blue) se obtuvieron de
Bio-Rad Para la separacioacuten de aacutecidos nucleicos se empleoacute agarosa de laboratorios
Conda (Pronadisa)
Para las inmunotrasnferencias o western blots el Inmobilon-P lo suministroacute
Millipore el 3MM Whatman y el bloqueante I-Block Tropix
Se emplearon peliacuteculas autoradiograacuteficas de AGFA CURIX RP2 que se revelaron
con productos de Eastman KodaK
Dimetilsulfoacutexido (DMSO) antibioacuteticos aacutecido p-cumaacuterico luminol (5-amino-23-
dihidro-14-phthalazinedione) asiacute como el sustrato para la peroxidasa O-fenilendiamina
(OPD) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) se compraron a Sigma
Los marcadores de tamantildeo de DNA y el inhibidor de proteasas Complete-Mini
EDTA-free se obtuvieron de Roche
Para la concentracioacuten de proteiacutenas se utilizoacute Vivaflow50 Vivaflow200 y Vivaspin50
de 100000MWCO de Sartorius (Vivascience Hannover Alemania)
Las inmunoglobulinas (Igs) conjugadas con peroxidasa contra Igs de conejo o de
ratoacuten fueron suministradas por GE-Healthcare asiacute como las inmunoglobulinas conjugadas
con fluoresceiacutena
III2 MEacuteTODOS III21 Manipulacioacuten de ceacutelulas virus y animales III211 Cultivo de ceacutelulas eucariotas
Las ceacutelulas se crecieron en placas de Petri con medio DMEM-10 incubaacutendose a
37ordmC en una atmoacutesfera con 5 de CO2 y 98 de humedad Las monocapas celulares se
subcultivaron desprendieacutendolas con tripsina-verseno
Para su almacenamiento las ceacutelulas se resuspendieron en STF con un 10 de
dimetilsulfoacutexido (DMSO) y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido
III212 Crecimiento del MNVH Para el crecimiento de virus MNVH se infectaron cultivos al 80 de confluencia de
Materiales y Meacutetodos
39
ceacutelulas LLC-MK2 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01 unidades formadoras de foco por
ceacutelulas (uffceacutelula) en DMEM-0 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se retiroacute el
inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-0 fresco Al diacutea siguiente se quita la mitad del medio de
la placa y se agrega medio DMEM-0 nuevo con 4microgml de tripsina y se dejoacute progresar la
infeccioacuten durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 del medio (sim3ml) y se agregoacute
medio DMEM-0 nuevo con 8microgml Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon y se
recogieron junto con el sobrenadante La preparacioacuten se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III213 Titulacioacuten de MNVH por tincioacuten inmunohistoquiacutemica
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M6 se infectaron con 200microl de diluciones
seriadas de virus Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se retiroacute el inoacuteculo y se
lavoacute con 05ml de DMEM-0 Entonces se agregoacute 1ml de DMEM-agar-tripsina y se incuboacute
durante 4diacuteas Al cabo de este tiempo se agregaron 2ml de formaldehiacutedo al 4 en PBS
1x y se incuboacute a temperatura ambiente durante 45min Se quitoacute el agar con cuidado y se
fijoacute con metanol durante 5min Luego se lavoacute 2x con agua y se bloqueoacute con PBS con 1
de seroalbuacutemina bovina (PBS-SAB1) durante 30min a temperatura ambiente
Despueacutes se antildeadieron 08mlpocillo de una dilucioacuten 11000 del anticuerpo anti-FTM-
6His conejo E en PBS-SAB1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Luego de lavar 5x
con agua se antildeadioacute 08ml de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa 1500 en
PBS-SAB 1 y se incuboacute 1h a temperatura ambiente Se lavoacute nuevamente 5x con agua y
se antildeadioacute 08ml de sustrato por pocillo en la proporcioacuten 10ml tampoacuten ELISA (tampoacuten
01M citrato 02M fosfato pH=55) 06ml de 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) (de una
solucioacuten de 20mg de AEC6ml DMSO bien disuelta por vortex y sonicacioacuten) 20microl H2O2
La placa se envolvioacute se mantuvo en oscuridad aprox 20min se quitoacute el sustrato y
se contaron las placas a simple vista
III214 Ensayo de Neutralizacioacuten de MNVH
Ceacutelulas LLC-MK2 confluentes en placas M96 se infectaron con 60microlpocillo con x
uff de MNVH que habiacutean sido preincubadas 30 minutos a 37ordmC en ausencia o presencia
de distintas cantidades de anticuerpo Se dejoacute adsorber durante 1 hora a 37ordmC Luego se
retiroacute el inoacuteculo y se lavoacute con 05ml de DMEM-0 Se agregoacute entonces 1ml de DMEM-agar-
Materiales y Meacutetodos
40
tripsina y se incuboacute durante 3-4 diacuteas Se cuantificoacute la reduccioacuten del nuacutemero de focos de
ceacutelulas infectadas en presencia del anticuerpo respecto al control sin anticuerpo Esta
cuantificacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo de titulacioacuten del virus por tincioacuten
inmunohistoquiacutemica descrito en el apartado III213
III215 Crecimiento del virus vaccinia
Para el crecimiento de virus vaccinia recombinantes se infectaron cultivos
confluentes de ceacutelulas CV-1 a una multiplicidad de infeccioacuten de 01unidades formadoras
de placa por ceacutelula (ufpceacutelula) en DMEM-25 Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a 37ordmC se
retiroacute el inoacuteculo se antildeadioacute medio DMEM-25 fresco y se dejoacute progresar la infeccioacuten
durante 48-72 horas Pasado este tiempo las ceacutelulas se rasparon se recogieron junto con
el sobrenadante y se centrifugaron 5 minutos a 1500rpm El sedimento se lavoacute con PBS
esteacuteril se resuspendioacute en (250microlplaca p100) 1mM de Na2HPO4 se congeloacute (-80ordmC) y
descongeloacute (37ordmC) tres veces para romper las ceacutelulas y se sonicoacute en un bantildeo de
ultrasonidos durante 3 minutos para la liberacioacuten del virus intracelular La preparacioacuten se
volvioacute a centrifugar a 1500rpm durante 5minutos para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se alicuoteoacute y se guardoacute a -80ordmC
III216 Titulacioacuten de virus vaccinia por plaqueo en agar
Pocillos de placas M-6 con ceacutelulas CV-1 confluentes se infectaron por duplicado
con 250microl de diluciones seriadas de virus vaccinia Despueacutes de 1 hora de adsorcioacuten a
37ordmC en medio DMEM-25 se retiroacute el inoacuteculo y se antildeadioacute 2ml de DMEM-agar A las 48
horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron con 2ml de paraformaldehiacutedo al 10 en PBS
completo durante 30 minutos y una vez retirado el agar se tintildeeron durante 30minutos con
1ml de 01 cristal violeta en 20 metanol A continuacioacuten se procedioacute a contar las
placas de lisis
III217 Construccioacuten de virus vaccinia recombinantes Los virus vaccinia recombinantes empleados en este trabajo (vv-F vv-FTM- y vv-
FTM- 6His) se prepararon siguiendo el protocolo de Blasco y Moss (Blasco et al 1995)
Brevemente placas p35 con ceacutelulas CV-1 se infectaron con la cepa de vaccinia vRB12 en
Materiales y Meacutetodos
41
medio DMEM-0 Una hora despueacutes se transfectaron usando lipofectina con 5ug del
plaacutesmido pRB21 que conteniacutea el gen a expresar (F FTM- o FTM- 6His) Como el vRB12 no
tiene el gen VP37 y es por tanto incapaz de formar placas los virus recombinantes (que
si forman placas) se pudieron recuperar de las ceacutelulas infectadas y transfectadas a los 2
diacuteas de haberse infectado mediante plaqueo en ceacutelulas CV-1 Las placas de lisis se
recuperaron y clonaron por plaqueo tres veces maacutes para asegurar que el virus purificado
proveniacutea de una uacutenica partiacutecula
III22 Clonaje y expresioacuten de la proteiacutena F del MNVH III221 Cultivo de bacterias y preparacioacuten de ceacutelulas competentes
Las bacterias se plaquearon a 37ordmC en medio soacutelido Circle-Grow y 100microgrml de
ampicilina Colonias individuales se aislaron y se crecieron a 37ordmC durante la noche con
fuerte agitacioacuten en 5ml de medio LB liacutequido conteniendo la misma concentracioacuten de
ampicilina A aliacutecuotas de estos cultivos se les antildeadioacute glicerol al 20 (concentracioacuten final)
y se guardaron a -80ordmC para su uso posterior (Miller 1972 Sambrook 1989)
Para la preparacioacuten de ceacutelulas competentes para transformacioacuten se siguioacute el
meacutetodo del cloruro de rubidio (Hanahan 1983) Las ceacutelulas se crecieron en medio SOB
enriquecido con Mg2+ a 37ordmC Posteriormente 1ml del cultivo se diluyoacute en 200ml de medio
SOBMg2+ y se crecioacute a 37ordmC con agitacioacuten fuerte hasta obtener una densidad oacuteptica a
550nm de 045-055 unidades El cultivo se centrifugoacute a 5000rpm durante 5minutos a 4ordmC
en un rotor JA-17 (Beckman) Las bacterias sedimentadas se resuspendieron suavemente
en 10ml de tampoacuten TfBI (100mM RbCl2 50mM MnCl2 30mM acetato potaacutesico 10mM
CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial y se volvioacute a centrifugar El sedimento
se resuspendioacute con suavidad en 24ml de tampoacuten TfBII (10mM MOPS 10mM RbCl2
75mM CaCl2 15 glicerol) por cada 30ml de cultivo inicial Por uacuteltimo se repartioacute en tubos
eppendorff preenfriados en un bantildeo de etanolCO2 Las bacterias se almacenaron
congeladas a -80ordmC hasta su uso
Empleando un plaacutesmido de concentracioacuten conocida se calculoacute la eficiencia de
transformacioacuten de las bacterias competentes (nordm de coloniasmicrog de plaacutesmido) en
presencia de ampicilina 100microgrml
III222 Extraccioacuten de RNA total (Meacutetodo del Trizol)
Materiales y Meacutetodos
42
Una placa p100 de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH se raspoacute a los 6 diacuteas
post-infeccioacuten para desprender las ceacutelulas que auacuten estaban pegadas Las ceacutelulas y el
sobrenadante se colocaron en un tubo de 20ml y se centrifugaron a 1200rpm por 5min Se
descartoacute el sobrenadante y se antildeadioacute 1ml de Trizol (1mlTrizol107 ceacutelulas)
resuspendiendo bien mediante pipeteos y voacutertex Se mantuvo 5min a temperatura
ambiente y entonces se pasoacute a un eppendorf
Se antildeadieron entonces 02ml de cloroformo (por ml de Trizol) y se mezcloacute con el
voacutertex durante 15seg Se dejoacute reposar 3min y entonces se centrifugoacute en minifuga a
maacutexima velocidad (13000rpm) durante 15min a 4ordmC El sobrenadante se pasoacute a otro
eppendorf (aproximadamente el 60 del vol) procurando no tomar volumen de la interfase
Se antildeadieron 05ml de isopropanol (por ml de trizol) y se agitoacute manualmente Se dejoacute
10min a temperatura ambiente y entonces se centrifugoacute en minifuga a maacutexima velocidad
(13000rpm) durante 10min a 4ordmC Se descartoacute el sobrenadante
Procurando no resuspender el pellet se antildeadioacute 1ml etanol 75 (por ml de trizol) Se
centrifugoacute en una minifuga a maacutexima velocidad (13000rpm) durante 5min a 4ordmC Se
descartoacute el sobrenadante y se dejoacute secar ligeramente
Entonces se resuspendioacute en 100microl de agua esteacuteril medinte pipeteo y vortex y se
guardoacute a -20ordmC
III223 Amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F por RT-PCR El gen que codifica para la proteiacutena F de MNVH se amplificoacute mediante RT-PCR a
partir del RNA total extraiacutedo de ceacutelulas infectadas por el virus (III222)
El cDNA se sintetizoacute agregando 600ng del oligonucleacuteotido negativo (Tabla 2
III116) a 2microgr de RNA en un volumen final de 20microl Esta mezcla se incuboacute durante
15min a 65ordmC Entonces se agregaron tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega)
dNTPs y Cl2Mg a una concentracioacuten final de 1x 400microM y 25mM respectivamente en un
volumen de 30microl Por uacuteltimo se agregoacute 1microl de Retrotranscriptasa (Promega) por tubo de
reaccioacuten y se incuboacute durante 30min a 42ordmC y 5min a 95ordmC
Posteriormente se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F de MNVH por
PCR Para esto se llevoacute a 100microl el volumen del tubo de reaccioacuten de la RT con una
concentracioacuten final de 600ng de cada uno de los oligos (Tabla 2 III116) 400uM de
dNTPs y 1x del tampoacuten de baja concentracioacuten salina (Promega) Finalmente se
Materiales y Meacutetodos
43
agregaron 25U de la Taq Plus Long (Stratagene) y se llevo a cabo el siguiente ciclado
94ordmC 2min 94ordmC 30seg 45ordmC 1min 72ordmC 5min (x 25ciclos) 72ordmC 10min
El producto de reaccioacuten de amplificacioacuten se analizoacute en un gel de agarosa 1
III224 Ligacioacuten y transformacioacuten de bacterias competentes El gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH amplificado se clonoacute en los
plaacutesmidos pTM1 pGEM4 y pRB21 Los dos primeros para expresioacuten y el tercero para el
desarrollo de los virus vaccinia recombinantes Asiacute cada plaacutesmido y los fragmentos
amplificados por RT-PCR se digirieron con las enzimas correspondientes -pTM1
(NcoIBamHI) pGEM4 (HindIIIAsp718) y pRB21 (EcoRIHindIII)- seguacuten las indicaciones
de la casa comercial para cada caso En el caso del plaacutesmido pTM1 el gen de la proteiacutena
F se digirioacute con la enzima AflIII que deja unos extremos compatibles con NcoI A
continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar
una posible recircularizacioacuten La enzima se inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos
El plaacutesmido tratado y los fragmentos amplificados se ligaron incubando la mezcla con la
enzima T4 DNA ligasa durante 15 minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida
de Roche)
Bacterias Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico
(15minhielo 1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
III225 Seleccioacuten de bacterias transformadas y secuenciacioacuten de las colonias positivas
Las bacterias transformadas se crecieron en placas de Circle-Grow con ampicilina
durante toda la noche a 37ordmC Para detectar las colonias que llevan el plaacutesmido con el gen
de la F de MNVH se hizo una PCR directamente de las colonias Para esto se tomaron
con una punta esteacuteril bacterias de las colonias a analizar y se agregaron a 50microl de mezcla
de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR (Promega) 200 microM dNTPs
75 ng de cada uno de los primers (los mismos que se utilizaron para el clonaje Tabla 2
apartado III116) y 5U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min
94ordmC 30seg 55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta
PCR se corrioacute en un gel de agarosa 1 y aquellas colonias en las que se amplificoacute una
banda de tamantildeo esperado (1620pb) se crecieron en 5ml de LB con ampicilina durante
Materiales y Meacutetodos
44
toda la noche con agitacioacuten fuerte a 37ordmC Se realizoacute una miniprep (Promega) de cada
uno de estos cultivos seguacuten las indicaciones de la casa comercial
El gen que codifica para la proteina F clonado en estos plaacutesmidos se secuencioacute
completamente con los primers indicados en la Tabla 2 (III116) La secuenciacioacuten del
DNA se llevoacute a cabo en un secuenciador automaacutetico Perkin-Elmer utilizando el Kit Big Dye
31 (Applied Biosystems) Para cada reaccioacuten de PCR se empleoacute como molde 100-300ng
de DNA y 30ng de los oligonucleoacutetidos especiacuteficos complementarios a regiones internas
del gen clonado (Tabla 2 III116) El perfil de ciclado fue el siguiente 94ordmC3min
96ordmC30seg 55ordmC4min (x 25min)
III226 Correccioacuten de secuencia y produccioacuten de mutantes de la proteiacutena F
Para la correccioacuten de la secuencia de la proteiacutena F asiacute como para la produccioacuten
posterior de mutantes se utilizoacute el kit de mutageacutenesis dirigida (Quik Change site-directed
mutagenesis kit Stratagene) usando como molde los plaacutesmidos pRB21-F pGEM4-F o
pTM1-F y los oligos correspondientes (Tabla 2 III116) El programa de PCR utilizados
fue 95ordmC 3min 95ordmC 30seg 55ordmC 1min 68ordmC 14min (x 18 ciclos) El resultado de la PCR
se dirigioacute seguacuten las indicaciones del proveedor con DpnI para eliminar el DNA parental
metilado
Bacterias E coli DH5α competentes se transformaron con los plaacutesmidos
resultantes Las ceacutelulas competentes se incubaron 5min en hielo y posteriormente se les
antildeadioacute el plaacutesmido y se incubaron 15min a 4ordmC 1min a 42ordmC y finalmente 5min a 4ordmC A
continuacioacuten se antildeadioacute 1ml de LB y se incubaron durante 1hora a 37ordmC Las bacterias
transformadas se crecieron durante la noche a 37ordmC en placas de Circle-Grow con
100microgml de ampicilina Se crecieron varias colonias y se seleccionaron aquellas cuya
secuencia fue la esperada
III227 Subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH en el plaacutesmido pCAGGS
El subclonaje del gen que codifica para la proteiacutena F del MNVH se realizoacute
amplificando el gen por PCR a partir del plaacutesmido pTM1 Para esto 5ng de pTM1-F se
agregaron a 50microl de mezcla de reaccioacuten con una concentracioacuten final de 1x tampoacuten PCR
Materiales y Meacutetodos
45
(Promega) 200 microM dNTPs 75 ng de cada uno de los primers (Tabla 2 apartado III116)
y 05U de Taq Polimerasa (Stratagene) El perfil de PCR fue 94ordmC 2min 94ordmC 30seg
55ordmC 45seg 72ordmC 45seg (x 25 ciclos) 72ordmC 2min El producto de esta PCR y el
plaacutesmido pCAGGS se digirieron primero con EcoRI y luego con SmaI de acuerdo a las
especificaciones de la casa comercial A continuacioacuten el plaacutesmido se tratoacute durante 1 hora
a 37ordmC con fosfatasa alcalina para evitar una posible recircularizacioacuten La enzima se
inactivoacute calentando a 65ordmC durante 30 minutos El plaacutesmido tratado y los fragmentos
amplificados se ligaron incubando la mezcla con la enzima T4 DNA ligasa durante 15
minutos a temperatura ambiente (kit de ligacioacuten raacutepida de Roche) Entonces bacterias
Ecoli DH5α competentes se transformaron mediante choque teacutermico (15minhielo
1min42ordmC y 2minhielo) con el producto de ligacioacuten
La seleccioacuten y secuenciacioacuten de colonias positivas se realizoacute de acuerdo a lo
indicado en III225
III228 Ensayo de fusioacuten de membranas Monocapas confluentes de ceacutelulas BSR T75 Vero 118 BHK o LLC-MK2
creciendo en microcaacutemaras (sim2x106 ceacutelulas) con DMEM-10 sin antibioacutetico se
transfectaron con 1microgr de DNA de plaacutesmidos que codificaban para la proteiacutena F del
MNVH Para estas transfecciones se utilizoacute Fugene (Roche) en una proporcioacuten 21 (microl
Fugenemicrogr de DNA) seguacuten las indicaciones de la casa comercial Para ello el DNA
disuelto en agua se llevo hasta 20microl con medio Optimem (Gifco) y se incuboacute con 2microl de
Fugene durante 45 minutos a temperatura ambiente Entonces se antildeadioacute la mezcla a las
ceacutelulas en medio DMEM-0 y se incuboacute durante 7horas a 37ordmC Luego se retiroacute el medio
se lavoacute dos veces con DMEM-25 y se mantuvieron las ceacutelulas en DMEM-25 por 16horas
Entonces las ceacutelulas se lavaron con DMEM-0 y se incubaron durante 1 hora con
medio DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2)
Posteriormente se retiroacute el medio y luego de lavar con PBS 1x pH=7 se sometieron
a pulsos de 4 minutos con pH aacutecido (PBS pH=5 10mM Hepes 5mM MES) Se retiroacute
nuevamente el medio y despueacutes de lavar con PBS 1x pH=7 se incubo durante 1 hora
con DMEM-0 con tripsina (05microgrml para las ceacutelulas BHK y BSR T75 2microgrml ceacutelulas
Vero 118 y LLC-MK2) Luego de este tiempo las ceacutelulas se lavaron y se mantuvieron
Materiales y Meacutetodos
46
durante 2 horas en DMEM-25 Este proceso se repitioacute 3 veces y entonces las ceacutelulas se
incubaron 20 horas maacutes en DMEM-0 con tripsina Todos los lavados e incubaciones se
hicieron a 37ordmC o con tampones pre-calentados Finalmente las ceacutelulas se fijaron con
metanol friacuteo y acetona y se realizoacute la inmunofluorescencia como se describe en el
apartado III253
III23 Purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH III231 Cromatografiacutea de Intercambio Anioacutenico
Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM- se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del ingleacutes
ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (sim100x)
Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de unioacuten Tris-HCl
20mM pH=75 se centrifugoacute 10min a maacutexima velocidad y se aplicoacute a una columna de
intercambio anioacutenico Q (Vivapure Q Vivascience Sartorious) previamente equilibrada en
dicho tampoacuten La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas por centrifugacioacuten con 500microl del tampoacuten
Tris-HCl 20mM pH=75 con 100 500 y 1000mM de NaCl La purificacioacuten se siguioacute por
SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y
con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante que
expresa la forma FTM-6His se concentroacute utilizando un sistema de flujo tangencial a traveacutes
de membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquopeso molecular corterdquo del
ingleacutes ldquoMolecular weight cut-offrdquo Sartorious) hasta un volumen final de 10-30ml (Entre 100
y 200 veces) Posteriormente este sobrenadante concentrado se dializoacute en el tampoacuten de
unioacuten 20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM Imidazol y se aplicoacute a una columna
HisTrap HP de 1ml (GE Healthcare) utilizando el sistema AKTAPrime Plus (GE Healthcare)
a un flujo de 03mlmin La columna se lavoacute a un flujo de 05mlmin con este tampoacuten de
unioacuten hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5
fracciones (5ml) La elucioacuten se realizoacute a 05mlmin y en 3 etapas con el volumen necesario
(hasta que la densidad oacuteptica se estabilizoacute en cero unidades en por lo menos 5 fracciones)
Materiales y Meacutetodos
47
del tampoacuten de elucioacuten (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl con 100mM 300mM y
500mM de Imidazol) La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se
reveloacute con el anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III232 Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel La muestra a inyectar en la columna de filtracioacuten en gel se dializoacute en el tampoacuten
de Tris-HCl 20mM pH=75 100mM NaCl se centrifugoacute a maacutexima velocidad 10min a 4ordmC y
se aplicoacute en este mismo tampoacuten (pre-enfriado a 4ordmC) en una columna de Superosa 12 HR
1030 La cromatografiacutea se llevo a cabo utilizando el sistema automaacutetico AKTAPurifier (GE
Healthcare) a un flujo constante de 03mlmin y siguiendo las recomendaciones de la
casa comercial para la columna utilizada (presioacuten etc) Se recogieron fracciones de 06ml
La purificacioacuten se siguioacute por SDS-PAGE 10 y western blot que se reveloacute con el
anticuerpo F465-484 diluido 15000 y con el anticuerpo anti-BSA diluido 11000
III24 Obtencioacuten de sueros policlonales en conejos New Zealand III241 Sueros policlonales frente a peacuteptidos sinteacuteticos con secuencia de la proteiacutena F del MNVH
Los peacuteptidos liofilizados se resuspendieron seguacuten su carga neta aparente en AcNa
100mM pH=52 (F83-102 y F226-244) o en CO3HNa 100mM pH=90 (F465-484)
Entonces estos peacuteptidos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund (Difco)
y se inocularon intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New Zealand
(por peacuteptido) de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten dos veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 13 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar
que los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -
20ordmC
Materiales y Meacutetodos
48
III242 Sueros policlonales frente a los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-FTM- Los virus vaccinia recombinante vv-F y vv-FTM- purificados por colchoacuten de sacarosa
se inocularon en conejos New Zealand (1x107ufp por conejo) Cada virus se inoculoacute
intramuscularmente en las patas de un par de conejos Se repitioacute esta inoculacioacuten dos
veces maacutes con intervalos de 15-20 diacuteas
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III243 Sueros policlonales frente a proteiacutena FTM- 6His purificada
Proteiacutena FTM- 6His purificada se emulsionoacute en adyuvante completo de Freund
(Difco) y se inoculoacute intradermicamente en muacuteltiples sitios del lomo a dos conejos New
Zealand de los que previamente se habiacutea extraiacutedo suero preinmune Al cabo de tres
semanas se les dio una segunda dosis de antiacutegeno emulsionado en adyuvante incompleto
de Freund (Difco) esta vez intramuscularmente en las patas traseras Se repitioacute esta
inoculacioacuten una vez maacutes 15-20 diacuteas despueacutes
Los conejos se sangraron por la oreja 15 diacuteas despueacutes de la uacuteltima inoculacioacuten y
los antisueros se separaron del coaacutegulo de sangre por centrifugacioacuten Se realizaron un
total de 7 sangriacuteas cada 20 diacuteas que fueron analizadas por ELISA Luego de verificar que
los tiacutetulos eran similares en todas las sangriacuteas eacutestas se juntaron y se congelaron a -20ordmC
III25 Meacutetodos para el anaacutelisis de proteiacutenas III251 ELISA
Placas de cloruro de polivinilo se recubrieron con 50microl de antiacutegeno diluido en PBS
(asymp 30ng de proteiacutena FTM- 6His purificada o 1microgr de peacuteptido) y se incubaron durante la
noche a 4ordmC Los pocillos se saturaron durante 30 minutos con 2 suero de cerdo (SC)
diluido en 005 Tween-20 en PBS para el ensayo de sueros o con SAB1 en PBS para
el caso de anticuerpos monoclonales A continuacioacuten se incuboacute 1hora a 37ordmC con los
sueros o AcMs diluidos en el tampoacuten anterior correspondiente Los complejos inmunes se
detectaron con un anticuerpo anti-Ig especiacutefico de especie conjugado con peroxidasa y se
revelaron con OPD (Sigma) diluido en tampoacuten 01M citrato 02M fosfato pH=55 y H2O2 al
Materiales y Meacutetodos
49
006 La reaccioacuten se paroacute antildeadiendo 3N H2SO4 y la densidad oacuteptica se midioacute a 490nm
III252 Electroforesis electrotransferencia e inmunodeteccioacuten de proteiacutenas (western blot)
Las proteiacutenas diluidas en tampoacuten de muestra (008M Tris-HCl pH68 2 SDS 10
glicerol 001 de azul de bromofenol) se separaron electroforeacuteticamente en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10 en presencia de 5 szlig-Mercaptoetanol a 80V hasta
que la muestra pasa el concentrador y a 120-150V mientras se resuelve en el separador
El gel se tintildeoacute durante 2 horas con 005 azul de Coomasie 45 metanol 7
aacutecido aceacutetico en agua El exceso de colorante se eliminoacute con 25 metanol 7 aacutecido
aceacutetico en agua
Cuando el gel se utilizoacute para realizar un western blot se electrotransfirioacute a papel
Inmobilon-P (Towbin et al 1979) en tampoacuten de transferencia (25mM Tris-HCl pH75
192mM Glicina y 20 metanol) durante 2 horas a 220mA Los sitios de unioacuten inespeciacutefica
de la membrana se bloquearon durante 1hora a temperatura ambiente o alternativamente
toda la noche a 4ordmC con 02 I-Block en PBS con 01 Tween20 Posteriormente la
membrana se incuboacute con agitacioacuten durante 1 hora a temperatura ambiente con los
antisueros diluidos en la solucioacuten de bloqueo A continuacioacuten la membrana se lavoacute con
PBS-005 Tween 20 Los complejos antiacutegeno-anticuerpo se detectaron mediante la
incubacioacuten con anti-Ig conjugado con peroxidasa y tras lavar la membrana nuevamente
con PBS 01 Tween 20 se revelaron con el sustrato luminiscente ECL (100mMTris-HCl
pH=85 800mM luminol 5mM aacutecido cumaacuterico y 003 H2O2) detectaacutendose las bandas
por autoradiografiacutea
III253 Inmunofluorescencia Las ceacutelulas se fijaron con metanol durante 5 minutos y con acetona durante 30
segundos ambos preenfriados a -20ordmC dejaacutendose posteriormente secar a temperatura
ambiente Despueacutes de bloquear los sitios de unioacuten inespeciacutefica con PBS-SAB 1 (cuando
el anticuerpo primario es un suero policlonal) o con PBS (para anticuerpos monoclonales)
las ceacutelulas se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante 30 minutos a
temperatura ambiente Posteriormente las ceacutelulas se lavaron con PBS e incubaron con
un anticuerpo secundario anti-Ig de ratoacuten conjugado con fluoresceiacutena (Amersham-
Materiales y Meacutetodos
50
Biosciences) diluido en PBS Por uacuteltimo las ceacutelulas se lavaron con PBS y H2O y se
observaron en un microscopio Zeiss equipado con un sistema de fluorescencia
III254 Microscopiacutea electroacutenica Las proteiacutenas se absorbieron a rejillas de carbono y se tintildeeron con 1
silicotungtato soacutedico a pH70 Para visualizar las muestras se utilizoacute un microscopio
electroacutenico Jeol 1200 a 100kV Las micrografiacuteas se tomaron con una dosis miacutenima en
condiciones de desenfoque que permitieron una resolucioacuten de 15nm aproximadamente
(Wrigley 1986)
III26 Estudios bioinformaacuteticos III261 Alineamiento de secuencias
Los alineamientos de las secuencias utilizado para este trabajo se realizoacute con el
programa BLAST 2 Sequences del paquete informaacutetico ExPASy Proteomics Server
(Tatusova 1999) o utilizando el programa MultAlin de la plataforma bioinformaacutetica
disentildeada por Genopole Toulouse-Midi-Pyreacuteneacutees (Corpet 1988)
III262 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH
Para conocer el perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F se utilizoacute el programa
Protscale (Gasteiger 2005) del grupo de programas de Expasy Proteomics Server que
aplica el algoritmo de Kyte amp Doolittle (Kyte et al 1982) utilizando ventanas de nueve
aminoaacutecidos y solapando los valores de 8 residuos
III263Determinacioacuten del punto Isoeleacutectrico teoacuterico de la proteiacutena F del MNVH El punto isoleacutectrico (pI) teoacuterico fue calculado utilizando el programa ProtParam
(Gasteiger 2005) del grupo de herramientas para la identificacioacuten y anaacutelisis de proteiacutenas
ExPASy Proteomic Server
IV RESULTADOS
Resultados
51
IV RESULTADOS
IV1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES IV1A Seleccioacuten de la liacutenea celular y de las condiciones para crecer el MNVH en cultivos celulares
Dado que en el laboratorio no se habiacutea trabajado anteriormente con el MNVH
se probaron diversas condiciones y liacuteneas celulares donde se evaluoacute la replicacioacuten de
este virus Para esto se infectaron ceacutelulas HEp-2 Vero 118 BHK BSR T75 o LLC-MK2
con la cepa NL199 del MNVH y la infeccioacuten se siguioacute por la aparicioacuten de efecto
citopaacutetico al microscopio oacuteptico y la aparicioacuten de ceacutelulas fluorescentes reveladas con un
suero de cobaya anti-MNVH (suero cedido por el Dr ADM Osterhaus) como se muestra
en la figura IV1 (panel A) Se llegoacute a la conclusioacuten de que si bien todos los tipos
celulares eran infectados por el MNVH el virus infectaba mejor a las ceacutelulas LLC-MK2
Esta liacutenea celular se utilizoacute por tanto habitualmente para la produccioacuten de semilla de
virus y extractos de ceacutelulas infectadas por el MNVH
La infeccioacuten del MNVH se describioacute como dependiente de tripsina en ceacutelulas tMK
(cultivo terciario de rintildeoacuten de mono van den Hoogen et al 2001) Puesto que en los
laboratorios no se dispone en general de este tipo de ceacutelulas se decidioacute comprobar si el
crecimiento del MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 tambieacuten era dependiente de tripsina Para
esto se antildeadieron varias cantidades de tripsina a cultivos de LLC-MK2 a distintos
tiempos despueacutes de la adsorcioacuten del virus Como se observa en la figura IV1 si no se
agrega tripsina la infeccioacuten se restringe a ceacutelulas individuales (panel B) es decir el virus
no se puede propagar a ceacutelulas vecinas Al agregar tripsina a una concentracioacuten de 2
microgml (panel C) se observoacute que apareciacutean focos de ceacutelulas infectadas en la monocapa
indicando que el virus era capaz de propagarse a ceacutelulas adyacentes
La concentracioacuten de tripsina de 2microgml resultoacute ser oacuteptima puesto que
concentraciones mayores teniacutean un efecto toacutexico en las ceacutelulas Ademaacutes la infeccioacuten fue
maacutes eficiente cuando cada dos diacuteas se retiroacute medio de cultivo de la placa (sim25) y se
agregoacute medio nuevo con tripsina (2microgml)
Resultados
52
El efecto citopaacutetico en las ceacutelulas LLC-MK2 aparece paulatinamente durante los
3-4 diacuteas posteriores a la infeccioacuten por el MNVH (figura IV2) A diferencia de lo que ocurre
con la mayoriacutea de los paramixovirus donde se observa la aparicioacuten de sincitios tras la
infeccioacuten el efecto producido por el MNVH en ceacutelulas LLC-MK2 se caracteriza por la
aparicioacuten de ceacutelulas redondeadas Eacutestas van aumentando en nuacutemero a medida que
avanza la infeccioacuten dando lugar a cuacutemulos o grupos de ceacutelulas redondeadas que
finalmente se desprenden cuando la infeccioacuten llega a sus estadiacuteos finales
Figura IV2 Evolucioacuten del efecto citopaacutetico en ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por MNVH Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01 uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Las fotografiacuteas se tomaron con un microscopio de contraste de fases a distintos tiempos post-infeccioacuten A 0h B 24h C 48h y D 72h
Figura IV1 Inmunofluorescencia de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con MNVH Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo y se agregoacute medio DMEM-25 (A) medio DMEM-0 sin tripsina (B) o medio DMEM-0 con 2 microgml de tripsina (C) Las ceacutelulas se fijaron a las 48h y se revelaron con un suero de cobaya anti-MNVH diluiacutedo 1100 (A) o con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200 (B y C)
Resultados
53
Figura IV3 Tincioacuten inmunohistoquiacutemica con AEC de ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron a una mdi de 01uffcel Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se quitoacute el inoacuteculo y la monocapa celular se lavoacute con medio DMEM-0 A continuacioacuten se agregoacute DMEM-0 con agarosa al 07 (A) o DMEM-0 con agarosa al 07 y 2microgml de tripsina (B) Las ceacutelulas se fijaron a los 4 diacuteas y se revelaron con un anticuerpo anti-F y AEC como sustrato de la reaccioacuten colorimeacutetrica
IV1B Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Como meacutetodo adicional para el seguimiento de la infeccioacuten por el MNVH asiacute
como para su titulacioacuten se puso a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos
Para esto ceacutelulas LLC-MK2 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del MNVH
Despueacutes de una hora de adsorcioacuten se retiroacute el inoacuteculo se lavoacute con medio DMEM-0 y se
agregoacute agarosa al 07 en DMEM-0 conteniendo (o no) 2microgml de tripsina A los 4 diacuteas
las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un suero anti-proteiacutena F (descrito maacutes adelante)
como se indica en Materiales y Meacutetodos Las ceacutelulas infectadas se pusieron de manifiesto
con el sustrato cromoacutegenico 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) que forma un producto final
rojo insoluble en agua lo que permite visualizar a las ceacutelulas infectadas con un color
marroacuten rojizo sobre un fondo claro de ceacutelulas sin infectar
En la figura IV3 se observa que las ceacutelulas infectadas teniacutean una coloracioacuten
rojiza tanto en ausencia como en presencia de tripsina sin embargo y de acuerdo a lo
observado por inmunofluorescencia en ausencia de tripsina (panel A) la infeccioacuten se
restringioacute a ceacutelulas individuales mientras que en presencia de tripsina (panel B) la
infeccioacuten se extendioacute tambieacuten a ceacutelulas vecinas dando lugar a la aparicioacuten de focos Por
esto en ausencia de tripsina el contaje de ceacutelulas infectadas fue maacutes tedioso y
dependiente de la observacioacuten al microscopio oacuteptico mientras que en presencia de
tripsina la formacioacuten de focos de ceacutelulas infectadas por MNVH facilitoacute el contaje a simple
vista
Resultados
54
Como consecuencia de los resultados presentados en este apartado las
semillas de MNVH producidas en el laboratorio se crecieron habitualmente en ceacutelulas
LLC-MK2 en presencia de tripsina durante 5-6 diacuteas Cada dos diacuteas se retiroacute el 25 de
medio de la placa y se agregoacute medio DMEM-0 fresco con 2microgml de tripsina Los tiacutetulos
obtenidos fueron del orden de 105uffml
IV2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
En primer lugar se sintetizaron los oligonucleoacutetidos con la secuencia del gen que
codifica para la proteiacutena F y a los sistemas en los que se queriacutea clonar el gen (Tabla III2
de Materiales y Meacutetodos) Entonces se realizoacute la puesta a punto del protocolo de RT-PCR
para determinar la temperatura de hibridacioacuten y concentracioacuten salina oacuteptimas Una vez
puesto a punto este protocolo se realizoacute la amplificacioacuten del gen de la proteiacutena F del
MNVH a partir del RNA total obtenido de ceacutelulas infectadas por el virus como se indica en
Materiales y Meacutetodos
El producto de estas RT-PCRs se clonoacute en los plaacutesmidos pGEM-4 (Promega)
pTM1 (Moss et al 1990) y pRB21 (Blasco et al 1995) como se indica en el esquema de
la figura IV4 El plaacutesmido pGEM-4 se seleccionoacute por ser un vector de clonaje que tiene
un tamantildeo pequentildeo (2781pb) lo que permite una alta eficiencia de transformacioacuten y el
clonado de genes de gran tamantildeo y un sitio de clonaje muacuteltiple reconocido por
numerosas enzimas de restriccioacuten Ademaacutes tiene las secuencias del promotor y
terminador de SP6 y T7 en sentido opuesto y flanqueantes al sitio de clonaje muacuteltiple lo
que permite una siacutentesis controlada de RNA positivo (mRNA) o negativo de acuerdo a la
polimerasa que se utilice o simplemente la secuenciacioacuten del gen de intereacutes pTM1 es un
vector de expresioacuten bajo el control de la RNA polimerasa del fago T7 que posee la regioacuten
5acute no traducible (5acuteUTR) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) despueacutes del promotor
de la polimerasa T7 lo que hace que los transcritos de este plaacutesmido sean maacutes estables y
traducibles por un mecanismo independiente de CAP (Elroy-Stein et al 1989 Fuerst et
al 1989) aumentando considerablemente la expresioacuten de la proteiacutena de intereacutes en
comparacioacuten con por ejemplo el plaacutesmido pGEM-4 Por uacuteltimo el pRB21 es un plaacutesmido
que contiene un promotor fuerte tempranotardiacuteo del virus vaccinia y unas regiones del
Resultados
55
Figura IV4 Esquema del clonaje del gen de la proteiacutena F del MNVH en los distintos vectores El producto de la amplificacioacuten por RT-PCR se digirioacute con las enzimas de restriccioacuten seleccionadas en cada uno de los plaacutesmidos en los que fue clonado Estas enzimas se muestran en rojo en el esquema de cada plaacutesmido El procedimiento de clonaje se detalla en Materiales y Meacutetodos (apartado III22) AmpR resistencia a ampicilina EMCV 5acuteUTR del virus de la encefalomiocarditis vv regiones del virus vaccinia utilizadas en la recombinacioacuten homoacuteloga para el desarrollo de virus vaccinia recombinante vP37 gen de la proteiacutena P37 del virus vaccinia PEL promotor temprano tardiacuteo del virus vaccinia T7 o SP6 promotores T7 o SP6
pRB21 5537 bps
EcoRISse8387PstINheISmaIXmaIHindIIIDsaINcoIStuI
vP37 AmpR
vv
vv PEL
pGEM4 2871 bps
AmpR
ApoI EcoRI Ecl136 SacI Asp718 KpnI AvaI SmaI XmaI BamHI XbaI AccI HincII SalI BspMI Sse8387 PstI SphI HindIII T7
SP6
T7 NcoI EcoRISmaIXmaIEcl136SacISpeIBamHIXhoIStuIPacIAccIHincIISalI
pTM1 5358 bps
AmpR
EMCV
Gen Proteiacutena F Digerido con las enzimas
correspondientes
Clonaje en plaacutesmido
Ceacutelulas infectadas con MNVH
RNA total RT-PCR
mismo virus flanqueantes para originar un virus vaccinia recombinante por recombinacioacuten
homoacuteloga que lleve la proteiacutena de intereacutes
Al secuenciar el gen de la proteiacutena F clonado en el plaacutesmido pRB21 se observoacute
que teniacutea algunos cambios con respecto a la secuencia del gen F clonado en los
plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 Ademaacutes tanto las secuencias del gen F clonado en los
plaacutesmidos pTM1 y pGEM-4 como en el pRB21 teniacutean cambios respecto a la secuencia
obtenida a partir de clones infectivos rescatados a partir de la cepa NL199 que fue la
que se utilizoacute en el clonaje o la NL100 (R Fouchier comunicacioacuten personal) que
pertenece al otro subtipo En la Tabla IV1 se indica la secuencia obtenida para dichos
clones infectivos asiacute como tambieacuten los cambios observados en la secuencia del gen de la
proteiacutena F clonada en los diferentes vectores Como puede observarse en dicha tabla se
detectaron cuatro cambios no conservativos en las posiciones 27 197 280 y 354 Puesto
que los cambios de aminoaacutecidos en estas posiciones correspondiacutean a residuos que
Resultados
56
estaban conservados en las cepas NL199 y NL100 que representan dos subtipos
distintos del MNVH se consideroacute que dichos cambios podriacutean influir de forma significativa
en las propiedades de la moleacutecula y por ello se corrigieron mediante mutageacutenesis dirigida
como se indica en la Tabla IV1 Asiacute la secuencia del gen F fue ideacutentica en todos los
vectores y se correspondiacutea con la secuencia obtenida en el laboratorio del Dr Osterhaus
cuya funcionalidad se habiacutea comprobado por rescate de virus infectivo a partir de una
copia de cDNA completo del genoma del MNVH (R Fouchier comunicacioacuten personal)
En nuestro laboratorio se construyoacute un mutante de la proteiacutena F del VRSH que
careciacutea de la regioacuten transmembrana (FTM- Bembridge et al 1999) Esta forma soluble de
la glicoproteiacutena F del VRSH se comportoacute igual que la proteiacutena salvaje en cuanto a
procesamiento plegamiento oligomerizacioacuten y reactividad con AcMs (Calder et al 2000)
sin embargo es una forma mucho maacutes sencilla de manejar y purificar ya que se secreta al
sobrenadante de ceacutelulas infectadas con estos virus vaccinia recombinantes Asumiendo
que dada la homologiacutea funcional y estructural que existe entre las proteiacutenas F del MNVH y
del VRSH el comportamiento entre las formas completa y soluble podriacutea ser el mismo
decidimos producir tambieacuten el mutante FTM- en pRB21 y el vaccinia recombinante
correspondiente Para esto se cambioacute en el pRB21-F el codoacuten Gly 478 por un codoacuten de
terminacioacuten por mutageacutenesis dirigida
Despueacutes de realizar la mutageacutenesis dirigida se comprobaron por secuenciacioacuten
los cambios introducidos y los plaacutesmidos obtenidos se emplearon en un ensayo de
expresioacuten transitoria (no mostrado) para comprobar por inmunofluorescencia que se
expresaban las distintas formas de la proteiacutena F
Una vez que se comproboacute que todos los plaacutesmidos teniacutean la secuencia correcta
Tabla IV1 Cambios de aminoaacutecidos entre los distintos plaacutesmidos y subtipos de MNVH En negro se indica la secuencia obtenida para cada plaacutesmido en rojo los cambios realizados por mutageacutenesis dirigida
Aminoaacutecido (Nordm en la
secuencia) NL100 NL199 pTM1
pGEM-4_FM pRB21_FM
27 S S L --gtS S
197 N N N S --gtN
280 D D G --gtD G --gtD
354 I I M --gtI I
Resultados
57
Figura IV5 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F (A) y vv-FTM- (B) Las ceacutelulas se infectaron a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con un pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
A B
y que todos expresaban las distintas formas de la proteiacutena F (F o FTM-) se procedioacute a la
construccioacuten de los virus vaccinia recombinantes para ambas formas tal como se
describe en Materiales y Meacutetodos Este tipo de vectores tienen dos ventajas para nuestro
propoacutesito Primero los transcritos de los virus vaccinia recombinantes no son expuestos a
las enzimas celulares de splicing esto evita el riesgo de un procesamiento inapropiado
que podriacutea ocurrir con secuencias que como el gen de la proteiacutena F han evolucionado
exclusivamente en el citoplasma Segundo las glicoproteiacutenas de membrana F y G del
VRSH un virus estrechamente relacionado al MNVH que han sido expresadas utilizando
este sistema fueron indistinguibles de las producidas por una infeccioacuten por VRSH en lo
que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuro distribucioacuten celular expresioacuten en la
superficie celular antigenicidad o movilidad electroforeacutetica (Ball et al 1986 Olmsted et al
1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
Cuando se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes vv-F y vv-F TM- se
comproboacute por inmunofluorescencia la expresioacuten de las dos formas de la proteiacutena Como
se observa en la figura IV5 tanto el vaccinia vv-F como el vv-FTM- expresaron la proteiacutena
F Entonces se seleccionoacute una placa de cada recombinante y se realizoacute la produccioacuten y
titulacioacuten de la semilla El tiacutetulo obtenido fue del orden 108-109 ufpml para los dos virus
IV2A Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel
Una vez que se obtuvieron los virus vaccinia recombinantes se procedioacute a la
purificacioacuten de la proteiacutena FTM- para conseguir una muestra lo suficientemente pura que
nos permitiera su observacioacuten al microscopio electroacutenico y su inoculacioacuten en conejos para
obtener sueros policlonales anti-F
Resultados
58
Este mutante como se comentoacute en la introduccioacuten al carecer de la regioacuten
transmembrana es secretado al sobrenadante por lo que su manejo y purificacioacuten es
teoacutericamente maacutes sencillo que a partir de extractos celulares o de membranas de ceacutelulas
infectadas Asiacute el sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vaccinia F TM- se
recogioacute y concentroacute mediante un sistema de filtracioacuten con flujo tangencial a traveacutes de
membranas con un tamantildeo de poro de 100000 MWCO (ldquoMolecular weight cut-offrdquo o ldquopeso
molecular corterdquo Sartorious) 100-200 veces hasta un volumen final de 10-30ml
En un primer momento y dado que no contaacutebamos con anticuerpos
monoclonales para una purificacioacuten por columna de inmunoafinidad se decidioacute intentar
una purificacioacuten por cromatografiacutea de intercambio ioacutenico (columnas Vivapure Vivascience)
y posterior cromatografiacutea de exclusioacuten molecular o filtracioacuten en gel (columna de Superosa
12HR 1030 GE Healthcare) La primera nos permitiriacutea una purificacioacuten de la F TM-
aprovechando la diferencia de carga que tiene cada una de las diferentes proteiacutenas en
una preparacioacuten cualquiera (en este caso sobrenadante concentrado) a un pH
determinado La segunda nos permitiriacutea separar por tamantildeo las diferentes proteiacutenas
ademaacutes de arrojar una aproximacioacuten de tamantildeo para aquellas proteiacutenas globulares en
preparaciones homogeacuteneas
Para determinar cuaacuteles eran las condiciones maacutes eficientes de purificacioacuten por
intercambio ioacutenico se evaluaron diferentes tampones utilizando tanto columnas de
intercambio catioacutenico como anioacutenico (Vivapure S y Q respectivamente) Siguiendo las
indicaciones de la casa comercial se probaron tampones diferentes y varios rangos de pH
Estos tampones fueron AcNa 20mM (pH= 40 45 50 55) Na2HPO4NaH2PO4 20mM
(pH= 60 65 70 75) y Tris-HCl 20mM (pH= 75 80 85) La proteiacutena FTM- se unioacute
mejor a una columna de intercambio anioacutenico (Vivapure Q) en el tampoacuten Tris-HCl 20mM
pH=75 y se eluyoacute a una concentracioacuten de NaCl que permitioacute su separacioacuten de la
seroalbuacutemina bovina (SAB) un contaminante mayoritario proveniente del medio de cultivo
celular
La figura IV6 muestra un SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie o revelado
por western blot de una purificacioacuten tipo por intercambio anioacutenico en la que el
sobrenadante de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el vv-FTM- se concentroacute dializoacute en el
tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 y se aplicoacute a una columna de intercambio anioacutenico
Resultados
59
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Ap
NR
E
1
E2
E3
Figura IV6 Pruebas de intercambio ioacutenico para la purificacioacuten de la proteiacutena FTM- Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-FTM- se concentroacute (sim100x) se dializoacute en tampoacuten de unioacuten (Tris-HCl 20mM pH=75) y se aplicoacute a la columna de intercambio anioacutenico La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas con 500ul de tampoacuten Ap aplicado sobrenadante concentrado NR no retenido E1 tampoacuten Tris-HCl 20mM con 100mM NaCl E2 con 500mM NaCl E3 con 1M NaCl Panel A SDS-PAGE tentildeido con Azul de Coomassie de la purificacioacuten Panel B western blot de la purificacioacuten revelado con un suero anti-F diluido 15000 Panel C Idem panel B pero revelado con anticuerpos anti-SAB diluido 11000
(Vivapure Q) La elucioacuten se hizo en 3 etapas aumentando la concentracioacuten salina
(E1=100mM E2=500mM y E3=1M NaCl) con un volumen de 500ul para cada condicioacuten
por lo que la muestra ademaacutes de purificarse se concentroacute En los western blot (paneles B
y C) se ve que la proteiacutena FTM- sale mayoritariamente en la fraccioacuten E1 (100mM NaCl) y
en cambio la SAB sale en la fraccioacuten E2 (500mM) ademaacutes por el SDS-PAGE tentildeido con
azul de Coomasie se ve que la mayor parte de las proteiacutenas contaminantes salen tambieacuten
en la fraccioacuten E2
La fraccioacuten E1 se sometioacute entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en
una columna Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) utilizando el sistema automaacutetico
AKTA Purifier (GE Healthcare) Como proteiacutena patroacuten se utilizoacute SAB dado que
conociacuteamos su tamantildeo (75KDa) y perfil de elucioacuten En el cromatograma de la figura IV7
se observa en rojo el perfil de la SAB y en 4 diferentes colores las curvas pertenecientes
a 4 purificaciones diferentes Al contrario de lo que se esperaba basaacutendonos en el perfil
de elucioacuten del mutante FTM- del VRSH (que por su conformacioacuten trimeacuterica tiene un tamantildeo
de sim220KDa y eluye antes que la SAB) la proteiacutena FTM- del MNVH eluyoacute despueacutes de la
SAB como si tuviera un tamantildeo menor
Al observar la fraccioacuten 11 de esta purificacioacuten al microscopio electroacutenico no se
pudo distinguir ninguna moleacutecula de proteiacutena F (no mostrado) Ademaacutes la muestra teniacutea
un elevado grado de impureza para realizar este tipo de ensayos
Resultados
60
SAB
Distintos lotes de FTM-
mAU 400
200
0
10 15 20 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
75 50 37
Figura IV7 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- por Filtracioacuten en gel La fraccioacuten E1 de la purificacioacuten por intercambio ioacutenico se aplicoacute a una columna Superosa 12HR 1030 Panel Superior cromatograma de la purificacioacuten por filtracioacuten en gel En rojo se muestra el perfil de la proteiacutena SAB y en distintos colores el perfil de los diferentes lotes purificados de FTM- Panel inferior western blot de las distintas fracciones de la purificacioacuten revelado con un suero anti- F diluido 15000
IV2B Purificacioacuten de la proteiacutena F TM- 6His por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten lo suficientemente pura que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten
al microscopio electroacutenico decidimos agregar una cola de 6 histidinas al mutante sin la
regioacuten citoplasmaacutetica (FTM-) para poder purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de
afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y un paso posterior de filtracioacuten en gel El mutante
FTM-6His se obtuvo por mutageacutenesis dirigida agregando un tag de 6 histidinas al plaacutesmido
pRB21-FTM- y originando entonces el vaccinia correspondiente La purificacioacuten de FTM-6His
se realizoacute a traveacutes de columnas de Ni2+ (HisTrap HP 1ml GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial Para esto el sobrenadante obtenido de ceacutelulas
Resultados
61
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) Sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM-6His se concentroacute (sim200x) dializoacute en tampoacuten de unioacuten y luego se aplicoacute a la columna HisTrap HP 1ml (GE Healthcare) La elucioacuten se realizoacute en 3 etapas 100 300 y 500mM de Imidazol Panel superior cromatograma de la purificacioacuten Panel inferior seguimiento de las diferentes etapas de la purificacioacuten por western blot revelado con un anticuerpo anti- F diluido 15000
0
1 2
50
Fracciones
20mM 100mM 300mM 500mM
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 850
1 2
50
Abs
orba
ncia
280
nm
Elucioacuten
100mM 300mM No Retenido + 1 2 7 9 15 17 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 61 62 63 64 65 72 73 74 75
500mM
75
50
37
75
50
37
infectadas con el virus vaccinia recombinante se concentroacute dializoacute en un tampoacuten de unioacuten
recomendado por GE Healthcare (20mM Na2HPO4NaH2PO4 500mM NaCl 20mM
Imidazol) y se inyectoacute en la columna utilizando el sistema automaacutetico AKTAPrime Plus
Se evaluoacute hacer la elucioacuten con un gradiente de 20 a 500mM de Imidazol (no mostrado)
pero se comproboacute que los mismos resultados se obteniacutean haciendo una elucioacuten en etapas
(100mM 300mM y 500mM) La purificacioacuten en etapas requirioacute ademaacutes menos tiempo
En la figura IV8 se muestra el perfil cromatograacutefico obtenido y el seguimiento de
la purificacioacuten por western blot Como puede observarse la proteiacutena se une a la columna
y se eluye principalmente con 100mM de Imidazol aunque una pequentildea parte de la
proteiacutena queda retenida y sale a 300mM
Las fracciones que contienen proteiacutena FTM-6His se juntaron y se sometieron
entonces a una cromatografiacutea de filtracioacuten en gel en una columna de Superosa
12HR1030 (GE Healthcare) Como puede observase en el perfil de dicha cromatografiacutea
(figura IV8) la preparacioacuten de proteiacutena FTM- 6His se resolvioacute en tres picos El primer y
segundo pico (por orden de elucioacuten) se corresponden con los dos picos que
habitualmente se observan para la FTM- del VRSH (perfil en azul) y que por microscopiacutea
electroacutenica se vio que corresponden a proteiacutena agregada o en forma trimeacuterica
respectivamente El tercer pico podriacutea corresponderse con la forma monomeacuterica de la
Resultados
62
Figura IV8 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His por cromatografiacutea de afinidad a iones metaacutelicos (IMAC) y filtracioacuten en gel (FG) Las fracciones de la purificacioacuten por IMAC que conteniacutean proteiacutena FTM- 6His se concentraron y se aplicaron a una columna de Superosa 12HR 1030 (GE Healthcare) Panel izquierdo cromatograma de la purificacioacuten en FG de las fracciones de la purificacioacuten por IMAC de FTM-6His En azul se muestra el perfil de la proteiacutena homoacuteloga FTM- del VRSH en verde el perfil de la SAB y en rojo el de la proteiacutena FTM-6His del MNVH Panel derecho SDS-PAGE tentildeido con azul de Coomassie y western blotrevelado con un suero anti- F diluido 15000 de los 3 picos de elucioacuten obtenidos en la purificacioacuten
250
100
75
50
37
25
15
10
A B C
0
100
200
300
400
mAU
00 50 100 150 200 250 ml
FVRSHTM-
FMTM- 6 His
SAB
M A B C A B C
proteiacutena FTM- o con una fraccioacuten considerable aunque no se detecte por western blot de
SAB Estos 3 picos se corrieron en un SDS-PAGE 10 y se tintildeeron con azul de
Coomassie o se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon para hacer un western
blot (panel derecho figura IV8) Aunque en el western blot se observa que las tres
fracciones contienen proteiacutena FTM- el SDS-PAGE muestra que la composicioacuten de cada
fraccioacuten es muy diferente La fraccioacuten A que podriacutea corresponder a proteiacutena agregada
tiene muchas impurezas La fraccioacuten B y la fraccioacuten C tienen un grado de pureza mucho
mayor y tienen una apariencia similar aunque la banda mayoritaria tiene una movilidad
ligeramente inferior en la fraccioacuten C
IV3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH IV3A Observacioacuten al microscopio electroacutenico de la proteiacutena FTM- 6His purificada
Las 3 fracciones de proteiacutena FTM-6His purificadas en el apartado anterior se
tintildeeron por tincioacuten negativa (apartado III254) y se observaron al microscopio electroacutenico
En la fraccioacuten A tal como se esperaba por lo observado en el SDS-PAGE no pudieron
diferenciarse partiacuteculas de proteiacutena FTM-6His del fondo por la cantidad de impurezas que
Resultados
63
Figura IV9 Visualizacioacuten al microscopio electroacutenico de proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y FG La fraccioacuten B de
la purificacioacuten de la proteiacutena FMTM-6His purificada por IMAC y filtracioacuten en gel se tintildeoacute por tincioacuten negativa como se detalla en
Materiales y Meacutetodos y se observoacute al microscopio electroacutenico Las micrografiacuteas se tomaron a 50000 aumentos En verde se resaltan las moleacuteculas individuales de proteiacutena FTM-6His En la foto A se observa una roseta sentildealada en rojo
A B C 50nm
habiacutea (no mostrado) En la fraccioacuten C tampoco fue posible distinguir moleacuteculas de
proteiacutena FTM-6His pero en este caso porque la poblacioacuten proteica teniacutea un tamantildeo
pequentildeo para el nivel de resolucioacuten de la teacutecnica (no mostrado) En esta fraccioacuten podriacutea
haber proteiacutena FTM-6His en forma monomeacuterica o SAB que por su tamantildeo no se resuelven
con este tipo de tincioacuten En cambio la fraccioacuten B tuvo una pureza y homogeneidad
suficiente como para permitir detectar campos en los que las partiacuteculas individuales se
encontraron lo suficientemente dispersas por lo que se realizoacute la adquisicioacuten de
micrografiacuteas La figura IV9 muestra varios campos de las micrografiacuteas tomadas sobre la
fraccioacuten B que permiten discernir sin dificultad partiacuteculas individuales de proteiacutena FTM-
6His (remarcadas en verde) Cabe destacar que aunque la proteiacutena se encontroacute
mayoritariamente no agregada en alguna micrografiacutea se observa la agregacioacuten de las
moleacuteculas de proteiacutena en forma de roseta (remarcadas en rojo)
IV3A1 Procesamiento de imaacutegenes y reconstruccioacuten de un volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
Con el fin de obtener un detalle mayor de la estructura del ectodominio del
triacutemero de la proteiacutena FTM-6His las micrografiacuteas se digitalizaron y mediante diferentes
paquetes de programas informaacuteticos (XMIPP EMAN SPIDER) se obtuvo la imagen
promedio del triacutemero Posteriormente se realizoacute la reconstruccioacuten tridimensional de la
estructura del mismo Para ello se seleccionaron 9953 imaacutegenes del triacutemero de FTM-6His
(Panel A figura IV10) que se sometieron a un proceso de clasificacioacuten usando un
algoritmo basado en meacutetodos de maacutexima probabilidad (del ingles maximun likelihood)
Resultados
64
implementado en XMIPP (Panel B figura IV10) Dada la calidad de la muestra y de las
micrografiacuteas obtenidas todas las imaacutegenes pudieron ser utilizadas para un alineamiento y
promediado de imaacutegenes lo que produjo un gran incremento de la relacioacuten sentildealruido
generando una imagen media que muestra en detalle la proteiacutena (Panel C figura IV10)
Este grupo de partiacuteculas homogeacuteneas pudieron entonces ser utilizados para
generar un primer modelo tridimensional mediante el paquete de programas EMAN Una
vez generado dicho modelo se realizoacute un refinamiento iterativo de la estructura usando los
algoritmos implementados en el programa SPIDER hasta que se alcanzoacute una
convergencia maacutexima momento a partir del cual las vueltas de refinamiento ya no
mejoran el modelo Cabe aclarar que una ventaja significativa de esta proteiacutena es que
tiene un eje de simetriacutea tres esto es tiene 3 caras indistinguibles entre siacute por lo que los
datos que se consiguen para una cara en realidad estaacuten definiendo tambieacuten las otras dos
Esto hace que la cantidad de imaacutegenes se multiplique por 3 La resolucioacuten final para la
estructura 3D obtenida que se muestra en la figura IV11 fue de 14 Aring
En el volumen 3D obtenido se observa claramente lo comentado acerca del
grado de simetriacutea 3 que se corresponde con que la proteiacutena F sea un homotriacutemero La
estructura tiene un tamantildeo aproximado de 17nm de longitud y en ella se pueden
diferenciar 3 zonas bien definidas a las que llamamos cabeza en la zona distal y de
C
A B
Figura IV10 Seleccioacuten clasificacioacuten y procesamiento de imaacutegenes Panel A partiacuteculas individuales del triacutemero de FTM-6His seleccionadas de las 8 micrografiacuteas digitalizadas del microscopio electroacutenico Panel B clasificacioacuten y alineamiento de las partiacuteculas Panel C promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
Resultados
65
aproximadamente 65nm de longitud por 7nm de ancho seguido por un cuello de 2nm de
extensioacuten que se encuentra conectado al tallo de 78nm de longitud Ademaacutes se
distinguen claramente un canal axial y 3 canales radiales que se comunican con dicho
canal
Figura IV11 Representacioacuten del volumen de la reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena FTM- del MNVH realizada a partir de micrografiacuteas de microscopio electroacutenico a una resolucioacuten de 14Aring En la figura se muestran 3 vistas del triacutemero rotado 90ordm y 135ordm (respectivamente de izquierda a derecha) En el panel A se muestra una vista superior del triacutemero en el panel B una vista lateral con una leve inclinacioacuten y en el panel C una vista lateral
Cabeza
Cuello
Tallo 168nm
7nm
A
B
Canal Axial
Canal Radial
C
Resultados
66
IV3B Modelo informaacutetico de la estructura tridimensional de la proteiacutena F
Como meacutetodo de aproximacioacuten alternativo a la caracterizacioacuten estructural por
microscopiacutea electroacutenica y procesamiento de imaacutegenes se realizaron tambieacuten modelos
informaacuteticos de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH Tomando
como base la estructura tridimensional de la proteiacutena F del virus de la parainfluenza 3
(Yin et al 2005) en el que se propone es el estado post-fusioacuten se modeloacute la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado post-
fusioacuten (figura IV12) Por otro lado teniendo en cuenta las coordenadas de la proteiacutena F
del virus de la parainfluenza 5 (VPI5) cuya estructura tridimensional se ha resuelto por
difraccioacuten de rayos X de los cristales obtenidos (Yin et al 2006) y que se propone estaacute
en un estado pre-fusioacuten (Connolly et al 2006) se modeloacute tambieacuten la estructura
tridimensional del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH en este supuesto estado pre-
fusioacuten (figura IV13)
Figura IV12 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopost-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se observan en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo carece de los aminoaacutecidos que corresponden al sitio de corte y al peacuteptido de fusioacuten se indica en punteado su potencial ubicacioacuten
21 -40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484 DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1F2
C
DII DI
RHC
RHA RHB
DIII
A
B
Resultados
67
Una diferencia importante entre ambos modelos aparte de que cada uno
corresponderiacutea a un estado funcional diferente de la proteiacutena es que en el primero (post-
fusioacuten) no se teniacutean las coordenadas del segmento correspondiente al sitio de corte y al
peacuteptido de fusioacuten segmento que siacute pudo resolverse en la estructura de la proteiacutena F del
parainfluenza 5 (segmento en naranja en la figura IV13)
Para la construccioacuten de los modelos informaacuteticos se hizo en primer lugar un
alineamiento de las secuencias de las proteiacutenas de fusioacuten de VPIH3 y VPI5 con la de la
proteiacutena F del MNVH y un anaacutelisis informaacutetico predictivo por regiones posterior para
buscar homologiacuteas estructurales Posteriormente se intercambiaron los aminoaacutecidos de la
proteiacutena F de la que se tienen las coordenadas por los aminoaacutecidos de la proteiacutena F del
MNVH originando un archivo ldquopdbrdquo (protein data base) que contiene la posicioacuten de cada
aacutetomo que conforma a la proteiacutena en un eje de coordenadas tridimensional Este archivo
puede observarse y analizarse con cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
Figura IV13 Modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH ldquopre-fusioacutenrdquo En la parte superior del esquema se indican los distintos dominios que se muestran en la estructura con el mismo color En las figuras se observan una vista lateral del triacutemero (B) o del monoacutemero (C) y una vista superior del triacutemero (A) Este modelo muestra en naranja el segmento correspondiente al sitio de corte y al peacuteptido fusioacuten ademaacutes de una extensioacuten de la regioacuten heptaacutedica B en blanco (GCN) que corresponde a una estructura estabilizadora que se utilizoacute para purificar esta proteiacutena (Yin et al 2006)
DIIDI
RHC
RHB
RHB
DIII
Pep Fusioacuten
GCNt
C
A
B
21-40 41-62 63- 90 129 -182 183- 275 276-355 362 -425 437-484
Peacuteptido de fusioacuten (103-121) F1 F2
Sitio de corte y Peacuteptido fusioacuten99-121
DI ss DIII RHC RHA DIDIII DII RHB GCNt
Resultados
68
de proteiacutenas (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc)
En estos modelos tridimensionales se encuentran representados los aminoaacutecidos
(20-90 y 126-483 en el post-fusioacuten y 20-482 en el pre-fusioacuten) de la proteiacutena F del MNVH
Como puede observarse en ambas figuras (IV12 y IV13) la proteiacutena se ha diferenciado
en dominios Los dominios I (amarillo) y II (rojo) integrados mayoritariamente por hojas β
forman parte de la cabeza de la proteiacutena El segmento pequentildeo de α-heacutelices
correspondiente a la RHC (gris) forma parte del cuello en el modelo post fusioacuten y parte de
la cabeza en el modelo pre-fusioacuten al igual que el dominio III (magenta) La RHA (verde)
compuesta por α-heacutelices forma parte del tallo en la forma de post-fusioacuten y se encuentra
expuesta en la parte superior de la cabeza en la forma pre-fusioacuten Por uacuteltimo la RHB
compuesta por α-heacutelices se muestra en ambos casos formando parte del tallo de la
proteiacutena
IV3C Anaacutelisis comparativo entre el modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena y el volumen 3D generado a partir del procesamiento de imaacutegenes tomadas por microscopiacutea electroacutenica (ldquoDockingrdquo)
Como se comentoacute en la introduccioacuten a pesar del porcentaje relativamente bajo de
identidad de secuencia con otros paramixovirus la proteiacutena F del MNVH revela las
caracteriacutesticas tiacutepicas de una proteiacutena de fusioacuten de acuerdo a lo descrito para las
proteiacutenas F de los miembros de la familia Paramixoviridae (Morrison 1988) Por otra parte
aunque las proteiacutenas F de los Paramixovirus tienen una elevada homologiacutea estructural
cada una de ellas tendraacute seguramente diferencias locales en su estructura terciaria y
cuaternaria debido entre otras cosas a diferencias en su secuencia de aminoaacutecidos yo
longitud de secuencia nuacutemero de sitios de corte etc Asiacute es muy probable que aunque
en rasgos generales este modelo se acerque a la realidad puede que haya diferencias
concretas con la estructura real de la proteiacutena F del MNVH debido a las caracteriacutesticas
intriacutensecas de eacutesta
Una vez obtenido el volumen 3D generado a partir de las micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico eacuteste puede utilizarse para compararlo con el modelo informaacutetico
Resultados
69
pdb de la estructura tridimensional de la proteiacutena Este anaacutelisis conocido como ldquoDockingrdquo
permitiraacute establecer similitudes y diferencias entre ambos y ademaacutes dar una idea de la
adecuacioacuten a la estructura real del modelo informaacutetico
El Docking realizado con el modelo pdb y el volumen 3D de la proteiacutena se muestra
en la figura IV14 En eacuteste se observa que hay una gran similitud entre ambas estructuras
Los canales radiales y axiales se corresponden asiacute como tambieacuten la torsioacuten observada en
el tallo en lo que corresponderiacutea a la regioacuten heptaacutedica B Otro dato significativo es que las
proyecciones que aparecen en el lateral del volumen 3D se corresponden con lo que
seriacutea el sitio de glicosilacioacuten N172 en la estructura de coordenadas (i)
Figura IV14 Docking realizado con el modelo informaacutetico de la forma post-fusioacuten y el volumen 3D de la proteiacutena F del MNVH obtenido a partir de la miscroscopiacutea electroacutenica Panel A vista lateral panel B vista superior panel C vista de la cabeza En formato de bolas se muestran los sitios de glicosilacioacuten de la proteiacutena N57 (amarillo) N172 (rojo) y N353 (naranja) Las proyecciones que se ven en el lateral coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 (i)
A B
C
(i)
Resultados
70
IV3D Ensayo funcional de la proteiacutena F del MNVH
Con la intencioacuten de comprobar la funcionalidad de la proteiacutena F que se clonoacute en
los distintos vectores se pensoacute en poner a punto un ensayo funcional para esta proteiacutena
Se trata de un ensayo de fusioacuten caracteriacutestico de este tipo de proteiacutenas que permite
evaluar los requisitos para su funcionalidad simplemente transfectando el plaacutesmido que
lleva el gen que codifica para la proteiacutena F y observando la aparicioacuten o no de ceacutelulas
multinucleadas (sincitios) Ademaacutes este ensayo seriacutea de mucha utilidad en el futuro para
estudiar el efecto que diferentes mutaciones pueden tener en la capacidad fusogeacutenica de
la proteiacutena
Como se comentoacute al inicio de esta seccioacuten la proteiacutena fue clonada en el
plaacutesmido pTM1 que tiene un promotor para la polimerasa del fago T7 lo que permite
cuando se transfecta en ceacutelulas que expresan esta polimerasa (ceacutelulas BSR T75) la
expresioacuten del gen que lleva clonado Aunque este plaacutesmido se utiliza en el laboratorio
para dos proteiacutenas homoacutelogas (las proteiacutenas F del VRSH y del virus Sendai) y con ambas
se obtiene aportando los requerimientos oportunos la formacioacuten de sincitios con el pTM1-
F de MNVH se consiguioacute expresar la proteiacutena pero no la formacioacuten de sincitios Se proboacute
la transfeccioacuten con diferentes cantidades de plaacutesmido y se fijaron las ceacutelulas hasta 72
horas despueacutes de la transfeccioacuten Dado que el MNVH necesita de la adicioacuten de tripsina al
medio para producir una infeccioacuten eficiente se agregoacute a diferentes tiempos post-
transfeccioacuten una cantidad determinada de tripsina obteniendo los mismos resultados
Ademaacutes y dado que el grupo de Rebecca Dutch (Schowalter et al 2006) habiacutea publicado
que esta proteiacutena requeriacutea en sus ensayos pH aacutecido (pH=5) para fusionar se sometioacute a
las ceacutelulas transfectadas a pulsos de pH=5 (apartado III228 Materiales y Meacutetodos) sin
embargo tampoco se consiguioacute visualizar la formacioacuten de sincitios en estas condiciones
En la figura IV15 (paneles A y B) se muestra una inmunofluorescencia de un
ensayo de formacioacuten de sincitios en ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F de
MNVH Las ceacutelulas se sometieron al tratamiento de pH y tripsina pero en ninguacuten caso se
observoacute la formacioacuten de sincitios El resultado no varioacute si las ceacutelulas transfectadas con el
pTM1-F de MNVH se trataron soacutelo con pH aacutecido o soacutelo con tripsina (no mostrado) Sin
embargo siacute se observaron sincitios en las ceacutelulas BSR T75 transfectadas con el pTM1-F
de VRSH (panel C)
Resultados
71
BglII
EcoRIEcl136SacIClaINsiIPpu10IAsp718KpnISmaIXmaISphIXhoINheI
introacuten pCAGGS 4745 bps
AmpR CMV-IE
An
Pβ-actina pollo
Figura IV16 Esquema de la secuencia del plaacutesmido pCAGGS La proteiacutena F del MNVH se subclonoacute en este plaacutesmido utilizando las enzimas EcoRI y SmaI como se indica en Materiales y Meacutetodos AmpR resistencia a ampicilina CMV-IE secuencia enhancer del citomegalovirus P promotor β- actina An secuencia poliA
Figura IV15 Ensayo de formacioacuten de sincitios con el pTM1-F de MNVH Ceacutelulas BSR T75 fueron transfectadas con 1microg de pTM1-F A las 16 horas se les agregoacute o no tripsina (05microgml) y se les sometioacute o no a 3 pulsos de pH=5 de 4 min Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el suero anti-FTM- diluido 11000 Panel A ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH tratadas con pH y tripsina Panel B ceacutelulas transfectadas con pTM1-F de MNVH a las que no se les aplicoacute ninguacuten tratamiento Panel C como control del procedimiento de transfeccioacuten se utilizoacute el pTM1-F de VRSH no se le aplicoacute ninguacuten tratamiento
+pH +Tripsina -pH -Tripsina
pTM1-F MNVH pTM1-F VRSH A B C
Como ya se habiacutea observado en el caso de la proteiacutena F del VRSH la cantidad
de proteiacutena expresada en la superficie de la ceacutelula es determinante para su capacidad de
fusioacuten de modo que el mismo gen clonado en pGEM4 no produce sincitios al ser
transfectado en ceacutelulas sin embargo si los produce si se encuentra clonado en pTM1
Suponiendo que tal vez no se estuvieran alcanzando los niveles de expresioacuten
necesarios para que la proteiacutena F del MNVH fusionara se decidioacute subclonar el gen de la
proteiacutena en el plaacutesmido pCAGGS (figura IV16 (Niwa et al 1991) Este plaacutesmido tiene
un alto grado de expresioacuten porque cuenta con un promotor complejo fuerte (Miyazaki et al
1989) compuesto por una secuencia enhancer del citomegalovirus el promotor fuerte de
la β-actina de pollo y una secuencia introacuten de este mismo gen que hacen que las
secuencias clonadas en este vector sean expresadas en mayor cantidad En la regioacuten 3acute
del gen clonado tiene una secuencia poliA para estabilizar el mRNA transcrito Por uacuteltimo
y dado que la expresioacuten del gen clonado en este caso la proteiacutena F estaacute ahora bajo el
control de la RNA polimerasa II celular este plaacutesmido nos permitiriacutea independizar el
ensayo de fusioacuten de las ceacutelulas BSR T75
Resultados
72
Figura IV17 Ensayo de formacioacuten de sincitios Ceacutelulas Vero 118 se transfectaron con 1microg de pCAGGS-F A las 16 horas se les agrego DMEM-0 con tripsina (1microgml) y se las incuboacute durante 1 hora Luego se sometioacute a las ceacutelulas a 3 pulsos de 4 minutos de pH=5 y nuevamente a 1hora de medio DMEM-0 con 2microgml de tripsina Se lavoacute con DMEM-25 y se incuboacute a 37ordmC durante 2 horas Este procedimiento se repitioacute 3 veces Se incuboacute por 16 horas maacutes con DMEM-0 con 1microgml de tripsina y a las 48horas post-transfeccioacuten las ceacutelulas se fotografiaron al microscopio de contraste de fases (panel inferior) Luego se fijaron y se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 Las flechas en la figura indican los sincitios formados
+pH +Tripsina -pH +Tripsina
Asiacute distintas cantidades de plaacutesmido el tiempo de expresioacuten y los requerimientos
de tripsina yo pH se evaluaron en ceacutelulas Vero 118 BSR T75 BHK y LLC-MK2 Como
resultado de esta puesta a punto se determinoacute que con 1microg de plaacutesmido por cada
200000 ceacutelulas se obteniacutea un nivel de expresioacuten adecuado Las ceacutelulas se sometieron (o
no) al tratamiento de pH y tripsina
En todos los tipos celulares se observoacute expresioacuten de la proteiacutena y formacioacuten de
sincitios La formacioacuten de sincitios estuvo supeditada a la adicioacuten de tripsina (05microgml
para las ceacutelulas BHK y BSR T75 1microgml ceacutelulas Vero 118 y LLC-MK2) Los pulsos de pH
aacutecido no influyeron de manera aparente en la capacidad fusogeacutenica de la proteiacutena F dado
que eacutesta fue capaz de fusionar incluso cuando no se sometioacute las ceacutelulas a dicho
procedimiento (figura IV17)
IV3E Anaacutelisis de la funcionalidad de la proteiacutena F y su dependencia del pH
El grupo de Rebbeca Dutch (Schowalter et al 2006) publicoacute recientemente que
la proteiacutena de fusioacuten de la cepa CAN97-83 soacutelo mostraba funcionalidad cuando las
Resultados
73
ceacutelulas transfectadas con un plaacutesmido que expresaba la proteiacutena F (pCAGGS-F) eran
tratadas con tripsina y expuestas a pH aacutecido
Dado que la cepa CAN97-83 (A2) pertenece a un linaje diferente al de la cepa a
partir de la cual nosotros realizamos el clonaje de la proteiacutena F (NL199 B1) decidimos
analizar maacutes en detalle la dependencia de pH para la fusioacuten de membranas promovida
por el MNVH Para esto los plaacutesmidos pCAGGS-F de las proteiacutenas F de las cepas
NL100 (A1) NL1700 (A2) y NL194 (B2) (cedidos por el Dr Ron Fouchier Holanda) se
evaluaron tambieacuten en el ensayo de formacioacuten de sincitios (apartado IV3F) En los
paneles A y B de la figura IV18 se muestra el resultado de dicho ensayo
Como puede observarse en los paneles A y B de la figura IV18 la proteiacutena F de
la cepa A1 (FA1-NL) es claramente dependiente de pH ya que fue capaz de producir
grandes sincitios cuando se la expuso a pH=5 pero no cuando se la mantuvo a pH neutro
La proteiacutena F de la cepa A2 (FA2-NL) no formoacute sincitios en ninguna de las dos condiciones
Por su parte las proteiacutenas F de las cepas B (FB1-NL y FB2-NL) fueron independientes de pH
dado que mostraron una capacidad fusogeacutenica similar a pH aacutecido o neutro Cabe aclarar
que el nivel de expresioacuten fue similar en todos los casos y que estos mismos resultados se
reprodujeron en ceacutelulas LLC-MK2 (no mostrado Vicente Maacutes resultados no publicados)
Al comparar la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena FA2-NL con la secuencia
de la proteiacutena F de la cepa CAN97-83 (FA2-CAN) se encontroacute que en la cepa holandesa
(FA2-NL) los aminoaacutecidos 270 y 294 eran una treonina y un glutaacutemico respectivamente
mientras que en la cepa canadiense eran una metionina y una glicina Para evaluar si la
diferencia en los resultados obtenidos por nuestro laboratorio y el de Rebbeca Dutch se
debiacutea a estos cambios de aminoaacutecidos se realizaron por mutageacutenesis dirigida los
mutantes simple y doble en la cepa holandesa para obtener una proteiacutena FA2-NL con la
misma secuencia que la proteiacutena F de la cepa CAN 97-83 (FA2-CAN) Al evaluarlos en el
ensayo de formacioacuten de sincitios se observoacute que el mutante simple FA2-NL-270M se
comportaba igual al tipo salvaje esto es no induciacutea la formacioacuten de sincitios (no mostrado)
el mutante simple FA2-NL-294G mostroacute una leve capacidad fusogeacutenica (no mostrado) y el
mutante doble FA2-NL-270M294G fue capaz de formar grandes sincitios a pH aacutecido y no a pH
neutro (paneles C y D figura IV18) Por lo tanto la proteiacutena FA2-NL-270M294G se volviacutea ahora
dependiente de pH coincidiendo con lo publicado por Rebbeca Dutch
Resultados
74
Figura IV18 Evaluacioacuten de las propiedades fusogeacutencias de las proteiacutenas F representativas de los cuatro linajes geneacuteticos (A1 A2 B1 y B2) y mutantes en la posicioacuten 294 de cada una de ellas Ceacutelulas Vero 118 fueron transfectadas con los plaacutesmidos pCAGGS-F del linaje indicado en la parte derecha de la figura Las ceacutelulas se sometieron o no a pH aacutecido Posteriormente se revelaron con un suero policlonal anti-F a una dilucioacuten 11000 En los paneles de la izquierda se muestran los resultados obtenidos con las proteiacutenas wt y en los paneles de la derecha los resultados obtenidos con los mutantes en la posicioacuten 294
FB
2
FB
1
F
A2
F
A1
270M-294G 270M-294G
294E 294E
wt mutantes
pH 50 pH 74 pH 50 pH 74
A B C D
294G 294G
294G 294G
Es interesante sentildealar que todas las secuencias de las proteiacutenas F publicadas
tienen una metionina en la posicioacuten 270 Ademaacutes las proteiacutenas cuya fusioacuten es
dependiente de pH (FA1-NL y la proteiacutena FA2-CAN) tienen en la posicioacuten 294 una glicina
mientras que las proteiacutenas independientes de pH (FB1-NL y FB2-NL) tienen un glutaacutemico en
la misma posicioacuten Para determinar la relevancia del residuo en la ubicacioacuten 294 se
realizaron por mutageacutenesis dirigida los mutantes inversos es decir FA1-NL G294E FB1-NL
E294G y FB2-NL E294G Estos mutantes se evaluaron en el ensayo de formacioacuten de
sincitios En los paneles C y D de la figura IV18 puede observarse que las
proteiacutenas FA1-NL294E y FB1-NL294G han perdido su capacidad fusogeacutenica y ya no promueven
Resultados
75
fusioacuten celular se las exponga o no a pH aacutecido La proteiacutena F B2-NL294G induce una
formacioacuten de sincitios similar a la tipo salvaje
Estos resultados sugieren que la sustitucioacuten de glutaacutemico a glicina en la posicioacuten
294 tiene un efecto de aumento de su capacidad fusogeacutenica en las cepas pertenecientes
al linaje A no asiacute en las cepas del linaje B
IV4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH Dado que en el laboratorio contaacutebamos soacutelo con pequentildeas cantidades de un
suero de cobaya anti-MNVH y de escasas cantidades de anticuerpos monoclonales anti-
proteiacutena F de este virus cedidos por el Dr ADM Osterhaus nos planteamos obtener
anticuerpos que reconociesen al virus o a la proteiacutena F en diferentes ensayos y de los que
dispusieacutesemos en grandes cantidades Para alcanzar este objetivo se plantearon las
estrategias que se detallan a continuacioacuten
Evaluacioacuten de sueros humanos
Inoculacioacuten de conejos con peacuteptidos sinteacuteticos
Inoculacioacuten de conejos con virus vaccinia recombinantes que expresan la proteiacutena F
Inoculacioacuten de conejos con proteiacutena F purificada (FTM- 6His)
IV4A Pool de sueros humanos
Seguacuten lo publicado la mayoriacutea de los individuos se han expuesto al MNVH antes
de los 5-10 antildeos de edad (van den Hoogen et al 2001 Ebihara et al 2003) y las
infecciones por este virus se han descrito en los 5 continentes (Howe 2002 Biacchesi et
al 2003 Ebihara et al 2003 Esper et al 2003 Freymouth et al 2003 Madhi et al
2003 Galiano et al 2006) Es decir este virus es muy ubicuo y la mayor parte de la
poblacioacuten humana tiene anticuerpos frente al MNVH Por ello se evaluaron para la
Resultados
76
reactividad con este virus una serie de sueros humanos disponibles en el laboratorio Se
observoacute que de 15 sueros ensayados 12 fueron positivos por inmunofluorescencia en
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el MNVH (datos no mostrados) De ellos 6 dieron una
sentildeal de inmunofluorescencia maacutes intensa por lo que se juntaron para formar un pool que
se utilizoacute preferentemente en ensayos de inmunofluorescencia como el que se mostroacute en
la figura IV19 (Paneles B y C)
Para comprobar si el pool de sueros humanos conteniacutea anticuerpos anti-proteiacutena
F se ensayoacute la reactividad de este pool por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas HEp-2
infectadas con un virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena F del MNVH (vv-F
ver apartado III217) Como se observa en la figura IV20 el pool reconocioacute a la proteiacutena
F dando una sentildeal claramente positiva en un foco de ceacutelulas infectadas que no se
observoacute en ceacutelulas HEp-2 sin infectar (fondo oscuro) o infectadas con el vaccinia parental
vRB12 (no mostrado)
IV4B Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Con el fin de disentildear peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH que permitieran la
obtencioacuten de sueros policlonales que reconociesen a dicha proteiacutena se hizo una
prediccioacuten informaacutetica del perfil de hidrofobicidad de la misma basada en su secuencia
de aminoaacutecidos En la figura IV21 se muestra dicho perfil obtenido como se detalla en
Materiales y Meacutetodos (apartado III262)
Teniendo en cuenta por un lado las regiones maacutes hidrofiacutelicas y por lo tanto
presumiblemente maacutes expuestas de la proteiacutena y por otro los conocimientos previos de
Figura IV20 Inmunofluorescencia de ceacutelulas HEp-2 infectadas con el virus vaccinia recombinante vv-F Las ceacutelulas se infectaron con una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con el pool de sueros humanos positivos para el MNVH diluido 1200
Resultados
77
Figura IV21 Perfil de hidrofobicidad de la proteiacutena F del MNVH En el eje de ordenadas se indica el valor de hidrofobicidad y en el de abcisas se representa la posicioacuten de los residuos de la proteiacutena F Las liacuteneas de colores indican los peacuteptidos que se seleccionaron indicando los liacutemites de cada peacuteptido
Hidrofobicidad
4 3 2
1
0
-1
-2
-3
Posicioacuten0 100 200 300 400 500
la proteiacutena homoacuteloga del VRSH (Garcia-Barreno et al 1989 Baker et al 1999 Zhao et
al 2000) se seleccionaron los siguientes peacuteptidos para ser sintetizados
Peacuteptido F 83-102 Como se comentoacute en la Introduccioacuten la proteiacutena F se procesa
proteoliacuteticamente para dar lugar a dos cadenas F2 (amino-terminal) y F1 (carboxi-
terminal) que quedan unidas covalentemente por al menos un puente disulfuro Teniendo en cuenta esto se planteoacute la conveniencia de tener un reactivo que pudiera
reconocer a la cadena F2 de la proteiacutena Como se observa en el perfil de hidrofobicidad
de la figura IV21 el segmento 83-102 (liacutenea azul) resultoacute tener un alto nivel hidrofiacutelico
por lo que teoacutericamente eacutesta deberiacutea ser una regioacuten bastante expuesta
Peacuteptido F 226-244 Para el disentildeo de este peacuteptido se tuvo en cuenta que en el caso del
VRSH esta zona pertenece al aacuterea antigeacutenica II de la proteiacutena F donde mapea el epiacutetopo
reconocido por un anticuerpo monoclonal (47F) que es altamente neutralizante (Garciacutea
Barreno et al 1989) altamente neutralizante Por otro lado la regioacuten que incluye los
aminoaacutecidos 226-244 en la proteiacutena F mostroacute unos valores bajos de hidrobicidad seguacuten
se ve en la figura IV21 que sugieren que esta regioacuten podriacutea estar expuesta en la
proteiacutena del MNVH
Peacuteptido F 465-484 Como se comentoacute en la Introduccioacuten las regiones heptaacutedicas RHA y
Resultados
78
RHB de la proteiacutena F de los paramixovirus son importantes para la estructura que adopta
la proteiacutena una vez producida la fusioacuten de membranas (Lambert et al 1996 Golding et al
2002) En el caso del VRSH tal como se habiacutea descrito previamente para la proteiacutena F
del VPI5 (Baker et al 1999) la cristalografiacutea de rayos X de un complejo formado por las
regiones heptaacutedicas A y B mostroacute que la regioacuten heptaacutedica amino-terminal (RHA) forma un
triacutemero de α-heacutelices enrolladas entre siacute recubierto antiparalelamente por tres heacutelices de la
RHB (Zhao et al 2000) Dado que la regioacuten heptaacutedica B se localiza en la parte exterior
del complejo de 6 heacutelices y tiene un valor hidrofiacutelico alto (ver figura IV21) se seleccionoacute
el peacuteptido F465-484 que contiene secuencias parciales de esta regioacuten
Los tres peacuteptidos seleccionados se inocularon por duplicado en seis conejos (ver
III24) y los sueros obtenidos se evaluaron en los siguientes ensayos
IV4B1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-peacuteptido en dichos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno el peacuteptido usado en cada inmunizacioacuten En el mismo ELISA se
evaluoacute si estos sueros reconociacutean tambieacuten a una forma soluble de la proteiacutena F
purificada (FTM- 6His) Como control positivo se utilizoacute el anticuerpo monoclonal 132 que
reconoce a la proteiacutena F del MNVH (cedido por el laboratorio del Dr ADM Osterhaus)
En la figura IV22 se muestra el resultado de la titulacioacuten de cada uno de los seis
sueros anti-peacuteptido con el peacuteptido correspondiente en comparacioacuten con la sentildeal obtenida
para la proteiacutena F Como puede observarse todos los conejos respondieron a la
inmunizacioacuten y los sueros respectivos reconocieron en mayor o menor medida a los
peacuteptidos correspondientes Sin embargo no todos reaccionaron con la proteiacutena F en las
condiciones ensayadas
Los dos sueros obtenidos a partir de los conejos inoculados con el peacuteptido F83-102
(graacutefica superior izquierda) reconocieron a este peacuteptido y el del conejo B mostroacute un tiacutetulo
ligeramente maacutes alto Ambos sueros reconocieron deacutebilmente a la proteiacutena F
Tambieacuten los dos sueros anti-F226-244 (graacutefica superior derecha) reconocieron al
Resultados
79
Figura IV22 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos de la proteiacutena F Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los peacuteptidos indicados en cada panel se ensayaron frente al peacuteptido correspondiente (1microgpocillo liacuteneas continuas) o frente a la proteiacutena FTM-6 His (30ngpocillo liacuteneas discontinuas) En cada panel la liacutenea en magenta indica la absorbancia obtenida con el anticuerpo monoclonal 132 enfrentado a la proteiacutena FTM-6His
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F83-102
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo A (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo B (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F226-244
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo C (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 4 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30 α-F465-484
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
Conejo D (proteiacutena F) (peacuteptido)
Conejo 6 (proteiacutena F) (peacuteptido)
Mab α-FMNVH132
peacuteptido correspondiente y nuevamente se observoacute una diferencia entre los dos conejos
el suero del conejo C reconocioacute mejor al peacuteptido que el suero del conejo 4 pero ninguno
de estos sueros reconocioacute a la proteiacutena F
Por uacuteltimo los sueros anti-F465-484 (panel inferior) reconocieron al peacuteptido
correspondiente aunque el del conejo 6 mostroacute un tiacutetulo algo maacutes alto que el del conejo D
Ademaacutes aunque reconocieron a la proteiacutena F la sentildeal fue similar a la obtenida con los
sueros anti-F83-102
IV4B2 Western Blot Los sueros anti-peacuteptido se ensayaron por western blot frente a una forma
Resultados
80
150
100
75
50
37
15
F0 F1 F2
A B C
F + - + - + -
Figura IV23 Western Blot con los sueros anti-peacuteptidos 30microl de sobrenadante de ceacutelulas infectadas con el vv-FTM- (+) o de un vaccinia irrelevante (-) concentrados 10x se sometieron a SDS-PAGE Posteriormente se electrotransfirieron y revelaron con una dilucioacuten 15000 de los siguientes sueros A anti-F83-104 (conejo B) B anti-F226-244(conejo C) C anti-F465-484 (D) Las bandas especiacuteficas correspondientes a los polipeacuteptidos F0 F1 y F2 se indican con un asterisco
soluble de la proteiacutena F Para esto las proteiacutenas del sobrenadante de ceacutelulas infectadas
con un virus vaccinia (vv-FTM-) que expresa una forma truncada de la proteiacutena F
desprovista de la regioacuten transmembrana se separaron por SDS-PAGE y se
electrotransfirieron a membranas que se revelaron con los distintos sueros (figura IV23)
Aunque todos los sueros reconocieron inespeciacuteficamente bandas de proteiacutenas presentes
tanto en el sobrenadante de ceacutelulas infectadas con vv-FTM- (canales +) como con un virus
vaccinia control (canales -) todos ellos mostraron reactividad especiacutefica con la banda
correspondiente al precursor F0 de la proteiacutena
El suero anti-F83-102 (panel A) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 de la proteiacutena
una banda de aproximadamente 15KDa que dado su peso molecular aparente podriacutea
corresponder a la cadena F2 de monoacutemeros de la proteiacutena F procesados
proteoliacuteticamente
El suero anti-F226-244 (panel B) reconocioacute al precursor F0 pero dio una sentildeal
maacutes deacutebil que la de los otros dos anti-sueros probados
El suero anti-F465-484 (panel C) reconocioacute ademaacutes del precursor F0 una banda
de aproximadamente 50 kDa que dado su peso molecular aparente podriacutea corresponder
a la cadena F1 de monoacutemeros procesados proteoliacuteticamente La relacioacuten entre la
cantidad de cadena F1 y la de precursor F0 detectada por el suero anti-F465-484 estaacute en
consonancia con la relacioacuten de cadena F2 y precursor F0 detectada por el suero anti-F83-
102 La ausencia de la banda F1 en el western blot revelado con el suero anti-F226-244 se
debe probablemente a la deacutebil sentildeal que dio este suero
Resultados
81
Los sueros anti-peacuteptido se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas LLC-MK2 infectadas por el MNVH o con ceacutelulas HEp-2 infectadas con un virus
vaccinia recombinante que expresaba la proteiacutena F (vv-F) En ambos casos el resultado
fue negativo (no mostrado) Tambieacuten se evaluoacute la capacidad de estos sueros para
neutralizar la infectividad viral en un ensayo de reduccioacuten de nuacutemero de focos infectivos
pero ninguno de los sueros mostroacute actividad en el ensayo (no mostrado)
IV4C Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Dado que los sueros anti-peacuteptido pareciacutean no reconocer a la proteiacutena F en
estado nativo (puesto que no neutralizaban la infectividad ni mostraban reactividad por
inmunofluorescencia y soacutelo alguno reconocioacute deacutebilmente a la proteiacutena FTM- en ELISA) se
inmunizaron conejos con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa
de la proteiacutena F (vv-F) o una forma soluble de esta proteiacutena desprovista de las regiones
transmembrana y citoplasmaacutetica (vv-FTM-)
Asiacute dos pares de conejos se inocularon como se indica en Materiales y Meacutetodos
con 1x107 ufpconejo de cada virus vaccinia Posteriormente los sueros obtenidos se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos inducidos
IV4C1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-proteiacutena en los sueros de los conejos
inoculados con los virus vaccinia recombinantes se evaluoacute por ELISA utilizando como
antiacutegeno proteiacutena F soluble purificada (FTM- 6 His) Como se observa en la figura IV24
todos los conejos respondieron a la inmunizacioacuten produciendo anticuerpos especiacuteficos
que reconocieron a la proteiacutena F Los sueros de los conejos inoculados con el virus
vaccinia recombinante vv-F reaccionaron 5-10 veces mejor con la proteiacutena F que los
sueros de los conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la forma
truncada de la proteiacutena (vv-FTM-)
Resultados
82
Figura IV25 Western blot con los sueros anti-vaccinias A y B Sueros anti-vv-F TM- conejo A y B diluidos 13000 C y D sueros anti-vv-F conejo C y D diluidos 13000 465-484 suero antipeacuteptido anti-F465-
484 diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada (apartado IV3B)
A B C D 465-484
Anti-vv-FTM- Anti-vv-F
F0 75
50
IV4C2 Western blot
Los sueros de los conejos mencionados en el apartado anterior se ensayaron
tambieacuten por western blot frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada Como se observa en la
figura IV25 todos los sueros reconocieron una banda que corresponde al precursor F0
de la proteiacutena y que no fue reconocida por el suero preinmune (no mostrado) Por otra
parte se observa que aunque en ELISA los sueros anti-vv-F (conejos C y D) reconocieron
mejor a la proteiacutena que los sueros anti-vv-FTM- (conejos A y B) la sentildeal en western blot
fue maacutes intensa con los sueros de los conejos inoculados con estos uacuteltimos virus vaccinia
recombinantes
Figura IV24 Titulacioacuten por ELISA de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes Diluciones seriadas de los sueros obtenidos frente a los virus vaccinia recombinantes vv-FTM- (conejos A y B) o vv-F (conejos C y D) se ensayaron frente a la proteiacutena FTM- 6His purificada (30ngpocillo) En magenta se indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30O
D 4
90nm
-Log10 (dilucioacuten)
Sueros anti-vFMTM-
(conejo A) (conejo B)
Sueros anti-vFM (conejo C) (conejo D)
Mab α-FMNVH132
Resultados
83
IV4C3 Inmunofluorescencia
Los sueros anti-vv-F y anti-vv-FTM- se probaron por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban bien la forma
completa de la proteiacutena F (vv-F) o formas solubles de la misma (vv-FTM- y vv-FTM- 6His) o
con un virus vaccinia irrelevante (vv-PRSVH vaccinia que expresa la proteiacutena P del VRSH)
Como se esperaba todos los sueros dieron una sentildeal positiva incluso con las ceacutelulas
infectadas con el virus vaccinia que no expresaba ninguna forma de la proteiacutena F aunque
ninguno dio una sentildeal apreciable con las ceacutelulas sin infectar (no mostrado) Es decir
todos los sueros teniacutean anticuerpos frente a proteiacutenas del virus vaccinia lo que indicaba
que las inmunizaciones habiacutean sido eficaces
Para poder discernir la sentildeal debida al reconocimiento de la proteiacutena F de la
sentildeal debida a la reactividad de los anticuerpos con proteiacutenas del virus vaccinia los
sueros se ensayaron por inmunofluorescencia frente a ceacutelulas LLC-MK2 infectadas con el
MNVH Como se observa en la figura IV26 todos los sueros dieron una sentildeal positiva
indicando la presencia de anticuerpos frente a las formas de proteiacutena F expresadas por
los virus vaccinia recombinantes utilizados en las distintas inmunizaciones
D
Figura IV26 Inmunofluorescencia con los sueros anti-vaccinia Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH (mdi de 02uffcel) Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-vv-F TM- (A) conejo A (B) conejo B o con los sueros anti- vv-F (C) conejo C y (D) conejo D diluidos 11000
B A
C
Resultados
84
IV4C4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con los virus vaccinia recombinantes
eran capaces de neutralizar al MNVH se probaron en ensayos de reduccioacuten del nuacutemero
de focos infectivos
En la figura IV271 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica todos los sueros inmunes redujeron
considerablemente el nuacutemero de focos infectivos incluso a las diluciones maacutes altas
utilizadas en el ensayo Los sueros preinmunes de los conejos B C y D disminuyeron
inespeciacuteficamente el nuacutemero de focos infectivos a las diluciones maacutes bajas pero esa
inhibicioacuten desaparecioacute a diluciones maacutes altas
En resumen los sueros de los conejos inoculados con los virus vv-F o vv-FTM-
conteniacutean anticuerpos especiacuteficos que reconocieron tanto a formas desnaturalizadas de la
proteiacutena F como lo demuestra los resultados de western blot de la figura IV25 como a la
forma nativa de esta proteiacutena puesto que son capaces de neutralizar la infectividad viral
Eacutesta uacuteltima caracteriacutestica es una diferencia importante con respecto a los sueros
obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F del MNVH
Figura IV27 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-vaccinia Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los distintos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero 118 y el nuacutemero de focos de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
Sueros anti-vvFTM-
conejo A preinmune conejo A conejo B preinmune conejo B
Sueros anti-vvF conejo C preinmune conejo C conejo D preinmune conejo D
Resultados
85
Figura IV28 Titulacioacuten por ELISA de los sueros anti-proteiacutena F TM-6 His Diluciones seriadas de los sueros anti-FTM-
6His (conejo E y F respectivamente) se ensayaron por ELISA utilizando como antiacutegeno sim30ngpocillo de proteiacutena F
TM- purificada La liacutenea en magenta indica el resultado obtenido con el anticuerpo monoclonal 132 utilizado como control
20 25 30 35 4000
05
10
15
20
25
30
OD
490
nm
-Log10 (dilucioacuten)
conejo E conejo F Mab α-FMNVH132
IV4D Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La inmunizacioacuten con virus vaccinia recombinante tiene la ventaja de inducir una
buena respuesta inmune sin tener que purificar el antiacutegeno deseado Sin embargo como
se ha visto en el apartado anterior esos sueros tienen altos niveles de anticuerpos frente
a antiacutegenos del virus vaccinia Por esto decidimos inocular conejos con proteiacutena FTM-
6His purificada La inoculacioacuten se llevo a cabo como se indica en Materiales y Meacutetodos
utilizando sim70microg de proteiacutena FTM- 6His para cada conejo Posteriormente los sueros se
evaluaron en varios ensayos para caracterizar los anticuerpos obtenidos
IV4D1 ELISA
La presencia de anticuerpos anti-F en estos sueros se evaluoacute por ELISA
utilizando como antiacutegeno la forma soluble de la proteiacutena F purificada (FTM- 6His) utilizada
en la inoculacioacuten
Como se observa en la figura IV28 los dos conejos respondieron a la
inmunizacioacuten produciendo altos tiacutetulos de anticuerpos especiacuteficos que reconocieron a esa
proteiacutena incluso a una dilucioacuten de 112500 Estos sueros policlonales tienen incluso
mayores tiacutetulos que el anticuerpo monoclonal 132 (control positivo)
Resultados
86
IV4D2 Western blot
Los sueros anti-FTM-6His se ensayaron en western blot frente a la proteiacutena FTM-
6His purificada Como se observa en la figura IV29 los dos sueros reconocieron una
banda que corresponde al precursor F0 de la proteiacutena que no fue reconocido por el suero
preinmune (no mostrado) Estos sueros dieron una sentildeal similar a la de uno de los sueros
obtenidos frente al peacuteptido 465-484 descrito en apartados anteriores El suero del conejo
E mostroacute una sentildeal algo maacutes intensa que la del conejo F
IV4D3 Inmunofluorescencia Los sueros anti-FTM-6His se probaron tambieacuten por inmunofluorescencia con
ceacutelulas infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa de
la proteiacutena F (vv-F) o con un vaccinia control que expresaba la proteiacutena P del VRSH
utilizado como control negativo En la figura IV30 se observa que el suero del conejo E
(Panel A) y el suero del conejo F (Panel B) tintildeeron focos de ceacutelulas infectadas por el vv-F
sobre un fondo oscuro de ceacutelulas no infectadas Esos mismos sueros no dieron sentildeal
apreciable con ceacutelulas infectadas con el virus vaccinia control (no mostrado)
Los mismos sueros se ensayaron tambieacuten por inmunofluorescencia con ceacutelulas
LLC-MK2 infectadas con el MNVH Como se observa en la figura IV30 (paneles C y D)
los dos sueros dieron una sentildeal positiva con focos de ceacutelulas infectadas sobre un fondo
oscuro de ceacutelulas sin infectar
Figura IV29 Western blot con los sueros anti-FTM-6His E y F Sueros anti-FTM-6His conejos E y F diluidos 15000 465-484 suero antipeacuteptido como control positivo del ensayo diluido 15000 En cada canal se aplicaron sim5ng de proteiacutena FTM- 6His purificada
E F 465-484
F0 75
50
Resultados
87
Figura IV30 Inmunofluorescencia con los sueros anti-FTM- 6His Paneles A y B Ceacutelulas Hep-2 se infectaron con vv-F a una mdi de 01ufpcel Veinticuatro horas maacutes tarde las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-F TM- 6His conejo E (A) o conejo F (B) diluidos 11000 Paneles C y D Ceacutelulas LLC-MK2 se infectaron con MNVH a una mdi de 02uffcel Cuarenta y ocho horas post-infeccioacuten las ceacutelulas se fijaron y se revelaron con los sueros anti-FTM- 6His conejo E (C) o conejo F (D) diluidos
B A
C D
IV4D4 Neutralizacioacuten
Para determinar si los sueros inoculados con la proteiacutena FTM-6His eran capaces
de neutralizar la infectividad viral se ensayaron como en el apartado IV2C4 para la
reduccioacuten del nuacutemero de focos infecciosos
En la figura IV31 se muestra el resultado de un ensayo representativo de 3
experimentos Como se observa en la graacutefica los dos sueros fueron capaces de
neutralizar al virus incluso a las diluciones maacutes altas utilizadas en el ensayo Los sueros
preinmunes mostraron una neutralizacioacuten inespeciacutefica a la dilucioacuten maacutes baja que
desaparecioacute a las diluciones maacutes altas
Resultados
88
25 20 15 100
20
40
60
80
100
N
ordm Foc
os
-Log10 (dilucioacuten de anticuerpo)
conejo E preinmune conejo E conejo F preinmune conejo F
En resumen los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena FTM- 6His
mostraron una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA que los
demaacutes sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten los sueros anti-FTM- 6His dieron una sentildeal maacutes intensa en los
ensayos de western blot y de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores
a los demaacutes sueros en los ensayos de neutralizacioacuten
Figura IV31 Neutralizacioacuten del MNVH con los sueros anti-FTM-6His Una cantidad determinada de virus (50uff) se incuboacute con diluciones seriadas de los dos sueros La mezcla de virus y sueros se empleoacute para infectar ceacutelulas Vero y el nuacutemero de placas de virus se cuantificoacute a los 4 diacuteas como se describioacute en Materiales y Meacutetodos Los resultados se muestran como porcentaje del nuacutemero de focos infectivos observados en ausencia de sueros
Resultados
89
V DISCUSIOacuteN
Discusioacuten
89
V DISCUSIOacuteN V1 CRECIMIENTO Y TITULACIOacuteN DEL MNVH EN CULTIVOS CELULARES V11 Condiciones de crecimiento para el MNVH en cultivos celulares
El MNVH mostroacute ser un virus difiacutecil de crecer dado que replica lentamente y
que esta replicacioacuten depende de la adicioacuten de tripsina Ademaacutes tiene un rango limitado de
liacuteneas celulares susceptibles y el desarrollo de efecto citopaacutetico producido por el virus es
muy lento y no tan evidente como en el caso del virus respiratorio sincitial humano
(VRSH) van den Hoogen y colaboradores reportaron que en las ceacutelulas tMK (cultivo
terciario de ceacutelulas de rintildeoacuten de mono) las ceacutelulas en las que se aisloacute el virus el efecto
citopaacutetico era indistinguible del VRSH (van den Hoogen et al 2001) Sin embargo ellos
tambieacuten observaron que la cepa del MNVH sobre la que se realizaron los primeros
estudios (NL0100 A1) mostraba un efecto citopaacutetico maacutes claro en estas ceacutelulas que la
cepa (NL0199 B1) con la que nosotros trabajamos Otro grupo ha publicado tambieacuten
que podriacutea haber una diferencia en el efecto citopaacutetico producido por unas cepas u otras
en una misma liacutenea celular (Hamelin et al 2004) sin embargo no estaacute claro queacute cepas
producen sincitios y cuaacuteles no
En nuestro laboratorio la infeccioacuten por MNVH en ceacutelulas Vero 118 o LLC-MK2
fue visible a los 3-4 diacuteas postinfeccioacuten Estos resultados coinciden con lo publicado por
Biacchesi y colaboradores (Biacchesi et al 2004a) y es similar a lo reportado por Herfst y
colaboradores (Herfst et al 2004) que empiezan a ver efecto citopaacutetico en estas ceacutelulas
entre los 3 y 6 diacuteas respectivamente Sin embargo estaacute en desacuerdo con lo publicado
por el grupo de Guy Boivin que ve un efecto citopaacutetico a los 10-14 diacuteas o incluso
despueacutes de 17 diacuteas (Boivin et al 2002 Hamelin et al 2004)
Por otro lado el virus crecioacute mejor en las ceacutelulas LLC-MK2 o Vero 118 y siempre
con el suplemento de tripsina en el medio de cultivo En el caso de las ceacutelulas BSR T75
BHK y HEp-2 el que la replicacioacuten del virus haya sido peor puede ser debido simplemente
a que eacutestas no sean ceacutelulas tan permisivas como las LLC-MK2 o Vero 118 para el MNVH
Discusioacuten
90
o tambieacuten que esos tres tipos celulares mostraron una sensibilidad mayor a la tripsina que
se agrega al medio para la propagacioacuten viral
En cuanto al hecho de que el virus crecioacute mejor cuando se antildeadioacute tripsina en el
medio en diacuteas posteriores durante la infeccioacuten es consistente con lo observado por
Kaverin que publicoacute una raacutepida inactivacioacuten de la tripsina en ceacutelulas Vero 118 por un
factor que estas ceacutelulas secretan al medio (Kaverin et al 1995) En este mismo estudio
los autores comentaron que un efecto similar aunque menor se observaba en las ceacutelulas
LLC-MK2
El titulo viral obtenido al crecer el virus en estas condiciones (105uffml) es similar
al obtenido por los distintos grupos que trabajan con este virus a estos tiempos de
infeccioacuten (Biacchesi et al 2004a Biacchesi et al 2004b Herfst et al 2004 Pham et al
2005) Sin embargo alguno de estos grupos han podido llevar a cabo cineacuteticas de 10-12
diacuteas (algo que en nuestro caso ha sido imposible dado que despueacutes de 7 diacuteas las ceacutelulas
se desprendieron totalmente) y alcanzar tiacutetulos del orden del 107uffml (Biacchesi et al
2004a Biacchesi et al 2004b)
V12 Ensayo de formacioacuten de focos infecciosos por el MNVH
Dado que el efecto citopaacutetico no es claro y parece ser dependiente de cepa una
manera sencilla de ver los focos infecciosos del MNVH es utilizando inmunotincioacuten El
ensayo de formacioacuten de focos infecciosos utilizando como sustrato cromoacutegenico 3-amino-
9-etil-carbazol (AEC) ha sido de utilidad para una faacutecil titulacioacuten de semillas virales asiacute
como para la cuantificacioacuten del efecto producido por los distintos anticuerpos en los
ensayos de neutralizacioacuten Ademaacutes aunque la adicioacuten de tripsina implica un paso maacutes
aumentoacute considerablemente el tamantildeo del foco haciendo maacutes faacutecil y maacutes fiable el contaje
Otros grupos han utilizado este tipo de ensayo para titulacioacuten viral o ensayos de
neutralizacioacuten viral convencional (van den Hoogen et al 2001 Biacchesi et al 2004a
MacPhail et al 2004 Graaf de et al 2007) pero en estos el tiempo de incubacioacuten post-
infeccioacuten fue de 6-7 diacuteas por lo tanto nuestro ensayo tiene una ventaja adicional al poder
revelarse a los 4 diacuteas
Discusioacuten
91
Un ensayo de este tipo raacutepido y fiable para detectar anticuerpos neutralizantes
puede ser importante para ensayar posibles candidatos a vacunas Tambieacuten puede ser
uacutetil para realizar estudios epidemioloacutegicos en sueros de pacientes infectados
V2 CLONAJE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V2I Clonaje y expresioacuten
Con respecto al clonaje de la proteiacutena F resultoacute llamativo el hecho de que el gen
clonado en los plaacutesmidos pGEM-4 y pTM1 tuviera una secuencia nucleotiacutedica y el gen
clonado en el plaacutesmido pRB21 tuviera algunos cambios de nucleoacutetidos que llevaban en
algunos casos a cambios en la secuencia de aminoaacutecidos El gen F clonado en pGEM-4 y
pTM1 fue amplificado en una RT-PCR y el gen F clonado en pRB21 fue amplificado en
una RT-PCR posterior Estas diferencias de secuencia podriacutean haberse originado por
cambios introducidos por la DNA polimerasa durante la amplificacioacuten cosa poco probable
dado que la polimerasa utilizada (Taq Plus Long Stratagene) es una mezcla de las
polimerasas Taq y Pfu y eacutesta uacuteltima tiene una capacidad procesiva y de correccioacuten de
prueba muy alta Es probable que esas diferencias se deban simplemente a la variabilidad
geneacutetica que caracteriza a una poblacioacuten de virus RNA y a que el virus del que se partioacute
para obtener el RNA que se amplificoacute no se habiacutea purificado por plaqueo
El gen de la proteiacutena se clonoacute en distintos sistemas (pTM1 pGEM-4 pRB21 y
pCAGGS) sin embargo el nivel de expresioacuten varioacute de unos a otros se consiguioacute un nivel
de expresioacuten mayor con el pCaggs gt pTM1 gt pGEM4 El plaacutesmido pRB21 se utilizoacute para
originar los virus vaccinia recombinantes
V22 Purificacioacuten de la proteiacutena FTM- o de la proteiacutena FTM- 6His implicaciones estructurales
Los mutantes FTM- y FTM-6His al carecer de la regioacuten transmembrana son
Discusioacuten
92
secretados al sobrenadante por lo que su manejo concentracioacuten y purificacioacuten resultoacute
mucho maacutes sencilla que una purificacioacuten a partir de extractos celulares o de membranas
de ceacutelulas infectadas con los virus vaccinia recombinantes o con el MNVH
En primer lugar y dado que no contaacutebamos con anticuerpos monoclonales para
una purificacioacuten mediante columnas de inmunoafinidad se decidioacute intentar purificar la
proteiacutena FTM- del MNVH mediante intercambio ioacutenico Se determinoacute probando varias
condiciones que lo oacuteptimo era utilizar un tampoacuten Tris-HCl 20mM pH=75 en una columna
de intercambio anioacutenico En estas condiciones la proteiacutena FTM- se eluyoacute con 100mM de
NaCl lo que permitioacute purificar la proteiacutena F y separarla de la seroalbuacutemina contaminante
mayoritario que acarreamos de la produccioacuten en ceacutelulas
En el paso posterior de purificacioacuten por filtracioacuten en gel esperaacutebamos que la
proteiacutena FTM- eluyera antes que la SAB como la proteiacutena FTM- del VRSH dado que se
supone ambas (FTM- de MNVH y del VRSH) tienen una conformacioacuten trimeacuterica Sin
embargo la proteiacutena FTM- eluyoacute despueacutes de la SAB aparentando un tamantildeo menor Una
explicacioacuten es que se hubiera degradado pero en el western blot que se muestra en la
figura IV7 se observa claramente que la proteiacutena estaacute mayoritariamente no degradada
Al mirar esta preparacioacuten al microscopio electroacutenico no pudo distinguirse ninguna
moleacutecula de proteiacutena FTM- lo cual indica que efectivamente la proteiacutena podriacutea no tener la
conformacioacuten correcta
El hecho de que la proteiacutena se unioacute a una membrana de intercambio anioacutenico a un
pH=75 indica que la proteiacutena a este pH tendriacutea una carga negativa osea que su punto
isoeleacutectrico (pI) deberiacutea ser menor a 75 Esta estimacioacuten estaacute de acuerdo con el pI
teoacuterico (pI=59) predicho sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH (ProtParam de
Expasy Proteomic Server)
Dado que no conseguimos por intercambio ioacutenico y filtracioacuten en gel una
preparacioacuten que nos permitiera entre otras cosas su observacioacuten al microscopio
electroacutenico decidimos antildeadir una cola de 6 histidinas al mutante FTM- (FTM-6His) para
purificar esta proteiacutena por cromatografiacutea de afinidad por iones metaacutelicos (IMAC) y luego
por filtracioacuten en gel La purificacioacuten por estos dos meacutetodos nos permitioacute conseguir una
Discusioacuten
93
preparacioacuten lo suficientemente pura y con la proteiacutena FTM-6His en una conformacioacuten
adecuada que utilizamos para hacer estudios de microscopiacutea electroacutenica y para la
produccioacuten de anticuerpos en conejos
Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado no podemos afirmar ni
descartar que el mutante FTM- de la proteiacutena del MNVH se esteacute plegando de una manera
correcta Hay que tener en cuenta que aunque han podido expresarse y purificarse
mutantes sin las regiones transmembrana y citoplasmaacutetica de varios virus de la misma
familia (FTM- del virus respiratorio sincitial humano del virus de la parainfluenza humana
tipo 3 y del virus de la enfermedad de Newcastle) existe por lo menos un caso publicado
en el que este mutante no oligomerizoacute eficientemente (virus de la parainfluenza tipo 5 Yin
et al 2006) hasta que no se le agregoacute un dominio de trimerizacioacuten (GCN) Puede ser
que el mutante FTM- del MNVH necesite como en el caso del virus de la parainfluenza tipo
5 una secuencia estabilizadora para formar de manera eficiente una estructura trimeacuterica
estable Sin embargo parece poco probable que el mutante FTM- del MNVH no pueda
plegarse correctamente y que el mutante FTM-6His al que soacutelo se le ha adicionado una
cola de 6 histidinas sea capaz de oligomerizar
Por otro lado si la proteiacutena FTM- no tiene la conformacioacuten trimeacuterica adecuada en la
etapa de filtracioacuten en gel no podemos descartar que el mutante FTM- la haya perdido
durante la purificacioacuten por intercambio ioacutenico donde una interaccioacuten con la membrana o
con los tampones podriacutea haber desestabilizado a la proteiacutena Esto es poco probable ya
que la conformacioacuten post-fusioacuten es una estructura altamente estable Ademaacutes sabemos
que la proteiacutena homoacuteloga FTM- de VRSH se expresa en forma trimeacuterica y tampoco pierde
su conformacioacuten en una purificacioacuten por intercambio ioacutenico Por uacuteltimo no se puede
descartar una interaccioacuten inespeciacutefica con la superosa de la columna de exclusioacuten
molecular que pudiera retrasar su elucioacuten
La produccioacuten de la proteiacutena utilizando el sistema de virus vaccinia recombinantes
y su purificacioacuten posterior por cromatografiacutea de unioacuten a iones metaacutelicos y filtracioacuten en gel
nos permitioacute conseguir una muestra en condiciones adecuadas para los estudios
detallados en esta tesis Sin embargo dado que seriacutea conveniente disponer de grandes
cantidades de proteiacutena purificada (para produccioacuten de anticuerpos maacutes estudios de
microscropia o criomicroscopiacutea etc) en el laboratorio se puso a punto un sistema de
Discusioacuten
94
expresioacuten de proteiacutenas solubles en huevos embrionados (Corral et al 2007) Este es un
sistema de produccioacuten maacutes eficiente en cuanto a cantidad de proteiacutena producida facilidad
en el manejo del sistema y costos de produccioacuten El protocolo de purificacioacuten puesto a
punto en esta tesis seraacute utilizado tambieacuten para purificar y caracterizar la proteiacutena FTM-6His
producida en el sistema de huevos
V 3 CARACTERIZACIOacuteN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEIacuteNA F DEL MNVH
V3 Anaacutelisis de la reconstruccioacuten de la estructura 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los datos estructurales publicados hasta el momento para otros paramixovirus
El volumen 3D mostrado en la figura IV24 de Resultados representa la primera
informacioacuten estructural disponible hasta la fecha para la proteiacutena de fusioacuten del MNVH
La reconstruccioacuten 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH reveloacute una
organizacioacuten homotrimeacuterica de la proteiacutena Estos resultados concuerdan con estudios
previos que mostraron una organizacioacuten trimeacuterica en la proteiacutena de fusioacuten de otros
paramixovirus como el virus de la parainfluenza 5 (Russell et al 1994) VRSH (Calder et
al 2000) y el virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001b)
La apariencia de la imagen promedio del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
(figura IV23 panel C) es similar a la obtenida por microscopiacutea electroacutenica para la proteiacutena
F del VRSH (Calder et al 2000) El volumen 3D es similar a la obtenida para la proteiacutena
FTM- del VRSH (no publicado) y la proteiacutena FTM- del virus Sendai (Ludwig et al 2003) y a
la estructura obtenida por rayos X de la proteiacutena FTM- del virus de la enfermedad de
Newcastle (Chen et al 2001b) o el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Yin et al
2005)
Una comparacioacuten de la estructura primaria de la proteiacutena F del MNVH con la de los
paramixovirus de los que tenemos informacioacuten estructural (los virus de la enfermedad de
Newcastle de la parainfluenza humana tipo 3 o Sendai(Chen et al 2001b Ludwig et al
Discusioacuten
95
2003 Yin et al 2005 Yin et al 2006) revela una identidad de secuencia de
aproximadamente el 15 en todos los casos y una similitud que alcanza hasta el sim40
Ambos valores pueden ser considerados como relativamente altos para proteiacutenas de
fusioacuten viral Por ejemplo en el caso de dos proteiacutenas muy similares en cuanto a
plegamiento como son las proteiacutenas E1 del virus del bosque Semliki o la proteiacutena E del
virus TBE (tick-borne enchephalitis) su identidad de secuencia es soacutelo del 12 (Rey et al
1995 Lescar et al 2001) Como se comentoacute anteriormente la identidad de secuencia de
la proteiacutena F del MNVH con respecto al VRSH es mayor 33 De todas maneras si uno
compara la secuencia entre las cuatro proteiacutenas de fusioacuten de esos paramixovirus se
observa que la identidad de secuencia estaacute homogeacuteneamente distribuida Ademaacutes se
encuentra el hecho de que todas estas proteiacutenas de fusioacuten comparten una distribucioacuten de
dominios (regiones heptaacutedicas regiones hidrofoacutebicas distribucioacuten de cisteiacutenas etc)
similar por lo que es de esperar una estructura 3D similar en todos los casos
Aparte de diferencias evidentes en la longitud del cuello o de la cabeza debido a
las diferencias en la longitud de la secuencia las estructuras de las proteiacutenas de fusioacuten
(determinadas hasta el momento) en el que se propone es el estado post-fusioacuten es para
todos estos paramixovirus muy similar En todos los casos puede distinguirse una
organizacioacuten en tallo cuello y cabeza donde la cabeza tiene una forma triangular un
canal axial en la parte central superior y 3 canales axiales en la parte lateral de la misma
V32 Modelo informaacutetico de la estructura terciaria y cuaternaria de la proteiacutena F del MNVH
El contar con un buen modelo de la estructura secundaria terciaria y cuaternaria de
la proteiacutena F del MNVH es una herramienta que nos permitiraacute avanzar en el anaacutelisis
estructural y funcional de la proteiacutena asiacute como tambieacuten en la posible interpretacioacuten de
resultados experimentales obtenidos Cualquier programa de coacutemputos para visualizacioacuten
de archivos ldquopdbrdquo (Rasmol SPDBViewer Chimera Pymol etc) nos permite una
visualizacioacuten parcial o completa de la proteiacutena pudieacutendola rotar en el espacio para
analizar sus dominios caracteriacutesticas de sus aminoaacutecidos interacciones intra o
extramoleculares etc Tambieacuten es posible realizar cambios de aminoaacutecidos y analizar las
implicaciones que estos cambios pueden tener (aumentodisminucioacuten de energiacutea libre
Discusioacuten
96
Figura V1 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En la figura se muestra dos vistas laterales diferentes del docking Se utilizan diferentes colores en el volumen 3D y en el fondo para resaltar la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En formato de bolas (rojo amarillo y naranja) se muestran los tres sitios de glicosilacioacuten que tiene la proteiacutena
interacciones con aminoaacutecidos adyacentes etc) en regiones cercanas
De hecho este modelo nos ha permitido plantear una mutageacutenesis de la proteiacutena F
para dar una explicacioacuten plausible a las diferencias observadas en la capacidad fusogeacutenica
de las proteiacutenas de fusioacuten de los diferentes linajes geneacuteticos del MNVH
V33 Docking adecuacioacuten del modelo informaacutetico con el volumen 3D del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH
A primera vista se observa que algunas caracteriacutesticas como las dimensiones
promedio y la localizacioacuten de los canales axiales y radiales se ajustan perfectamente
(figura V1)
Discusioacuten
97
Figura V2 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra con maacutes detalle la parte del tallo del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N172 remarcado en color rojo que coincide con las proyecciones que salen perpendiculares (i) de la proteiacutena en el volumen 3D (ii) Proyecciones que se supone corresponden con la cola de 6 histidinas En el panel de la derecha se muestra con maacutes detalle la parte del cuello del ectodominio de la proteiacutena y el sitio de glicosilacioacuten N57 (iii) remarcado en amarillo que coincide con el engrosamiento que se observa en esta parte en el volumen 3D
(i)
(ii)
(iii)
La torsioacuten que se observa en el tallo concuerda con las regiones RHB de los 3
monoacutemeros que se encuentran cubriendo a las RHA de los mismos (figura V2) Las
proyecciones laterales que tiene el tallo (i) coinciden con el sitio de glicosilacioacuten N172 que
se sabe es modificado en la proteiacutena (Schowalter et al 2006) Por encima de estas
proyecciones el tallo se afina lo que concuerda con que en esta zona soacutelo las regiones
HRA estaacuten en forma de heacutelices mientras que las RHB (entre los aminoaacutecidos 436-456)
tienen una conformacioacuten elongada Las extensiones del tallo en la parte inferior del
mismo (ii) que no se ven en el modelo informaacutetico podriacutean deberse a la cola de 6
histidinas que cada tiene cada monoacutemero y que no interaccionan entre siacute La unioacuten de
estas 3 extensiones se origina por el tratamiento de simetriacutea de la reconstruccioacuten aunque
no es probable que exista en la realidad
En el cuello existe un engrosamiento que coincide con lo que seriacutea el sitio de
glicosilacioacuten N57 que se situacutea en el modelo informaacutetico justo en la parte inferior del bucle
(iii aminoaacutecido 53-64) y que se sabe tambieacuten es modificado (figura V2)
Discusioacuten
98
Los azuacutecares unidos a los sitios de glicosilacioacuten N57 (iii) y N172 (i) se pueden
vislumbrar en el promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes
(figura V3)
El docking encaja muy bien en la regioacuten de la cabeza (figura V4) Los canales
axiales observados en el volumen 3D originado a partir de la microscopiacutea electroacutenica se
ajustan con los canales axiales formados en el modelo informaacutetico sobre lo que seriacutea la
regioacuten heptaacutedica C (RHC) y el DIII Ademaacutes como ya se habiacutea observado en la estructura
cristalina de la proteiacutena F del virus de la enfermedad de Newcastle (Chen et al 2001a) o
en las reconstrucciones hechas a partir de crio-electromicroscopiacutea para la proteiacutena F del
virus Sendai (Ludwig et al 2003) estos canales convergen en el centro del triacutemero con el
canal axial
En la figura V4 se observa que soacutelo un bucle formado por los aminoaacutecidos 393-405
no encaja del todo en el volumen 3D (i) Puede ser que esta zona sea localmente
diferente a la misma regioacuten en la proteiacutena F del PIVH3 de la que se tomaron las
coordenadas para hacer el modelo informaacutetico Ademaacutes en este caso el sitio de
glicosilacioacuten N353 (bolas naranjas en la figura V4) que se sabe que es modificado
(Schowalter et al 2006) no se observa como una proyeccioacuten en el volumen 3D
Figura V3 Promedio bidimensional originado a partir de la coleccioacuten de imaacutegenes Las flechas indican las densidades que se corresponden con la ubicacioacuten de los sitios de glicosilacioacuten N57(iii) y 172-174 (i)
(iii)(i)
Discusioacuten
99
De esta manera el perfil de elucioacuten en la columna de filtracioacuten en gel de la proteiacutena
FTM- del MNVH purificada asiacute como las imaacutegenes de microscopiacutea y el promedio
bidimensional y el volumen 3D originado a partir de eacutestas apoyan que la proteiacutena tiene
una conformacioacuten trimeacuterica lo que parece general en las proteiacutenas de fusioacuten de los
paramixovirus En otras proteiacutenas de fusioacuten (gp41 del VIH-1 gp41 del VIS HA del virus
de la gripe A GP2 del virus eacutebola Env-TM del virus de la leucemia murina de Moloney y
Figura V4 Docking del volumen 3D y el modelo informaacutetico de la estructura del ectodominio de la proteiacutena F del MNVH En los paneles superiores se muestra una vista lateral de la cabeza en diferentes colores para poder apreciar mejor diferencias en la adecuacioacuten del modelo informaacutetico En los paneles inferiores se muestran vistas superiores del triacutemero en este se indica el segmento de los aminoaacutecidos 393-405 que queda fuera del volumen 3D (iv) En formato de bolas naranjas se muestra el sitio de glicosilacioacuten N353
(iv) (iv)
Discusioacuten
100
la proteiacutena gp64 de baculovirus entre otras) tambieacuten se ha podido determinar que su
estructura tridimensional es de triacutemero (Weissenhorn et al 1999) Todo ello sugiere la
existencia de un alto grado de similitud en la estructura cuaternaria de las proteiacutenas
virales de fusioacuten
V34 Requerimientos funcionales de la proteiacutena F del MNVH comparacioacuten con los requerimientos necesarios para otras proteiacutenas de fusioacuten
En cuanto a la funcionalidad de la proteiacutena F del MNVH los resultados detallados
en esta tesis indican que esta proteiacutena requiere a diferencia del resto de los neumovirus
la adicioacuten de tripsina al medio para fusionar y que esta fusioacuten ocurre a pH neutro
Ademaacutes como el resto de los miembros de esta subfamilia no requiere de la co-
transfeccioacuten de la proteiacutena de adhesioacuten G para formar sincitios
El hecho de que la proteiacutena pueda fusionar a pH neutro concuerda con la idea de
que la entrada de los paramixovirus ocurre por la fusioacuten de la membrana viral y celular
El anaacutelisis de las proteiacutenas F de los diferentes linajes en los ensayos de formacioacuten
de sincitios sugiere que la glicina en la posicioacuten 294 es un determinante para que la
fusioacuten sea dependiente de pH al menos para las proteiacutenas F del linaje A
Se sabe que la protonacioacuten de los residuos histidina es importante en la activacioacuten
de ciertas proteiacutenas de fusioacuten que requieren pH aacutecido para fusionar (Carneiro et al
2003) Dado que el residuo 294 estaacute localizado en la base de la cabeza en el modelo ldquopre-
activordquo de la proteiacutena F del MNVH en las proximidades de una histidina (H368)
proponemos que los aminoaacutecidos glutaacutemico o glicina podriacutean influir de manera diferente
en la protonacioacuten de la histidina 368 Es decir que el glutaacutemico en la posicioacuten 294 facilite
la protonacioacuten de la histidina 368 incluso a pH neutro mientras que la protonacioacuten de esta
histidina requiera pH aacutecido cuando el aminoaacutecido en dicha posicioacuten es una glicina Sin
embargo este no parece ser el caso para las proteiacutenas F del linaje B Estas diferencias
podriacutean ser debidas a la influencia de otros aminoaacutecidos diferentes en las proteiacutenas F del
linaje B en las proximidades de esta histidina 368 (figura V5)
Discusioacuten
101
La ausencia de glicina en la posicioacuten 294 de la secuencia de las proteiacutenas F del
linaje B publicadas apoya la hipoacutetesis de que la fusioacuten dependiente de pH aacutecido se
restringe a las proteiacutenas F del linaje A Por otra parte dado que las cepas que tienen una
glicina en la posicioacuten 294 representan soacutelo una pequentildea proporcioacuten de las secuencias de
proteiacutenas F del linaje A publicadas (27 de 433) la dependencia del pH aacutecido es
probablemente una peculiaridad de ciertas proteiacutenas F del MNVH maacutes que un
mecanismo general de fusioacuten
Es interesante destacar que se ha observado que la cepa NL194(B2) a partir de
la cual se clonoacute la proteiacutena FNL-B2 utilizada en este trabajo adquiere ciertas mutaciones
en la proteiacutena de fusioacuten del virus a medida que este se pasa en cultivo (ceacutelulas Vero 118)
Al comparar en ensayos de formacioacuten de sincitios la proteiacutena F tipo salvaje y la proteiacutena F
E294
NL1700 (A2) NL199 (B1) NL194 (B2)
H368
H368
G294
NL100 (A1) CAN9783 (A2)
Figura V5 Localizacioacuten de los residuos 294 y la histidina 368 en el modelo ldquopre-fusioacutenrdquo de la proteiacutena F del MNVH En el panel de la izquierda se muestra su ubicacioacuten en la estructura de la proteiacutena En los paneles de la derecha se muestra la proximidad que existe entre el residuo en la posicioacuten 294 y la histidina de la posicioacuten 368
Discusioacuten
102
mutante obtenida luego de los pases se observa que esta uacuteltima tiene una capacidad
fusogeacutenica mayor (Herfst y colaboradores artiacuteculo enviado) Un comportamiento similar
fue observado cuando virus de la cepa NL199(B1) se pasoacute rutinariamente a bajas
temperaturas (Ron Fouchier comunicacioacuten personal) Es posible que los pasajes in vitro
pudieran seleccionar mutaciones en la proteiacutena F que mejoraran la replicacioacuten viral y
tambieacuten la capacidad fusogeacutencia de esta proteiacutena
Tanto la proteiacutena FCAN-A2 como la FNL- A1 fueron clonadas a partir de cepas que han
sido aisladas a partir de ceacutelulas en cultivos mientras que la mayoriacutea de las secuencias
disponibles para la proteiacutena F en las bases de datos derivan del secuenciamiento directo
de muestras cliacutenicas Asiacute la mutacioacuten 294G presente en ambas proteiacutenas podriacutea haberse
seleccionado por su pase repetitivo en cultivos celulares
V4 OBTENCIOacuteN DE REACTIVOS INMUNOQUIacuteMICOS FRENTE A LA PROTEIacuteNA F DEL
MNVH V41 Pool de sueros humanos Estos sueros se consideraron como primera opcioacuten para la deteccioacuten del MNVH y
como se esperaba dada la alta incidencia de este virus en la poblacioacuten mundial fueron
positivos
Un resultado hasta ahora no descrito es que estos sueros que reconocen al MNVH
reconocieron tambieacuten a la glicoproteiacutena F en ceacutelulas infectadas por los vaccinia
recombinantes vv-F y vv-FTM- Estos sueros constituyen por tanto una importante
herramienta para deteccioacuten del MNVH y de las distintas formas de la proteiacutena F del virus
Teniendo en cuenta la poca variabilidad geneacutetica que existe entre los dos linajes
(diferencia que es mayor entre los sublinajes) en la proteiacutena F (94-97 de identidad
aminoaciacutedica) y que ademaacutes se sabe que las otras dos proteiacutenas de membrana (las
proteiacutenas G y SH) son aparentemente poco inmunogeacutenicas y en cambio la proteiacutena F es
muy inmunogeacutenica (Skiadopoulos et al 2006) es factible pensar que
Discusioacuten
103
independientemente de la cepa tipo del MNVH que hubiese infectado a las personas de
las que se extrajeron los sueros reconoceriacutean a la proteiacutena F clonada en nuestro
laboratorio
No se puede inferir nada concluyente del porcentaje de individuos que presentan
serologiacutea positiva para el virus ya que soacutelo se analizaron 15 muestras Seriacutea interesante
realizar un anaacutelisis con un mayor nuacutemero de muestras de distintos antildeos para poder
dilucidar rangos de edades de seropositividad y seroprevalencia en Espantildea
V42 Sueros policlonales dirigidos frente a peacuteptidos sinteacuteticos
Teniendo en cuenta los resultados presentados en el apartado IV4B todos los
peacuteptidos indujeron una respuesta inmune en los conejos inoculados aunque el tiacutetulo
alcanzado incluso con el mismo peacuteptido fue distinto en cada uno de los conejos Sin
embargo aunque todos los sueros reconocieron a los peacuteptidos a partir de los cuales
fueron originados y a la proteiacutena F del MNVH en estado desnaturalizado (western blot) no
fueron capaces de reconocer a la proteiacutena en ensayos de ELISA inmunofluorescencia o
neutralizacioacuten donde la proteiacutena tiene un estado nativo o cuasi-nativo
Seguacuten el perfil hidrofoacutebico realizado sobre la secuencia de la proteiacutena F del MNVH
todos los peacuteptidos mostraron un caraacutecter hidrofiacutelico por lo que estariacutean presumiblemente
expuestos Una correlacioacuten con esta prediccioacuten se observa si ubicamos los tres peacuteptidos
en los modelos informaacuteticos presentados en el apartado IV3B de los Resultados Los
peacuteptidos F83-102 (rojo) y F465-484 (azul) estaacuten muy expuestos en el modelo pre-fusioacuten
(Paneles A y B figura V6) en cambio el peacuteptido F226-244 (amarillo) se encuentra maacutes
escondido En el modelo que se propone como estado post-fusioacuten todos los peacuteptidos
aparecen expuestos (Paneles C y D figura V6) El peacuteptido F83-102 se divisa menos porque
este modelo carece de los aminoaacutecidos 91 a 125 Estas predicciones apuntan a que la
falta de reconocimiento no seriacutea debido a que estas zonas no esteacuten expuestas en la
proteiacutena
En los paneles E F y G de la figura V6 se muestra la conformacioacuten que se
propone para los diferentes peacuteptidos en la proteiacutena Dado que los peacuteptidos son cortos
Discusioacuten
104
Figura V6 Ubicacioacuten en el modelo estructural informaacutetico de los peacuteptidos utilizados para la inoculacioacuten (paneles A a D) y estructura de los peacuteptidos en este modelo (Panel E a G) Los 3 peacuteptidos se han resaltado en los modelos informaacuteticos que se propone pertenecen a los estados pre (izquierda) y post-fusioacuten (derecha) presentados en Resultados Los paneles E F y G muestran la estructura que los peacuteptidos adoptan en estos modelos Peacuteptido 82-103 color rojo Peacuteptido 226-244 color amarillo Peacuteptido 464-485 color azul
A
B D
C
F83-102
F226-244
F465-484
E
F
G
(aproximadamente 20 aminoaacutecidos) es muy probable que no esteacuten adoptando la
conformacioacuten que tienen en la proteiacutena F del MNVH y por esto los sueros obtenidos no
los reconocen en la proteiacutena nativa Estos resultados coinciden con un trabajo previo
realizado con peacuteptidos de la proteiacutena F del VRSH en nuestro laboratorio (Loacutepez et al
1993) En este estudio los peacuteptidos F255-275 (21 residuos) F235-275 (41 residuos) y
F215-275 (61 residuos) se inocularon en conejos y ratones obteniendo altos tiacutetulos de
anticuerpos anti-peacuteptidos en todos los casos Sin embargo ninguno de los sueros
obtenidos en conejos reconocioacute a la proteiacutena F nativa y de los sueros obtenidos en
ratones solo el suero anti-peacuteptido F215-275 (61 residuos) reconocioacute deacutebilmente a la
proteiacutena F nativa Estudios estructurales de estos peacuteptidos mostraron que el incremento
en la antigenicidad del peacuteptido maacutes largo se correlacionaba con la conformacioacuten
adoptada por los peacuteptidos en solucioacuten ya que el espectro de dicroiacutesmo circular de los
peacuteptidos F255-275 y F235-275 fue similar y con un alto contenido de estructuras
aperioacutedicas en cambio el peacuteptido F215-275 mostroacute un alto contenido de estructuras
perioacutedicas (α-heacutelices yo hojas β)
Discusioacuten
105
V43 Sueros policlonales de conejos inoculados con virus vaccinia recombinantes
Los sueros de conejos inoculados con los virus vv-F o vvFTM- contienen anticuerpos
especiacuteficos que reconocieron tanto a las formas desnaturalizadas de la proteiacutena F del
MNVH como a la forma nativa ya que fueron capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
Estos resultados indican que como en el caso de la proteiacutena F del VRSH la proteiacutena F del
MNVH adoptoacute una conformacioacuten similar a la forma existente en la membrana viral
(Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987)
El sistema de virus vaccinia recombinantes fue escogido para la inoculacioacuten de
conejos porque ha sido una herramienta muy utilizada desde su desarrollo en la deacutecada
de los 80 (Mackett et al 1982) para la expresioacuten y caracterizacioacuten de una multitud de
genes virales o no De hecho los virus vaccinia recombinantes han sido ampliamente
utilizados para la caracterizacioacuten de proteiacutenas homoacutelogas a la F del MNVH en virus tan
relacionados como el virus de la parainfluenza humana tipo 3 (Spriggs et al 1987) o el
virus respiratorio sincitial Las glicoproteiacutenas de membrana F y G del VRSH que han sido
expresadas utilizando este sistema fueron indistinguibles de las producidas en una
infeccioacuten por el VRSH en lo que respecta a glicosilacioacuten puentes disulfuros distribucioacuten
celular expresioacuten en la superficie celular antigenicidad o mobilidad electroforeacutetica (Ball et
al 1986 Olmsted et al 1986 Stott et al 1987 Wertz et al 1987) Por otro lado la
inoculacioacuten de estos recombinantes en una gran variedad de animales dio como
resultado antisueros especiacuteficos para estas proteiacutenas con altas concentraciones de
anticuerpos neutralizantes para el VRSH
Bembridge y colaboradores publicaron que la respuesta inducida al inocular
ratones con virus vaccinia recombinantes que expresaban la forma completa o soluble de
la proteiacutena F del virus respiratorio sincitial humano no habiacutea mostrado diferencias
cuantitativas o cualitativas importantes (Bembridge et al 1999) En nuestro caso no se
hicieron ensayos para determinar queacute tipo de anticuerpos fueron inducidos pero del
ELISA de la figura IV8 de Resultados se desprende que aparentemente los sueros de los
conejos inoculados con el virus vaccinia recombinante que expresa la proteiacutena soluble
tienen un tiacutetulo levemente inferior
Por uacuteltimo dado que tanto los sueros originados a partir del virus vaccinia que
Discusioacuten
106
expresa la proteiacutena completa como los originados a partir del virus vaccinia que expresa
la proteiacutena sin la regioacuten transmembrana y citoplasmaacutetica pudieron neutralizar la
infectividad viral la conformacioacuten que ambas adoptan debe o ser similar o compartir
epiacutetopos con la proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
V44 Sueros policlonales de conejos inoculados con proteiacutena FTM- 6His purificada
La proteiacutena FTM- 6His inoculada en conejos originoacute unos sueros que mostraron
una mayor reactividad con la proteiacutena F en los ensayos de ELISA en comparacioacuten con
los sueros obtenidos frente a peacuteptidos de la proteiacutena F o frente a virus vaccinia
recombinantes Tambieacuten dieron una sentildeal maacutes intensa en los ensayos de western blot y
de inmunofluerescencia y en general se mostraron superiores a los demaacutes antisueros en
los ensayos de neutralizacioacuten
Es destacable el hecho de que la proteiacutena purificada que no tiene la regioacuten
transmembrana ni se le ha agregado ninguna secuencia estabilizadora homoacuteloga a la
secuencia GCNt (Yin et al 2006) y que por tanto estariacutea en el que se supone estado de
post-fusioacuten sea capaz de neutralizar la infectividad del MNVH seguramente a traveacutes de
una interaccioacuten con la proteiacutena F (en estado pre-activo) Estos resultados sugieren que
podriacutean existir epiacutetopos comunes entre la forma pre-activa o los intermediarios y la forma
post-activa de la proteiacutena
VI CONCLUSIONES
Conclusiones
107
VI CONCLUSIONES
1- El MNVH (cepa NL199) crece mejor en ceacutelulas Vero118 o LLC-MK2 y siempre en
presencia de tripsina (2microgml) El efecto citopaacutetico se observa a partir de los 3 diacuteas y a
diferencia de lo que ocurre con la mayoriacutea de los paramixovirus no existe una formacioacuten
clara de sincitios sino maacutes bien la formacioacuten de cuacutemulos de ceacutelulas redondeadas que se
desprenden de la placa en los estadiacuteos avanzados de la infeccioacuten
2- Se ha puesto a punto un ensayo de formacioacuten de focos infecciosos que seraacute de utilidad
para seguir la infeccioacuten por el MNVH Este ensayo podraacute utilizarse entre otros para
titulacioacuten del MNVH y para la evaluacioacuten de reactivos en ensayos de neutralizacioacuten viral
Este ensayo seriacutea tambieacuten de utilidad para el seguimiento del rescate del MNVH en
sistemas de geneacutetica reversa
3- Se han producido anticuerpos que permiten la deteccioacuten del MNVH y de la proteiacutena de
fusioacuten (F) del mismo en los diferentes ensayos que se utilizan de manera rutinaria en el
laboratorio (ensayos de inmunofluorescencia western blot y ELISA) Ademaacutes varios de
los sueros originados son capaces de neutralizar la infeccioacuten viral
4- Se han generado virus vaccinia recombinantes que permiten la expresioacuten de una forma
soluble de la proteiacutena F que teniendo en cuenta los ensayos de neutralizacioacuten viral
realizados con los sueros de los conejos inoculados con la proteiacutena purificada indican que
esta proteiacutena debe adoptar una conformacioacuten muy similar o compartir epiacutetopos con la
proteiacutena que se encuentra en la membrana viral
5- Se ha puesto a punto un protocolo de purificacioacuten de la proteiacutena FTM- 6His que nos
permitioacute alcanzar una pureza suficiente para analizar esta proteiacutena al microscopio
electroacutenico
6- El volumen 3D de la proteiacutena FTM- 6His se determinoacute a partir de micrografiacuteas tomadas al
microscopio electroacutenico El procesamiento y anaacutelisis de estas imaacutegenes muestra que la
proteiacutena FTM- 6His como sus proteiacutenas homoacutelogas de la familia de los paramixovirus es
un triacutemero y tiene una estructura en forma de cono de aproximadamente 17nm de longitud
Conclusiones
108
en la que pueden diferenciarse tres partes cabeza cuello y tallo
7- Se ha elaborado un modelo de la estructura tridimensional de la proteiacutena F del MNVH
en el que se supone es el estado post-fusioacuten basado en la estructura atoacutemica de la
proteiacutena F del virus de la parainfluenza humana tipo 3 Este modelo se puede encajar en
el volumen 3D generado a partir de la microscopiacutea electroacutenica
8- La proteiacutena F del MNVH de la cepa NL199 clonada en el pCAGGs es capaz de
inducir la formacioacuten de sincitios independiente del pH en ceacutelulas transfectadas Como en el
caso del VRSH no requiere de la co-expresioacuten de la proteiacutena G para la formacioacuten de
sincitios pero sin embargo siacute requiere de la adicioacuten de tripsina
9- El aminoaacutecido en la posicioacuten 294 de la proteiacutena F del linaje A del MNVH parece ser
importante para su capacidad fusogeacutenica Un residuo de glicina en esta posicioacuten
determina que la proteiacutena sea dependiente de pH para inducir la formacioacuten de sincitios
en las proteiacutenas del linaje A aunque no para las proteiacutenas F del linaje B Dado que el
residuo glicina en la posicioacuten 294 se encuentra soacutelo en una pequentildea proporcioacuten de las
secuencias de proteiacutena F del linaje A publicadas (27 de las 433) la dependencia del pH
aacutecido para fusionar es probablemente una caracteriacutestica poco comuacuten entre las proteiacutenas
de fusioacuten del MNVH
VII BIBLIOGRAFIacuteA
Bibliografiacutea
109
Baker KA Dutch RE Lamb RA y Jardetzky TS (1999) Structural basis for paramyxovirus-mediated membrane fusion Mol Cell 3(3) 309-19
Ball LA Young KK Anderson K Collins PL y Wertz GW (1986) Expression of the major glycoprotein G of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors Proc Natl Acad Sci U S A 83(2) 246-50
Bastien N Ward D Van Caeseele P Brandt K Lee SH McNabb G Klisko B Chan E y Li Y (2003) Human metapneumovirus infection in the Canadian population J Clin Microbiol 41(10) 4642-6
Bembridge GP Lopez JA Bustos R Melero JA Cook R Mason H y Taylor G (1999) Priming with a secreted form of the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) promotes interleukin-4 (IL-4) and IL-5 production but not pulmonary eosinophilia following RSV challenge J Virol 73(12) 10086-94
Biacchesi S Pham QN Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Infection of nonhuman primates with recombinant human metapneumovirus lacking the SH G or M2-2 protein categorizes each as a nonessential accessory protein and identifies vaccine candidates J Virol 79(19) 12608-13
Biacchesi S Skiadopoulos MH Boivin G Hanson CT Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2003) Genetic diversity between human metapneumovirus subgroups Virology 315(1) 1-9
Biacchesi S Skiadopoulos MH Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004a) Recovery of human metapneumovirus from cDNA optimization of growth in vitro and expression of additional genes Virology 321 247-259
Biacchesi S Skiadopoulos MH Yang L Lamirande EW Tran KC Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2004b) Recombinant human Metapneumovirus lacking the small hydrophobic SH andor attachment G glycoprotein deletion of G yields a promising vaccine candidate J Virol 78(23) 12877-87
Blasco R y Moss B (1995) Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque formation Gene 158(2) 157-62
Boivin G Abed Y Pelletier G Ruel L Moisan D Cote S Peret TC Erdman DD y Anderson LJ (2002) Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus a new paramyxovirus responsible for acute respiratory-tract infections in all age groups J Infect Dis 186(9) 1330-4
Boivin G De Serres G Cote S Gilca R Abed Y Rochette L Bergeron MG y Dery P (2003) Human metapneumovirus infections in hospitalized children Emerg Infect Dis 9(6) 634-40
Buchholz UJ Biacchesi S Pham QN Tran KC Yang L Luongo CL Skiadopoulos MH Murphy BR y Collins PL (2005) Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus effects on RNA synthesis attenuation and immunogenicity J Virol 79(11) 6588-97
Buchholz UJ Finke S y Conzelmann KK (1999) Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter J Virol 73(1) 251-9
Calder LJ Gonzalez-Reyes L Garciacutea-Barreno B Wharton SA Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2000) Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies Virology 271(1) 122-31
Bibliografiacutea
110
Cantiacuten C Holguera J Ferreira L Villar E y Muntildeoz-Barroso I (2007) Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated endocytosis J Gen Virol 88 559-569
Carneiro FA Staufer F Lima CS Juliano MA Juliano L y Da Poian AT (2003) Membrane fusion induced by the Vesicular Stomatitis Virus depends on histidine protonation JBiol Chem 278 13789-13794
Collins PL and Crowe James E Jr (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 46 Respiratory Syncytial Virus and Metapneumovirus paacuteg 1601-1646 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Collins PL Hill MG Camargo E Grosfeld H Chanock RM y Murphy BR (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development Proc Natl Acad Sci U S A 92(25) 11563-7
Collins PL Hill MG Cristina J y Grosfeld H (1996) Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus a nonsegmented negative-strand RNA virus Proc Natl Acad Sci U S A 93(1) 81-5
Connolly SA Leser GP Yin HS Jardetzky TS y Lamb RA (2006) Refolding of a paramyxovirus F protein from prefusion to postfusion conformations observed by liposome binding and electron microscopy Proc Natl Acad Sci U S A 103(47) 17903-8
Corpet F (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering (httpbioinfogenopole-toulouseprdfrmultalinmultalinhtml)
Corral T Ver LS Mottet G Cano O Garciacutea-Barreno B Calder LJ Skehel JJ Roux L y Melero JA (2007) High level expression of soluble glycoproteins in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs using a Sendai virus minigenome system BMC Biotechnol 7 17
Cseke G Wright DW Tollefson SJ Johnson JE Crowe JE Jr y Williams JV (2007) Human metapneumovirus fusion protein vaccines that are immunogenic and protective in cotton rats J Virol 81(2) 698-707
Chan DC Fass D Berger JM y Kim PS (1997) Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein Cell 89(2) 263-73
Chan DC y Kim PS (1998) HIV entry and its inhibition Cell 93(5) 681-4 Chen L Colman PM Cosgrove LJ Lawrence MC Lawrence LJ Tulloch PA y
Gorman JJ (2001a) Cloning expression and crystallization of the fusion protein of Newcastle disease virus Virology 290(2) 290-9
Chen L Gorman JJ McKimm-Breschkin J Lawrence LJ Tulloch PA Smith BJ Colman PM y Lawrence MC (2001b) The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion Structure 9(3) 255-66
Daecke J Fackler OT Dittmar MT y Krausslich HG (2005) Involvement of clathrin-mediated endocytosis in human immuno-deficiency virus type 1 entry J Virol 79 1581-1594
de Swart RL van den Hoogen BG Kuiken T Herfst S van Amerongen G Yuksel S Sprong L y Osterhaus AD (2007) Immunization of macaques with formalin-inactivated human metapneumovirus induces hypersensitivity to hMPV infection Vaccine 25(51) 8518-28
Dollner H Risnes K Radtke A y Nordbo SA (2004) Outbreak of human metapneumovirus infection in norwegian children Pediatr Infect Dis J 23(5) 436-40
Bibliografiacutea
111
Dunn K y Maxfield FR (1998) Ratio imaging instrumentation Methods Cell Biol 56 217-36
Dutch RE Jardetzky TS y Lamb RA (2000) Virus membrane fusion proteins biological machines that undergo a metamorphosis Biosci Rep 20(6) 597-612
Ebihara T Endo R Kikuta H Ishiguro N Yoshioka M Ma X y Kobayashi K (2003) Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan J Med Virol 70(2) 281-3
Ebihara T Endo R Ma X Ishiguro N y Kikuta H (2005) Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by an immunofluorescent-antibody test J Clin Microbiol 43(3) 1138-41
Escribano-Romero E Rawling J Garciacutea-Barreno B y Melero JA (2004) The soluble form of human respiratory syncytial virus attachment protein differs from the membrane-bound form in its oligomeric state but is still capable of binding to cell surface proteoglycans J Virol 78(7) 3524-32
Esper F Boucher D Weibel C Martinello RA y Kahn JS (2003) Human metapneumovirus infection in the United States clinical manifestations associated with a newly emerging respiratory infection in children Pediatrics 111(6 Pt 1) 1407-10
Esper F Martinello RA Boucher D Weibel C Ferguson D Landry ML y Kahn JS (2004) A 1-year experience with human metapneumovirus in children aged lt5 years J Infect Dis 189(8) 1388-96
Falsey AR Erdman D Anderson LJ y Walsh EE (2003) Human metapneumovirus infections in young and elderly adults J Infect Dis 187(5) 785-90
Frank J (1996) Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies Academic Press (publisher) Inc
Frank J Radermacher M Penczek P Zhu J Li Y Ladjadj M y Leith A (1996) SPIDER and WEB processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields J Struct Biol 116(1) 190-9
Freymouth F Vabret A Legrand L Eterradossi N Lafay-Delaire F Brouard J y Guillois B (2003) Presence of the new human metapneumovirus in French children with bronchiolitis Pediatr Infect Dis J 22(1) 92-4
Fuentes S Tran KC Luthra P Teng MN y He B (2007) Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein J Virol 81(15) 8361-6
Fuerst TR Niles EG Studier FW y Moss B (1986) Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase Proc Natl Acad Sci U S A 83(21) 8122-6
Galiano M Trento A Ver L Carballal G y Videla C (2006) Genetic heterogeneity of G and F protein genes from Argentinean human metapneumovirus strains J Med Virol 78(5) 631-7
Garciacutea-Barreno B Delgado T y Melero JA (1996) Identification of protein regions involved in the interaction of human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleoprotein significance for nucleocapsid assembly and formation of cytoplasmic inclusions J Virol 70(2) 801-8
Garciacutea-Barreno B Palomo C Penas C Delgado T Perez-Brena P y Melero JA (1989) Marked differences in the antigenic structure of human respiratory syncytial virus F and G glycoproteins J Virol 63(2) 925-32
Garciacutea J Garciacutea-Barreno B Vivo A y Melero JA (1993) Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein the phosphoprotein and the 22K protein Virology 195(1) 243-7
Bibliografiacutea
112
Gasteiger E Hoogland C Gattiker A Duvaud S Wilkins MR Appel RD Bairoch A (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook Humana Press (httpwwwexpasychtoolsprotscalehtml)
Glaser CA Honarmand S Anderson LJ Schnurr DP Forghani B Cossen CK Schuster FL Christie LJ y Tureen JH (2006) Beyond viruses clinical profiles and etiologies associated with encephalitis Clin Infect Dis 43(12) 1565-77
Gonzaacutelez-Reyes L Ruiz-Arguello MB Garciacutea-Barreno B Calder L Loacutepez JA Albar JP Skehel JJ Wiley DC y Melero JA (2001) Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion Proc Natl Acad Sci U S A 98(17) 9859-64
Graaf de M Herfst S Schrauwen EJA van den Hoogen B Osterhaus ADME y Fouchier RAM (2007) An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus Journal of Virological Methods 143(2) 169-74
Greensill J McNamara PS Dove W Flanagan B Smyth RL y Hart CA (2003) Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis Emerg Infect Dis 9(3) 372-5
Hallak LK Collins PL Knudson W y Peeples ME (2000) Iduronic acid-containing glycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytial virus infection Virology 271(2) 264-75
Hamelin ME Abed Y y Boivin G (2004) Human metapneumovirus a new player among respiratory viruses Clin Infect Dis 38(7) 983-90
Hamelin ME Prince GA y Boivin G (2006) Effect of ribavirin and glucocorticoid treatment in a mouse model of human metapneumovirus infection Antimicrob Agents Chemother 50(2) 774-7
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166(4) 557-80
Hardy RW Harmon SB y Wertz GW (1999) Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination J Virol 73(1) 170-6
He B Lin GY Durbin JE Durbin RK y Lamb RA (2001) The SH integral membrane protein of the paramyxovirus simian virus 5 is required to block apoptosis in MDBK cells J Virol 75(9) 4068-79
Herfst S de Graaf M Schickli JH Tang RS Kaur J Yang CF Spaete RR Haller AA van den Hoogen BG Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Recovery of human metapneumovirus genetic lineages a and B from cloned cDNA J Virol 78(15) 8264-70
Herfst S de Graaf M Schrauwen EJ Ulbrandt ND Barnes AS Senthil K Osterhaus AD Fouchier RA y van den Hoogen BG (2007) Immunization of Syrian golden hamsters with F subunit vaccine of human metapneumovirus induces protection against challenge with homologous or heterologous strains J Gen Virol 88(Pt 10) 2702-9
Hernandez LD Hoffman LR Wolfsberg TG y White JM (1996) Virus-cell and cell-cell fusion Annu Rev Cell Dev Biol 12 627-61
Howe M (2002) Australian find suggests worldwide reach for metapneumovirus Lancet Infect Dis 2(4) 202
Johnson S Oliver C Prince GA Hemming VG Pfarr DS Wang SC Dormitzer M OGrady J Koenig S Tamura JK Woods R Bansal G Couchenour D Tsao E Hall WC y Young JF (1997) Development of a humanized monoclonal
Bibliografiacutea
113
antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus J Infect Dis 176(5) 1215-24
Kaida A Iritani N Kubo H Shiomi M Kohdera U y Murakami T (2006) Seasonal distribution and phylogenetic analysis of human metapneumovirus among children in Osaka City Japan J Clin Virol 35(4) 394-9
Kaverin NV y Webster RG (1995) Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity J Virol 69(4) 2700-3
Kim HW Canchola JG Brandt CD Pyles G Chanock RM Jensen K y Parrott RH (1969) Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine Am J Epidemiol 89(4) 422-34
Kuo L Grosfeld H Cristina J Hill MG y Collins PL (1996) Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus J Virol 70(10) 6892-901
Kyte J y Doolittle RF (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein J Mol Biol 157(1) 105-32
Lamb RA (1993) Paramyxovirus fusion a hypothesis for changes Virology 197(1) 1-11 Lamb RA y Friffith D P (2006) En Fields Virology 5ta Ed Chapter 41
Paramyxoviridae The Viruses and their replication paacuteg 1449-1497 Editado por DM Knipe amp PM Howley Philadelphia Lipopincott Williams amp Wilkins
Lamb RA y Jardetzky TS (2007) Structural basis of viral invasion lessons from paramyxovirus F Curr Opin Struct Biol 17(4) 427-36
Lambert DM Barney S Lambert AL Guthrie K Medinas R Davis DE Bucy T
Erickson J Merutka G y Petteway SR Jr (1996) Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion Proc Natl Acad Sci U S A 93(5) 2186-91
Landry ML Ferguson D Cohen S Peret TC y Erdman DD (2005) Detection of human metapneumovirus in clinical samples by immunofluorescence staining of shell vial centrifugation cultures prepared from three different cell lines J Clin Microbiol 43(4) 1950-2
Lawrence MC Borg NA Streltsov VA Pilling PA Epa VC Varghese JN McKimm-Breschkin JL y Colman PM (2004) Structure of the haemagglutinin-neuraminidase from human parainfluenza virus type III J Mol Biol 335(5) 1343-57
Lescar J Roussel A Wien MW Navaza J Fuller SD Wengler G y Rey FA (2001) The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH Cell 105 137-148
Lin Y Bright AC Rothermel TA y He B (2003) Induction of apoptosis by paramyxovirus simian virus 5 lacking a small hydrophobic gene J Virol 77(6) 3371-83
Ling R Davis PJ Yu Q Wood CM Pringle CR Cavanagh D y Easton AJ (1995) Sequence and in vitro expression of the phosphoprotein gene of avian pneumovirus Virus Res 36(2-3) 247-57
Loacutepez JA Andreu D Carreno C Whyte P Taylor G y Melero JA (1993) Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein J Gen Virol 74 ( Pt 12) 2567-77
Ludtke SJ Baldwin PR y Chiu W (1999) EMAN semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions J Struct Biol 128(1) 82-97
Bibliografiacutea
114
Ludwig K Baljinnyam B Herrmann A y Boumlttcher C (2003) The 3D structure of the fusion pimed Sendai F-protein determined by electron cryomicroscopy Embo J 22 No15 3761-3771
Mackett M Smith GL y Moss B (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector Proc Natl Acad Sci U S A 79(23) 7415-9
MacPhail M Schickli JH Tang RS Kaur J Robinson C Fouchier RA Osterhaus AD Spaete RR y Haller AA (2004) Identification of small-animal and primate models for evaluation of vaccine candidates for human metapneumovirus (hMPV) and implications for hMPV vaccine design J Gen Virol 85(Pt 6) 1655-63
Madhi SA Ludewick H Abed Y Klugman KP y Boivin G (2003) Human metapneumovirus-associated lower respiratory tract infections among hospitalized human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected and HIV-1-uninfected African infants Clin Infect Dis 37(12) 1705-10
Maertzdorf J Wang CK Brown JB Quinto JD Chu M de Graaf M van den Hoogen BG Spaete R Osterhaus AD y Fouchier RA (2004) Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of human metapneumoviruses from all known genetic lineages J Clin Microbiol 42(3) 981-6
Maggi F Pifferi M Vatteroni M Fornai C Tempestini E Anzilotti S Lanini L Andreoli E Ragazzo V Pistello M Specter S y Bendinelli M (2003) Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-year study of nasal swabs from infants in Italy J Clin Microbiol 41(7) 2987-91
Manoha C Espinosa S Aho SL Huet F y Pothier P (2007) Epidemiological and clinical features of hMPV RSV and RVs infections in young children J Clin Virol 38(3) 221-6
Martinez I y Melero JA (2000) Binding of human respiratory syncytial virus to cells implication of sulfated cell surface proteoglycans J Gen Virol 81(Pt 11) 2715-22
Melikyan GB Barnard RJ Abrahamyan LG Mothes W y Young JA (2005) Imaging individual retroviral fusion events from hemifusion to pore formation and growth Proc Natl Acad Sci U S A 102(24) 8728-33
Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetic Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Mink MA Stec DS y Collins PL (1991) Nucleotide sequences of the 3 leader and 5 trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA Virology 185(2) 615-24
Miyazaki J Takaki S Araki K Tashiro F Tominaga A Takatsu K y Yamamura K (1989) Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5 Gene 79(2) 269-77
Morrison TG (1988) Structure function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins Virus Res 10(2-3) 113-35
Moss B Elroy-Stein O Mizukami T Alexander WA y Fuerst TR (1990) Product review New mammalian expression vectors Nature 348(6296) 91-2
Mullins JA Erdman DD Weinberg GA Edwards K Hall CB Walker FJ Iwane M y Anderson LJ (2004) Human metapneumovirus infection among children hospitalized with acute respiratory illness Emerg Infect Dis 10(4) 700-5
NCMI-EMAN National Center for Macromolecular Imaging httpncmibcmtmceduncmi Niwa H Yamamura K y Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector Gene 108(2) 193-9 Olmsted RA Elango N Prince GA Murphy BR Johnson PR Moss B Chanock
RM y Collins PL (1986) Expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus by a recombinant vaccinia virus comparison of the individual contributions of
Bibliografiacutea
115
the F and G glycoproteins to host immunity Proc Natl Acad Sci U S A 83(19) 7462-6
Peiris JS Tang WH Chan KH Khong PL Guan Y Lau YL y Chiu SS (2003) Children with respiratory disease associated with metapneumovirus in Hong Kong Emerg Infect Dis 9(6) 628-33
Pelletier G Dery P Abed Y y Boivin G (2002) Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child Emerg Infect Dis 8(9) 976-8
Percivalle E Sarasini A Visai L Revello MG y Gerna G (2005) Rapid detection of human metapneumovirus strains in nasopharyngeal aspirates and shell vial cultures by monoclonal antibodies J Clin Microbiol 43(7) 3443-6
Peret TC Boivin G Li Y Couillard M Humphrey C Osterhaus AD Erdman DD y Anderson LJ (2002) Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America J Infect Dis 185(11) 1660-3
Pham QN Biacchesi S Skiadopoulos MH Murphy BR Collins PL y Buchholz UJ (2005) Chimeric recombinant human metapneumoviruses with the nucleoprotein or phosphoprotein open reading frame replaced by that of avian metapneumovirus exhibit improved growth in vitro and attenuation in vivo J Virol 79(24) 15114-22
Randhawa JS Wilson SD Tolley KP Cavanagh D Pringle CR y Easton AJ (1996) Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus J Gen Virol 77 ( Pt 12) 3047-51
Raza K Ismailjee SB Crespo M Studer SM Sanghavi S Paterson DL Kwak EJ Rinaldo CR Jr Pilewski JM McCurry KR y Husain S (2007) Successful outcome of human metapneumovirus (hMPV) pneumonia in a lung transplant recipient treated with intravenous ribavirin J Heart Lung Transplant 26(8) 862-4
Rey FA Heinz FX Mandl C Kunz C y Harrison SC (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalistis virus at 2A resolution Nature 375 291-298
Roberts SR Lichtenstein D Ball LA y Wertz GW (1994) The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons J Virol 68(7) 4538-46
Ruprecht J y Nield J (2001) Determining the structure of biological macromolecules by transmission electron microscopy single particle analysis and 3D reconstruction Prog Biophys Mol Biol 75(3) 121-64
Russell CJ Jardetzky TS y Lamb RA (2001) Membrane fusion machines of paramyxoviruses capture of intermediates of fusion Embo J 20(15) 4024-34
Russell CJ y Luque LE (2006) The structural basis of paramyxovirus invasion Trends Microbiol 14(6) 243-6
Russell R Paterson RG y Lamb RA (1994) Studies with cross-linking reagents on the
oligomeric form of the paramyxovirus fusion protein Virology 199(1) 160-8 Sachse C Chen JZ Coureux PD Stroupe ME Fandrich M y Grigorieff N (2007)
High-resolution electron microscopy of helical specimens a fresh look at tobacco mosaic virus J Mol Biol 371(3) 812-35
Samal SK y Zamora M (1991) Nucleotide sequence analysis of a matrix and small hydrophobic protein dicistronic mRNA of bovine respiratory syncytial virus
Bibliografiacutea
116
demonstrates extensive sequence divergence of the small hydrophobic protein from that of human respiratory syncytial virus J Gen Virol 72 ( Pt 7) 1715-20
Sambrook J Fritsh EF Maniatis T (1989) Molecular Cloning A laboratory manual 21-69 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor Nueva York
Scheltinga SA Templeton KE Beersma MF y Claas EC (2005) Diagnosis of human metapneumovirus and rhinovirus in patients with respiratory tract infections by an internally controlled multiplex real-time RNA PCR J Clin Virol 33(4) 306-11
Schildgen O Glatzel T Geikowski T Scheibner B Matz B Bindl L Born M Viazov S Wilkesmann A Knopfle G Roggendorf M y Simon A (2005) Human metapneumovirus RNA in encephalitis patient Emerg Infect Dis 11(3) 467-70
Schowalter RM Smith SE y Dutch RE (2006) Characterization of human metapneumovirus F protein-promoted membrane fusion critical roles for proteolytic processing and low pH J Virol 80(22) 10931-41
Skehel JJ y Wiley DC (1998) Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion Cell 95(7) 871-4
Skehel JJ y Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69 531-69
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Amaro-Carambot E Surman SR Collins PL y Murphy BR (2006) Individual contributions of the human metapneumovirus F G and SH surface glycoproteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity Virology 345(2) 492-501
Skiadopoulos MH Biacchesi S Buchholz UJ Riggs JM Surman SR Amaro-Carambot E McAuliffe JM Elkins WR St Claire M Collins PL y Murphy BR (2004) The two major human metapneumovirus genetic lineages are highly related antigenically and the fusion (F) protein is a major contributor to this antigenic relatedness J Virol 78(13) 6927-37
Spider Web httpwwwwadsworthorgspider_docspiderdocsspiderhtml Spriggs MK Murphy BR Prince GA Olmsted RA y Collins PL (1987) Expression
of the F and HN glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by recombinant vaccinia viruses contributions of the individual proteins to host immunity J Virol 61(11) 3416-23
Stockton J Stephenson I Fleming D y Zambon M (2002) Human metapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness Emerg Infect Dis 8(9) 897-901
Stott EJ Taylor G Ball LA Anderson K Young KK King AM y Wertz GW (1987) Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus J Virol 61(12) 3855-61
Stowell MH Miyazawa A y Unwin N (1998) Macromolecular structure determination by electron microscopy new advances and recent results Curr Opin Struct Biol 8(5) 595-600
Tang RS Mahmood K Macphail M Guzzetta JM Haller AA Liu H Kaur J Lawlor HA Stillman EA Schickli JH Fouchier RA Osterhaus AD y Spaete RR (2005) A host-range restricted parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the human metapneumovirus (hMPV) fusion protein elicits protective immunity in African green monkeys Vaccine 23(14) 1657-67
Tatusova TA Madden TL (1999) EXPASY Proteomics Server (Expert Protein Analysis System) (httpgenopoletoulouseinrafrblastwblats2html)
Bibliografiacutea
117
Teng MN y Collins PL (1998) Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles J Virol 72(7) 5707-16
Thuman-Commike PA (2001) Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy FEBS Lett 505(2) 199-205
Towbin H Staehelin T y Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 76(9) 4350-4
Ulbrandt ND Ji H Patel NK Riggs JM Brewah YA Ready S Donacki NE Folliot K Barnes AS Senthil K Wilson S Chen M Clarke L MacPhail M Li J Woods RM Coelingh K Reed JL McCarthy MP Pfarr DS Osterhaus AD Fouchier RA Kiener PA y Suzich JA (2006) Isolation and characterization of monoclonal antibodies which neutralize human metapneumovirus in vitro and in vivo J Virol 80(16) 7799-806
van den Hoogen BG Bestebroer TM Osterhaus AD y Fouchier RA (2002) Analysis of the genomic sequence of a human metapneumovirus Virology 295(1) 119-32
van den Hoogen BG de Jong JC Groen J Kuiken T de Groot R Fouchier RA y Osterhaus AD (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease Nat Med 7(6) 719-24
van den Hoogen BG Herfst S Sprong L Cane PA Forleo-Neto E de Swart RL Osterhaus AD y Fouchier RA (2004a) Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses Emerg Infect Dis 10(4) 658-66
van den Hoogen BG Osterhaus DM y Fouchier RA (2004b) Clinical impact and diagnosis of human metapneumovirus infection Pediatr Infect Dis J 23(1 Suppl) S25-32
Viazov S Ratjen F Scheidhauer R Fiedler M y Roggendorf M (2003) High prevalence of human metapneumovirus infection in young children and genetic heterogeneity of the viral isolates J Clin Microbiol 41(7) 3043-5
Walsh EE y Hruska J (1983) Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins identification of the fusion protein J Virol 47(1) 171-7
Weissenhorn W Carfi A Lee KH Skehel JJ y Wiley DC (1998) Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit GP2 from the envelope glycoprotein ectodomain Mol Cell 2(5) 605-16
Weissenhorn W Dessen A Calder LJ Harrison SC Skehel JJ y Wiley DC (1999) Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses Mol Membr Biol 16(1) 3-9
Wertz GW Stott EJ Young KK Anderson K y Ball LA (1987) Expression of the fusion protein of human respiratory syncytial virus from recombinant vaccinia virus vectors and protection of vaccinated mice J Virol 61(2) 293-301
Williams JV Harris PA Tollefson SJ Halburnt-Rush LL Pingsterhaus JM Edwards KM Wright PF y Crowe JE Jr (2004) Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children N Engl J Med 350(5) 443-50
Wrigley NG Brown EB Skehel JJ (1986) Electron micoscopy of influenza virus Electron microscopy of proteins 103-163 pp 5 Viral Structure Academic Press Londres
Wyde PR Chetty SN Jewell AM Boivin G y Piedra PA (2003) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro Antiviral Res 60(1) 51-9
Bibliografiacutea
118
Wyde PR Moylett EH Chetty SN Jewell A Bowlin TL y Piedra PA (2004) Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by NMSO3 in tissue culture assays Antiviral Res 63(1) 51-9
Yin HS Paterson RG Wen X Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein Proc Natl Acad Sci U S A 102(26) 9288-93
Yin HS Wen X Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2006) Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation Nature 439(7072) 38-44
Yu Q Davis PJ Li J y Cavanagh D (1992) Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus Virology 186(2) 426-34
Yuan P Thompson TB Wurzburg BA Paterson RG Lamb RA y Jardetzky TS (2005) Structural studies of the parainfluenza virus 5 hemagglutinin-neuraminidase tetramer in complex with its receptor sialyllactose Structure 13(5) 803-15
Zaitsev V von Itzstein M Groves D Kiefel M Takimoto T Portner A y Taylor G (2004) Second sialic acid binding site in Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase implications for fusion J Virol 78(7) 3733-41
Zhao X Singh M Malashkevich VN y Kim PS (2000) Structural characterization of the human respiratory syncytial virus fusion protein core Proc Natl Acad Sci U S A 97(26) 14172-7
Zhou ZH Hardt S Wang B Sherman MB Jakana J y Chiu W (1996) CTF determination of images of ice-embedded single particles using a graphics interface J Struct Biol 116(1) 216-22
Zimmer G Budz L y Herrler G (2001) Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein Cleavage at two furin consensus sequences J Biol Chem 276(34) 31642-50
VIII ANEXO
- SUMMARY
- IacuteNDICE
- ABREVIATURAS
- I INTRODUCCIOacuteN
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- I1 Clasificacioacuten del MNVH y analogiacutea con otros virus
- I2 Caracteriacutesticas de la enfermedad
- I3 Biologiacutea molecular del MNVH
- I4 La glicoproteiacutena F del MNVH
- I5 Proceso de fusioacuten de membranas
- I6 Teacutecnicas para el estudio estructural de proteiacutenas
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- II OBJETIVOS
- III MATERIALES Y MEacuteTODOS
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- III1 Materiales
- III2 Meacutetodos
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- IV RESULTADOS
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- IV1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- IV2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- IV3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- IV4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
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- V DISCUSIOacuteN
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- V1 Crecimiento y titulacioacuten del MNVH en cultivos celulares
- V2 Clonaje expresioacuten y purificacioacuten de la proteiacutena F del MNVH
- V3 Caracterizacioacuten estructural y funcional de la proteiacutena F del MNVH
- V4 Obtencioacuten de reactivos inmunoquiacutemicos frente a la proteiacutena F del MNVH
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- VI CONCLUSIONES
- VII BIBLIOGRAFIacuteA
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