candidiasis

CandidosisEs una infección micótica primaria o secundaria causada por miembros del género Candida. Las manifestaciones clínicas pueden ser aguda, subaguda o crónica a episódica. Participación puede estar localizado en la boca, garganta, piel, cuero cabelludo, la vagina, los dedos, las uñas, los bronquios, pulmones, o el tracto gastrointestinal, o convertirse en sistémica como en la septicemia, endocarditis y meningitis.Distribución: En todo el mundo.Agentes etiológicos: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei. C. parapsilosis, C. guilliermondii y C. pseudotropicalis. Todos están en todas partes y se producen de forma natural en los seres humanos.

FORMAS CLÍNICAS DE LEVADURAS DEL GÉNERO CANDIDA

Cutaneas:Localizadaas: grandes pliegues, interdigitales y uñasDifusas: amplias superficialesProfundas: granulomas candidiasicos

Mucocutaneas:Mucosa oral: muguet, queilitis, glositisMucosa genital: vaginitis, balanitisMucosa digestiva: esofagitis, enteritisMucosa respiratoria: bronquial , pulmonarCandidiasis mucocutanea cronica

SistemicasLocalizadasSistema nervioso centralEndocarditisTracto urinarioArtritis y osteitisPeritoneo, higado, bazo y vesicula biliarDiseminadasCandidiasis diseminada cronica o hepatoesplenicaCandidiasis diseminada aguda

CUANDO DEBE SER CONSIDERADA UNA LEVADURA PRODUCTORA DE UNA MICOSIS

Se debe establecer si la levadura aislada está causando infección, esta colonizando o es sola una contaminación.Es necesario una correlación entre el examen directo y el aislamiento de la levadura.C. neoformans. Tinta china positiva o recuperada de cultivo es significativo. C. albicans aisladas de esputos o de orina (chorro del medio), rara vez patógena. En pacientes inmunosuprimidos las levaduras aisladas de sitios estériles es indicativo de infección diseminada con probable fungemía

El diagnóstico se refuerza si en el examen directo o coloraciones se observan pseudohifas (p/micelio) o blastosporas (b/conidias) aisladas o gemantes.Hemocultivos positivos (25-50%) pueden indicar:Candidemia transitoria debida a colonización de catéteres.Candidemia profunda o una invasivaHemocultivos negativos no descarta fungemia

Condiciones asociadas al aumento de la tasa de infecciones fungicas

Aumento de pacientes imunocomprometidosMayor utilizacion de procedimientos medicos invasivosMayor uso de fluconazolSobrevida de pacientes críticosMejoramiento de recursos diagnósticos

RICHARDS et al.(EUA)

1993

1o S. coag. neg.2º Enterobacterias3o S. aureus4o Candida sp5o Enterococcus sp.6º Outras

Variáveis AUTOR

Ano

AGENTES

SériesVINCENT et al.(EUROPA)

1995

1ºEnterobacterias 2o S. aureus3o P. aeruginosa4o S. coag. neg.5o Candida sp.6o Outras

PFALLER et al.(EUA)

1999

1o S. coag. neg.2o S. aureus 3o Enterococcus sp4o Candida sp5o Outras

Distribucion de agentes relacionados a UCI Hospitales Terciários

Leucemia agTransplantesQuemadosCirugia GIPrematuros

Alto riesgo

Total - admisiones

Factor de riesgoAntibioticos 1.7Cateter IV 7.2Colonizacion Candida 10.4Hemodialisis 10.4

Óbito p/ candidíasis

Óbito p/ enfermeda de base

Candidemia

Candidemia hospitalariaIndicadores de gravedad

Wenzel. Clin Infect Dis 1995;20:1531-4.

Sobreviven

Etiologia de la candidemia: relevancia de las espécies “no-albicans”

Distribucion de espécies de Candida aisladas de Hemocultivos.European and North American Sentry-Program

Europa (170)

5321126413

Espécie

C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis C. guilliermondii C. krusei Candida spp

USA (203)

566

197126

Canadá (61)

5323118--23

Distribucion de espécies en 103 episódios de candidemia obtenidos de pacientes admitidos en 5 centros médicos do Brasil, Chile, Argentina e Venezuela

• Espécies Número (%)

C. albicans 43 (42)C. parapsilosis 22 (21,3)C. tropicalis 25 (24,2)C. glabrata 8 (7,7) Outras 5 (4,8)

Candida albicans:Predomina en candidiasis genital, oral y cutánea (>90%).En candidemias y enfermedad invasora continúa siendo la causa más frecuente, pero se ha observado una disminución del 7%-10% (1997-2005) en su prevalencia. También se ha notado disminución de acuerdo con el incremento en la edad, después de la exposición a los azoles y en las UCI

Candida glabrataSe ha incrementado desde 1993, su frecuencia como causa de candidemia en Norte América.Se ubica como la segunda especie más frecuente.La cataloga como un importante oportunista emergente con gran potencial para desarrollar resistencia a los antimicóticos, especialmente al fluconazol. Se la asocia a pacientes mayores de 60 años, trasplantados de órganos sólidos o con cáncer.La profilaxis con fluconazol es un factor predisponente. En latinoamerica esta especie tiene una baja incidencia (4-6%).

El complejo Candida parapsilosis Está conformado por tres especies: C. parapsilosis, C. orthopsilosis y C. metapsilosis. El complejo es considerado patógeno exógeno y se encuentra como colonizador transitorio de piel-uñas y, ocasionalmente, de mucosas. Se asocia a infecciones adquiridas a través de las manos y de los ambientes hospitalarios e, igualmente, también con nutrición parenteral, cirugías recientes que requieran catéteres intravenosos y uso de caspofungina en pacientes con trasplante de células madre. En Latinoamérica esta especie está distribuida en todos los rangos de edad, incluyendo neonatos, grupo que es el más frecuentemente afectado por esta especie en Norteamérica y otras regiones del mundo

Candida tropicalis

Es considerada una causa importante de candidiasis invasora en pacientes con cáncer, especialmente con leucemia, neutropenia y en trasplante de células madre. Se ha observado disminución de candidemias por esta especie con el uso profiláctico de fluconazol en pacientes con cáncer. Esta especie disminuyó como agente de las candidemias en Norteamérica del 10%-12% en los años noventa a 7%-8% en el año 2000. En América Latina y Asia, su incidencia en candidemia es mayor del 15%.

Candida krusei

Es una especie considerada emergente debido al uso profiláctico con fluconazolEstá asociada a pacientes con neutropenia. La colonización por esta especie es un predictor de candidemia. Se trata de un microorganismo multidrogo-resistente debido a que tiene una resistencia intrínseca al fluconazol,Tiene una susceptibilidad disminuida a la anfotericina y la fluocitosina que está además, asociada a alta mortalidad (80%-40%)

Genero Candida: mas de 163 espécies - 15 patógenasRelevancia epidemiológicaDiversidad de susceptibilidad los antifúngicos Base para definicion de la terapeuticaNecesidad de identificacion correcta y rápida

Importancia de la definicion de la espécie

Para un diagnóstico correcto es necesario seleccionar,obtener y enviar la muestra adecuada.Existen condiciones importantes para tener en cuenta, como sigue: las muestras deben ser recolectadas asépticamente en frasco estéril con tapa rosca y se deben enviar al laboratorio a la menor brevedad posible. Su recolección y transporte varían de acuerdo con el espécimen y sitio de la infección. Además, cada espécimen debe estar bien rotulado, debe ir acompañado de los datos del paciente (nombre completo, sexo, edad) y datos clínicos (factores de riesgo, tratamiento con antibióticos o antimicóticos, sospecha clínica), examen solicitado y nombre, dirección y otra información de contacto del médico que lo solicita

Los aislamientos de Candida spp. provenientes de sitios corporales no estériles (orina, secreciones respiratorias) presentan dificultades en su valoración pues no permiten establecer un diagnóstico de candidiasis invasora y aun los cultivos cuantitativos no logran diferenciar entre colonización e infección; no obstante, tienen importancia como factor de riesgo.

IDENTIFICACION DE LEVADURAS

Criterios morfológicos:

Macroscópicos:morfología de la colonia

Microscópicos:Presentación de las levaduras (Blastoconidias, artrosporas y de pseudomicelios)Producción de Clamidosporas (Bilis Agar, Agar harina de maiz)Tubo germinal

• Método clássico• Métodos comerciales

Métodos disponíbles

CARACTERISTICAS UTILIZADAS EN LA CLASIFICACION DE LAS LEVADURAS

En medio líquido: Formación de sedimento, anillo o película. En medio sólido: Textura: cremosa, mucosa.Color: blanco a beige; con pigmento carotenoide , naranja a rojo (Rhodotorula sp., Sporobolomyces sp.), sin pigmento carotenoide (Metschnikowia pulcherrima). Superficie : lisa, rugosa, cerebriforme, etc.Con filamentos o pseudofilamentos : in vitro : en función del medio utilizado.in vivo : Cándida spp. (de saprófito a patógeno).Pseudofilamentos :los brotes se alargan y producen cadenas ramificadas, sin separación.Filamentos verdaderos : el brote crece continuamente.

Examen microscópico directofresco

Artrosporas: Esporas formadas por ciertos tipos levaduras con filamentos verdaderos. Trichosporon.Clamidosporas: C. albicans, esporas grandes, redondas, de pared gruesa.Balistosporas: Sporobolomyces esporas producidas de una protuberancia de la célula madre, son expulsados a gran distancia.

Colonia

Rugosa Mucoide AnaranjadaBlanca/BiegeCremosa

SecaAchatada

Macromorfologia en SGA

Candida TrichosporonGeotrichumC. rugosa

Cryptococcus Rhodotorula C. krusei

Aspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextrose

Tubo germinativoC. albicans: Formacion de tubo germinativo en blastoconídios expuestos a suero humano o animal, luego de 2-3 h de incubacion a 37oC

Tubo germinativo

Negativo Positivo

Outras espécies de levedura

C. albicansC. DubliniensisCrece a 42ºC

MicrocultivoTécnica de cultivo en lamina o placa de Petri sobre medio ágar-harina de maiz con Tween 80Estímula la formacion de pseudohifas a baja tension de O2

Visualizacion de: artroconídios, blastoconídios, clamidoconídios, pseudohifas e hifas verdaderasPresencia y disposicion entre 48 a 96 horas de incubacion

Microcultivo

Examen microscópico directo

HemocultivoGiemsa

Examen microscópico de colonias levaduriformes

Cryptococcus sp

Saccharomyces cerevisiae

Pichia membranifaciens Candida globosa

Saccharomyces cerevisiae


Candida krusei


Trichosporon spp Trichosporon cutaneum

Blasto-artroconidios


25ºC por 2 a 7 días

en agar harina de maíz - Tween 80 agar arroz - Tween 80

Microcultivo ( Dalmau, 1929 ) Estudio micromorfológico de levaduras

Pseudohifas + Blastoconídios

Sin clamidoconídios Con clamidoconídios

Otras espécies de levadura

C. albicansC. dubliniensis

Microcultivo:

Pseudohifas, blastoconídios, Clamidoconídios

C. albicansC. dubliniensis

Termotolerancia (42 - 45oC)C. albicans (+) C. dubliniensis (-)

Caldo NaCl hipertonico C. albicans (+) C. dubliniensis (-)

C. albicans C. dubliniensis

Alves SH, Milan EP et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 43:85-86, 2002.

Pseudohifas Blastoconídios

Sin clamidoconidios

Candida spp

Pruebas bioquímicas

Microcultivo:

Blastoconídios sin pseudohifas o c/ pseudohifas rudimentares

Microcultivo: ausencia de pseudohifa

Sin cápsula y urease (-) Con cápsula y urease (+)

C/ ascosporas S/ ascosporasCryptococcusRhodotorula

Candida glabrata

PichiaHansenula

Saccharomyces

Busqueda de cápsula

Cryptococcus spp

Hidrólisis de uréa

Produccion de ureasa Uréa de Christensen lectura de 24-48h Interpretacion:Trichosporon spp variáble Cryptococcus spp positivoCandida spp negativo (exceto C. lipolytica e eventualmente C. krusei)

Reproduccion sexuadaEstruturas de reproduccion sexuada = ascosporosMedios que estimulan la produccion de ascosporos V8: 7-10 dias Ágar extrato de malte,

ágar acetato de sódioInoculacion de levadura en medio de cultivo apropriadoFrotis de cultivo teñido por la técnica de ácido-resistencia visualizacion de los ascos que se colorean de verdeGeneros: Saccharomyces, Pichia, Hansenula, etc.

Artroconídios

Artroconídios

C/ blastoconídiosy ureasa (+)

S/ blastoconídiosy ureasa (-)

GeotrichumTrichosporon

Microcultivo:

Esquema de IdentificacionLeveduras

Crescimento rápido no estimulado por lipídios

Colonias alaranjadasMalassezia spp.

Crescimento lento estimulado por lipídios

Colonias blancas

Rhodotorula spp. Blastoconídios Artroconídios

Ascosporas (-)

Cápsula (+)

Ascosporas (+)

Urease (+) Urease (-)Cápsula (-)

Leveduras sexuadas Saccharomyces spp.Pichia spp.

Candida spp.Identificação baseada emAssimilação Fermentação

Cryptococcus sppTrichosporon spp. Geotrichum spp.

Caracteres bioquímicos Permite la diferenciaccion el nível de espécieCaracterísticas metabólicas inherentes a cada espécie de levadura

Cryptococcus

Rhodotorula

Trichosporon Geotrichum SacharomycesPichiaHansenulaCandida

Asimilacion de carbohidratos (Auxanograma)

Capacidad de asimilar determinado carbohidrato como única fuente de carbono para mantener la viabilidad celularMedio sólido sin fuentes de carbono, con inóculo a ser testadoAdicionarse el azúcar que se desea testar 15 azúcares Despues incubacion (24 - 72h), la presencia de crecimento visíble (turvidez) indica asimilacion (+)

Capacidad de utilizar determinado azúcar para producion de energia en baja tension de O2 con producion de etanol y gás (CO2) Medio basal líquido conteniendo solucion de un azúcar + inóculo 6 azúcares Visualizacion de la formacion de CO2 en tubos de Durham invertidos Lectura: 24h - 14 dias

Fermentacion de carbohidratos (Zimograma)

Asimilacion de nitrogeno

Algunas levaduras poseen capacidad de asimilar nitrogeno inorganico a forma de nitrato (lectura: 24-48h) Medio sólido basal conteniendo fuente de C, mas sin fuente de N + inóculoAgreguese nitrato de potássio en el campo y peptona (control positivo) en otro campo - presencia de crecimiento visíble (turbidez) indica asimilacion (+)

Identificacion de las principales levaduras de interes clínico

Ph=pseudo-hifa; Gli=glicose; Sac=sacarose; Gal=D-galactose; Raf=rafnose; Xil=D-xilose; Cel=celobiose; Tre=trealose; Dul=dulcitol; Mal=maltose; V=variáble

-

-

+

+

+

+Mal

-+-----+pseudohifas (-)C.glabrata

-------+pseudohifas/blastoc. alongados

C. krusei

++++++++pseudohifas finas Blastocon.

C. guilliermondii

-+-+-+++pseudohifas curvas/células gigantes

C. parapsilosis

-+V+-+++pseudohifas/Blastoc en cadenas

C. tropicalis

-+-+-+V+Clamidocon.C. albicans

DulTreCelXilRafGalSacGli

AssimilacionMorfologiaLevaduras

Limitaciones del método clásico

Técnica laboriosa

Consumo de tiempo

Requiere profesional experimentado

Requisitos• Padronizados• Simples• Rápidos• Fácil lectura e

interpretacion• Bibliografía• C0sto-beneficio

Métodos comercialesObjetivos• Facilitar el trabajo

de laboratório• Ampliar el

espectro de diagnóstico

• Mejorar el diagnóstico

• Identificacion precoz

• Apoyar al clínico

Crecimiento en CHROMAgar Candida :

C. albicans (verde) C. tropicalis (azul)C. krusei (rosa y rugosa) C. parapsilosis (rosácea-lisa) Prototheca wickerhamii (crema)

CHROMAgar Candida

IDENTIFICACION DE LEVADURAS: CRITERIOS BIOQUÍMICOS

1.Enzimáticos

Medios cromogénicos:CHROMagar Candida®Cromogen Albicans ®Candida ID ®Albicans ID2 ®CandiSelect ®Fluoroplate Candida ®Agar SDCA-MUAG ®

Métodos VantajasRapidez en la identificacion de espécie o

espécies mas freduentes en la rutinaPosibilidad de aislamiento en cultivos

mixtosFacilidad de lectura y simplicidad de

procedimiento

LimitacionesEspecificidad (variáble conforme o

método)Costo (kit e leitura UV)Necessidad de identificacion de espécies

no albicans

Galerias API:ID 32CAPI 20C AUX

RapID Yeast Plus System

AuxacolorFungifast I TwinCandifast

Métodos manuales de identificacion:

J Med Microbiol,50:1105-10,2001; Med Mycol,37(2):11-7,1999;J Clin Pathol,52(4):271-3,1999

ID32C

Métodos Manuais

AUXACOLOR® C.Neg GLU MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO.

CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. ACT. POX.

Pruebas adicionales

Microcultivo

Cápsula

Pigmentação

IDENTIFICACION DE LEVADURAS

Sistemas semi-automáticos:

API 20C AUX®Galería ID 32C®Sistema Vitek ®

Asimilación de azúcares ID 32C (API)

MicroscanWalkAway - 40WalkAway - 96

Vitek YBCVitek 2 ID-YST

Clin Microbiol Rev, 5(3):302-27,1992; JCM,34(10):2408-10,1996; JCM,36(5):1197-200,1998; J Clin Pathol,52(4):271-3,1999; JCM,37(6):1967-70,1999

Métodos automatizados de identificacion

•Sistemas automáticos:•Sistema Vitek 2 ID-YST Sistem ® (Identificación y sensibilidad)

•Sistema Biolog YT Microplate®•Rapid Yeast Identification Panel Micro Scan®

VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)

Pruebas Rápidas

RapID Yeast Plus System®Fongiscreen 4H®

Criterios Inmunológicos:

Bichro-latex albicans® Krusei-color®

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales manuales y automatizados para la identificacion de levaduras

Evaluar costo x benefício antes de adotar el método comercialEvaluar la correlacion del sistema comercial con el método clásicoGuardar los kits a temperatura adequada, respetando su plazo de validezRealizar adecuado mantenimiento del equipoFamiliarizarse com los procedimientos y patrones de lectura

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales manuales y automatizados para la identificacion de levedurasCertificarse sobre cuales espécies son identificadas por cada métodoCuidado para obtener inóculos puros e viáblesUtilizar siempre microcultivo y otros testes adicionales.Realizar control de calidad con organismos controle.Conocer las espécies problema.

SUCEPTIBILIDAD ANTIFUNGICA

METODO DE DIFUSION EN AGAR CON LECTURA AUTOMATIZADA

Presionar el hisopo contra el borde interno del tubo para remover el exceso de líquido antes de inocular

Asegurese de usar hisopos de algodón y no de dacrón.

Remover el exceso de líquido del hisopo

Después de 15 mínutos de haber ajustado el inoculo cubrir el agar completamente con el hisopo en 3 diferentes direcciones. No presione el hisopo sobre el agar.

Esparcir el inoculo en el agar

Deje desaparecer la humedad de la superficie del agar antes de colocar los discos. Asegurese que cada disco quede firme sobre el agar. Use un dispensador de discos si es posible.

Dispensar los sensidiscos sobre el agar

Incube los placas por 18 horas a 35°C. El crecimiento sobre el agar debe ser uniforme, formando una capa confluente. Para C

neoformans incubación por 72 horas.

Incubación de placas

Lecturas de las placas en el Biomic®

TECNOLOGIA

Sistema lector de placas mediante análisis digital de imagen

CámaraTarjeta de VídeoComputador

BIOMIC®

Como realizar y leer pruebas de difusión en Agar con BIOMIC®

Sensibilidad antifúngica in vitro

Método M27-A de los NCCLS Método propuesto por el EUCAST Métodos alternativos y comercializados

◦ Sensititre YeastOne◦ Etest◦ Fungitest◦ Difusión de disco

No hay tecnología y no hay máquina que substituyan al conocimiento, la experiencia y

la sensibilidad del ser humano. Solo él es capaz de interpretar, analizar y juzgar

correctamente.

Armando Fonseca Presidente - SBPC/ML

candidiasis

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