CAPITULO 2

VECTORES PARA CLONACION GENETICA: PLASMIDOS Y BACTERIOFAGOS

Una molécula de ADN necesita mostrar varias características para ser capaz de actuar como un vector para la clonación de genes. Lo más importante es que debe ser capaz de replicarse dentro de la célula huésped, de modo que numerosas copias de la molécula de ADN recombinante se pueden producir y se pasan a las células hijas. Un vector de clonación también debe ser relativamente pequeño, idealmente menos de 10 kb en tamaño, ya que las moléculas grandes tienden a descomponerse durante la purificación, y son también más difíciles de manipular. Dos tipos de molécula de ADN que satisfacen estos criterios pueden ser encontradas en las células bacterianas: plásmidos y cromosomas de bacteriófagos.

2. 1 PLASMIDOS

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que llevan una existencia independiente en la célula bacteriana. Los plásmidos casi siempre llevan uno o más genes, y, a menudo estos genes son responsables de una característica útil que se muestra por la bacteria huésped. Por ejemplo, la capacidad de sobrevivir en concentraciones normalmente tóxicas de antibióticos tales como cloranfenicol o ampicilina es a menudo debido a la presencia en la bacteria de un plásmido que lleva los genes de resistencia a antibióticos. En el laboratorio, resistencia a los antibióticos es a menudo utilizado como un marcador seleccionable para asegurar que las bacterias en un cultivo contienen un particular plásmido.

La mayoría de los plásmidos poseen al menos una secuencia de ADN que puede actuar como un origen de replicación, por lo que son capaces de multiplicarse dentro de la célula independientemente del principal cromosoma bacteriano. Los plásmidos más pequeños hacen uso de ADN propio de la célula huésped, enzimas de replicación con el fin de hacer copias de sí mismos, mientras que algunos de los más grandes los portadores de genes que codifican para las enzimas especiales que son específicos para la replicación del plásmido.

Unos pocos tipos de plásmido también son capaces de replicarse a sí mismos mediante la inserción en el cromosoma bacteriano. Estos plásmidos integrativos o episomas pueden mantenerse estables de esta forma a través de numerosas divisiones celulares, pero siempre existe en alguna etapa como elementos independientes.

2.1.1 Tamaño y número de copias

El tamaño y número de copias de un plásmido son particularmente importantes al momento de concertar la clonación. Ya hemos mencionado la importancia del tamaño del plásmido y un tamaño de menos de 10 kb es deseable para un vector de clonación. Los plásmidos con un intervalo de aproximadamente 1,0 kb para la más pequeña a más de 250 kb de los plásmidos más grandes, por lo que sólo unos pocos son útiles para fines de clonación. Sin embargo, como veremos en el capítulo 7, los plásmidos más grandes pueden ser adaptados para la clonación en algunas circunstancias.

El número de copias se refiere al número de moléculas de un plásmido individual que normalmente se encuentran en una única célula bacteriana. Los factores que controlan el número de copias no son bien entendidos. Algunos plásmidos, especialmente los más grandes, son exigentes y tienen un bajo número de copias de tal vez sólo uno o dos por célula, mientras que otros, llamados plásmidos relajados, están presentes en múltiples copias, de 50 o más por célula. En términos generales, un vector útil de clonación tiene que estar presente en la célula en múltiples copias para que se puedan obtener grandes cantidades del DNA recombinante.

2.1.2 Conjugación y compatibilidad

Los plásmidos se dividen en dos grupos: de conjugativos y no-conjugativos. Los plásmidos conjugativos se caracterizan por la capacidad de promover la conjugación sexual entre las células bacterianas, un proceso que puede resultar en un plásmido conjugativo propagado de una célula a todas las otras células en un cultivo bacteriano. La conjugación y la transferencia de plásmidos se controlan por un conjunto de genes de transferencia o TRA, que están presentes en los plásmidos de conjugación pero ausentes en las de tipo no-conjugativo. Sin embargo, un plásmido conjugativo no puede, en virtud de algunas circunstancias, ser co-transferido junto con un plásmido conjugativo cuando ambos están presentes en la misma célula.

Varios tipos diferentes de plásmidos que se pueden encontrar en una sola célula, incluyendo más de un plásmido conjugativo en un momento diferente. De hecho, las células de E. coli se sabe que contienen hasta siete plásmidos diferentes a la vez. Para ser capaces de coexistir en la misma célula, los diferentes plásmidos deben ser compatibles. Si dos plásmidos son incompatibles luego uno o el otro se perderá rápidamente de la célula. Los diferentes tipos de plásmido por lo tanto, pueden ser asignados a diferentes grupos de incompatibilidad sobre la base de si son o no pueden coexistir, y los plásmidos de un solo grupo de incompatibilidad a menudo relacionados entre otros de varias maneras. La base de la incompatibilidad no se entiende bien, pero los eventos durante la replicación del plásmido se cree que es la base de este fenómeno.

2.1.3 Clasificación de los plásmidos

La clasificación más útil de plásmidos de origen natural se basa en la característica principal de codificado por los genes del plásmido. Los cinco tipos principales de plásmido de acuerdo con esta clasificación son los siguientes:

Fertilidad o plásmidos F: llevar sólo genes TRA (genes de transferencia) y no tienen características más allá de la capacidad para promover la transferencia conyugal de plásmidos. Un ejemplo bien conocido es el plásmido F de E. coli.

Plásmidos de resistencia o R: llevan genes que confieren la resistencia a la bacteria huésped a uno o más agentes antibacterianos, tales como cloranfenicol, ampicilina, y mercurio. Los plásmidos R son muy importantes en microbiología clínica como la propagación a través de las poblaciones naturales pueden tener profundas consecuencias en el tratamiento de infecciones bacterianas. Un ejemplo es RP4, que se encuentra comúnmente en Pseudomonas, pero también ocurre en muchas otras bacterias.

Col plásmidos: codifican para colicinas, proteínas que matan a otras bacterias. Un ejemplo es ColE1 de E. coli.

Plásmidos degradativos: permiten a la bacteria huésped metabolizar moléculas inusuales tales como el ácido salicílico y tolueno, siendo un ejemplo TOL de Pseudomonas putida

Plásmidos de virulencia: confieren patogenicidad de la bacteria al huésped, que incluyen los Plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, que inducen la enfermedad agalla de la corona en plantas dicotiledóneas.

2.1.4 plásmidos en los organismos distintos de las bacterias

Aunque los plásmidos se han generalizado en las bacterias no son de ninguna manera tan comúnes en otros organismos. La mejor característica de los plásmidos eucarioticos es el círculo 2 μm que se produce en muchas cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae. El descubrimiento del plásmido de 2 μm fue muy fortuito ya que permitió la construcción de vectores de clonación para este importante organismo industrial. Sin embargo, la búsqueda de plásmidos en otros eucariotas (tales como los hongos filamentosos, plantas y animales) ha probado ser decepcionantes, y se sospecha que

muchos organismos superiores simplemente no albergan plásmidos dentro de sus células.

2.2 BACTERIOFAGOS

Los bacteriófagos o fagos, como comúnmente se les conoce, son virus que infectan específicamente a las bacterias. Como todos los virus, los fagos son muy simples en su estructura, que consiste simplemente en un ADN (o, en ocasiones ácido ribonucleico (ARN)) molécula que lleva un número de genes, incluyendo varios para la replicación del fago, rodeado por una capa protectora o cápside compuesta por moléculas de proteína.

2.2.1 ciclo de infección de los fagos

El patrón general de la infección, que es la misma para todos los tipos de fagos, es un proceso de tres pasos proceso (Figura 2.6):

1. La partícula de fago se une a la parte exterior de la bacteria e inyecta su ADN cromosómico en la célula.

2. La molécula de ADN del fago se replica, por lo general por las enzimas codificadas por genes específicos en el cromosoma del fago.

3. Otros genes de fagos promueven la síntesis directa de los componentes de la proteína de la cápside, y nuevas partículas del fago se ensamblan y se liberan de la bacteria.

Con algunos tipos de fagos todo el ciclo de infección se completa muy rápidamente, posiblemente en menos de 20 minutos. Este tipo de infección rápida se denomina un ciclo lítico, como la liberación de las nuevas partículas del fago se asocia con la lisis de la célula bacteriana. La función característica de un ciclo de infección lítica es que la replicación del ADN del fago es seguida inmediatamente por la síntesis de proteínas de la cápside, y la molécula de ADN del fago nunca se mantiene en una condición estable en la célula huésped.

2.2.2 fagos lisogénicos

En contraste con un ciclo lítico, la infección lisogénica se caracteriza por la retención de la molécula de ADN del fago en la bacteria huésped, posiblemente durante muchos miles de divisiones celulares. Con muchos fagos lisogénicos el ADN del fago se inserta en el genoma bacteriano, en una manera similar a la inserción episomal. La forma integrada del ADN del fago (llamado el profago) está en reposo, y una bacteria (referido como un lisógeno) que lleva un profago es por lo general fisiológicamente indistinguible de una célula no infectada. Sin embargo, el profago es eventualmente liberado del genoma del huésped y el fago vuelve al modo de lítica y lisa la célula. El ciclo de infección de lambda (λ), un típico fago lisogénico de este tipo, se muestra en la Figura 2.7.

Un número limitado de fagos lisogénicos siguen un ciclo de infección en un lugar diferente. Cuándo M13 o un fago relacionado infecta E. coli, las nuevas partículas de fago se ensamblan continuamente y se liberan de la célula. El ADN de M13 no se integra en el genoma bacteriano y no se convierte en silencioso. Con estos fagos, nunca se produce la lisis celular, y la bacteria infectada puede seguir creciendo y dividiéndose, aunque a un ritmo más lento que las células no infectadas. La Figura 2.8 muestra el ciclo de infección M13.

Aunque hay muchas variedades diferentes de bacteriófagos, sólo λ y M13 tienen un papel importante como vectores de clonación. Ahora vamos a considerar las propiedades de estos dos fagos en más detalle.

Organización de genes en el ADN de λλ es un ejemplo típico de un fago de cabeza y la cola (véase la figura 2.5a). El ADN está contenido en la estructura poliédrica de la cabeza y la cola sirve para unir el fago a la superficie bacteriana y para inyectar el ADN en la célula (véase la figura 2.7).La molécula de ADN de λ es de 49 kb y se ha estudiado intensamente por las técnicas de cartografía genética y la secuenciación del ADN. Como resultado de ello las posiciones e identidades de todos los genes en la molécula de ADN son conocidos (Figura 2.9). Una característica del mapa genético de λ es que los genes relacionados en términos de función se agrupan en el genoma.

Por ejemplo, todos los genes que codifican para los componentes de la cápside se agrupan juntos en el tercio izquierdo de la molécula, y los genes que controlan la integración del profago en el genoma hospedador se agrupan en el centro de la molécula. El agrupamiento de los genes relacionados es sumamente importante para el control de la expresión del genoma de λ, lo que permite que los genes se enciendan y apaguen como grupo en lugar de individualmente. El agrupamiento también es importante en la construcción de vectores de clonación de λ.

La forma linear y circular del ADN de λUna segunda característica de λ que resulta ser de importancia en la construcción de vectores de clonación es la conformación de la molécula de ADN. La molécula se muestra en la Figura 2.9 es lineal, con dos extremos libres, y representa el ADN presente en la estructura de la cabeza del fago. Esta molécula lineal consta de dos cadenas complementarias de ADN, bases apareadas de acuerdo con las reglas de Watson-Crick

(es decir, ADN de doble hebra). Sin embargo, en cualquiera de los extremo de la molécula es un corto tramo de 12 nucleótidos en la que el ADN es monocatenario(Figura 2.10a). Las dos hebras individuales son complementarias, y por lo tanto pueden basar par con uno otra para formar una molécula circular, completamente de doble hebra (Figura 2.10b).

Cadenas simples complementarias se denominan extremos "pegajosos" o extremos cohesivos a menudo, porque el apareamiento de bases entre ellos puede "pegarse" los dos extremos de una molécula de ADN (o los extremos de dos moléculas diferentes de ADN). Los extremos cohesivos λ se llaman sitios cos y juegan dos papeles distintos durante el ciclo de infección λ. En primer lugar, permiten que la molécula de ADN lineal que se inyecta en la célula sea circularizado, que es una condición necesaria previa para la inserción en el genoma bacteriano (véase la figura 2.7).

La segunda función de los sitios cos es bastante diferente, y entra en juego después de que el profago ha escindido del genoma del huésped. En esta etapa un gran número de moléculas de ADN nuevo de λ son producidas por el mecanismo de replicación de círculo rodante (Figura 2.10c), en el que una cadena de ADN continua se "salió" de la molécula molde. El resultado es una catenaria que consiste en una serie de genomas λ lineales unidas a los sitios cos. El papel de los sitios cos es ahora para actuar como secuencias de reconocimiento para una endonucleasa que escinde la catenaria en los sitios cos, la producción de genomas λ individuales. Esta endonucleasa, que es el producto del gen A de la molécula de ADN de λ, crea en la monocatenaria los extremos pegajosos, y también actúa en conjunción con otras proteínas para empaquetar cada uno de los genomas de λ en una estructura de la cabeza del fago. Los procesos de escisión y envasado reconocen sólo los sitios cos y las secuencias de ADN a cada lado de ellos, por lo que cambiar la estructura de las regiones internas del genoma de λ, por ejemplo mediante la inserción de nuevos genes, no tiene ningún efecto sobre estos eventos tan largo como la longitud total del genoma de λ no se altera demasiado.

M13 un fago filamentoso

M13 es un ejemplo de un fago filamentoso (véase la figura 2.5b) y es completamente diferente a la estructura de λ. Por otra parte, la molécula de ADN de M13 es mucho más pequeño que el genoma λ, siendo sólo 6.407 nucleótidos de longitud. Es circular y es inusual en que consiste enteramente de ADN de una sola hebra.

El menor tamaño de la molécula de ADN de M13 significa que tiene espacio para un menor número de genes que el genoma de λ. Esto es posible porque la cápside M13 está construida a partir de múltiples copias de sólo tres proteínas (que requieren sólo tres genes), mientras que la síntesis de la estructura de la cabeza y de la cola λ involucra a más de 15 proteínas diferentes. Además, M13 sigue un ciclo de infección más simple que λ, y no es necesario para la inserción de genes en el genoma huésped.

La inyección de una molécula de ADN de M13 en una célula de E. coli se produce a través de los pilis, las estructuras que conectan dos células durante la conjugación sexual (véase la Figura 2.4). Una vez dentro la célula la molécula de una sola cadena actúa como molde para la síntesis de una hebra complementaria, lo que resulta en ADN de doble cadena normal (figura 2.11a). Esta molécula no se inserta en el genoma bacteriano, pero en su lugar hay hasta más de 100 copias presentes en la célula (Figura 2.11b). Cuando la bacteria se divide, cada célula hija recibe las copias del genoma del fago, que continúa replicándose, manteniendo de ese modo sus números totales por célula. Como se muestra en la figura 2.11c, nuevas partículas de fago son continuamente montadas y

puestas en libertad, alrededor de 1000 nuevos fagos que se producen durante cada generación de una célula infectada.

Varias características de este fago M13 lo hacen atractivo como un vector de clonación. El genoma es menor de 10 kb de tamaño, bien dentro del rango deseable para un vector potencial. Además, la forma replicativa de doble cadena (RF) del genoma de M13 se comporta mucho como un plásmido, y puede ser considerada como tal a fines experimentales. Se prepara fácilmente de un cultivo de células de E. coli infectadas (p. 43) y puede ser presentada de nuevo por transfección (p. 81). Lo más importante, los genes clonados con un vector basado en M13 se pueden obtener en la forma de ADN de una sola hebra. Versiones de cadena simple de los genes clonados son útiles para varias técnicas, en particular de secuenciación de ADN y la mutagénesis in vitro (págs. 169 y 203). La clonación en un vector M13 es una manera fácil y fiable para la obtención de una sola hebra de ADN para este tipo de trabajo. Vectores M13 también se utilizan en la presentación de fagos, una técnica para la identificación de pares de genes cuyos productos de proteínas interactúan entre sí (p. 220).

2.2.3 Virus como vectores de clonación en otros organismos

La mayoría de los organismos vivos están infectados por virus y no es sorprendente que no ha sido gran interés en la posibilidad de que los virus pueden ser utilizados como vectores de clonación para organismos mayores. Esto es especialmente importante

cuando se tiene en cuenta que los plásmidos no se encuentran comúnmente en los organismos distintos de bacterias y levaduras. Varios virus eucariotas han sido empleados como vectores de clonación para aplicaciones especializadas: por ejemplo, adenovirus humano se utilizan en la terapia génica (p. 259), baculovirus se utilizan para sintetizar importantes proteínas farmacéuticas en células de insecto (p. 240), y caulimovirus y geminivirus se han utilizado para la clonación en las plantas (p. 120). Se discuten estos vectores con más detalle en el Capítulo 7.